UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE ROS

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

CTEDRA MICROBIOLOGA AGRCOLA

Gua de Trabajos Prcticos
BENINTENDE, S.; SNCHEZ, C., STERREN, M., MUSANTE, C. y CHAJUD, A.

Ao Lectivo 2009

TEORICO - PRCTICO UNIDAD 1: PRINCIPALES GRUPOS DE AGRONMICA

MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA

Introduccin Bacterias, levaduras, hongos, algas, protozoarios integran un grupo de organismos que se asemejan entre s por su tamao pequeo y su sencillez de estructura y organizacin. A estos grupos de seres vivos, a pesar de pertenecer a categoras taxonmicas diferentes, se les denomina microorganismos, y son reagrupados para su estudio en la ciencia denominada Microbiologa. El tamao de los microorganismos adems de incidir en su morfologa, actividad y metabolismo, tiene consecuencias en sus intervenciones ecolgicas y su manipulacin en el laboratorio. Las clulas microbianas son de dos tipos diferentes. El tipo menos desarrollado es el de bacterias y cianobacterias que se denomina procariota. El tipo celular ms desarrollado, eucariota, se halla en todas las dems formas biolgicas: algas, protozoarios, hongos. Las bacterias tpicas constituyen el grupo de organismos ms abundantes de la naturaleza. Su tamao vara entre 0,5 a 1 m de ancho por 1 m de largo, con forma variable. El nmero y actividad de las bacterias en un ambiente natural como suelo, leche, agua estn afectados por las condiciones ambientales del hbitat en el que viven y las prcticas culturales. Los microorganismos eucariotas son seres vivos unicelulares o pluricelulares, pero nunca con diferenciacin en tejidos (excepto en ciertos grupos de hongos), pudiendo ser coloniales, cenocticos o miceliares, y cuyo pequeo tamao obliga a emplear el microscopio para observarlos y analizar su estructura. El trmino algas se refiere a un conjunto grande y variado de organismos eucariotas que contiene clorofila y que llevan a cabo una fotosntesis oxignica. En contraste con las algas, los hongos carecen de clorofila. Es un grupo grande y variado de microorganismos eucariotas que se pueden agrupar en mohos, levaduras y setas. Los protozoos son microorganismos unicelulares que carecen de pared celular, y que por lo general son incoloros y mviles. Estos se distinguen de las bacterias por su tamao mayor y su naturaleza eucariota. Normas de trabajo en el laboratorio de microbiologa agrcola Para el trabajo en el laboratorio de microbiologa es necesario tener en cuenta una serie de previsiones 1. Las guas de trabajos prcticos deben ser ledas atentamente antes de iniciado cada uno de los trabajos prcticos. Es necesario comprender los fundamentos que se tratan de poner de relieve con cada unos de los pasos a seguir. 2. Las operaciones efectuadas en microbiologa: siembras, diluciones, aislamientos, repiques, etc. se realizan de forma que se evite toda posible contaminacin. Trabajar en la zona de esterilidad que genera el mechero. 3. Antes de iniciar la actividad prctica y al finalizar la misma limpiar la superficie de la mesada con solucin germicida. 4. Mantener la mesa libre de todo elemento que no sea imprescindible. 5. Deber anotarse cuidadosamente toda la informacin de las observaciones de cada uno de los trabajos prcticos que se desarrollen. 6. Al final del trabajo prctico dejar ordenada la mesada. El material utilizado deber lavarse con agua de canilla y enjuagado con agua destilada. Poner el material de vidrio utilizado en bandejas destinadas para este fin. Mantener el orden y la limpieza del laboratorio.
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7. Dar cuenta al docente de cualquier accidente tales como cortaduras, quemaduras o derramamiento de cultivos. Tomar todas las precauciones posibles para evitar estos accidentes.

TRABAJO PRCTICO N 1 NORMAS GENERALES PARA LA PRCTICA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA AGRCOLA. OBSERVACIN MICROSCPICA DE MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA AGRONMICA Objetivos Conocer las normas de manejo en el laboratorio de Microbiologa Agrcola Observar y reconocer los principales microorganismos de inters agronmico Actividades 1. Observe los preparados de microorganismos proporcionados por la Ctedra utilizando el microscopio ptico compuesto (ver prctico de microscopa Ctedra Biologa) 2. Observe detenidamente las diferencias en lo que se refiere a: tamao de clulas, tipo celular, formas, agrupamientos y estructuras caractersticas. 3. Esquematice lo observado. 4. Indique el aumento empleado en cada observacin.

TEORICO - PRCTICO UNIDAD 7: ESTERILIZACION Esterilizacin se define como la destruccin o eliminacin de cualquier forma de vida. Comprende aquellos tratamientos que dejan al objeto tratado libre de todo organismo vivo. Los mtodos de esterilizacin pueden clasificarse de acuerdo al agente, ya sea fsico o qumico, que se emplee para eliminar los microorganismos. MTODOS DE ESTERILIZACIN a. Calor b. Filtracin c. Radiacin d. Agentes qumicos Previo a la esterilizacin los objetos a esterilizar deben limpiarse y acondicionarse de manera adecuada. Limpieza y acondicionamiento del material a esterilizar Si bien en Microbiologa Agrcola no se trabaja con microorganismos patgenos todo material sucio debe tratarse con precaucin y en los casos de sospecha de presencia de patgenos se debe desinfectar antes de lavar. Es fundamental que todo el material de vidrio se lave y enjuague varias veces. La limpieza y desinfeccin del material sucio empleado en el laboratorio de microbiologa debe ser tratado atendiendo las siguientes instrucciones. 1. Con precaucin para evitar roturas. 2. Recogerlo en recipientes adecuados para su desinfeccin y posterior limpieza. 3. A las pipetas se las coloca en recipientes con solucin desinfectante hasta el lavado. Previamente se les saca, valindose de un alambre, el trozo de algodn que ha actuado como filtro en el extremo superior. 4. Las cajas de Petri y los tubos de ensayo se destapan y se los coloca boca abajo, se los hierve en agua jabonosa a fin de que escurran todo el medio de cultivo que contienen. 5. Al material que tiene colorantes se lo separa del resto y se lo trata con soluciones especiales (HCl, HNO3 o mezcla sulfocrmica). El material propio del laboratorio de Microbiologa Agrcola se presenta en la figura 1. 1. Calor Seco 2. Calor Hmedo 3. Calor Directo

Caja de petri

Tubos de ensayo en gradilla

Tubo de ensayo con medio de cultivo

ansa en anillo

esptula de Drigalsky o rastrillo

Figura 1. Materiales de laboratorio utilizados en el laboratorio de Microbiologa Agrcola

Una vez limpio el material debe acondicionarse para que luego de la esterilizacin conserve esta condicin hasta su uso. Las cajas de Petri se las envuelve en papel para. En el extremo superior de las pipetas se coloca un trozo de algodn que acta como filtro y se las envuelve en papel en forma individual o se las coloca en estuches metlicos. A los tubos de ensayo se los tapa con tapones plstico autoclavables (tapones bacteriolgicos) o con tapones de algodn. Mtodos de esterilizacin Una vez que el material est limpio y acondicionado se procede a su esterilizacin. El mtodo de esterilizacin que se emplear depender del material.

a.- CALOR Los objetos pueden ser esterilizados por calor seco en estufa, por calor hmedo que proporciona el vapor caliente en autoclave. La esterilizacin por calor seco requiere ms tiempo e intensidad que la que utiliza calor hmedo por dos razones: - la conduccin es ms lenta y menos eficiente en el aire que en el vapor de agua - algunas bacterias pueden sobrevivir en estado de desecacin. La estructura terciaria de las protenas se estabiliza en parte por uniones puente hidrgeno entre restos de la cadena peptdica. Estas uniones pueden reemplazarse por uniones con molculas de agua en un ambiente saturado de vapor de agua, lo cual facilita la desnaturalizacin de las protenas. Esto explica por qu se requiere mayor temperatura para causar un dao irreversible cuando el material est seco que cuando est hmedo. Calor seco Se utiliza para esterilizar vidrios y materiales resistentes al calor. Los objetos envueltos en papel son colocados en estufa de esterilizacin (figura 2) a una temperatura de 170 C durante 90 minutos, observndose que el envoltorio de papel va adquiriendo un color ligeramente tostado al cabo del tiempo mencionado. La doble pared que tiene la estufa permite la circulacin de aire caliente por formacin de corriente convectiva.

Figura 2 Estufa de esterilizacin

Calor Hmedo Se utiliza para esterilizar soluciones acuosas como medios de cultivo, soluciones nutritivas y ciertos elementos que no resisten el calor seco, como ser portafiltros. El tratamiento se lleva a cabo en un autoclave (figura 3), en la que se genera un ambiente saturado de vapor de agua a una presin interna mayor que la atmosfrica, lo que permite que la temperatura de ebullicin del agua aumente. En el siguiente cuadro la presin es indicada como sobrepresin respecto de la presin atmosfrica. PRESION TEMPERATURA TIEMPO 1 atm 121C 15 min 3/4 atm 115C 20 min Estas temperaturas slo se logran en un ambiente saturado en vapor de agua por lo que al iniciarse la operacin todo el aire debe ser expelido y reemplazado por vapor de agua. Si queda algo de aire, la presin parcial de vapor de agua ser inferior a la que marca el manmetro y por lo tanto la temperatura lograda ser inferior. Por eso conviene tener medidor de vapor de agua y temperatura independientes.
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FUNCIONAMIENTO DEL AUTOCLAVE: Se coloca agua hasta el falso fondo (a) que se encuentra en su interior. Se coloca el material a esterilizar convenientemente preparado, se cierra la tapa (b) ajustando en cruz los tornillos (c) y se deja la espita (d) abierta. Se encienden los mecheros (e) y se calienta el autoclave hasta desprendimiento de vapor de agua en forma continua por la espita. Esto indica que todo el aire que contena el autoclave ha sido eliminado, es decir que se ha purgado el aparato. Se cierra la espita. Se observa en el manmetro el aumento de presin, hasta que llega a la presin escogida a partir de la cual se controla el tiempo de esterilizacin. Luego se cierra la fuente de calor y se deja enfriar (el manmetro vuelve a cero). Recin ahora se puede abrir la espita y luego la tapa.

Figura 3. Autoclave

. Un caso del empleo del calor hmedo es el procedimiento conocido como tindalizacin. La tindalizacin es una forma de esterilizacin por autoclave que se aplica a soluciones que contengan sustancias que son afectadas por el calor (termolbiles). Por ejemplo la leche, cuyo azcar la lactosa, se carameliza a 100C, a la vez que las protenas se desnaturalizan. La tindalizacin consiste en el calentamiento discontinuo en autoclave a vapor fluente, es decir con la espita abierta. De esta manera la presin interna es igual a la atmosfrica y la temperatura no supera los 100C. Esto se realiza durante 30 min. y en 3 das consecutivos. Estos lapsos de 24 h. permiten a las esporas germinar y luego estas clulas son destruidas en el siguiente calentamiento. Calor Directo Esta forma de esterilizacin consiste en exponer directamente el objeto a la accin de la llama como por ejemplo: esterilizacin de ansas (calentamiento al rojo), bocas de tubos (flameado) esterilizacin de morteros (alcohol encendido). b.- FILTRACION Se emplea para aquellas sustancias que son alteradas por el calor en sus estructuras y caractersticas fsicoqumicas. Por ejemplo: sueros, soluciones de enzimas, toxinas bacterianas, etc. Este mtodo es muy usado en la industria farmacolgica. Los filtros pueden ser de porcelana, yeso, vidrio incrustado, siendo los ms comunes los de membrana formado por una pelcula de celulosa (figura 4)

Los filtros se ubican en un portafiltros y la filtracin se realiza por succin y succin ms presin. Las bacterias son eliminadas de las soluciones debido al efecto de colador por el tamao de los poros y por la adsorcin a las paredes de estos por las diferencias de cargas elctricas con los microorganismos.

Filtro de membrana

Figura 4. Filtro de membrana

c.- RADIACION La regin ultravioleta del espectro, entre 2400 a 3000 A, es la que tiene mayor accin sobre los microorganismos. El ADN tiene un pico de absorcin a los 2650 A, y el efecto principal de la radiacin sobre el material gentico es que provoca la unin entre bases de pirimidina adyacentes y as se interfiere con la correcta replicacin y funcin de la molcula de ADN. La consecuencia es que la clula bacteriana pierde la capacidad de dividirse. Este mtodo de esterilizacin es empleado para desinfeccin de aire o superficies debido a que las radiaciones UV no tienen poder de penetracin. Para emplear este mtodo se utilizan lmparas germicidas. Otro tipo de radiaciones utilizadas son las radiaciones ionizantes que incluyen rayos de longitud de onda corta (rayos X, rayos csmicos y rayos gamma). En contraste con la radiacin UV, las radiaciones ionizantes penetran fcilmente a travs del vidrio y de otros materiales, pero por ser ms peligrosas y menos asequibles tienen un uso restringido como agente esterilizante. d.- AGENTES QUIMICOS Definiciones importantes El trmino compuesto antimicrobiano es usado para designar a cualquier sustancia capaz de destruir o inhibir el desarrollo de microorganismos. Las sustancias antimicrobianas pueden clasificarse de la siguiente manera: Germicidas: son sustancias que provocan la destruccin de las clulas vegetativas y las esporas de los microorganismos.
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Cuando un germicida es especfico para bacterias u hongos se los designa bactericidas o fungicidas respectivamente. Germistticos: son sustancias que impiden el desarrollo de microorganismos muchos de los cuales mueren pero algunos quedan en vida latente pudiendo multiplicarse nuevamente cuando la accin del agente disminuye por cualquier razn. Cuando son especficos para bacterias u hongos se los llama bacteriostticos y fungistticos respectivamente. Antibiticos: son sustancias de accin germicida o germisttica producida por ciertos microorganismos, o bien sintetizados en laboratorios especializados. Mecanismos de accin de las sustancias antimicrobianas Las clulas microbianas pueden ser inactivadas o desorganizadas de maneras muy diferentes. Algunos de los mecanismos de accin antimicrobiana son: a- Destruccin o alteracin de estructuras celulares: como la pared celular, membrana celular (alterando la permeabilidad selectiva), protenas (algunas sustancias actan precipitndolas), cidos nucleicos. b.- Inactivacin de reacciones enzimticas: como aquellas que inhiben la sntesis de la pared celular, la sntesis de ADN y ARN. Factores que influyen sobre la accin de compuestos antimicrobianos Tiempo: Una sustancia antimicrobiana debe estar en contacto con el material a desinfectar por un perodo de tiempo adecuado. La muerte de los microorganismos es un fenmeno gradual: la mayora muere rpidamente y otros tienen mayor resistencia. Concentracin: Los agentes qumicos no tienen efecto mientras su concentracin no llega a un determinado valor. Aumentndola gradualmente se observa primero un efecto germisttico y luego germicida. Temperatura: La eficiencia en general aumenta con la temperatura. Humedad: La presencia de agua facilita la penetracin del antimicrobiano a la clula. Naturaleza del medio: La presencia de materia orgnica en el medio disminuye la accin de los antimicrobianos porque acta protegiendo al microorganismo. Naturaleza del microorganismo: Los microorganismos que tienen alguna forma de resistencia (bacterias que tienen cpsulas) son menos afectados por los antimicrobianos. Compuestos antimicrobianos empleados Cationes inorgnicos: Las sales de Hg, Ag y Cu son usadas comnmente como germicidas y germistticos. Por ejemplo el SO4Cu es usado para impedir el desarrollo de algas o mezclado con Ca(OH)2 (Caldo Bordels) para el control de hongos en agricultura. lcalis y detergentes: La accin de los lcalis se debe a la elevada concentracin de OH-. Por ejemplo el HONa es usado para lavar tachos de leche, instalaciones de fbrica de productos lcteos etc. Los detergentes tienen la propiedad de limpiar superficies sucias mediante una accin mecnica de arrastre, inhiben mecanismos enzimticos, adems disminuyen la tensin superficial favoreciendo el ingreso de sustancias en los poros. Pueden ser: aninicos, catinicos y no inicos. Acidos inorgnicos y orgnicos: La accin de los cidos minerales fuertes (FH) se basa en la accin de los iones H+. La accin de los cidos orgnicos puede deberse a varios factores: bajo pH, accin de la molcula disociada o no disociada. Entre estos podemos mencionar: cidos actico, propinico, butrico, srbico. Alcoholes: El etanol es una de las sustancias ms extensamente empleadas en el control de microorganismos. Utilizado al 70% aumenta su poder de penetracin.
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Fumigantes: son sustancias antimicrobianas usadas en forma gaseosa. Ej: xido de etileno, bromuro de metilo, formaldehdo, etc. Halgenos y compuestos halogenados: Entre ellos los ms empleados son Cl e I. Cloro: es usado en potabilizacin de aguas. Para uso corriente es empleado bajo la forma de hipoclorito de Na o Ca. Iodo: empleado en desinfecciones cutneas. Sustancias oxidantes: Es el caso del agua oxigenada que se emplea para desinfecciones cutneas, cuya accin disminuye con la presencia de materia orgnica. Fenol: su accin bactericida est basada en la actividad sobre protenas. Se emplea en desinfeccin de instrumentos de laboratorio, recipientes de basura, etc. Bibliografia BIDOU, D y GRUPILLO, J. Fundamentos y Tcnicas de esterilizacin. Editorial Mdica Panamericana. 1977. BROOK, T. Biologa de los microorganismos. 6ta ed. Omega S.A. Barcelona. 1991. SEELEY, H. y DEMARK, P. Microbios en accin. Manual de laboratorio de microbiologa. Ed.Blume. Espaa. 1973.

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TRABAJO PRCTICO N 2 RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL EMPLEADO EN EL LABORATORIO MICROBIOLOGA AGRCOLA. PREPARACIN DEL MATERIAL DE LABORATORIO PARA SU ESTERILIZACIN

DE

Objetivos Reconocer el material de laboratorio y los elementos de limpieza empleados. Conocer los mtodos de esterilizacin ms usados en un laboratorio de Microbiologa Agrcola. Comprender los fundamentos fsicos y qumicos de los mtodos de esterilizacin. Desempearse con higiene y precaucin en el mbito del laboratorio. Actividades El prctico consistir en el reconocimiento y acondicionamiento del material de vidrio que se utiliza en la rutina del laboratorio de Microbiologa Agrcola. a. Cajas de petri 1. Se pueden acondicionar en unidades individuales o en grupos de 2 o 3 cajas. 2. Se toma una hoja de papel de diario cuyo tamao sea aproximadamente dos veces el tamao de la caja de petri. 3. Se extiende el papel sobre la mesada y se coloca sobre el mismo la caja observando que la base de la misma quede hacia arriba. 4. Se envuelve la caja haciendo una muesca o doblez con el papel sobrante de la envoltura. 5. Se pliegan los extremos hacia el lado de la tapa. b. Pipetas 1. Antes de proceder a su acondicionamiento se coloca un filtro de algodn en la boquilla con ayuda de un clip. 2. Cortar tiras de papel de diario de aproximadamente 6 cm de ancho. 3. Sobre la mesada colocar la pipeta sobre el papel en forma cruzada y envolver. 4. Plegar los extremos. 5. Hacer una flecha sobre el papel, indicando el extremo inferior de la pipeta y anotar el volumen de la misma. c. Tubos de ensayo Confeccionar los tapones: 1. Tomar tiras de algodn 2. Plegar el algodn sobre si mismo de manera que se forme un tapn de aproximadamente 2,5 cm y de ancho que ajuste a la boca del tubo de ensayo. 3. Disponer los tubos en cestillas para su posterior esterilizacin.

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TERICO - PRCTICO UNIDAD N 8: MEDIOS DE CULTIVOS Introduccin Cualquier ser vivo, por su actividad vital (crecimiento, mantenimiento, reproduccin) requiere continuos aportes de energa para reponer las prdidas y para que todo su sistema pueda funcionar. La nutricin es el proceso por el cual los seres vivos toman del medio en el que habitan las sustancias qumicas necesarias para crecer. Se denomina medio de cultivo al conjunto de sustancias nutritivas que permiten el crecimiento y multiplicacin de los microorganismos. Para construir un medio de cultivo para un organismo o grupo de organismos deben conocerse las necesidades de los mismos. Las clulas microbianas pueden tener entre un 80 a 90% de agua. Su composicin elemental, en base seca, est constituida por un 50% de C, mientras que el otro 50% se distribuye en elementos tales como O, N, H, P, S, K, Ca, Mg, Fe. Constituyentes de los medios de cultivo Carbono (C): Este elemento aporta a los microorganismos esqueletos carbonados, de su catabolismo obtienen energa para su crecimiento y multiplicacin. Puede ser suministrado a travs de diferentes fuentes, las orgnicas como los hidratos de carbono (lactosa, sacarosa, maltosa, dextrosa, xilosa, manita, almidn, etc.), aminocidos (aa), cidos orgnicos, etc. La fuente inorgnica de C es el CO2. Nitrgeno (N): Puede encontrarse en la naturaleza tanto en forma orgnica como inorgnica. En el primer caso los microorganismos lo obtienen de la descomposicin y mineralizacin de aa y bases nitrogenadas y en el segundo caso se pueden suministrar como sales inorgnicas: NO3K, (NH4)2SO4. El nitrgeno gaseoso (N2) slo sirve como fuente para las bacterias fijadoras de este elemento: Bradyrhizobium, Azotobacter, Anabaena, etc. Muchos medios de cultivo presentan en un solo compuesto las fuentes de nitrgeno y carbono; como aquellos que contienen peptonas, aminocidos, o algunas protenas como la casena, etc. Sales minerales: Son fuente de cationes y de aniones. Todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos qumicos que se pueden clasificar segn las cantidades en los que son requeridos en macroelementos (K, Na, S, P, Ca, Fe) y microelementos (Mn, Zn, Co, Cu, Ni). Factores de crecimiento: Son aquellos elementos esenciales para el desarrollo de los microorganismos, y que estos no los pueden sintetizar a partir de compuestos ms simples. Ej.: vitaminas (biotina, tiamina, niacina), coenzimas, aminocidos (arginina, asparagina, cistena). Indicadores de pH: Cumplen la funcin de visualizar fcilmente si en un medio hay o no crecimiento, o si acidifica o basifica el medio. Ej: azul de bromotimol, rojo neutro, rojo de fenol, prpura de bromocresol, etc. Clasificacin de los medios de cultivo Los medios de cultivo se clasifican de la siguiente manera: De origen animal: leche, carne. De origen vegetal: mosto de malta, agua de levadura, papa, zanahoria, interiores de frutos. Qumicamente definidos: medios para nitritadores, Azotobacter, Czapecks. Mixtos: constituidos por sustancias qumicamente definidas y sustancias naturales, como por ejemplo levadura glucosada, agar papa glucosado, caldo extracto de carne, caldo nutritivo, etc.

naturales Por su composicin artificiales:

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generales:

Por su funcin

diferenciales:

selectivos

Son aquellos en cuales hay desarrollo de la flora microbiana mas variada. Ej.: agar nutritivo standard (ANS), agar papa glucosado (APG), caldo nutritivo. Son aquellos que debido a su composicin qumica le dan caractersticas especiales a los diferentes gneros bacterianos por el aspecto de sus colonias. Ej.: PEMBA, Rojo congo, agar nutritivo almidn, medio tetrazolio (permite distinguir Pseudomonas solanacearum). Son complejos, y sirven no solo para diferenciar entre gneros, sino que adems tienen accin selectiva sobre otros microorganismos. Ej.: caldo nutritivo con ClNa 10%, agar nutritivo tamponado a pH 5.

Para hacer selectivo un medio de cultivo se puede proceder de la siguiente manera: Aportando los compuestos nutritivos que un determinado microorganismo necesita y no los que requieren otros. Inhibiendo el desarrollo de algunos microorganismos no deseados, a travs del pH, que limite su desarrollo, o incorporando sustancias inhibidoras, como por ejemplo colorantes (eosina, azul de metileno), metales pesados (bismuto), agentes antimicrobianos (vancomicina, neomicina, cloranfenicol), sustancias qumicas (sales en concentraciones que inhiben el desarrollo). Factores ambientales Adems de los nutrientes apropiados es indispensable que los factores ambientales se ajusten apropiadamente a cada organismo cultivado. El establecimiento de un pH ptimo y su mantenimiento durante el crecimiento es de gran importancia, sobre todo para aquellos microorganismos que a pesar de producir cidos no los toleran. De acuerdo a su pH ptimo los microorganismos se clasifican en: Acidfilos: Dentro del pH 3.5 a 5.5 se encuentra la gran mayora de los microorganismos. Ej.: hongos y levaduras, bacterias lcticas y acticas. Neutrfilos: Desarrollan dentro del rango de pH 6.5 a 7.5. Ej.: Bacillus, Azotobacter. Basfilos: El pH ptimo de crecimiento y desarrollo es mayor a 7.5. Ej.: nitritadores, Micrococcus ureae, Bacillus pasteurii, Sarcina urea. Preparacin de los medios de cultivo En general los requerimientos de nutrientes de los organismos son los mismos, la principal diferencia entre ellos radica en que algunos microorganismos requieren determinados nutrientes en forma especfica. Se han proporcionado diferentes recetas de medios de cultivo en las que se presta atencin a los aspectos de la nutricin del organismo que se cultiva. Los medios de cultivo se pueden preparar adicionando cantidades precisas de sustancias inorgnicas y/u orgnicas puras al agua destilada siguiendo un protocolo de preparacin. Sin embargo muchos laboratorios comerciales dedicados al abastecimiento preparan medios de cultivo deshidratados que pueden reconstituirse al aadir H2O destilada (medios preformulados). Cuando se prepara un medio de cultivo es necesario tener en cuenta algunos aspectos tales como los que se mencionan a continuacin. . Ajuste de pH Cuando se construye un medio de cultivo, se debe llevar el pH al ptimo para el desarrollo del microorganismo que nos interesa.
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Para ello el pH se corrige adicionando soluciones cidas o bsicas de acuerdo al punto al que deseemos llegar. Los medios de cultivo preformulados generalmente tienen un pH ajustado. . Solidificantes usados Los medios de cultivo se pueden preparar para ser usados en estado lquido o en estado de gel (semi-slidos). Un medio de cultivo lquido es convertido en estado semislido si se le aade un agente gelificante. Los medios de cultivo que contienen agentes gelificantes se pueden utilizar en placas de petri, donde las clulas microbianas pueden crecer y formar masas visibles llamadas colonias. Agar: es un poligalactsido extrado de algas marinas, fluidifica a 85C. No modifica sensiblemente el pH de los medios y no es atacado por la mayora de los microorganismos. Gelatina: es una sustancia proteica extrada de los huesos de pescado. Fluidifica a 28C y solidifica a 20C. Es atacada por microorganismos proteolticos. Su poder gelificante puede disminuir con pH inferior a 5.0 o cuando se calienta a mas de 100 C. Se emplea al 10 o 15 %. Silicogel: es un gel acuoso del cido silcico. Como est exento de materia orgnica se utiliza para hacer medios estrictamente selectivos. Es muy empleado en microbiologa del suelo. . Distribucin en tubos Tubos en estra o pico de flauta: llevan de 7 a 8 ml de medio solidificable. Luego de ser esterilizados se los deja enfriar inclinados. Uso: para mantenimiento de cepas. Tubos en puncin: llevan de 10 a 15 ml de medio solidificable. Se dejan enfriar en forma vertical. Uso: para preparar cajas de petri, siembra en profundidad para microorganismos anaerobios facultativos.

. Esterilizacin de los medio de cultivo Antes de utilizar un medio de cultivo deben excluirse los organismos no deseados o contaminantes. Por consiguiente se debe esterilizar el medio de cultivo enseguida de su preparacin. La forma ms comn es por calor utilizando el autoclave tal como se vio en el Trabajo Prctico N 2. Bibliografa BROCK, T. & M. MADIGAN. Microbiologa. 6ta Edicin. Prentice Hall Hispanoamrica S. A. Mxico. 1993 STANIER, R. et al. Microbiologa. Traduccin de la 5ta Edicin. Revert,. Espaa. 1986.
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TRABAJO PRCTICO N 3 PREPARACIN Y DISTRIBUCIN DE MEDIOS DE CULTIVO LQUIDOS Y AGARIZADOS Objetivos Comprender el rol de los medios de cultivo en el estudio de microorganismos. Identificar y reconocer las funciones de los constituyentes de los medios de cultivo. Adquirir habilidad en la preparacin de medios de cultivo. Actividades El desarrollo del presente trabajo prctico estar basado en la preparacin de algunos de los medios de cultivo utilizados durante el cursado de la asignatura. 1. Preparacin de medios de cultivo preformulados a. Leer las instrucciones del marbete b. Calcular la cantidad de preformulado necesaria para la cantidad de medio de cultivo indicada c. Pesar la cantidad de medio de acuerdo al volumen a preparar d. Colocar en un recipiente de tamao mayor al volumen a preparar e. Controlar el pH segn indicacin del marbete f. Si es preciso repartir en recipientes ms pequeos ser necesario disolver el agar en bao mara o microondas para lograr una distribucin uniforme del solidificante. 2. Construccin de medios de cultivo a. Leer el protocolo de preparacin del medio de cultivo. (Ver Anexo) b. Calcular la cantidad de cada uno de los constituyentes necesaria para la cantidad de medio de cultivo indicada. c. Pesar los constituyentes de acuerdo al volumen a preparar. d. Colocar en un recipiente de tamao mayor al volumen a preparar. e. Agregar un volumen de agua menor al calculado. No agregar el agar agar. f. Mover suavemente el recipiente para que se disuelvan las sustancias. La solucin deber ser clara. g. Llevar a volumen. h. Medir el pH y ajustar si es necesario utilizando HCl o OHNa i. Agregar el agar agar. El agar se disolver calentando a bao de Mara o en microondas. j. Si es preciso repartir en recipientes ms pequeos ser necesario disolver el agar para lograr una distribucin uniforme del solidificante. 3. Distribuir segn las especificaciones del docente. 4. Acondicionar los recipientes para su esterilizacin, utilizando tapones y envolturas apropiadas. 5. Analizar la constitucin de los medios de cultivo. Evaluar las caractersticas de cada uno de los medios de cultivo empleados en Microbiologa Agrcola y en asignaturas afines.

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TERICO PRCTICO UNIDAD N 9: CULTIVO DE MICROORGANISMOS. MTODOS DE SIEMBRA Introduccin La siembra o inoculacin constituye una actividad de rutina en la prctica microbiolgica, y consiste en introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. En este medio se deben encontrar los elementos necesarios para que los microorganismos lleven adelante sus actividades metablicas y respiratorias, en condiciones adecuadas de temperatura y concentracin de O2 o CO2. Ello se logra artificialmente utilizando los medios de cultivo, los que una vez sembrados se llevan a estufa para mantenerlos a la temperatura que permite el desarrollo y la multiplicacin de los microorganismos. Segn los objetivos que se persigan, es posible diferenciar dos tipos de siembras: Mtodos de siembra destinados al recuento de microorganismos cuando es necesario conocer la carga microbiana de un medio (leche, suspensin de suelo, cultivo lquido de microorganismos) Mtodo de siembra destinado a aislamiento cuando es necesario separar un microorganismo a partir de una poblacin que puede contener varios tipos. Mtodos de siembra destinados al recuento de microorganismos Las siembras para recuentos son aplicadas en la medicin del crecimiento de los microorganismos, entre otros fines. Si bien la medicin del crecimiento se puede hacer por varios mtodos, en el presente prctico se har especial hincapi en las determinaciones cuantitativas basadas en el recuento microbiano. En estos casos el contenido microbiano de un medio (leche, agua, suelo, alimentos, etc.) es de varios millones por gramo o mililitro de inculo, y los recuentos en placa permiten la determinacin de los microorganismos presentes en una muestra sobre la base de que se desarrollen en un medio de cultivo apropiado, en placa, formando colonias. Es decir, que en medio slido cada viable dar origen a una colonia, de manera que se determinan por este mtodo slo las clulas microbianas viables en las condiciones de trabajo (nutrientes, temperatura, atmsfera). El mtodo involucra, como primer paso, la dispersin de la muestra a contar, usando diluciones decimales de la muestra, tal como se muestra en la figura 5 , con el objetivo de obtener concentraciones apropiadas de clulas bacterianas en las placas, evitando obtener tanto placas repletas de colonias, como placas sin ninguna colonia, ya que ambos casos seran intiles para el proceso de conteo.

Muestra para recuento

O,1 gr o ml de la muestra por ml de dilucin

Figura 5. Procedimientos para recuento de viables utilizando diluciones seriadas de la muestra.

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Para hacer una dilucin decimal (10-1), se mezcla 1 ml de la muestra con 9 ml del diluyente, o 0,5ml de la muestra con 4,5 ml de diluyente. Si se necesita una dilucin centsima (10-2) se realiza una dilucin decimal siguiente a la 10-1. En la mayora de los casos se necesitan estas diluciones seriadas para lograr la dilucin final deseada. Durante la ejecucin es importante que se utilice una pipeta diferente para cada dilucin, an cuando sea de la misma muestra. Esto se debe a que la muestra inicial, que contiene la mayor cantidad de organismos, no expuls a todos los organismos de la pipeta al expulsar el contenido de sta. Los organismos que se adhieren a las paredes de la pipeta pueden ser arrastrados fuera en diluciones posteriores y ocasionar un serio error en la cuenta final. En el recuento en placa como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino unidades formadoras de colonias (u.f.c.), y a los efectos de que todas las clulas que queden en una placa tenga una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del mtodo sean menores, se establece que las condiciones ptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa, como lo muestra la figura 6.

Figura 6. Seleccin de placas para recuentos de unidades formadoras de colonias.

Hay dos formas de hacer la siembra de microorganismo para realizar un recuento en placa: el mtodo de siembra en placa por extensin y el mtodo de siembra incorporado (figura 7). En el mtodo de siembra en placa por extensin se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo 0,1 ml de cada dilucin. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas, usando un rastrillo estril. Es importante que la superficie de la placa est seca de modo que el lquido que se extienda se embeba. En el mtodo de siembra incorporada o por inclusin se procede a depositar 1 ml de cada dilucin en placas estriles, vacas y por duplicado. Posteriormente se agrega a cada placa 15 a 20 ml de medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45 C en bao de mara. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular. As, la muestra se mezcla con el medio de agar.
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Figura 7. Mtodos para realizar el recuento en placa: a) en placa extendida; b) siembra por inclusin.

En cualquiera de los casos luego de la siembra es necesario llevar las placas a estufa para permitir el crecimiento de los microorganismos. Luego del tiempo de incubacin en estufa se retiran las placas y se cuentan las colonias desarrollas por placa. Para calcular en nmero de microorganismos presentes en la muestra inicial es necesario hacer un promedio de las repeticiones de la dilucin sembrada y se corrige el valor obtenido por un factor que contempla la dilucin en la que se hace el recuento y el volumen sembrado. Mtodo de siembra para aislamiento En el hbitat natural, raramente se encuentra a los microorganismos en forma pura (un solo tipo de microorganismo), y el tamao de las clulas es tan pequeo como para permitir que se las tome individualmente. Ello obliga a disponer de un procedimiento que permita separar los diferentes tipos de microorganismos de una poblacin mixta. El tipo de siembra que se aplica con este fin se denomina siembra para aislamiento por estra. En estos casos las clulas son separadas por agotamiento, al realizar estras sobre la superficie del agar. El inculo inicial tiende a diluirse progresivamente con cada sucesiva estra. Luego se incuban las placas en estufa para su desarrollo. Transcurrido el perodo de incubacin se observa que las estras iniciales proporcionan un crecimiento confluente, y a lo largo de las ltimas estras se van desarrollando colonias bien aisladas. Si se desea mantener el microorganismo aislado y su descendencia se hace un segundo tipo de siembra denominado repique, con el objetivo de conservar el microorganismo a travs del tiempo. Este cultivo constituido por una sola clase de microorganismo se denomina cultivo puro, a partir del cual se pueden hacer diferentes estudios tales como pruebas bioqumicas, morfologa, coloracin, anlisis genticos, identificacin taxonmica, etc. (figura 8).

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Figura 8. Mtodo de siembra por estra para obtener cultivo puro: a) se toma del tubo con ansa el inculo a sembrar; b) se hacen estras en una placa estril de agar; c) apariencia de la placa estriada despus de la incubacin.

Bibliografa BROCK, T. & M. MADIGAN. Microbiologa. 6ta Edicin. Prentice Hall Hispanoamrica S. A. Mxico. 1993

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TRABAJO PRCTICO N 4 SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO SLIDOS Objetivos Diferenciar los tipos de siembra y su aplicacin prctica. Desarrollar habilidades en la realizacin de las tcnicas de siembra utilizadas en Microbiologa. Actividades Se dispondr de una muestra a partir de la cual se realizarn los diferentes mtodos de siembra, teniendo en cuenta de realizar como paso previo la preparacin de las diluciones. a. Preparacin de las diluciones 1. Acondicionar la zona de trabajo esterilizando la mesada y prendiendo el mechero. 2. Preparar a partir de la muestra las diluciones seriadas partiendo de la muestra para la primer dilucin. Realizar las diluciones sucesivas tomando 0,5 ml de muestra y trasvasarlo a 4,5 ml de diluyente. 1. Luego de preparada la dilucin descartar inmediatamente la pipeta. 2. Cada vez que se prepare la dilucin agitar con agitador vrtex. 3. Una vez preparada las diluciones sembrar dentro de los 15 minutos. b. Siembra en placa extendida para conteo de microorganismos 1. Antes de preceder a la siembra rotular la base de las placas con los datos de la comisin. 2. Depositar 0.1ml de la dilucin sobre la superficie de la placa que ya contiene el medio de cultivo. Se realizan duplicados para cada dilucin. 3. Se comienza a sembrar por la mayor dilucin y se emplea la misma pipeta para todas las diluciones 4. Extender el contenido depositado sobre toda la superficie de la placa con la ayuda de un rastrillo de vidrio o esptula de Drigalsky, en el mismo orden que la siembra. 5. Llevar a estufa por 48 hs., invirtiendo las placas. 6. Luego de la incubacin elegir una dilucin en la cual contar y afectar el resultado por la dilucin correspondiente y el volumen sembrado. Nmero de colonias Muestra Dilucin seleccionada Volumen sembrado

Promedio

ufc por ml/g

c. Siembras para el aislamiento de microorganismos 1. Cargar el ansa en anillo con el inculo de la muestra. 2. Hacer estras paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa. 3. Esterilizar el ansa. 4. Con el ansa fra se gira la placa 90 y se vuelve a estriar tocando 3 a 4 veces el rea sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. 5. Se repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa. 6. Llevar a estufa y luego de incubar las placas observar el desarrollo microbiano.

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TRABAJO PRCTICO N 5 ANLISIS MICROBIOLGICO DE SUELOS Objetivos Comprender la importancia de los microorganismos del suelo y analizar el efecto de los factores ecolgicos sobre el desarrollo de los mismos. Conocer algunos de los diversos enfoques que se pueden plantear para el estudio de los microorganismos del suelo. Desarrollar habilidades en las tcnicas relacionadas a microbiologa del suelo. Introduccin El anlisis microbiolgico del suelo plantea problemas muy particulares, que derivan del hecho de que la poblacin microbiana coloniza un medio ambiente extremadamente heterogneo, que vara en sus condiciones fsicas y qumicas de un punto a otro. El anlisis microbiolgico tradicional, que estudia las especies en cultivo puro en laboratorio informa sobre la morfologa y propiedades fisiolgicas, pero debe ser completado con estudios ecolgicos que son los que nos informan sobre la actividad real de una poblacin en su ambiente natural, la que resulta de interacciones con otras comunidades y con su medio ambiente. El conjunto de condiciones ambientales va a determinar la naturaleza cuali y cuantitativa de la poblacin microbiana, la que a su vez interactuar y modificar el medio en el que se desarrolla. Toma de muestras Las muestras a tomar deben estar compuestas por 10 submuestras como mnimo. Esto es importante debido a la distribucin heterognea de los microorganismos en el suelo. Los instrumentos empleados normalmente son: palas, barrenos, muestreadores, etc. Tratamiento de Muestras Preincubacin de las muestras Si no es posible trabajar con muestras frescas (inmediatamente tradas del campo) stas pueden ser conservadas hasta su procesamiento. Las condiciones de almacenaje o conservacin son decisivas al evaluar la poblacin microbiana ya que se genera un nuevo ambiente al cambiar las condiciones de temperatura, humedad, etc. que afectarn la actividad de los mismos. Los mtodos ms comunes de conservacin y almacenamiento son: secado al aire, conservacin en fro (heladera) congelacin (freezer). Las muestras que han sido conservadas por alguno de los mtodos citados requieren un pretratamiento para restablecer la poblacin de microorganismos. Este tratamiento que se denomina pre incubacin consiste en la incubacin de las muestras por 5-10 das a temperatura de 25 C y humedad ptima de 65 % de la capacidad de campo antes de realizar el anlisis microbiolgico. En este trabajo prctico no se realizar la pre incubacin de las muestras sino que se trabajar con las muestras de suelo frescas. Ejecucin del anlisis microbiolgico de suelo A cada grupo de trabajo se le asignar una muestra de suelo proveniente de una situacin agronmica. Sobre las muestras de suelo se evaluar: 1. Poblacin global de microorganismos a travs de: Actividad respiratoria: con esta tcnica se evala el CO2 desprendido absorbido en un lcali y se lo cuantifica por retrotitulacin.

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2. Grupos funcionales: a. Grupo funcional relacionado al Ciclo del Carbono: Celulolticos (C). Este grupo funcional lleva a cabo la descomposicin de la celulosa y comprende una variedad de microorganismos como: bacterias aerbicas y anaerbicas, actinomicetes y numerosos hongos. b. Grupo funcional relacionado al Ciclo del Nitrgeno: Nitritadores (N). La mineralizacin del N consiste en dos procesos: la amonificacin de compuestos orgnicos y la nitrificacin que consiste en la oxidacin del amonio hasta nitrito y nitrato. En este trabajo prctico se evaluar el grupo funcional nitritadores. Los dos grupos mencionados sern evaluados a travs de la tcnica del Nmero Ms Probable (NMP). Los resultados obtenidos para cada una de las situaciones agronmicas asignadas a los grupos de alumnos se analizarn en relacin a las caractersticas fsico qumicas de los suelos. Anlisis de Trabajos Cientficos Cada grupo deber leer, analizar y exponer un trabajo cientfico de la temtica asignado por el docente. Presentacin de informe Se deber presentar y aprobar un informe escrito con los resultados obtenidos que seguir el formato de un trabajo Cientfico (Ver instrucciones en anexo). Bibliografa ALEF, K. & NANNIPIERI, P. Methods in applied soil microbiology and biochemistry. Academic Press. Great Britain. 1995. ALEXANDER, M. Introduccin a la Microbiologa del Suelo. AGT Editor. Mxico. 1980. BLACK, C. EVANS, D. WHITE, J. Methods of soil analysis Part II. Chemical and Microbiological properties. ASA. USA. 1965. FRIONI, L. Ecologa microbiana del Suelo. Universidad de la Repblica. Montevideo. 1990. FRIONI, L. Procesos microbianos. Tomos I y II. Editorial Universidad Nacional de Ro Cuarto. 1999. JENKINSON, D. & POWLSON, D. The effects of biocidal treatments on metabolism in soil. A method for measuring soil biomass. Soil Biol. Biochem. Vol. 8 pp 209 to 213. Pergamon Press. 1976. PAUL, E. & CLARK, F. Soil Microbiology and biochemistry. Academic Press. 1989. TATE, R. Soil Microbiology. Wiley & Sons. USA. 1995.

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Tcnicas a emplear Para realizar el anlisis microbiolgico de suelo las muestras se conservarn en heladera, una vez tradas del campo. No se realizar la preincubacin. 1- Poblacin global de microorganismos Actividad respiratoria a) Incubacin 1. Pesar 50 gr. de suelo y colocarlo en recipientes con cierre hermtico. Hacer 4 repeticiones. 2. Colocar en cada uno de los recipientes un vasito de precipitado con 25 ml. de OHNa 0,2 N. 3. Preparar un recipiente que se denominar blanco y que llevar todos los de reactivos pero sin suelo. 4. Incubar en estufa por 7 das a 25 C. b) Evaluacin del CO2 desprendido luego de la incubacin 1. Se trasvasa el OHNa a un erlenmeyer de 125 ml. 2. Agregar 4 ml. de Cl2Ba. al 20 % y 2 a3 gotas de timolftalena. 3. Titular con H2SO4 0,1 N hasta llegar al punto final. c) Clculos mg C-CO2 en la muestra = 25 ml(b) - x ml a * N a * 1,2 Nb a = cido; b = base 1. Promediar las cuatro repeticiones de mg C-CO2 de las muestra de suelo. 2. Calcular la cantidad de mg C-CO2 contenida en el blanco. 3. Restar al promedio de la muestra la cantidad encontrada en el blanco. 4. Llevar los resultados a 100 gr. de suelo seco.

H2O

NaOH

MUESTRA SUELO

BLANCO H2O NaOH

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2- Grupos funcionales Aislamiento y recuento de Celulolticos aerobios por la tcnica del NMP a) Analizar la funcin fisiolgica de los componentes del medio de cultivo. Medio de cultivo K2HPO4 1gr - Controlar pH = 7,5. NaNO3 0,5 gr - Distribuir 9 ml por tubo. MgSO4. 7H2O 0,5 gr - Papel de filtro (tiras de 1 x 9 cm KCl 0,5 gr en cada tubo). FeSO4. 7H2O 0,01 gr H2O destilada 1000 cc b) Realizar la preparacin de diluciones de suelo (Ver TP N 4) para la siembra. 1. Pesar 10 gr. de suelo. 2. Colocar en erlenmeyer con 95 ml de agua estril. 3. Agitar 10 min. 4. Dentro de los 10 min siguientes agitar a mano vigorosamente por unos segundos. 5. En ambiente estril transferir 1 ml del centro de la solucin a 9 ml de solucin fisiolgica. As se obtiene la dilucin 10-2. 6. Homogenizar 7. Diluir hasta la dilucin 10-5. Siembra Se trabajar en ambiente estril 1. Sembrar 1 ml en medio para celulolticos. 2. Sembrar 3 tubos por dilucin para las diluciones 10-2 a 10-6 incluidos. 3. Incubar en estufa los tubos a 28 C por 21 das. Recuento de Celulolticos por el mtodo del NMP 1. Despus del perodo de incubacin observar si en los tubos hay desintegracin de papel, cambio de color, etc. en cuyo caso el tubo se considerar positivo. 2. Contar el nmero de tubos por cada dilucin en la que existe crecimiento. Determinacin del N caracterstico y clculo del NMP de Celulolticos por el mtodo de Mac Grady La lectura de los resultados consiste en contar por cada dilucin el nmero de tubos positivos. Por ej.: Diluciones 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 N de tubos (+) 3 1 0 0 0 El nmero caracterstico se lee as: 1. La ltima dilucin donde todos los tubos o la mayora son positivos es la primera cifra del nmero caracterstico. Las dos siguientes son aquellas del nmero de tubos positivos para cada una de las diluciones siguientes. Ej. : 310 para la dilucin 10-1. 2. Se busca en la tabla del NMP de Mac Grady (ver Anexo) el nmero ms probable de grmenes contenidos en el volumen sembrado de la dilucin correspondiente a la primera cifra caracterstica. Para el ej. : 310 corresponden a 4,5 grmenes / ml de la dilucin 10-1. 3. Llevar el nmero de grmenes por gramo de suelo seco. En la figura 9 se muestra un esquema de un recuento de viables en medio lquido por la tcnica del Numero Mas Probable.

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Figura 9. Esquema de un recuento de microorganismos en un medio lquido por la tcnica del Nmero Ms probable

Aislamiento y recuento de Nitritadores por la tcnica del NMP a) Analizar la funcin fisiolgica de los componentes del medio de cultivo. Medio de cultivo H2O destilada 1000 cc SO4 ( NH4 )2 0,5 gr K2HPO4 1,0 gr NaCl 0,3 gr Mg. SO4 7 H2O 0,3 gr Fe SO4 7 H2O 0,03 gr CaCO3 7,5 gr -Distribuir 3 ml por tubo Siembra Se trabajar en ambiente estril. 1. Sembrar 0,5 ml. en medio para Nitritadores. 2. Sembrar 3 tubos por dilucin desde 10-1 a 10-5 incluido. 3. Incubar en estufa a 28 C por 21 das. Recuento de Nitritadores por el mtodo del NMP Despus del perodo de incubacin visualizar la presencia de Nitritadores agregando a cada tubo unas gotas de Reactivo de Griess, el cual indica la presencia de NO2-. As: color rojo (+) NO2 Existen Nitritadores Determinacin del N caracterstico y clculo del NMP de Nitritadores por el mtodo de Mac Grady La lectura y la expresin de los resultados es similar a la de Celulolticos.

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TERICO PRCTICO UNIDAD N 16: FIJACIN BIOLGICA SIMBITICA DE NITRGENO Introduccin La Fijacin Biolgica del Nitrgeno (FBN) es realizada por un grupo de procariontes que poseen la enzima nitrogenasa que reduce el N2 a NH4+. Las bacterias simbiticas de mayor importancia agronmica que poseen esta propiedad son aquellas pertenecientes a los gneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium y Azorhizobium. Las cepas de estas bacterias pueden no estar en cantidad suficiente en un suelo o no ser eficientes en la FBN para satisfacer la demanda del cultivo de leguminosa con el que se asocian simbiticamente, por lo que la inoculacin es la prctica de campo por la cual los microorganismos son incorporados a las semillas de especies de leguminosas (soja, alfalfa, lotus, etc.). No todos los organismos de estos gneros nodulan a todas las leguminosas por lo que se hace necesario inocular con los microorganismos especficos para cada grupo de leguminosas.

Gnero Rhizobium

Especie leguminosarum biovar trifoli leguminosarum biovar viceae leguminosarum biovar phasseoli etli tropici loti

Husped Trifolium Pisum, Vicia Phaseolus vulgaris Phaseolus vulgaris Phaseolus vulgaris, Leucaena Lotus tenuis Lotus corniculatum Cicer arietinum Cicer arietinum Glycine max Glycine max Vignia, Arachis, Lupinus, Lotus, etc. Glycine max Medicago, Melilotus, Trigonella Sesbania rostrata

ciceri mediterraneum Bradyrhizobium elkani japonicum spp (Vigna), (Lopinus), etc Shinorhizobium fredii meliloti Azorhizobium caulinodans

Los inoculantes son fertilizantes biolgicos de origen industrial que contienen bacterias seleccionadas por infectividad, efectividad, etc. vehiculizadas por un portador denominado carrier. El carrier o soporte puede ser lquido slido. Dado que se trata de un producto industrial existen requerimientos de identificacin en el marbete que estn estipulados en la legislacin argentina por la Resolucin 310/94 de la SAGyP (en Material complementario CD). En la prctica existen diversas formas de realizar la inoculacin de las semillas, cada una de las cuales presenta ventajas y desventajas. Producida la germinacin de las semillas inoculadas, las bacterias colonizan y penetran los pelos radiculares formando los ndulos en los que se producen la fijacin de nitrgeno gaseoso. Los rizobios sufren cambios morfolgicos, fisiolgicos y bioqumicos en los ndulos en las zonas de activa fijacin transformndose en bacteroides, mientras que las bacterias se encuentran en la zona meristemtica del ndulo y en activa divisin celular. Los bacteroides se presentan en grupos aislados, encerrados en envolturas membranosas originadas por la planta (siombiosomas). No se dividen y aparecen con las formas caractersticas de X, Y de clava como se muestra en la figura 10.

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Figura 10. Bacteroides

Evaluacin a campo de la nodulacin en plantas inoculadas Una vez implantado el cultivo se puede evaluar el estado de la nodulacin de las plantas realizando controles peridicos del sistema radicular. Esta prctica es muy importante por cuanto permite ver cmo va el cultivo en cuanto al establecimiento de los ndulos que se forman a partir de las bacterias introducidas por el inoculante, e inferir las consecuencias sobre la nutricin nitrogenada. La primera evaluacin de nodulacin puede realizarse aproximadamente a los 14 das de germinadas las plantas realizando el conteo de ndulos. En sucesivos muestreos se pueden evaluarar los parmetros: abundancia, tamao, ubicacin y coloracin al corte. La mxima expresin de la nodulacin se observa en floracin (R6 en soja). En cuanto al tamao los ndulos efectivos son generalmente grandes. En la abundancia se registra el nmero de ndulos y existen escalas para las distintas especies de leguminosas. Un parmetro que surge de la relacin entre estos dos es la densidad nodular que es el cociente entre el masa total de los ndulos y el nmero total de ellos. La distribucin de los ndulos entre la raz primaria y las races secundarias es un parmetro importante que nos indicara de qu tipo de cepas provienen dichos ndulos. Los ndulos que se encuentran en las races secundarias e incluso en los extremos, se supone que provienen de cepas nativas del suelo los que se encuentran en raz principal o cercanos a ella se suponen provienen del inoculante. En cuanto a la coloracin al corte los ndulos efectivos son grandes y tienen un color rosado intenso en el interior. Si los ndulos se presentan blancos no estn fijando N, los ndulos verdes son los que se encuentran al principio de la nodulacin. En ciertas leguminosas se puede observar ndulos que presentan simultneamente regiones blancas, rojas y negras. Las blancas corresponden a reas de crecimiento nodular y no existe fijacin y las reas negras a zonas de senescencia. Bibliografa FRIONI, L. Ecologa microbiana del suelo. Universidad de la Repblica. Montevideo. 1990 POSGATE, J. Nitrogen fixation. Edward Arnold. 1978 VINCENT, J. Manual prctico de rhizobiologa. Hemisferio Sur. Bs. As. 1975 CIAT. Simbiosis leguminosa - rizobio. Manual de mtodos de evaluacin, seleccin y manejo agronmico. Colombia.1998

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Trabajo Prctico N 6 FIJACIN BIOLGICA DE NITRGENO Objetivos Conocer las prcticas de inoculacin de semillas de leguminosas. Aplicar la tcnica de evaluacin de la nodulacin en plantas de leguminosas. Observar bacterias fijadoras de nitrgeno a partir de ndulos de leguminosas. Actividades a) Inoculacin a.1.Leer las indicaciones del marbete de la bolsa del inoculante. Realizar la inoculacin de semillas segn las indicaciones del marbete. a.2. Analizar la Resolucin 310/94. b) Evaluacin visual de plantas noduladas b.1. De las muestras de plantas disponibles, lavar las races eliminando la tierra y cuidando que no haya desprendimiento de ndulos. b.2. Evaluar visualmente la nodulacin segn los parmetros y la respectiva escala que se presenta en el siguiente cuadro. ABUNDANCIA Nula 0 Escasa 1 - 10 Regular 11 - 20 Buena 21 - 40 Muy Buena + 40 TAMAO Chicos Medianos Grandes UBICACIN Raz principal Raz secundaria COLOR AL CORTE Blancos Verdes Rosados

b.3.Concluir sobre el tipo de nodulacin evaluada. c) Observacin de bacteroides c.1. Observar al microscopio con objetivo de inmersin los bacteroides a partir de los frotis que suministra la Ctedra. c.2. Caracterizar los mismos.

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TERICO - PRCTICO UNIDAD N 18: MICROBIOLOGA DE LA LECHE Introduccin La calidad de la leche tiene incidencia directa en la salud, en los procesos tecnolgicos de transformacin, como as tambin en su conservacin, siendo adems una de las pautas de pago de este producto a los tamberos. El concepto de calidad de leche abarca dos aspectos: la calidad fsico-qumica y la calidad higinico-sanitaria. La primera est relacionada con la calidad y cantidad de los componentes qumicos, como son grasa butirosa, protenas, lactosa, etc. La segunda tiene que ver con el grado de contaminacin de las bacterias u otros elementos extraos. Hacen a la misma: a) el excesivo nmero banales o la contaminacin por grmenes patgenos. b) la presencia de sustancias qumicas extraas como residuos de plaguicidas, desinfectantes, detergentes, antibiticos, etc. c) el contenido de clulas somticas superiores a los normales, indicador del estado de sanidad de la ubre. Respecto al primer punto, que es el que trataremos en el curso, existen numerosos y diversos mtodo que permiten apreciar la calidad bacteriolgica de la leche. Estos se pueden clasificar en mtodos directos e indirectos. Los mtodos directos son precisos y significativos ya que permiten la enumeracin de los grmenes, pero tambin son ms largos y delicados, exigiendo que se realicen en laboratorios bien equipados. Entre estos mtodos podemos citar el recuento de bacterias mesfilas aerobias y grupos microbianos de importancia desde el punto de vista higinico y tcnico, como: coliformes, termorresistentes, esporulados, psicrfilos, bacterias lcticas, etc. El recuento de bacterias mesfilas aerobias permite estimar la poblacin microbiana total, lo que indica el nivel de medidas higinicas adoptadas durante la produccin y el cuidado puesto en el manejo del producto. Para hacer el recuento se siembran diluciones, ya que el nmero de microorganismos por ml de leche suele ser alto, utilizndose como medio de cultivo Plate Count Agar (PCA). Este es un medio rico en factores de crecimiento para el desarrollo de bacterias lcticas. El trmino bacterias coliformes se utiliza para designar las enterobacteriacias. Este grupo de bacterias son huspedes normales del intestino de los mamferos, y su presencia en la leche o el agua puede atribuirse a una contaminacin fecal. Tienen importancia desde el punto de vista higinico, porque varias de las especies son responsables de enfermedades infecciosas, y desde el punto de vista tecnolgico por la propiedad bioqumica de algunas de ellas de fermentar azcares con formacin de gas y cidos. Los gneros de mayor significancia son Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella, etc. El recuento de las mismas (colimetra) es uno de los medios ms significativos para la apreciacin de la calidad higinica de la leche y de la eficiencia del saneamiento a la que se la somete. Para su conteo se utilizan medios selectivos azucarados, como el Agar Bilis Rojo Violeta (ABRV), que contienen sales biliares, que inhiben la mayor parte de otros grupos bacterianos. Las bacterias esporuladas tienen importancia tecnolgica en lo se refiere a la conservacin del producto alimenticio, debido ha que las esporas en condiciones apropiadas pueden dar lugar a la generacin de bacterias contraproducentes al mantenimiento de la calidad del producto. A temperaturas relativamente bajas, entre 5 y 15 C, predomina la flora psicotrofa constituida principalmente por bacterias Gram (-) muy diversas, entre las cuales se encuentran proteolticos y lipolticos, que pueden alterar las propiedades de la leche pasteurizada y conservada a temperatura de refrigerador.

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Las bacterias termodricas corresponden a aquellos microorganismos que sobreviven a la pasteurizacin, teniendo por lo tanto una incidencia directa sobre los productos manufacturados. El recuento se debe realizar luego de la pasteurizacin en cajas de Petri. conteniendo PCA. La presencia de bacterias lcticas no es un ndice de mala calidad, ya que son agentes indispensables de la transformacin de la leche en diversos productos lcteos. En la tabla N 1 se muestran algunos valores indicativos de la calidad higinico sanitaria de la leche. Entre los mtodos indirectos se han ensayado pruebas simples y rpidas cuyo valor es relativo. Se pueden citar las pruebas basadas en la reduccin de indicadores que se fundamentan en que el tiempo de decoloracin de un indicador de la oxidorreduccin. Esta prueba da una medida del grado de contaminacin de la leche, ya que existe una relacin entre la importancia del desarrollo microbiano y el descenso del potencial redox. Esta relacin no considera el nmero de grmenes, sino su actividad reductora. Un ejemplo de ella es la prueba de la reductasa, que se basa en medir el tiempo que tarda en reducirse el indicador azul de metileno (azul en estado oxidado e incoloro al estado reducido). Cuanto mayor es la actividad de los microorganismos, ms rpida es la reduccin del indicador. Otro tipo de pruebas son aquellas basadas en el desarrollo de la flora acidificante. Se puede citar la prueba del alcohol. Consiste en mezclar partes iguales de alcohol (70%) y leche, y observar si existe floculacin (resultado positivo), por la formacin de grumos en las paredes del tubo de ensayo. La correspondencia de esta prueba con la estabilidad coloidal est basada en que la acidez natural de la leche (13 - 14 D) aumenta por accin microbiana llegando hasta valores de 40 - 45 D, producindose la desestabilizacin del complejo casenico por aumento de la acidez a temperatura ambiente o por accin de otro agente desestabilizante como el alcohol. Que un tambo produzca leche de buena calidad higinica no supone, que produzca leche sin microorganismos. Sino que la carga bacteriana inicial sea mnima, pues de lo contrario, ni el enfriamiento, ni la posterior pasteurizacin van a lograr mejorar este aspecto de la calidad. La pasteurizacin es el mtodo de saneamiento que se le efecta a la leche en la industria. Se trata de un tratamiento en el que se combinan tiempo de exposicin y temperatura. Persigue una doble finalidad: la destruccin de grmenes patgenos para el hombre y la reduccin de la flora banal con el fin de mejorar la conservacin. En la grfica N 1 se puede observar los principios del mtodo. La recta del medio define las normas recomendables para conseguir una pasteurizacin eficaz. En estas condiciones el aspecto fsico no se modifica en lo que se refiere a la capa de crema (factor atractivo par el consumidor), adems existe un margen de seguridad suficiente para la destruccin del patgeno Mycobacterium tuberculosis. Este fue el germen patgeno que se tom como indicador para establecer los tiempos y temperaturas de exposicin.

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Pasteurizacin de leche
80 75

Temperatura (C)

Lnea de crema Muerte M. Tuberculosis Pasteurizacin

70 65 60 55 50 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2

Log del tiempo en minutos

Por lo tanto segn las normas fijas de la pasteurizacin se puede afirmar que se destruye los grmenes patgenos para el hombre. Estas normas corresponde a dos puntos sealados en el diagrama: * 62 C durante 30 minutos: pasteurizacin baja. * 72 C durante 15 segundos: pasteurizacin alta, que ha reemplazado en los ltimos tiempos a la primera. Luego de la pasteurizacin, la leche contiene an bacterias termorresistentes y esporas, pudiendo estas desarrollar, si las condiciones les son favorables, influyendo en la conservacin de la leche pasteurizada. La eficiencia del proceso de pasteurizacin es del 99%, es por ello la importancia de que la carga bacteriana inicial sea lo ms baja posible, siendo ms persistente el grado de contaminacin cuanto mayor es el nmero de microorganismos iniciales. Bibliografa ALAIS, CH. Ciencia de la leche. Comp. Editorial Continental. Mxico. 1980 GIRARD ROUGIEUX, J. Tcnicas de Microbiologa Agrcola. Ed. Acribia. Zaragoza. 1964

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Tabla N 1: Algunos valores indicativos de la calidad higinico - sanitaria de la leche

Control Recuento total Objeto Medicin del nmero de organismos en la leche. Gua sobre la higiene de la ordeadora y el tanque. Standard Menos de 500.000 bacterias por ml. Causas Higiene, limpieza y/o enfriamiento pobres. Leche vieja. Remedios Usar mtodos de higiene y limpieza recomendables. Adecuado control de la temperatura del tanque de enfriamiento. Formacin de piedra Usar mtodos de de leche, material de higiene y limpieza caucho en mal recomendables. estado, limpieza e Asegurar buena calidad higiene pobres. del agua. Reemplazar material de goma defectuoso. Contaminacin por Usar mtodos de estircol, higiene higiene y limpieza pobre, agua recomendables y agua contaminadas, de buena calidad. Lavar residuos de leche las ubres y evitar el en depsitos. contacto de las pezoneras con estircol. Insuficiente control Desinfeccin de las de las posibles pezoneras, tratamiento contaminaciones. de los animales, control Irritacin de la ubre. anual de la ordeadora. Eliminacin de animales si es necesario. No haber separado la Seguir los perodos de leche de vacas retencin tratadas. recomendados. Se penaliza con la suspencin de las entregas sin plazo determinado por la autoridad competente.

Termodricos

Menos de 10.000 bacterias por ml.

Coliformes

Como medida de Menos de 100 higiene del ordee. bacterias por ml.

Recuento de clulas somticas

Indica el nivel de mastitis en la leche.

Antibiticos Adulteraciones

Deteccin de antibiticos en la leche. Detectar el grado de materiales solubles, como leche en polvo o lactosa

Menos de: 2.105 excelente 3.105 muy buena 4.105 buena 6.105 aceptable 8.105 pobre mas- muy pobre No debe haber. No debe haber.

Orientacin Lctea - (43) - Diciembre 1994

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TRABAJO - PRCTICO N 7 ANLISIS MICROBIOLGICO DE LECHE Objetivos Conocer los anlisis ms comunes relacionados a la calidad bacteriolgica que se realizan sobre la leche cruda Apreciar el efecto de la pasteurizacin sobre la calidad bacteriolgica de la leche Desarrollar habilidad para llevar adelante marchas analticas Actividades Se trabajar con leche cruda de un tambo de la zona. Parte de la muestra se someter al proceso de pasteurizacin a. Pasteurizacin 1. Se coloca en un tubo de ensayo la leche a bao de Mara 2. Controlar que alcance 72 C manteniendo durante 15 segundos (pasteurizacin alta) b. Anlisis bacteriolgicos Se evaluar, tanto en leche cruda y pasteurizada, mesfilos aerobios totales y coliformes 1. Para realizar el recuento se preparan diluciones de la muestra usando solucin fisiolgica (medio isotnico) (ver Trabajo Prctico N 4) 2. Para realizar el recuento de mesfilos aerobios totales a. Sembrar en placa extendida 0.1ml de una dilucin conveniente empleando como medio de cultivo Plate Count Agar (PCA) b. Incubar a 30 C durante 48 hs 3. Para realizar el recuento de coliformes a. Sembrar 1ml de leche sin diluir en caja de petri y verter Agar Bilis Rojo Violeta (ABRV) fluidificado y mantenido a una temperatura de 40 a 45 C (siembra por inclusin) b. Homogeneizar el medio con la dilucin segn las normas dictadas en el prctico c. Dejar solidificar en posicin horizontal. Luego incubar a 30 C durante 48 hs c. Resultados 1. Hacer el recuento de las placas eligiendo aquellas cajas que tienen entre 30 y 300 colonias 2. Comparar los resultados obtenidos para leche cruda y leche pasteurizada completando el cuadro Muestra Leche Cruda Leche pasteurizada Anlisis bacteriolgico MAT Coniformes MAT Coliformes Nmero promedio de colonias Dilucin contada Volumen de ufc por ml de siembra leche

3. Calcular la eficiencia de pasteurizacin

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ANEXO Medio Rojo Congo Manita Manitol PO4K2H SO4Mg.7H2O ClNa Fe Cl3. 6 H2O Cl2Ca Extracto de levadura Rojo Congo (sol c. 1/400) H2O destilada Agar agar Llevar a pH= 7 10 gr (reemplazable por 12,5 g de glicerina (10,16 ml)) 0.5 gr 0.1 gr 0.2 gr 0.01 gr 0.15 gr 0.5 gr 10 ml 1000 ml 15 gr

Tabla de Mc Grady (3 tubos por dilucin) N Caracterstico 000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200 N de microbios 0.0 0.3 0.3 0.6 0.6 0.4 0.7 1.1 0.7 1.1 1.1 1.5 1.6 0.9 N Caracterstico 201 202 210 211 212 220 221 222 223 230 231 232 300 301 N de microbios 1.4 2.4 1.5 2.0 3.0 2.0 3.0 3.5 4.0 3.0 3.5 4.0 2.5 4.0 N Caracterstico 302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333 N de microbios 6.5 4.5 7.5 11.5 16.0 9.5 15.0 20.0 30.0 25.0 45.0 110.0 110.0 140.0

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Pautas generales para la presentacin de informe (Instructivo) Mediante esta gua se sugieren algunas pautas para facilitar la realizacin de los informes de trabajos prcticos. El informe debe ser impreso en hojas blancas, tamao A4. Con letra tamao 11 o 12 e interlineado simple o intermedio (1,5). Mrgenes (medidas aconsejadas): derecho 1,5; izquierdo; 2,5; superior 3; inferior 2,5 cm. El trabajo deber estar debidamente paginado y presentarse anillado, troquelado, o en carpetas plsticas. En la portada deber constar la siguiente informacin: - Institucin - Nombre de la asignatura - Ttulo del trabajo - Alumnos - Ao El resto del trabajo constar de las siguientes partes: Introduccin Metodologa Resultados ( Resultados y Discusin) Conclusiones ( Consideraciones Finales) Anexos Bibliografa Algunas cuestiones prcticas a tener en cuenta al momento de redactar el trabajo: Utilizar tipos de letras agradables a la vista del lector (Times New Roman, Arial, Tahoma, por ejemplo). Las letras muy recargadas cansan la vista del lector. No confiar en el corrector ortogrfico y de redaccin de la computadora ya que pasa por alto algunos errores. En la portada se pueden incluir fotos, dibujos u otros materiales que estn relacionados con el tema del trabajo. Orientaciones para la presentacin de la bibliografa1 La bibliografa utilizada para la realizacin del trabajo debe presentarse ordenada alfabticamente. En su presentancin debe constar la siguiente informacin bsica, en el orden presentado: Con letra mayscula: apellido del/os autor/es, inicial del nombre (cuando hay ms de dos autores se separan con punto y coma). Con letra minscula: ao de edicin (puede ir entre parntesis). Ttulo de la obra (en letra itlica cuando se trata de un libro). Editorial. Ciudad en que se edit. Nmero de la edicin. Volumen. Captulo. Pginas. Esta es la informacin bsica que debe presentarse cuando se elabora la seccin Bibliografa. Existen algunas diferencias de forma, en la presentacin, segn se trate de libros, artculos cientficos publicados en revistas especializadas, trabajos presentados en congresos, tesis, etc. Estos aspectos se tratan a continuacin con ejemplos.
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Se debe tener en cuenta que no existe una nica forma de presentar la bibliografa, por lo general cada institucin, editorial, revista, etc. adopta una forma o estilo de presentacin que debe ser respetada por los que autores que quieran publicar sus obras en ellas. 36

Ejemplos: Cuando se trata de un libro: el ttulo siempre se escribe con letra itlica. EVANS, L. T. 1983. Fisiologa de los Cultivos. Buenos Aires. Ed. Hemisferio Sur S.A. Cap. 6. Cuando el libro est editado en ingls: el ttulo se escribe en el mismo idioma (ingls) con letra itlica. MONGE, P. R. y CAPELLA, J. N. 1980. Multivariate techniques in human communication research. Nueva York. Academic Press. Cuando se trata de un trabajo presentado en un congreso: el ttulo no va en letra itlica y no se cita la ciudad en que se edit la revista, ni la editorial. Los autores se separan con punto y coma, cuando son ms de dos. ESCANDE, A. R.; PEDRAZA, M. V. ; RUFFINENGO, S. PALACIO, A. PEREYRA,V.R. y LAICH, F.S. 1997. Manejo de la podredumbre del captulo del girasol (Sclerotinia sclerotiorum) en el campo mediante Trichoderma spp. dispersado por abejas melferas. IX CONGRESO LATINOAMERICANO DE FITOPATOLOGA. Montevideo. Resmenes. p. 215 Artculos publicados en revistas, en castellano y en ingls: el ttulo del trabajo no va escrito en letra itlica y no se cita la ciudad en que se edit la revista, ni la editorial. MONTEALEGRE, J. R. y HENRQUEZ, J. L. 1990. Posibilidades de control integrado de Sclerotium rolfsii Sacc. mediante hongos del gnero Trichoderma y fungicidas. Rev. Fitopatologa. Nov. 25 (2):68-74. PAPAVIZAS, G. C. y LEWIS, A. 1989. Effect of Gliocladium and Trichoderma on damping-off and blight of snapbean caused by Sclerotium rolfsii in the greenhouse. Plant Pathology. 38: 277286. Artculos en los que no figura el autor: se coloca una lnea y a continuacin el ttulo del material y toda la informacin que se posea del mismo. . 2003. Publicacin peridica El Diario. Artculo informacin nacional, 1 seccin. Obtienen hormona humana de vacunos clonados. Paran. 3 de octubre de 2003. Bibliografa extrada de internet: Trabajo presentado en un congreso en Brasil extrado de la pgina de internet que figura en el final, entre parntesis. CIAN, D.; STERREN, M.; BENINTENDE, M. y BENINTENDE, S. 2000. Ajuste de la tasa de mineralizacin de las capas subsuperficiales por distribucin de microorganismos en profundidad. FERTIBIO 2000. 22 al 26 de octubre. Santa Mara. Brasil. (En: www.ufsm.br/fertibio2000) Cuando no aparece el nombre del autor ni ninguna otra informacin, se coloca solamente la pgina de internet. La informacin extrada en estos casos carece de todo sustento cientfico y por lo tanto no debe ser la que predomine en el trabajo de investigacin.

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