Ingegneria Genetica

Ma che cosa esattamente lIngegneria Genetica?

Al giorno doggi luomo deve affrontare molte sfide, tra le quali malattie molto pericolose, che minacciano lumanit. La scienza ogni giorno si impegna nel combatterle, ma i progressi fatti non sono abbastanza Circa 20 anni fa nacque un nuovo ramo della scienza,ovvero lingegneria genetica. Per ingegneria genetica si intende quel complesso di tecniche che permettono di isolare, trasferire, modificare, clonare, analizzare i geni del patrimonio genetico di un organismo o manipolare altri materiali biologici, come per esempio cellule, enzimi, acidi organici... Lingegneria genetica un grande passo avanti non solo perch ha aperto le porte a nuove cure e a nuove tecniche per comprendere meglio noi e ci che ci sta attorno, ma anche perch ha permesso di migliorare lefficacia di qualche cura e soprattutto di produrre nuove medicine. Inoltre molte medicine prodotte con qualche tecnica di ingegneria genetica possono essere prodotte in gran numero in poco

tempo.

La tecnologia del DNA ricombinante

La tecnologia del DNA ricombinante un insieme di tecniche che hanno lo scopo di combinare geni di cellule diverse in un unica molecola di DNA.

Il DNA ricombinante una tecnica utilissima per produrre molte proteine, indispensabili per molte cure, in poco tempo. Il suo procedimento relativamente semplice e prevede luso di speciali enzimi detti enzimi di restrizione. Questi enzimi sono particolari perch possono tagliare il DNA in specifiche sequenze di riconoscimento. In natura questi enzimi sono presenti nei batteri e sono usati per difendere il batterio dallingresso di DNA estraneo. Perci la parola restrizione sa ad indicare che si restringono le probabilit che un DNA estraneo possa sopravvivere. Il primo passo da fare isolare il DNA di una cellula contenente il gene interessato. Dopodich si isola un plasmide batterico. Tramite gli

enzimi di restrizione si applica un taglio al plasmide. Sempre con questi enzimi si taglia il DNA della cellula donatrice in specifiche sequenze in modo da isolare il gene interessato. In seguito si inserisce il gene nel plasmide e, tramite lenzima DNAligasi, si uniscono i pezzi. Il plasmide viene cos reinserito nel batterio. Questo batterio viene messo in coltura. Quando esso si riprodurr duplicher anche il gene estraneo e, cos facendo in breve tempo si potr disporre di molte proteine, prodotte proprio grazie a questo gene. Una proteina prodotta proprio grazie a questa tecnica linterferone. Comunque vediamo un po pi nella specifico questo procedimento.

1 passo: isolare il DNA dalle cellule

Il 1 passo da fare isolare il DNA contenente il gene che interessa. Per fare ci bisogna prendere delle cellule contenenti questo DNA e aggiungere una soluzione saponata. Il sapone provoca la rottura delle membrane e del nucleo cellulare, e la separazione delle proteine dal DNA. Ora si deve separare il DNA dalle proteine e dai resti cellulari. Occorre aggiungere del detergente a questa soluzione e fare cos un mix. Questo mix deve essere centrifugato e durante la centrifugazione si formano tre strati. Lo strato pi inferiore composto dai resti cellulari pesanti. Quello intermedio composto dal detergente e dalle proteine e quello superiore dalla soluzione saponata con il DNA. Quest ultimo strato deve poi essere spostato in un altra provetta. A questo punto bisogna aggiungere dellalcol. Il DNA precipita poich insolubile in alcol. In questo momento possibile vedere il DNA ad occhio nudo. Esso appare come filamenti opachi. In questo momento necessario centrifugare il tutto e , dopo, aspirare il liquido sovrastante in modo da avere solo il DNA. Tutto questo procedimento si pu fare anche a casa con questo semplice esperimento.

Esperimento: Estrazione del DNA dai pomodori

Cosa serve: Un pomodoro Un coltellino da cucina Un cucchiaio Una chiavetta Una tazza Un imbuto con un filtro per caff di carta Una provetta richiudibile o una bottiglietta

Acqua Spirito

2 passo: tagliare il DNA in pezzi

I genetisti sono spesso interessati ad un particolare gene. Per questo, la maggior parte delle volte, hanno solamente bisogno di un piccolo frammento di DNA. Con lo scopo di isolare uno specifico frammento di DNA essi usano delle forbici (enzimi di restrizione) che tagliano il DNA in pezzi. Queste forbici riconoscono una specifica sequenza di lettere nel DNA, e lo tagliano in quel punto. Cos si formano dei frammenti di DNA di lunghezza differente. Ci sono molte forbici diverse per il DNA. Tutte riconoscono e tagliano delle sequenze specifiche nel DNA. Le forbici vengono isolate da dei microrganismi e sono prodotte commercialmente. Il loro nome deriva dal microrganismo da cui sono state isolate. Per esempio lenzima EcoRI si chiama cos perch stato isolato da un batterio chiamato Escherichia coli RY13. Per lavorare con il gene interessato il genetista deve isolarlo. Per riconoscere questo gene il genetista deve prendere il frammento di DNA di una specifica lunghezza. Per fare ci usa una tecnica chiamata elettroforesi su gel. Il genetista inserisce i frammenti di DNA dentro un gel, che una sorta di gelatina. Il gel si trova dentro un recipiente riempito di liquido. Il recipiente collegato ad una sorgente di corrente, che circola dal polo negativo a quello positivo. I frammenti di DNA di diversa lunghezza migrano ad una velocit differente, secondo la loro lunghezza: pi sono corti e pi si spostano velocemente. Questo perch il gel fatto come una specie di rete da pesca. I frammenti di DNA pi corti passano pi facilmente di quelli lunghi attraverso le maglie della rete, e si spostano quindi pi velocemente. In seguito il genetista immerge il gel in un colorante che si lega al DNA rendendolo luminoso sotto una lampada UV. Sul gel si possono vedere cos delle bande luminose. Ogni banda formata da numerosi frammenti di DNA della stessa lunghezza. Il genetista pu quindi isolare dal gel la banda dove si trova il frammento di DNA con il quale vuole continuare a lavorare.

3 passo: introdurre il gene interessato nel plasmide

Dopo aver preso il plasmide e averlo tagliato in un solo punto, e dopo aver preso il gene che interessa, c bisogno di introdurre quest ultimo ne plasmide. La cosa importante che il plasmide e il gene devono essere tagliati dagli enzimi di restrizione in maniera complementare. Perci per unire il gene al plasmide si usa lenzima DNA-ligasi. Si sar cos ottenuto un anello di DNA ricombinato. In questo momento bisogna introdurre questo plasmide ricombinato dentro ad un batterio. Per fare ci il plasmide e dei batteri vengono introdotti in una provetta contenente una soluzione nutritiva. Questa provetta verr riscaldata ad una temperatura di circa 56C. I batteri avranno una specie di shock in seguito a questo innalzamento di temperatura e sulla loro parete si formeranno dei buchi. Il plasmide potr cos entrare. Quando la provetta sar raffreddata i buchi si richiuderanno e cos il plasmide sar intrappolato allinterno del batterio. In realt la probabilit che un batterio incorpori il plasmide davvero molto bassa (circa 0,000001%). Ma esiste una tecnica in grado di riconoscere i batteri che portano il plasmide. Il plasmide contiene un gene protettore: grazie a questo gene il batterio produce una proteina che gli permette di essere protetto contro un veleno antibatterico

(antibiotico). Il veleno antibatterico messo su una piastra in plastica ricoperta di sostanze nutritive sotto forma di gel. I batteri sono quindi sparsi su questa piastra. Dopo qualche ora passata a 37C solamente i batteri che possiedono il plasmide contenente il gene protettore sono capaci di moltiplicarsi. Sulla piastra restano perci solo i batteri che portano il plasmide ricombinante, mentre gli altri sono morti. I batteri col plasmide ricombinato vengono messi in coltura in modo da farli riprodurre. In poco tempo si avranno tantissimi batteri e Ognuno di loro produrr la proteina codificata dal gene donato.

Topi transgenici
I batteri non sono i soli a poter essere geneticamente modificati. Infatti, anche possibile modificare geneticamente piante e animali, in modo che ciascuna delle loro cellule contenga un gene addizionale e produca la proteina corrispondente a quel gene. Allinterno di tessuti ed organi alcune cellule lavorano in stretta collaborazione, e si influenzano reciprocamente. La funzione precisa di numerose proteine, perci, non pu essere che studiata in organismi multicellulari. Gli animali che vengono pi spesso geneticamente modificati sono: il moscerino della frutta (Drosophila), il pesce zebra e il topo. Lessere umano e il topo fanno entrambi parte dei mammiferi, e nelluomo sono presenti, in forma simile, il 99% dei geni del topo. Ecco perch il topo costituisce un modello appropriato per lo studio delle proteine che giocano un ruolo importante nellorganismo umano. I topi che hanno subito manipolazioni genetiche non sono solamente utili per studiare la funzioni di proteine importanti. Essi servono ugualmente da modello di malattie come il cancro. Cos si pu introdurre nel topo un gene cancerogeno

(oncogene), e lespressione della proteina corrispondente porter alla formazione del tumore. I ricercatori studiano, grazie a questi topi, lo sviluppo dei tumori o lazione di certi farmaci. Se lanimale guarisce, significa che il farmaco efficace. I modelli animali esistono anche per altre malattie. Per mezzo di un ago, sinietta il DNA che porta il gene dinteresse dentro un ovulo di topo fecondato. In alcuni ovuli fecondati il DNA iniettato si inserisce nel DNA del topo. Le cellule cos modificate si dividono e formano un embrione pluricellulare. Se il DNA iniettato integrato nel genoma del topo, allora tutte le cellule dell embrione conterranno il gene addizionale. Diversi embrioni vengono introdotti nellutero di un topo femmina. Tre settimane pi tardi nasceranno i topolini, e una parte di essi porter il gene addizionale. Per studiare la funzione di una proteina necessario, alcune volte, spegnere un gene nel topo, o rimpiazzarlo con una copia modificata. Si parla allora, rispettivamente, di topi knock-out (spento) e knock-in (rimpiazzato). Vediamo ora come si producono topi knock-in e topi knock-out. Si isolano delle cellule staminali embrionali da embrioni di topo, e vi si inserisce il DNA contenente il gene dinteresse. In precedenza, una piccola parte del gene stata modificata in modo che produca una proteina difettosa o modificata. Tranne che per questa piccola modifica, la sequenza di lettere del gene inserito esattamente la stessa di quella del gene presente gi nel topo. Di conseguenza i due geni si avvicinano e scambiano materiale genetico. Questo processo si chiama ricombinazione omologa. Si formano cos cellule staminali nelle quali un gene stato rimpiazzato per una copia modificata. Infine, si introducono le cellule staminali cos modificate nellembrione di topo, che viene impiantato in una femmina.

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

La reazione a catena della polimerasi (o PCR) tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantit di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni. Per questa tecnica c bisogno di una molecola di DNA contenente il gene che vogliamo produrre in grandi quantit, di enzimi DNA polimerasi, di primers, ovvero brevi catene nucleotidiche ad 1 filamento complementari allinizio o alla fine del gene che interessa, e di una grande quantit di nucleotidi di ogni tipo.

La prima cosa da fare mettere tutti questi ingredienti in una provetta e alzare la temperatura a 94. A questa temperatura il DNA si denatura e si divider in due singoli filamenti. Ora la temperatura va abbassata a 60. In questo momento i primers si andranno a legare allinizio o alla fine dei due filamenti nucleotidici. In seguito poi si alza la temperatura a 72. A questa temperatura le DNA polimerasi iniziano il loro lavoro. La DNA polimerasi inizia la duplicazione da dove ci sono i primers, usando i nucleotidi dispersi in provetta. I primers inseriti prima avevano lunica funzione di creare un sito dove la DNA polimerasi potesse iniziare la duplicazione. Ora, i due filamenti singoli saranno diventati doppi e si avranno due copie del gene prescelto. Questo procedimento pu essere ripetuto per pi volte e dato che dura circa 3 minuti, in un ora si possono produrre pi di un milione di copie del gene.

Cellule staminali
Una cellula non esprime tutto il potenziale del suo corredo genetico, ma solo una parte. Questo il motivo perch esistono cellule cos diverse nonostante abbiano gli stessi geni. La specializzazione della struttura e della funzione delle cellule chiamata differenziamento. Le cellule che non si sono ancora differenziate sono chiamate cellule staminali. Pi semplicemente le cellule staminali sono cellule il cui destino non stato ancora deciso.

Nelle fasi iniziali dello sviluppo umano, le cellule staminali, situate nell'embrione, sono diverse da tutti i tipi di cellule esistenti nell'organismo, ovvero da quelle cerebrali, ossee, cardiache, muscolari, epidermiche La possibilit di controllare lo spettacolare potere di queste cellule staminali embrionali, allo scopo di curare vari tipi di malattie, entusiasma gli studiosi. Per esempio, il morbo di Parkinson e l'Alzheimer sono il risultato di lesioni in gruppi determinati di cellule cerebrali. Con la realizzazione di un trapianto di cellule staminali derivate da un embrione alla parte del cervello colpita, si spera di sostituire la parte di tessuto cerebrale danneggiata. Essendo l'utilizzo di embrioni una questione di grande controversia in termini etici, gli scienziati di tutto il mondo cercano altre fonti di cellule staminali. Il tipo di cellule staminali che si trova nel midollo osseo degli adulti sembra essere una possibilit. Queste cellule staminali sono potenzialmente gi capaci di differenziarsi in una gran variet di globuli rossi nell'arco del ciclo vitale. Queste cellule staminali sono dette pluripotenti perch possono differenziarsi in vari tipi di cellule. Le cellule staminali embrionali sono dette totipotenti perch possono differenziarsi un tutti i tipi di cellule. In futuro, gli scienziati sperano di manipolare le cellule staminali adulte affinch, invece di produrre soltanto globuli rossi, possano dare origine a cellule cerebrali, epatiche, cardiache e nervose. Ma come usare queste cellule staminali? La prima cosa da fare prendere una cellula della pelle dal paziente ammalato. Poi bisogna prendere una cellula uovo e rimuovere il nucleo. In seguito bisogna rimpiazzare questo nucleo appena tolto con il nucleo di una cellula asportata dal paziente. La cellula viene trattata con lelettricit, cos inizia a dividersi. Poi viene lasciata crescere per circa una settimana fino a quando non si forma lembrione. Cos, le cellule staminali vengono prese e messe in provette sterili. Le cellule staminali crescono e si moltiplicano in laboratorio. Quando sono pronte vengono impiantate nel paziente. Queste cellule possiedono il DNA del paziente e perci vanno bene. In teoria queste cellule dovrebbero iniziare il processo di differenziamento, in modo da riformare le cellule perdute o danneggiate.

OGM
L'obiettivo degli agricoltori moderni non molto diverso da quello dei primi coltivatori di 10000 anni fa. Oggi come ieri, l'agricoltore vuole piante resistenti e ad alta resa. I metodi sono invece cambiati nel corso degli anni: selezione e incroci mirati (ad esempio: i cereali fra le graminacee selvatiche); moltiplicazione delle piante attraverso la selezione dei germogli (es.: moltiplicazione delle piante di patate esenti da virus); fusione dei protoplasti (es.: fusione di due cellule di diverse variet vegetali e quindi unione dei corredi cromosomici); trattamento delle sementi con radiazioni o sostanze chimiche (creazione di nuove variet grazie a mutazioni genetiche casuali, ad esempio la pera giapponese). Questo breve elenco lo dimostra: il DNA delle piante stato modificato da sempre. Lo stesso vale oggi per lingegneria genetica: con il suo aiuto si possono trasferire in modo pi preciso sulle piante uno o pi geni, e quindi nuove propriet (ad es.: resistenza contro un determinato insetto). Il gene introdotto non deve essere necessariamente il gene di un'altra pianta, pu anche provenire da batteri, funghi, virus o animali. Queste piante sono dette OGM perch possiedono un patrimonio genetico variato grazie a delle tecniche scientifiche. Gli OGM sono sicuramente molto utili ma non si ancora sicuri sulle conseguenze che potrebbero portare alle piante e soprattutto a chi le mangia. Perci ci sono persone che sono molto dubbiose al riguardo. Infatti le nuove caratteristiche delle piante potrebbero interferire col normale metabolismo. Oppure, soprattutto, queste piante transgeniche potrebbero invadere altri orti e prendere il posto delle piante naturali. Inoltre c un altro fattore che rende molto dubbiosi, ovvero limperativo etico di non intervenire sul DNA e non manipolare le basi stesse della vita. Una liberalizzazione di tali ricerche potrebbe, secondo questa posizione, condurre ad aberrazioni di ogni genere, creazione di ibridi, di organi clonati, applicazione della clonazione in campo umano, etc.