MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA Introduccin: La microscopa de fluorescencia es una de las herramientas fundamentales de

Investigacin en Biologa Molecular y en Biotecnologa. Sobre la base de un microscopio ptico, en el microscopio de Fluorescencia se utiliza luz monocromtica (Lser comnmente) para excitar (radiacin normalmente ultravioleta), a travs de un divisor selectivo de haz y del objetivo, los estados electrnicos de ciertas especies moleculares de la muestra. Estas especies moleculares tienen la virtud de desexcitarse emitiendo luz visible con una f frecuencia caracterstica. i i El uso de radiacin monocromtica de baja longitud de onda p g permite maximizar la resolucin que alcanza un microscopio ptico convencional.
Problema: Determinar la resolucin de un microscopio de fluorescencia que cuenta con una lente de objetivo de 100x de apertura numrica NA=1.45 y una fuente monocromtica laser de 488 nm (tomar n=1.5) . RESOLUCIN: La expresin de Airy para la resolucin X para =NA/2 es:

= 488 nm UAM Dpto Fsica Aplicada

MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA Introduccin: La microscopa ha experimentado avances notables fruto de nuevos adelantos de
instrumentacin. El Microscopio Confocal permite realizar estudios de secciones de muestras al introducir una apertura que permite excitar un punto localizado de la muestra (en realidad un volumen aproximado a 3). Mediante un barrido se puede ir recogiendo la luz emitida en cada punto y reconstruir una imagen 3D. En este nuevo caso la resolucin no viene determinada solo por los parmetros de la lente sino tambin por el tamao del punto colector de luz (pinhole) y se puede estimar mediante: d ti di t

Problema: Estimar si se producira un aumento notable de la resolucin si el problema anterior se tratara en una configuracin de microscopio confocal. RESOLUCIN: Utilizando la expresin anterior podemos ver que se produce un notable aumento de la resolucin. b) UAM Dpto Fsica Aplicada X = 232 nm

MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA Bases Fsicas de la Fluorescencia: El fenmeno de la fluorescencia se produce cuando un

sistema electrnico (ya sea en un tomo, molcula o nanoestructura) presenta una configuracin de niveles cunticos q p g que permiten transiciones de excitacin que dan lugar a q g otras transiciones de relajacin que son radiativas. La radiacin emitida cumple la siguiente condicin energtica con respecto a los niveles cunticos de origen y de relajacin.

Las transiciones radiativas no son nicas sino que dan lugar a q g un espectro caracterstico de emisin La fluorescencia no es un fenmeno muy eficiente en general. No todos los electrones excitados se relajan mediante transiciones radiativas sino que pueden sufir fenmenos de conversin interna o de traspaso de energa a sistemas vecinos. Desde el punto de vista energtico los fotones excitados sufren transiciones internas (vibracionales) que tampoco son radiativas.
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La eficiencia de las distintas transiciones entre estados puede medirse mediante los espectros caractersticos de excitacin (absorcin de fotones que excitan estados electrnicos) como de emisin (emisin de fotones fruto de una relajacin electrnica radiativa). La diferencia entre los mximos de excitacin y emisin se conoce como Corrimiento Stokes. A-F F-E

A-C F-D E

Resolucin
El proceso de fluorescencia se puede inducir tambin mediante procesos no lineales. Dos fotones (Two Photon Fluorescence Microscopy, TPFM) de menor ea es os oto es ( o o o uo esce ce c oscopy, ) e o energa pueden actuar simultneamente para producir la excitacin electrnica. La eficiencia de este proceso es menor en general pero existen fluorforos especficos para producir esta excitacin (que requiere un Lser). Una ventaja reside en que la radiacin d excitacin es IR o Vi d manera que se evitan llos procesos d di i de it i Vis de it de AUTO fluorescencia.
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TPFM En cualquier caso la mayor ventaja de la TPFM reside en la propia naturaleza de la excitacin. Los dos fotones deben tener una localizacin y sincronizacin que haga el proceso eficiente. Esta condicin de colocalizacin permite que se puedan analizar puntos aislados d lluz y reconstruir li t i l d de t i imgenes 3D mediante un sistema de barrido similar al del microscopio confocal. Imagen: izq. Visin d un corte y I i Vi i de t reconstruccin 3D de una clula de rata marcada mediante un fluorforo impermeable a la membrana celular. dcha. p Idem, mediante un fluorforo permeable.

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MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA Microscopa Confocal:

Imagen: Microscopa confocal mostrando la autofluorescence del cotyledon en un brote de Arabidopsis thaliana on cortes desde el interior rico en orgnulos (0 m) hasta la pared celular (6 m).

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Imagen: Secciones de microscopa confocal de Clulas Madre humanas en membranas para la Ingeniera de Tejidos.

MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA Naturaleza de los Fluorforos: Como hemos visto previamente, existen tres tipos de estructuras fluorescentes. Los elementos lantnidos como el Tb, Er, Yb, presentan transiciones electrnicas que cumplen con las reglas de transicin cunticas q dan lugar q p g que g a fluorescencia. Sin embargo, son elementos altamente txicos y forman complejos organometlicos inestables (chelates) de modo que su uso en biologa es minoritario (el Er es sin embargo referencia en las comunicaciones pticas). Los fluorforos molculares son sin duda los de uso mas extendido. Estas estructuras moleculares tienen en comn la existencia de anillos con enlaces C-C de tipo que dan lugar a una estructura de niveles electrnicos compatible con los procesos de fluorescencia. Entre estos fluorforos moleculares existen fluorforos naturales y sintticos. Tres de los aminocidos que constituyen las p q y protenas p presentan este tipo de estructura y p son por tanto fuente de AUTO-FLUORESCENCIA .

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MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA Estos aminocidos se encuentran presentes en multitud de protenas que conforman la estructura de la clula. En general la fluorescencia inducida por estos aminocidos no se puede aprovechar mas all de la produccin de una imagen general sin a penas capacidad de localizacin de orgnulos. Si adems se tiene en cuenta que la eficiencia cuntica (fotones emitidos entre los absorbidos) es mximo 0.2 es necesaria una fuente de excitacin intensa que puede daar la muestra biolgica en visualizacin visualizacin. Como alternativa existe una larga gama de fluorforos sintticos que permiten localizar la fluorescencia y p producir contrastes q revelan la estructura de lo observado: que - Fluorforos de intercalamiento y adhesin: YOYO es un derivado que activa su configuracin cuando se intercala en una doble hebra de ADN (planos purina pirimidina).
Problema: El ADN aislado de Enterobacteria phage tiene 48,502 pares de bases y mide en formato extendido 16 m. A pesar de tener una anchura inferior a los 20 nm explicar porqu se puede ver en el microscopio cuando est marcada con un fluorforo adecuado. Qu fluorforo? RESOLUCIN: la falta de resolucin a lo ancho no impide identificar la longitud difumunada en anchura. Figura : E Fi Espectros de absorcin y emisin para YOYO intercalado en ADN d t d b i i i i t l d de doble hebra (discontinuo y puntos) y espectro de absorcin (continuo) sin emisin para la forma libre del fluorforo. UAM Dpto Fsica Aplicada

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Figura : Imgenes de microscopa confocal de la amlificacin de la seal de f f f fluorescencia de YOYO intercalado en ADN de O O doble hebra enlazado entre dos nanopartculas de Ag (resonancia plasmnica).

DAPI es un compuesto que optimiza su fluorescencia cuando se adhiere al ADN y permite marcar q p los nucleos de cualquier tipo de clulas.

Figura : Visiones de la estructura de la adhesin y marcado de un nucleo en divisin de una clula mesenquimtica. UAM Dpto Fsica Aplicada

MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA - Marcadores de membrana BODIPY: Al carecer de carga inica son permeables a la membrana celular permitiendo marcar clulas con alta actividad de intercambio (neuronas)
Figura : Clulas del encfalo humno en fase previa y posterior a su diferenciacin neuronal. La clula origen expresa una proteina que reconoce a un derivado BODIPY mientras que la expresin se inhibe tras la diferenciacin neuronal.

- D i d Tiol: L marcadores mas comunes para lla bi l celular se obtienen a partir Derivados Ti l Los d biologa l l bti ti de la formacin de complejos entre molculas fluorescentes con protenas capaces de detectar estructuras especficas de la clula (Inmunotincin).
Figura : Imagenes de inmunotincin mltiple de clulas mesenquimticas humanas: a (verde, citoesqueleto de actina; rojo beta catenina) b (rojo actina) El azul rojo, beta-catenina). (rojo, actina). corresponde a una tincin DAPI del nucleo. UAM Dpto Fsica Aplicada

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- Protenas Fluorescentes: Existen estructuras macromoleculares fluorescentes naturales como la Proteina Fluorescente Verde (GFP) aislada de una medusa (Aequoria Victoria). Su estructura de tambor aloja a un fluorforo que permanece as invariante en un amplio rango de condiciones fisiolgicas. fisiolgicas La modificacin qumica ha permitido desarrollar otras protenas fluorescentes con emisin variable. Estas protenas pueden formar vectores para trazar orgnulos de la clula.

Secuencia de ADN para un vector con GFP. 5-ATGGGCCGGGACCACATGGTGCTGCACGAGTACGTGAACGCCGCCGGCATCACAGACGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGC-3. Figura : Estructura de la GFP y espectros de emisin de proteinas derivadas. ADN para un vector con GFP e imagen derivada. UAM Dpto Fsica Aplicada

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- Puntos Cunticos (QDs quantum dots): Los puntos cunticos son estructuras de semiconductor (QD s, que integran del orden de 1000 tomos. El carcter semiconductor implica la existencia de una estructura de niveles electrnicos que se modifica en funcin del tamao del QD.

Figura : A. Dependencia del mximo de emisin con el tamao y naturaleza de un QD. Semiconductores (II-VI: CdS, CdSe, CdTe, etc III V InP InAs, etc IV-VI: PbSe etc ) Insercin: CdTe etc.; III-V: InP, InAs etc.; IV VI PbSe, etc.). Insercin espectros de emisin de algunos de estos QDs B. Espectros de alg nos QDs. B absorcin y emisin para core-shell QDs de CdSe/ZnS (Linea vertical, excitacin a 488 nm mediante un laser de Ar.) UAM Dpto Fsica Aplicada

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Las caractersticas fsicas de los QDs con respecto a los fluorforos moleculares son: -Espectros de absorcin amplios (se puede excitar con una gama amplia de frecuencias, especialmente intensa hacia el UV) -Coeficientes de extincin molar (absorcin) entre 10-100 veces mas que los fluorforos. - Espectros de emisin estrechos con FWHM de 25 to 40 nm (CdSe). -Corrimiento Stokes incluso > 200 nm frente a < 100 nm para fluorforos moleculares. -La eficiencia cuntica puede alcanzar 0.7 en estructuras core-shell. -Vida de la fluorescencia: 10-20 ns frente a < 5 ns para fluorforos moleculares. -Fotoestabilidad excelente frente a la degradacin de los fluorforos moleculares. -Seccin eficaz multi-fotnica: 2-3 ordenes de magnitud superior a los fluorforos moleculares. Las desventajas de los QDs emergen de las dificultades para producir complejos especficos con biomolculas y de los problemas en su internalizacin celular celular.
Figura : Relacin tamao-color y tincin celular mediante QDs de CdSe.

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Una de las grandes ventajas de los QDs es la optimizacin de la Transferencia de Energa por Resonancia Fluorescente (FRET). En este modo de fluorescencia existe un agente donor que absorbe la luz y transfiere la energa al agente aceptor que sufre la desexcitacin radiativa Para radiativa. que el fenmeno sea posible debe existir coincidencia entre las bandas prohibidas, una gran proximidad (dependencia 1/r6) y alineamiento de momentos dipolares. Esto supone un sistema sensible para determinar distancias en Sistemas Biolgicos unimoleculares (plegamiento De protenas, interacciones y enlaces, cambios conformacionales).
Figura : Aplicacin de FRET a la determinacin de distancias entre bases en ADN de doble hebra. Espectros de absorcin del donor y de emisin del aceptor. Resultados del anlisis.

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