PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE VALPARAISO FACULTAD DE INGENIERA ESCUELA DE INGENIERA BIOQUMICA

Laboratorio de Biocatalisis Determinacin de curvas de calibrado y cintica de crecimiento celular de la levadura Kluyveromyces Marxianus

Nombres:

Yailn Godoy Jimenez Francisco Ocares Briceo Christian Pinilla Herrera

6 de Septiembre 2012

Resumen
En el presente informe se presentan diferentes experiencias experimentales que buscan diversos objetivos enfocados tanto como por ejemplo la realizacin de una curva de calibrado o como la obtencin de la cintica de un microorganismo dado en la prctica. Como primera etapa se obtuvo las curvas de calibrado por medio de dos mtodos cualitativos, uno de ellos fue el mtodo de DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico) que se aplico una solucin patrn de lactosa stock de 2 (g/L), obteniendo como resultado nuestra de ecuacin de regresin lineal Y (ABS)= 0,359x 0,0585. El otro mtodo empleado fue el de turbidimetra, que consiste en la medicin de la turbidez a travs de las absorbancias de las soluciones. El resultado de esta curva de calibrado para biomasa fue de Y (ABS)= 3,7299x 0,0156 Una vez que se realizaron las curvas de calibrado, se procedi a la realizacin del diseo medio cultivo, en la cual a travs de diferentes clculos, se obtuvieron las masas de los diferentes nutrientes y del sustrato limitante (lactosa) para el crecimiento microbiano, mostrado en el Anexo C. Por ltimo, poniendo en prctica todo lo aprendido, procedi a estudiar la cintica de crecimiento de la levadura Kluyveromyces Marxianus, midiendo a lo largo del tiempo su respectivo consumo de lactosa (g/L) y aumento de biomasa (g/L), concentrando todos los datos en un grfico de concentracin (g/L) versus tiempo (h). Segn lo realizado, se mostr que la velocidad de crecimiento resultante fue de = 0,3126 (1/h) Al concluir estas prcticas, se logro obtener las curvas de calibrado, sin mayores problemas, mientas que en la preparacin del diseo del medio de cultivo, al inocular se observo un crecimiento y adems se pudo deducir que el microorganismo Kluyveromyces Marxianus logr presentar un crecimiento, pero no al 100% fiable, ya que no se pudo disponer de todo el tiempo necesario.

ndices

ndices2 Resultados y Discusin...3 1. Curvado de Calibrado para Cuantificacin de Lactosa / Crecimiento de Biomasa por Turbidimetra..3 2. Preparacin de medios de cultivo, esterilizacin e inoculacin.5 2.1. 2.2. 2.3. Preparacin de un medio de cultivo.5 Esterilizacin...5 Inoculacin..6

3. Cintica de crecimiento celular y Consumo de lactosa de la levadura Kluyveromyces Marxianus..6 Conclusiones8 Bibliografa.9 Anexos10 a) Anexo A.....11 b) Anexo B..12 c) Anexo C..14 d) Anexo D.17

Resultado y Discusin

1. Curvado de Calibrado para Cuantificacin de Lactosa / Crecimiento de Biomasa por Turbidimetra

Figura 1. Curva de calibrado para la cuantificacin de lactosa. La lnea de tendencia corresponde a regresin lineal de los datos. Absorbancia medida a 540 nm. En este grfico podemos encontrar la construccin de la curva de calibrado para la medicin de azcares reductores (soluciones de lactosa) de concentracin stock de 2 (g/L). sta experiencia se realiz por duplicado, ya que una vez tenido los resultados se calcul el promedio entre las absorbancias resultantes (Tabla A1) y su respectiva desviacin estndar, para as poder conseguir un margen error aceptable y un R lineal muy cercano a 1. La absorbancia de la muestra problema medida por el espectrofotmetro fue de 0,114, lo cual es aceptable, producto que se encuentra dentro de los parmetros de nuestra curva de calibrado derivada de la cuantificaciones de lactosa. Por tanto, reemplazando en la ecuacin de la recta proveniente de la Fig. 1 dio como resultado una concentracin de 0,4805 (g/L) de lactosa. Como discusin de esta parte de la prctica, podemos abordar que la Ley de lambeert slo es aplicable para bajas concentraciones, por lo que al elaborar una curva de calibracin para garantizar la linealidad, se necesita que nuestras muestras fueran diluidas adecuadamente para poder leerlas dentro de la curva sin la necesidad de extrapolar. Podemos sealar que en la Fig. Se presentan las barras de error, que corresponde al alejamiento de la absorbancia de una desviacin estndar establecida para nuestros 3

datos, en la cual entre mayor sea la desviacin entre los datos, mayor ser el error de este. De esta forma, se destacaron los datos de nuestra serie de absorbancia que se alejan de la media de forma significativa. Con lo dicho anteriormente, se puede analizar los diferentes puntos (absorbancias) que se nos presentan en la Fig. Concluyendo que slo 2 puntos acentuados en el Anexo A fueron aquellos que se salen del protocolo de nuestra experiencia y que pudo haberse causado por diferentes factores como una mala manipulacin o una defectuosa medicin en el espectrofotmetro. Cabe destacar que la lactosa es un azcar reductor y que posee aproximadamente la mitad como mximo de poder reductor por residuo glucosilo que la glucosa o galactosa libres por ejemplo, puesto que su residuo de glucosa puede formar la cadena abierta (Robert W. McGilvery, Reverte 1977)

Figura 1.2. Curva de calibrado para la medicin de crecimiento exponencial de Biomasa. Centrifugacin a 10.000 rpm por intervalos de 15 minutos, previo Secado a 105 y medicin de la absorbancia a 650 nm. En esta parte de la experiencia lo primero que se realiz fue la obtencin de la concentracin inicial por medio de secado de la muestra a 105, para luego ser pesada. Como se ejecutaron dos secados a la misma muestra, se consiguieron dos concentraciones iniciales, las cuales al momento de diluir y alcanzar nuestra concentracin final, se lograron obtener nuestros parmetros de Eje X. Se recab dos valores distintos para cada medicin, con lo cual se sac el promedio para cada valor a distintas diluciones. Para la obtencin de las absorbancias se nos present un rango entre 0.8-0.1, por lo que se debi realiza una dilucin previa al procedimiento utilizando los factores correspondiente que se presentan en el Anexo B. Este mismo mtodo tambin se realiz para las absorbancias que se adquirieron, logrando una curva de calibrado para la obtencin de concentracin de biomasa de un cultivo en fase de crecimiento exponencial. Gracias a esta regresin lineal podemos calcular la concentracin de la muestra problema que se nos present. 4

La absorbancia de la muestra problema medida a travs de un espectrofotmetro a 650 nm fue de 0,569. Por lo tanto reemplazando en la ecuacin de la recta de la Fig. 1.2.nos da como resultado 0,6269 (g/L) de biomasa. Sobre las barras de error obtenidas en esta regresin que se nos exhibi, podemos enfocarnos slo en una muestra, la cual fue destacada en el Anexo B, ya que los dems puntos el error que produjeron fue nfimo comparado con la muestra mencionada anteriormente. Esto se pudo haber producido por una mala dilucin que realizamos o un incorrecto manejo de las celdas antes de medir en el espectrofotmetro. La determinacin de la biomasa es una de las variables ms importantes en este caso, ya que su determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia de un bioproceso. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de produccin, de consumo de nutrientes y del clculo de los dems balances de cualquier proceso biolgico.

2. Preparacin de medios de cultivo, esterilizacin e inoculacin

2.1 Preparacin de un medio de cultivo El medio de cultivo que se preparo toma en consideracin un crecimiento de 2g/l de biomasa. Como fuente de energa y carbono se utiliz lactosa, siendo as el sustrato limitante del cultivo junto a esto otros componentes que se encuentran en el Anexo C (Tabla C 1.1) ayudarn al crecimiento teniendo en cuenta que se encontraran en un 50 % de exceso Cabe sealar que se utilizara extracto de levadura que permitir mejorar el crecimiento del medio, asi entregara los requerimientos nutricionales a la clula. Para la preparacin del medio de cultivo se utiliz la formula de rendimiento celular.

Los componentes del Anexo C (Tabla C 1.1) se utilizaran para preparar 100 ml de este medio (esto se realizo por duplicado) en un matraz de volumen total de 500 mL. Adems se utiliz tampn citrato para mantener un pH de 6,5 aproximadamente.

2.2 Esterilizacin Para esterilizar los materiales de laboratorio y los componentes del medio de cultivo se utiliz la autoclave a 121 c durante 20 minutos Un autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presin y temperatura para ello, evitando con las altas presiones que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura. El fundamento del autoclave es que coagula las protenas de los microorganismos debido a la presin y temperatura, pero se sabe que hay microorganismos que sobreviven a ciertas temperaturas del autoclave como los prione. 5

2.3 Inoculacin Para llevar a cabo la inoculacin se debe adicionar bajo mechero las sales al matraz de 500ml que contiene la lactosa, mezclar bien y luego inocular a partir de un cultivo liquido que se nos proporcion, en este caso la Kluyveromyces Marxianus. En este caso se adiciona un 10% del inoculo a la mezcla. En el Anexo C se puede estudiar a fondo todos los clculos experimentales para disear un medio de cultivo

3. Cintica de crecimiento celular y Consumo de lactosa de la levadura Kluyveromyces Marxianus

Figura 3. Cintica de crecimiento celular de la levadura Kluyveromyces Marxianus. Agitacin a 200 rpm y 30C. Muestras de 3 mL tomadas aproximadamente cada 45 minutos. Como se puede observa en la grfica de concentracin Lactosa / Tiempo / Biomasa siendo lactosa (g/L) y biomasa (g/L) correspondientes al eje Y y respectivamente el tiempo (h) en el eje X (Anexo D), se puede definir que la lactosa fue consumida por el microorganismo (m.o.), pero no en su totalidad debido a la falta de tiempo en que realizamos la experiencia, debindose as haber tomado una mayor cantidad de muestras en un periodo de tiempo ms extenso, porque el m.o. logra un crecimiento exponencial aproximadamente a las 8 hrs de incubacin, quedando demostrado en la Fig.3 que no se puede observar todas las fases del crecimiento celular. Al asimilar la lactosa el m.o. se 6

visualiz que la biomasa aumento favorablemente, viendo este resultado por medio de la absorbancias que se consiguieron a travs de la turbidimetra. No obstante cabe destacar, que en la primera muestra que se realiz a los 0,75 (h) de espera, se consigui un decrecimiento de biomasa, por lo que se pudo haber originado por diversos factores, ya sea la mala manipulacin de los instrumentos, como tambin el tiempo en se realiza la incubacin, que debe realizarse lo ms rpido posible para no interferir en el crecimiento celular. Tambin se puede destacar que la medicin en el tiempo 0 (h) pudo haber sido errnea, por el motivo que pudo haberse encontrado la celda del espectrofotmetro de manera defectuosa o mal manipulada, la cual arroj una absorbancia mayor a lo que deba ser originalmente. Por ende, s en las muestras siguientes se sigui una tendencia creciente, con respecto a la regresin que se debiese cumplir. Se puede decir tambin que la muestra obtenida a las 2,25 (h) nuevamente no se registr una predisposicin a crecer, por lo que pudo haber sido afectada por factores mnimos, como una mala dilucin pero que no perturba considerablemente el crecimiento. Gracias a los datos obtenidos segn el anexo, no podemos dar con certeza que el obtenido sea el correcto, ya que segn el tiempo empleado, el periodo de incubacin que se debe regir es de 8 (h) aproximadamente, por lo que en nuestra experiencia no podemos apreciar el verdadero crecimiento exponencial porque nuestro tiempo ejecutado fue de slo 3,75 (h), o sea llegando ni siquiera a la mitad de la incubacin original. Por ende el microorganismo presento fases de latencia, que es cuando se adaptan al medio de cultivo y de crecimiento celular, la cual el ritmo de reproduccin de clulas ocurre a ritmo constante, pero siendo ste ltimo no en su totalidad. Con la grfica resultante de los datos que se presentan en el anexo, el resultante de la ecuacin de la Fig. 3.1. Result ser de 0,3126 (1/h). Se debe recalcar tambin que le punto 0,0 no fue considerado para la obtencin del , ya que se aleja demasiado de los parmetros y de la linealidad de la regresin.

Figura 3.1. Velocidad de Crecimiento de la levadura Kluyveromyces Marxianus

Conclusiones
Como primera conclusin podemos decir se realizaron todos los experimentos segn lo especulado en la gua entregada, obteniendo as resultados conformes y adecuados a los establecido para la determinacin de los distintos parmetros para cada objetivo. En general se cumplieron todos los objetivos, tanto como para la realizacin de las curvas de calibrado, diseo de medio cultivo y cintica de crecimiento de la levadura Kluyveromyces Marxianus. Sobre las curvas de calibrado se logro establecer una regresin lineal aceptable, producto de la linealidad de los puntos y su respectivo R. Se pudo ratificar que la experiencia realizada en el laboratorio fue correcta, ya que al hacerla por duplicado y analizando su ecuacin de la recta, se confirma que con sus intercepto muy cercanos a 0 y sus pendientes muy similares. Por otro lado, en la preparacin del diseo de medio de cultivo celular estril, nos pudo percatar que resulto correctamente a lo esperado, viendo as un notorio cambio de color y una apreciacin en la suspensin de microorganismos analizando cualitativamente por turbidez. Cuando sembramos el microorganismo, Kluyveromyces Marxianus, en un medio de cultivo apropiado, el mismo comienza a dividirse activamente, empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo. Este proceso contina hasta que un nutriente del medio se agota, pero en este caso de la experiencia no ocurre esto, ya que los nutrientes que le aplicamos al medio de cultivo, junto con su sustrato limitante, que es lactosa, no se acabaron en su totalidad quedando demostrado que el crecimiento no se detuvo.

Bilbliografa

Robert W. McGilvery. 1977. Azucares Reductores. Robert W. McGilvery. Biochemical Concept. 5ta Edicin. Editorial revert, s.a.

Charles W. Bamforth. 2005. Food, Fermentation and Micro-organisms. Charles W. Bamforth. 1 Edicin. Editorial Wiley-Blackwell Publishing.

Pauline M. Doran.1998. Principios de Ingeniera de Los Bioprocesos.3ra Edicin. Editorial Acribia. ARAUJO, Karelen et al. 2007. Efecto de la concentracin de lactosa sobre la cintica de crecimiento de Kluyveromyces marxianus var. marxianus y la produccin de b-D-galactosidasa (E.C. 3.2.1.23). Rev. Tc. Ing. Univ. Zulia vol.30, n.1, pp. 64-73

ANEXOS

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Anexo A Curva de calibrado de lactosa por el mtodo DNS

Concentracin del estndar inicial de lactosa: 2(g/L) Tabla A.1 Datos para la determinacin de la curva de calibrado de lactosa por el mtodo DNS Volumen de solucin estndar de lactosa (ml) 1 1,6 2,2 2,8 3,4 4 Volumen de agua adicionada (ml) 3 2,4 1,8 1,2 0,6 0 Concentraci n de lactosa Absorbanci Absorbanci (g/L) a1 a2 0,5 0,16 0,142 0,8 0,19 0,209 1,1 0,347 0,334 1,4 0,46 0,361 1,7 0,588 0,559 2 0,74 0,593

Tubo 1 2 3 4 5 6

Absorbancia de muestra problema de lactosa: 0,114 Muestra no fue diluida Absorbancia medida 540nm

Tabla A.2 promedio y desviacin estndar de datos Tubo 1 2 3 4 5 6 Promedio 0,151 0,1995 0,3405 0,4105 0,5735 0,6665 Desviacin estndar 0,01272792 0,01343503 0,00919239 0,07000357 0,0205061 0,1039447

Promedio y desviacin estndar entre las distintas absorbancias obtenidas para cada tubo

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Anexo B Curva de calibrado de biomasa

Tubo Volumen de muestra (ml) 1 1 2 0,9 3 0,8 4 0,7 5 0,6 6 0,5 7 0,3 8 0,2

Volumen de agua (ml) 3 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,7 3,8

Absorbancia Absorbancia Concentracin Concentracin 1 2 1 2 0,651 0,765 0,146 0,245 0,645 0,615 0,132 0,221 0,545 0,580 0,117 0,196 0,520 0,552 0,102 0,172 0,419 0,401 0,088 0,147 0,354 0,358 0,073 0,123 0,188 0,187 0,044 0,074 0,130 0,137 0,029 0,049

Tabla B1.1.- Datos de absorbancia para la determinacin de la curva de calibrado de biomasa Absorbancia de muestra problema de lactosa: 0,569 Muestra fue diluida 4 veces (FD= 4) Absorbancia medida a 650 nm Tabla B2.1.- Promedio y desviacin estndar de datos Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 promedio promedio Desviacin concentraciones absorbancias estndar 0,196 0,708 0,081 0,176 0,630 0,021 0,157 0,563 0,025 0,137 0,536 0,023 0,117 0,410 0,013 0,098 0,356 0,003 0,059 0,188 0,001 0,039 0,134 0,005

Promedio entre las distintas concentraciones y absorbancias obtenidas para cada tubo; desviacin estndar calculada para las distintas absorbancias obtenidas 12

Tabla B3.1. Datos de peso seco para determinacin de curva de calibrado de biomasa

Nmero de Capacho 1 15

Peso Capacho seco (g) 0,3888 0,2786

Volumen muestra (ml) 20 20

Peso Capacho + muestra seca (g) 0,4005 0,2982

Peso Muestra (g) 0,0117 0,0196

Concentracin (g/L)

0,585 0,98

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Anexo C CINTICA DE CULTIVO CELULAR Tabla C1.1 Preparacin de un medio de cultivo

X (g/L) % en PM nutriente 342,3 132,1 136,1 246,4 42.1 21.2 28.7 9.86

2,0

Nutriente

Fuente N PA de tomos

% en clula

Yx/s

Masa a agregar So (g/L) para 200 ml 4,55 0,71 0,17 0,061 0,91 0,14 0,034 0,012

C12H22O11 (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4*7H2O

C N P Mg

12 2 1 1

12 14 39,1 24,3

48 7,5 2,5 0,3

0,44 2,83 11,48 32,87

Tabla C1.2 Masa con exceso 50% Masa con 50% de exceso

Nutriente

C12H22O11 (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4*7H2O

0,91 0,213 0,051 0,018

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Para preparar este medio de cultivo se realizo de la siguiente manera. con la levadura 1. Para el clculo de % de nutrientes se utiliza la siguiente ecuacin :

El numero de tomos referente a la fuente de algn elemento del nutriente que se le aplicara al medio 2. Para el clculo de Y x/s se aplica la ecuacin de rendimiento dada por

Este factor esta dado si el microorganismo tiene facultades tanto como aerobias o anaerobias: Factor anaerobio: 0.1 Factor aerobio: 0,5 0,6 Factor de otros componentes: 1

3. Cuando se quiere calcular la concentracin de sustrato , aplicamos la ecuacin de rendimiento dada de la siguiente manera

Teniendo as que

En esta experiencia nuestra concentracin de biomasa inicial (Xi) es 0 g/l y nuestra concentracin de biomasa final sern los 2 g/l. La concentracin inicial de sustrato es la que queremos saber , sabiendo que la final a la correspondiente es 0 ya que el medio aun no empieza su actividad

4. Gracias a los clculos de concentraciones de sustrato de cada fuente de los correspondientes nutrientes se pudo sacar la masa agregar para nuestros 200 ml (0,2L )del matraz , as con este volumen se pudo analizar que Masa agregar (g) = so (g/l) * 0,2 L 5. Por ultimo en el experimento todos nuestros nutrientes estarn a un exceso de 50 % descartando el sustrato limitante que ser la lactosa 15

Ejemplo para el clculo de la masa que se agregara Para el sustrato limitante como c12h22o11 y fuente de C utilizaremos el factor para un microorganismo aerobio, 0,5. Por tanto esto ser de la siguiente manera siguiendo los pasos anteriores.

% nutrientes: 12*12 /342,3 *100% = 42,1 %

Yx/s = (42,1 / 48)*0,5 = 0,44

So = 2g/l / 0,44 = 4,55 g/L Masa agregar (g) = so (g/l) * 0,2 L Masa agregar (g) = 4,55 g/l * 0,2 L = 0,91 g ( no se saca el exceso porque es el sustrato limitante) Para el Fosfato Monopotsico (KH2PO4) con un factor de 1 porque es otro componente

% nutrientes: 1*39,1 /136,1 *100% = 28,71 %

Yx/s = (28,7/2,5 )*1 = 11,48

So = 2g/l / 11,48 = 0,17 g/L Masa agregar (g) = so (g/l) * 0,2 L Masa agregar (g) = 0,17g/l * 0,2 L = 0,034g Con el 50 % de exceso nos quedara en 0,051 g que tenemos que agregar a la muestra de este nutriente

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Anexo D Cintica de crecimiento celular

Tabla D1.1.- Determinar concentracin de biomasa Tiempo 0 45 1:30 2:15 3:00 3:45 T (hrs) 0 0,75 1,5 2,25 3 3,75 Absorbancia 1 Absorbancia 2 0,096 0,095 0,047 0,057 0,11 0,083 0,089 0,095 0,132 0,152 0,177 0,16

Muestra fue diluida 3 veces (FD 3) Absorbancia a 650 nm Segn Ecc. Figura. Tabla D1.2 Concentracin 1 0,090 0,050 0,101 0,084 0,119 0,155 Promedio Concentracin 2 concentraciones 0,089 0,089 0,058 0,054 0,079 0,090 0,089 0,087 0,135 0,127 0,141 0,148 Desviacin estndar 0,001 0,006 0,015 0,003 0,011 0,010

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Tabla D2.-Determinar consumo de lactosa Tiempo (h) 0:00 0:45 1:30 2:15 3:00 3:45 T(hrs) 0 0,75 1,5 2,25 3 3,75 Absorbancia 1 0,13 0,166 0,352 0,55 0,66 0,94 Absorbancia 2 0,172 0,231 0,37 0,617 0,651 0,95 FD 10 5 3,3 2 1,5 1

Procedimiento del mtodo de DNS (figura y anexo A) Segn ecuacin Concentracin Concentracin Promedio Desviacin 1 2 concentraciones estndar 5,408 6,456 5,932 0,741 3,153 3,964 3,559 0,574 3,613 3,761 3,687 0,105 3,178 3,512 3,345 0,236 2,795 2,762 2,778 0,024 2,562 2,587 2,575 0,018 Tabla D3.- Determinacin de Ln(X/X0) 0,000 -0,493 0,013 -0,028 0,354 0,509 T 0,000 0,750 1,500 2,250 3,000 3,750

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