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JLIA GAZZONI JARDIM

UTILIZAO DE PRPOLIS NO CONTROLE DA MASTITE BOVINA

MARECHAL CNDIDO RONDON - PR 2009

JLIA GAZZONI JARDIM

UTILIZAO DE PRPOLIS NO CONTROLE DA MASTITE BOVINA

Trabalho de Graduao apresentado Universidade Estadual do Oeste do Paran, como parte das exigncias do Curso de Zootecnia, para obteno do ttulo de Zootecnista.

MARECHAL CNDIDO RONDON - PR 2009

JLIA GAZZONI JARDIM

UTILIZAO DE PRPOLIS NO CONTROLE DA MASTITE BOVINA

Trabalho de Graduao apresentado Universidade Estadual do Oeste do Paran, como parte das exigncias do Curso de Zootecnia, para obteno do ttulo de Zootecnista.

APROVADO: 26 de novembro de 2009.

______________________________ Prof PhD. Erika C. T.de Mello Peixoto

__________________________ D.Sc. Bruno Borges Deminicis

____________________________ Prof D.Sc. Regina Conceio Garcia (Orientadora)

Se o que voc estiver fazendo no estiver lhe divertindo, voc no est fazendo coisa alguma. Carvalho e Nakagawa A cincia nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez. George Bernard Shaw O que somos consequncia do que pensamos. Buda Bom mesmo ir luta com determinao, abraar a vida e viver com paixo, perder com classe e viver com ousadia, pois o triunfo pertence a quem se atreve, e a vida muito bela para ser insignificante. Charles Chaplin

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AGRADECIMENTOS

A UNIOESTE pela oportunidade de realizao do curso. Aos meus professores pelos ensinamentos transmitidos para minha formao profissional. Em especial s professoras DSc. Regina Conceio Garcia e DSc. Erika Cosendey Toledo de Mello Peixoto, por fazerem do aprendizado no um trabalho, mas um contentamento, obrigada pela pacincia, ateno, amizade, apoio e importantssima colaborao e orientao no desenvolvimento deste trabalho. Ao meu grande amigo Eduardo Luiz Heinzen por sua dedicao, incentivo, companheirismo, sempre me apoiando em todo o trabalho, fazendo com que este se concretizasse. Ao Clauber Polese pela realizao dos laudos laboratoriais das amostras de prpolis. Ao Sr. Romeu Hepp por ceder seus animais e sua propriedade para a realizao desse trabalho. A UNESP-Botucatu por ceder o Laboratrio de Microbiologia do Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica e pela realizao das amostras laboratoriais de CCS do leite. Agradeo a Deus pelas pessoas que colocou em meu caminho por todo apoio e carinho, por toda ajuda e incentivo. Aos meus pais Jorge de Abreu Jardim e Ruth Regina Gazzoni Jardim por acreditarem em mim, por tantas vezes que abdicaram de seus sonhos, para realizar os meus. Ao meu irmo Bruno Gazzoni Jardim por seu amor, alegria, carinho e apoio incondicional nas horas difceis de minha vida.

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Ao meu namorado Bruno Borges Deminicis pelo amor, carinho, pacincia, disposio a mim dedicados. Obrigada por estar sempre ao meu lado me divertindo, me promovendo como pessoa, mulher e ser humano. A Suzane Conceio Pantolfi Tostes pela amizade e pelos anos de convivncia na mesma moradia. As minhas amigas por todas as experincias compartilhadas: ngela Hinkel (Anjinha), Andressa de Andrade (Xucra), Camila Hunoff (Camilo), Carine Ferreira de Souza (Cacah), Carolina Mecabo, Elisngela Neuhaus, Fabiane Murakami e Taimara Bernardi. A todos aqueles que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste trabalho. MUITO OBRIGADA

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BIOGRAFIA

JLIA GAZZONI JARDIM, filha de Jorge de Abreu Jardim e Ruth Regina Gazzoni Jardim, nasceu em 04 de novembro de 1986, na cidade do Rio de Janeiro, Estado do Rio de Janeiro. Cursou o 1 Grau no Colgio Sagrada Famlia, concluindo-o em dezembro de 2000 e o 2 Grau na Sociedade Educacional Professor Altair Mongruel SEPAM em Ponta Grossa Paran, concluindo-o em dezembro de 2003. Ingressou em 2006 no curso de graduao em Zootecnia da Universidade Estadual do Oeste do Paran UNIOESTE, campus de Marechal Cndido Rondon onde em dezembro de 2009 obteve o ttulo de Zootecnista.

SUMRIO

AGRADECIMENTOS BIOGRAFIA SUMRIO RESUMO ABSTRACT INTRODUO 2. REVISO DE LITERATURA 2.1. Atividade antimicrobiana da prpolis 2.2. Atividade antiinflamatria da prpolis 2.3. Extrato de prpolis 3. MATERIAL E METODOS 3.1. Anlise do Leite 3.1. Preparo do extrato alcolico de prpolis 3.1.2. Compostos Fenlicos (%) 3.1.3. Teor de Flavonides em Quercetina (%) 3.2. Anlise Estatstica 4. RESULTADOS E DISCUSSO 4.1. California Mastite Teste (CMT) 4.2. Contagem de Clulas Somticas Correlao entre CMT e CCS 4.3. Anlise Microbiolgica do Leite 4.4. Anlise Fsico-qumica da Prpolis 4.4.1. Teores de Compostos Fenlicos e Flavonides 4.4.2. Propriedade Antioxidante 5. CONSIDERAES FINAIS 6. CONCLUSO 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

iii v vi viii ix 1 4 4 5 6 9 9 12 12 12 13 14 15 15 17 18 20 20 21 22 23 24

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RESUMO

JARDIM, Jlia Gazzoni, Universidade Estadual do Oeste do Paran, agosto de 2009, Utilizao de prpolis no controle da mastite bovina. Orientadora: Regina Conceio Garcia. Conselheiros: Erika Cosendey Toledo de Mello Peixoto, Bruno Borges Deminicis. Mastite corresponde inflamao da glndula mamria e apresenta-se de forma clnica ou subclnica. O risco de resduos de antibiticos no leite e a alta relao custo / benefcio, so fatores que devem ser considerados na implantao da terapia durante a lactao. A tolerncia e ausncia de toxicidade conferem prpolis seu valor medicinal quando administrada ao organismo animal. A mastite clnica foi identificada pelo teste da caneca de fundo preto. A mastite subclnica foi identificada pelo California Mastite Teste (CMT), contagem de clulas somticas (CCS) e exame microbiolgico. Foram realizados quatro tratamentos: Grupo 1: uso de 5mL de extrato alcolico de prpolis a 30%, por via oral, durante sete dias consecutivos; Grupo 2: alm do procedimento descrito no Grupo 1, foi utilizado 5mL de prpolis a 30% adicionado de glicerina lquida em igual volume na desinfeco por imerso dos tetos; Grupo 3: uso de extrato alcolico de prpolis a 30% na desinfeco dos tetos e Grupo 4 (controle): os animais foram submetidos aos procedimentos de desinfeco por imerso dos tetos antes e aps a ordenha, rotineiramente empregados pela propriedade. Os resultados foram analisados pelo teste no paramtrico Qui-quadrado em nvel de 5% de probabilidade, que demonstrou no ter havido diferena entre os tratamentos. Este estudo objetivou verificar as atividades teraputicas e anti-spticas da prpolis no controle de mastite bovina. Palavras-chave: Agroecologia, leite, produo orgnica, biodinmica.

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ABSTRACT

JARDIM, Jlia Gazzoni , Universidade Estadual do Oeste do Paran, agosto de 2009, Propolis use in the control of the bovine mastitis. Adviser: Regina Conceio Garcia. Council member: Erika Cosendey Toledo de Mello Peixoto, Bruno Borges Deminicis. Mastitis corresponds to the inflammation of the mammary gland and it comes of clinical form or subclinical. The risk of residues of antibiotics in the milk and the high relationship cost / benefit, they are factors that should be considered in the implantation of the therapy during the nursing. The tolerance and toxicant absence check to your propolis medicinal value when administered to the animal organism. The mastitis clinical was identified by the test of the mug of deep black color. The mastitis subclinical was identified by California Mastitis Test (CMT), somatic count cells (SCC) and exam microbiological. Four treatments were accomplished: Group 1: I use from 5mL of alcoholic extract of propolis to 30%, orally, for seven consecutive days; Group 2: besides the procedure described in the Group 1, it was used 5mL of propolis to 30% added of liquid glycerin in equal volume in the pre-dipping and post-dipping; Group 3: use of alcoholic extract of propolis to 30% in the pre-dipping and post-dipping and I Group 4 (it controls): the animals were submitted to the pre-dipping procedures and post-dipping, routine used by the property. The results were analyzed by the technique of variance non parametric in level of 5% of probability, that demonstrated not to have had difference between the treatments. This study aimed at to verify the therapeutic and antiseptic activities of the propolis in the control of bovine mastitis. Keywords: Agroecology, milk, production organic, biodynamic.

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INTRODUO

O consumidor em diferentes pases exige, cada vez mais, alimentos naturais e de melhor qualidade. O uso de promotores de crescimento, como os antibiticos, j est proibido pelo Mercado Comum Europeu, na avicultura e suinocultura, desde janeiro de 2006. H necessidade de se restringir o uso de antibiticos em humanos e na produo animal (MC CARTNEY, 2005). A demanda por produtos orgnicos e naturais cresce a cada ano, s em 2008 o mercado mundial de orgnicos movimentou 41,5 bilhes de dlares e o Brasil acompanha essa tendncia mundial. O incentivo produo orgnica foi uma das metas do governo em 2005 e vem sendo incentivada at a atualidade (ALVES, 2005). Alm disso, a implantao de medidas de qualidade e controle vem contribuindo para os avanos na produo de alimentos, inclusive sobre a cadeia leiteira. Mudanas nos conceitos de produo exigem que o leite seja produzido em condies higinicas, por animais sadios e que no estejam eliminando resduos de antibiticos ou de outras drogas; essa preocupao no recente e tem sido demonstrada j h muitos anos (LOPES e VIANA, 1996). A fim de garantir produtos de melhor qualidade na mesa do consumidor, a instruo normativa 51 (BRASIL, 2002), regulariza a produo, transporte e venda do leite e produtos lcteos, e est sendo implantada pelo Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento nos diferentes estados brasileiros, devendo estar efetivamente implantada at 2012. constituda de regulamentos tcnicos que padronizam a produo de leite, determinando parmetros de identidade (leite A, B e C) e qualidade (requisitos microbiolgicos e fsico-qumicos), alm de proibir a presena de resduos de antibiticos no leite.

A mastite bovina compromete a qualidade do leite pelo risco de veiculao de agentes patognicos, causando grandes prejuzos para a atividade, sendo citada como a principal doena da bovinocultura leiteira (BRITO e BRESSAN, 1996; VEIGA, 1998; PINTO et al., 2001; CARAVIELLO, 2004). As maiores perdas esto relacionadas diminuio da produo (BRITO e BRESSAN, 1996; HOLANDA JNIOR et al., 2005), responsvel por 66% das perdas diretas. Porm, gastos indiretos com medicamentos, leite descartado, servios veterinrios, descarte prematuro de animais, diminuio do valor comercial dos animais e do leite quando se remunera por qualidade, alm do aumento de mo de obra para realizao de tratamentos, devem ser contabilizados. Alm disso, alteraes na composio do leite como diminuio de casena, gordura e lactose (VEIGA, 1998), prejudicam o rendimento industrial (BRIETZKE, 2004) e o tempo de conservao do produto no comrcio. A mastite caracteriza-se por uma enfermidade multifatorial, e para ser controlada, faz-se necessrio rigoroso monitoramento dos animais, do homem, ambiente, instalaes, manejo de ordenha, entre outros (BRITO, 2000). Assim, esta afeco apresenta difcil controle e erradicao. Quanto mais precocemente for detectada, e tratada maiores chances de recuperao e menores chances de proliferao e contgio entre os animais (SANTOS, 2005a). Animais doentes podem contaminar outros por meio de resduos nos equipamentos de ordenha, assim como pelo contato direto entre eles (VEIGA, 1998; SANTOS, 2003). Portanto, toda propriedade leiteira deve estabelecer rigoroso controle da mastite, incluindo a forma subclnica (VEIGA, 1998), uma vez que o fator que mais contribui para o alto ndice de mastite a durao das infeces (BRITO e BRITO, 2000). Entretanto, a interveno teraputica nos casos subclnicos pouco frequente entre os produtores, principalmente pela necessidade de descarte do leite, quando se utilizam produtos base de antibiticos (SANTOS, 2000). A viabilidade econmica desse tratamento s demonstrada nos casos de apresentao simultnea de mastite clnica em um ou mais quartos do mesmo animal, pois neste caso, j se teria o custo do descarte do leite (SANTOS, 2005b). Alm disso, ainda que se realize o tratamento em apenas um quarto mamrio, os outros tambm podem eliminar resduos antimicrobianos, devido passagem sangunea (BRITO, 2000). Assim, o tratamento da mastite subclnica normalmente protelado at o final da lactao e somente institudo na fase de secagem. Portanto, o no tratamento da mastite subclnica tem sido questionado, pois pode favorecer a evoluo do quadro (SANTOS, 2005d), uma vez que infeces crnicas so mais difceis de se curar (BRITO e BRITO, 2000),

principalmente nas infeces por Staphylococcus aureus, que o principal agente causador de mastite bovina (SANTOS, 2000). A necessidade de interveno farmacolgica unnime, pois a taxa de cura espontnea baixa (SANTOS, 2005a) e as bactrias esto se tornando cada vez mais resistentes aos tratamentos convencionais (SFORCIN, 1996; BRITO, 2000; TAYLOR et al., 2002), porm, seu emprego gerou preocupao quanto presena de resduos no leite. Portanto, determinou-se a busca por solues alternativas que tratem do problema sem gerar descarte do leite. Se os meios alternativos forem eficientes no controle da mastite e envolverem solues naturais e ecologicamente favorveis, estaro em consonncia com a demanda de um mercado consumidor cada vez mais exigente, favorecendo inclusive maior lucratividade atividade leiteira. Ao longo da histria o homem aprendeu a utilizar produtos naturais na medicina e um dos produtos mais utilizados tem sido a prpolis (PEREIRA, 2002). Sua atividade antibacteriana (GARCIA et al.,2004a; GOULART, 2000; FERNANDES JNIOR, et al., 1994, 2001, 2005) e antiinflamatria (ALMEIDA e MENEZES 2002; ORSI et al., 2000; SFORCIN et al., 2002) foram extensivamente estudadas. Porm, a despeito de diversos estudos comprovarem as propriedades farmacolgicas da prpolis, a maioria ocorreu em condies controladas, geralmente em animais de laboratrio (MENEZES, 2005). Assim a necessidade de se realizar ensaios clnicos capazes de determinar as doses a serem administradas e seu real efeito in vivo, a campo, foi considerada (ALMEIDA e MENEZES 2002; MENEZES, 2005, LOGUERCIO et al., 2006 ). Alm disso, a vegetao da regio onde a prpolis coletada (TEIXEIRA et al., 2006; FERNANDES JNIOR et al., 2006) e a gentica da rainha (GHISALBERTI, 1979), podem influenciar sua composio e sua potncia, justificando assim, estudos regionalizados. Portanto, objetivou-se no presente estudo avaliar as atividades teraputicas e anti-spticas da prpolis no controle da mastite bovina.

2. REVISO DE LITERATURA

2.1. Atividade antimicrobiana da prpolis Os efeitos bacteriostticos e bactericidas da prpolis foram demonstrados tanto em bactrias classificadas como Gram positivas como negativas, porm as primeiras apresentaram maior sensibilidade (GOULART, 2000; PINTO et al.,2001; VARGAS et al., 2005; FERNANDES JNIOR et al., 2006). Efeito bactericida sobre bactrias Gram negativas foi demonstrado por Orsi et al.(2005a), entretanto esses autores ressaltaram que os resultados foram dependentes da regio na qual a prpolis foi coletada. Assim, a atividade biolgica da prpolis varia conforme seu tipo (PARK et al., 1998; ALMEIDA e MENEZES, 2002). A prpolis foi classificada, por meio de marcadores qumicos, objetivando a padronizao do produto nas diferentes regies brasileiras (MARCUCCI, 1995). Observou-se efeito inibitrio sobre os gneros Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus e Mycobacterium, principais bactrias causadoras da mastite bovina (GRANGE e DAVEY, 1990; LANGONI et al., 1996; KOO et al., 2002; MIORIN et al., 2003) e efeito parcialmente efetivo em gneros como Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Proteus e Salmonella (GRANGE e DAVEY, 1990; LANGONI et al.. 1996; FERNANDES JNIOR et al., 1995, 1997, 2005). Murakami (2007) utilizou o extrato alcolico de prpolis (EAP) e mel como veculo, via intramamria para o tratamento da mastite subclnica em bovinos. Alm da utilizao do EAP a 30% com glicerina lquida no pr-dipping e ps-dipping. Efeito bactericida em Salmonella foi demonstrado ainda, no controle de raes avcolas (MAZZUCO et al., 1996) e em amostras coletadas de alimento contaminado, causador de enterite em humanos (ORSI et al., 2005a). 4

Garcia et al. (2004a) avaliaram a utilizao de extrato alcolico de prpolis em raes de coelhos, encontraram converso alimentar e ganho de peso relativamente melhores quando estes foram alimentados com raes contendo 0,1% do referido extrato. A adio de prpolis em pequenas quantidades rao melhorou o desempenho dos animais, prejudicando os mesmos quando adicionada em nveis mais elevados (0,3%), porm, no houve alterao dos parmetros bioqumicos sricos dos animais quando ministrada na referida concentrao. Em outro trabalho Garcia et al. (2004b) utilizaram o extrato alcolico de prpolis em raes de coelhos para controle da Pasteurella mutocida, e verificaram uma reduo significativa da carga bacteriana, demonstrado por meio de UFC/mL, presente no lavado traqueobrnquico desses animais. Estes resultados podem ter interferido na melhor converso alimentar e ganho de peso. A susceptibilidade in vitro da Candida albicans prpolis, foi demonstrada por Fernandes Jnior et al. (1994). No ano seguinte, apontaram pela ordem decrescente de susceptibilidade, os seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus , Cndida albicans, Cndida guilliermondi, Cndida parapsilosis, Staphylococcus typhimurium, Escherichia coli. Azevedo et al. (1999) utilizaram prpolis em candidase oral em humanos e verificaram sensibilidade em 95,71% das amostras utilizadas, porm observaram resistncia para as espcies C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata. Entretanto, sua eficincia em C. albicans e C. tropicalis foi demonstrada mais tarde (SFORCIN et al., 2001). Biachini e Bedendo (1998) demonstraram seu efeito inibitrio em bactrias fitopatognicas quando inoculadas em meio de cultura contendo 10% de extrato aquoso de prpolis. 2.2. Atividade antiinflamatria da prpolis Mirzoeva e Calder (1996) atriburam ao cido cafico, quercetina, narigenina e ao ter fenlico do cido cafico as propriedades antiinflamatrias da prpolis. Substncias conhecidas capazes de inibir a inflamao como cido saliclico, apigenina, cido felrico e galangina foram identificadas na prpolis por Krol et al. (1996). A supresso de prostaglandinas e leucotrienos de macrfagos (MIRZOEVA e CALDER, 1996; BORRELI et al., 2002) e incremento na liberao de histamina (ORSI et al., 2005b) seriam os principais responsveis por este efeito.

A sntese de prostaglandinas e xido ntrico foram associados a processos inflamatrios e carcinognicos (LIANG et al., 1999). Esses autores demonstraram a capacidade inibitria de diversos flavonides, dentre eles a apigenina, sobre a transcrio de RNAm na sntese de ciclooxigenase, enzima necessria formao desses elementos. Entretanto, Orsi et al. (2000) avaliaram o efeito da prpolis sobre ativao do sistema macrofgico pelo oxignio, os resultados obtidos apontaram discreta elevao de H2O2 e inibio sobre a formao de xido ntrico, dependente de sua concentrao. Almeida e Menezes (2002) realizaram extensa reviso sobre o efeito antiinflamatrio da prpolis in vitro e verificaram a necessidade de maiores estudos in vivo. Sforcin (1996) comprovou ao imunoestimulante da prpolis, demonstrando in vitro, aumento da atividade ltica das clulas natural killer sobre clulas tumorais de ratos tratados com extrato hidroalcolico de prpolis a 10%. Adicionalmente, os flavonides tm ao antioxidante, minimizando a peroxidao lipdica e o efeito dos radicais livres, esta propriedade foi confirmada pela inibio da oxidao do perxido de hidrognio no luminol, evidenciado por meio de espectrofotometria eletrnica (MARCUCCI et al., 2005; KROL et al., 1990). Arteriosclerose, cardiopatias e derrames so alguns problemas relacionados s oxidaes dos cidos graxos poliinsaturados e que aparecem com menor risco naqueles que ingerem maiores quantidades de flavonides, como alimentos vegetais e vinho tinto (MARCUCCI et al., 2005). 2.3. Extrato de prpolis A Instruo Normativa n0 3, de 19/01/2001, do Departamento de Inspeo de Produtos de Origem Animal, do Ministrio da Agricultura e Abastecimento (IN3), padroniza a composio, propriedades fsicas, qumicas, caractersticas sensoriais, alm de regulamentar condio para comercializao e consumo dos extratos de prpolis. A prpolis bruta obtida com auxlio de coletores ou por raspagem manual e realizam-se a remoo de impurezas como restos de madeira, abelhas, favo, folhas, traas e outras incluses mais presentes, quando o processo de obteno se d por meio de raspagem (GOULART, 2000; SILVA, 2003b). A triturao ou fragmentao foi utilizada por diversos autores (SARTORI et al., 1994; SFORCIN, 1996; GOULART, 2000, DANTAS et al., 2006) a fim de aumentar as superfcies de contato, apressando o processo de extrao. A pulverizao por alta 6

rotao no recomendada por Silva (2003a), pois partes dos componentes ativos podem ser destrudos pelo aquecimento e atrito entre a prpolis e as ps do equipamento (liquidificador). Com a finalidade de prevenir o crescimento de microrganismos contaminantes, conservam-se a prpolis bruta, at o momento do preparo do extrato, a uma temperatura que varia de -4oC a -10o C (SARTORI et al., 1994; SFORCIN, 1996; GOULART, 2000; DANTAS et al., 2006). A prpolis bruta encontra-se no estado slido e por ser uma resina, no solvel em gua (KONISHI et al., 2005). Para separar a poro resinosa da balsmica, ou seja, extrair os princpios ativos da prpolis so necessrios solventes e, de preferncia, incuos ao consumo humano. lcool de cereais e lcool neutro purificado (obtido da cana de acar) podem ser utilizados, desde que contenham no mximo 70o GL (BRASIL, 2000), ou seja, 7 partes de lcool para 3 partes de gua, o equivalente a 70% de lcool absoluto (SILVA, 2003a), etanol (SAWAYA et al., 2004), acetona (DANTAS et al., 2006), lcool etlico isolado (FERNANDES JNIOR, 1994; SFORCIN, 1996; GOULART, 2000; ORSI et al., 2005) ou em associao a outras substncias como propilenoglicol, polissorbato 80, lauril sulfato de sdio (KONISHI et al., 2005), tambm foram utilizados como solventes. Extrato de prpolis a 30% (30g de prpolis bruta para cada 100 mL de solvente) frequentemente utilizado (GOULART, 2000; SFORCIN et al., 2001; KONISHI et al., 2005; ORSI et al., 2005b). Porm maiores propores, 50%, 60%, 70% e 80% tambm foram testadas (PARK et al., 1998; KOO et al., 1999; CUNHA et al., 2004; VARGAS et al., 2004; DANTAS et al., 2006), sendo que maiores proveitos foram obtidos a partir de extratos a 50% (SAWAYA et al., 2004) e 70% (CUNHA et al., 2004). Park et al. (1998) verificaram que os extratos etanlicos de prpolis entre 60 a 80% inibiram satisfatoriamente o crescimento microbiano e apresentaram ao antioxidante a 70 e 80%. Essa proporo dever ser obtida pela pesagem da prpolis e solvente, volume a volume ou peso a peso. Porm essa percentagem se refere base da matria natural, sendo que a base da matria seca pode ser determinada por evaporao em estufa 50oC durante 24 horas (GOULART, 2000), obtendo-se a concentrao em g/mL. O Ministrio da Agricultura determina que o extrato deva apresentar no mnimo 11% de extrato seco, tambm denominado de slidos solveis totais (SILVA, 2003a). A maneira mais precisa de se quantificar compostos fenlicos e flavonides utilizando-se cromatografia lquida de alta eficincia (FUNARI,2006). Entretanto, tcnicas como espectrometria pode representar uma alternativa mais simples, de

menor custo e possibilitar anlises rpidas, de amostras numerosas em laboratrios mais modestos (ADELMANN, 2005). Considerando-se que a composio qumica da prpolis extremamente complexa e que pode variar em at 300 componentes (CASTRO et al., 2001 e TEIXEIRA, et al, 2006), e considerando-se ainda que os compostos fenlicos e flavonides tm sido responsabilizados pelas principais atividades teraputicas da prpolis (GHISALBERTI, 1979; GRANGE e DAVEY, 1990; MARCUCCI, 1995; PARK et al 2000; MARCUCCI, et al. 2005; ANDRA, et al., 2005). Para realizar a infuso do extrato de prpolis, o frasco deve ser protegido do calor e luz solar direta (SARTORI et al., 1994; FERNANDES JNIOR, 1995; GARCIA et al., 2004a e b) a fim de se prevenir foto degradao. Entretanto, CUNHA et al. (2004) no observaram efeito da luminosidade sobre a extrao dos teores fenlicos totais, que variou de 6,41 e 15,24% em extratos etanlicos (70% volume para volume) obtidos pela macerao da prpolis. A agitao frequente em tempos variados foi realizada por GARCIA et al. (2004a e b), trs vezes ao dia (FERNANDES JNIOR, 1994) ou a cada trs dias (SILVA, 2003a). Para isso utiliza-se p ou colher de material atxico e inerte como madeira, plstico (poliamida) ou ao inox (SILVA, 2003a). Esse perodo de infuso pode variar de 7 dias (FERNANDES JNIOR, 1994; SFORCIN, 1996; GOULART, 2000), 10 a 30 dias (CUNHA et al., 2004, KONISHI et al., 2005), 35 a 45 dias (SILVA, 2003a). Aps a ltima agitao, SILVA (2003a) recomendou deixar decantar por trs dias ou mais e remover com auxlio de sifo o sobrenadante. Realiza-se a seguir a filtragem, embalagem e rotulagem do extrato, que deve possuir no mnimo 11% de extrato seco (BRASIL, 2000). Os primeiros resultados referente qualidade da prpolis foram os publicados por Bankova et al. (1992), Bonvehi e Coll (1994) e Bonvehi et al. (1994). No Brasil, utilizam-se as normas do Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade do Extrato de Prpolis, presentes na normativa N. 03, de 19 de Janeiro de 2001 do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento - MAPA (BRASIL, 2001), que visa manter a qualidade do extrato alcolico de prpolis brasileiro e determinar os requisitos mnimos de qualidade destinada ao comrcio nacional.

3. MATERIAL E METODOS

O presente estudo foi realizado na Granja Hepp, caracterizada como sistema familiar, no municpio de Marechal Cndido Rondon na latitude de 243340S, longitude 540412 W e altitude mdia de 420m (IAPAR, 1978). A propriedade apresenta rea de 5,4 hectares destinada ao pastejo, dividida em 27 piquetes formados por Tifton 85 (Cynodon sp). Os trabalhos foram iniciados em Novembro de 2007 e finalizados em Fevereiro de 2008. Avaliou-se 288 quartos mamrios em 72 fmeas plurparas da raa Holands Preto e Branco e seus cruzamentos, entre trs a seis lactaes e em fase inicial da lactao, at 90 dias do parto, com produo mdia diria de 20 litros de leite por animal. Os animais foram ordenhados duas vezes ao dia por meio de ordenhadeira mecnica canalizada e balde ao p. Foram excludos todos os animais livres de mastite ou portadores da forma clnica da doena. Para tanto, realizaram-se exames clnicos e complementares O exame clnico especial foi realizado em duas etapas, antes e aps a ordenha, objetivando detectar diferenas no tamanho ou formato dos tetos, aumento de linfonodo retro-mamrio, reaes inflamatrias, atrofia do aparelho mamrio, entre outros sinais 3.1. Anlise do Leite

Inicialmente, foram utilizados teste da caneca de fundo preto e Califrnia Mastite Teste (CMT) no diagnstico da mastite clnica e subclnica respectivamente. Optou-se pela realizao do CMT por ser considerado um exame eficiente e prtico 9

para ser executado durante a ordenha (VEIGA, 1998); sendo amplamente utilizado no diagnstico da mastite subclnica e se baseia na presena de clulas somticas no leite (SPEXOTO, 2003). O teste da caneca de fundo preto foi utilizado antes da primeira ordenha do dia, a partir da coleta dos trs primeiros jatos de leite de cada quarto mamrio, em um recipiente de fundo preto, para pesquisa de grumos, cogulos, pus ou outras alteraes. O Califrnia Mastite Teste (CMT) foi realizado em recipiente plstico, com quatro compartimentos iguais de 1,5cm de altura, onde foram coletados 2mL de leite de cada quarto mamrio separadamente. Foi adicionado, em igual volume, reagente prprio (Lauril sulfato de sdio a 3%), detergente aninico corado com Bromocresol prpura, e por meio de movimentos circulares realizou-se a mistura durante 20 segundos (SCHALM e NOORLANDER, 1957). O resultado foi utilizado para classificar os animais em 4 categorias: 0( zero) representa todos os animais cujos exames no apresentaram reao; 1 atribudo de acordo com leve reao e formao de gel (escore +), 2 para formao mais espessa com mamilo central (escore ++) e 3 formao de gel muito espesso aderente ao fundo do recipiente (escore +++). O quarto mamrio foi considerado positivo para mastite subclnica quando apresentou escores 1+, 2+ ou 3+ e negativo na ausncia de reao. Para as amostras de leite provenientes dos tetos que apresentaram resultados positivos ao CMT, realizou-se a Contagem de Clulas Somticas (CCS), alm da anlise microbiolgica individual. Para tanto, as amostras foram encaminhadas ao Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista Campus de Botucatu. Para a CCS utilizou-se aparelho eletrnico Somacount 300 (Bentley), e valores maiores ou iguais a 200 mil clulas somticas por mililitro de leite foram considerados positivos para mastite subclnica, de acordo com Ruegg (2008). O controle microbiolgico foi realizado a partir de amostras de leite de cada quarto mamrio separadamente. Para realizar a coleta de leite e posterior isolamento dos microrganismos presentes nas amostras de leite, as mos do coletor foram lavadas, desinfetadas (lcool 70%) e enluvadas. As tetas foram lavadas com gua para remoo de sujidades provenientes de camas, poeira, fezes, etc. e procedeu-se secagem pelo uso de papel toalha. Posteriormente, foi realizada a desinfeco das extremidades das tetas com algodo embebido com lcool 70%, conforme recomendaes de Brito e Brito (1999). As coletas de leite foram realizadas antissepticamente, em frascos estreis, transportadas sob refrigerao em caixa trmica temperatura de 4-5 C e mantidas congeladas -18 C. Aps o trmino do perodo de coleta, as amostras congeladas 10

foram enviadas ao laboratrio para realizao da cultura, de acordo com Brito e Brito (1999). O controle microbiolgico das amostras de leite de cada quarto mamrio foi realizado separadamente e posterior isolamento dos microrganismos presentes em cada coleta. As coletas de leite foram realizadas assepticamente, em frascos estreis, mantidas refrigeradas temperatura de 4-5
o

C e enviadas ao laboratrio de

microbiologia do Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica da UNESP, Botucatu SP em 24 horas para realizao da cultura de acordo com Brito e Brito (1999). Neste laboratrio, foram realizados cultivos microbiolgicos com 0,1 mL de leite em placas de Petri contendo meios de gar-sangue ovino a 5% e Mac Conkey gar, incubando-se a 37C. Realizaram-se as leituras das placas s 24, 48 e 72 horas, observando-se a morfologia das colnias, alm da quantidade desenvolvida. Adicionalmente as amostras foram examinadas em lminas de vidro, coradas pelo mtodo de Gram, para verificar-se ao microscpio tico, alm da morfologia bacteriana sua caracterstica morfotintorial. Os microrganismos foram repicados para meio de caldo crebro-corao (BHI) para realizao das provas taxonmicas, segundo Krieg e Holt (1984), Carter e Cole Junior (1990) e Quinn et al. (1994). Todos os exames supracitados foram realizados no momento imediatamente anterior ao incio dos tratamentos (dia zero) e posteriormente, nos dias sete e 14 aps o incio dos tratamentos. A eficcia da desinfeco dos tetos foi avaliada de acordo com National Mastitis Concil (HOGAN et al.,1990). Realizaram-se quatro tratamentos, onde os animais do grupo (1) foram submetidos ao tratamento da mastite subclnica pelo uso de 10mL de extrato alcolico de prpolis (EAP) a 30%, por via oral, durante 7 dias consecutivos, aps cada ordenha. Nos animais do grupo (2), alm do procedimento descrito para o grupo 1, foi utilizado 5ml EAP adicionado gua filtrada e fervida em igual volume para imerso dos tetos, no momento imediatamente anterior ao procedimento da ordenha. Este procedimento repetiu-se aps a ordenha, entretanto, para esse momento, substituiu-se o veculo aquoso por glicerina lquida em igual volume (5 mL). O tempo de imerso foi de aproximadamente 30 segundos, alcanando todo comprimento dos tetos. Para os animais constituintes do grupo (3), administrou-se lcool de cereais (10 mL), via oral, por sete dias consecutivos, e os animais constituintes do grupo controle-testemunha (4) no foram submetidos a nenhum tipo de tratamento, a no ser aquele rotineiramente utilizado pela propriedade (limpeza das tetas com gua de torneira e secagem com toalha; antes da ordenha).

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3.1. Preparo do extrato alcolico de prpolis A prpolis bruta foi coletada por raspagem, na regio do municpio de Marechal Cndido Rondon PR; foi fragmentada, pesada e mantida temperatura de -4C at o momento do preparo do extrato (SARTORI et al. 1994; SFORCIN, 1996; GOULART, 2000; DANTAS et al., 2006). Para obteno dos princpios ativos foi utilizado como solvente, lcool de cereais na proporo de 30%, pesando-se tanto a prpolis quanto o solvente, para (GOULART, 2000; SFORCIN, et al. 2001; KONISHI, et al., 2005; ORSI, et al. 2005b). O extrato foi acondicionado em frascos de colorao mbar e mantido ao abrigo da luz (SARTORI et al., 1994; FERNANDES JNIOR, 1995; GARCIA et al, 2004a e b). Durante o perodo de extrao procedeu-se agitao diariamente, em tempo de trinta segundos, uma vez ao dia, durante os 30 dias consecutivos. Aps esse perodo o extrato de prpolis foi obtido por meio de filtrao. As anlises fsico-qumicas foram executadas de acordo com Orsi et al. (2000) e realizadas no laboratrio de Tecnologia de Produtos de Origem Animal (TPOA) da Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE) 3.1.2. Compostos Fenlicos (%) Para a determinao da porcentagem de compostos fenlicos, foram pesados 2,5mL dos EAP (P1). Em seguida adicionou-se 7mL de lcool etlico e 0,5mL de acetato de chumbo a 10%. A soluo foi agitada e deixada em repouso por 24 horas, em temperatura ambiente. Aps este perodo de tempo, a soluo foi filtrada em papel de filtro, previamente pesado (P2), e mantido a temperatura ambiente por 12 horas. Em seguida, o papel de filtro foi colocado em estufa a 50C por uma hora e novamente pesado (P3). A porcentagem de compostos fenlicos foi determinada atravs da seguinte frmula: Compostos Fenlicos (%) = ((P3 P2)/P1) x 100 3.1.3. Teor de Flavonides em Quercetina (%) Uma alquota de 0,4mL foi retirada dos EAP e transferida para balo volumtrico de 25mL. Em seguida, acrescentou-se 0,5mL de cloreto de alumnio a 5% em metanol absoluto, completando-se o balo com metanol. A soluo foi agitada e colocada em repouso por 30 minutos ao abrigo de luz. Decorrido este perodo de tempo, a soluo foi colocada em espectrofotmetro de U.V. a 425nm, para leitura da 12

absorbncia. Para zerar o aparelho, foi utilizado metanol absoluto. Para o preparo do padro, foi utilizada quercetina: 0,2mg/mL de quercetina foi transferida para balo volumtrico de 25mL, acrescentando-se a seguir 0,5mL de cloreto de alumnio em metanol a 5%. O balo foi completado para 25mL com metanol. A soluo foi agitada e mantida em repouso por 30 minutos ao abrigo de luz (POPOVA, 2005). O teor de flavonides totais em quercetina foi determinado de acordo com a frmula: Teor de Flavonides (mg/mL) = Leitura da amostra x Massa do Padro Leitura do padro x Volume da amostra 3.2. Anlise Estatstica O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com quatro tratamentos e 72 repeties ( ver se so os animais ou os tetos) Para a anlise estatstica dos dados foi aplicado o teste no paramtrico Quiquadrado em nvel de 5% de probabilidade. A distribuio da ocorrncia do CMT, segundo a intensidade nos grupos e momento de avaliao, foi apresentada por meio da estatstica descritiva envolvendo a frequencia absoluta e percentual (ZAR, 1999). O estudo do CMT e da CCS segundo os grupos e os tetos dos animais foi analisado pela tcnica de varincia ANOVA no paramtrica para o modelo de medidas repetidas em grupos independentes, complementada com os respectivos testes de comparaes mltiplas, no nvel de 5% de significncia (ZAR, 1999). A indicao da significncia foi realizada por meio de letras colocadas ao lado das medidas descritivas [mediana (valor mnimo mximo)]. Duas medidas seguidas de uma mesma letra minscula no diferem (P> 0,05) quanto aos respectivos grupos fixados o momento de avaliao, e duas medianas seguidas de uma mesma letra maiscula no diferem (P> 0,05) quanto aos respectivos momentos de avaliao dentro do grupo considerado. A anlise no paramtrica de Spearman 5% de significncia foi utilizada para calcular a correlao entre CMT e CCS.

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4. RESULTADOS E DISCUSSO

H muito a mastite bovina vem sendo citada como principal doena da bovinocultura leiteira (BRITO e BRESSAN, 1996; VEIGA, 1998; PINTO et al., 2001; CARAVIELLO, 2004). Seu impacto econmico permite consider-la como a mais onerosa afeco desta atividade (BRITO e BRITO, 2000; CARAVIELLO,2004), apresentando-se amplamente disseminada nos rebanhos (BRITO e BRITO, 2000). Corroborando com esses achados, o presente estudo avaliou 72 fmeas bovinas em lactao e observou incidncia em 98,70% dos animais. Esta enfermidade pode apresentar-se sob a forma clnica e subclnica, neste estudo foram observados sinais clnicos como hiperemia, edema e dor palpao nas glndulas afetadas por mastite clnica diferindo das ocorrncias subclnicas, onde o diagnstico exige exames complementares. Porm, a forma subclnica representa maior impacto na produtividade leiteira devido a sua maior prevalncia (VEIGA, 1998; RIBAS, 1999; FONSECA e SANTOS, 2000; BRITO e BRITO, 2000; SANTOS, 2005a). Corroborando com isso, observou-se menor prevalncia da forma clnica (5,26%) em relao subclnica (94,73%). Ribas (1999) verificou que 20 % das fmeas em produo de um determinado rebanho, apresentaram mastite em um ou mais quartos do bere, sendo 97% sob a forma subclnica. Fonseca e Santos (2000) verificaram que em mdia, 40% dos animais do rebanho brasileiro apresentam mastite subclnica e que o ideal seria no ultrapassar 15 a 20%.

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4.1. California Mastite Teste (CMT) Com relao aos resultados referentes ao Califrnia Mastite Teste, para o presente experimento, no foram demonstrados diferenas entre os grupos e o momento de avaliao (Tabela 1). Porm, Murakami (2007) observou uma diminuio de 45% no grau de infeco do teto atravs do CMT, aps sete dias de tratamento. Tabela 1. Medidas descritivas (mdia aritmtica, desvio padro e mediana) em porcentagem do Califrnia Mastite Teste segundo o grupo e o momento de avaliao (T0 - imediatamente anterior ao tratamento; T7 - sete dias e T14 - 14 dias aps o incio dos tratamentos).

Grupo Oral Oral e Imerso lcool Controle

T0 3,25 0,89 4,00 aA 3,25 0,88 3,50 aA 3,32 0,85 4,00 aA 3,46 0,71 4,00 aA

Momentos de avaliao T7 3,00 1,15 3,00 aA 3,62 1,03 4,00 aA 3,04 1,09 3,00 aA 3,30 0,92 4,00 aA

T14 2,60 1,37 2,00 aA 2,81 1,28 3,50 aA 2,56 1,22 2,00 aA 2,84 1,12 3,00 aA

Mdias com mesma letra na coluna e linha no diferem entre si Mdias com letra diferente na coluna e linha diferem entre si

4.2. Contagem de Clulas Somticas A contagem de clulas somticas parmetro para avaliao da qualidade do leite (BRASIL, 2002) e est diretamente relacionada ao grau de infeco da glndula mamria. Corroborando com estas informaes, o presente estudo verificou que em 174 amostras de leite que apresentaram valores de CCS acima de 200 mil clulas/mL, 86,20% apresentaram infeco mamria clnica. Costa et al (2007) consideraram que animais livres de mastite apresentam contagens de at 100 mil clulas/mL. J Veiga (1998), Thiers (1999), Brito e Brito (2000), Souza (2005) e Ruegg (2008) consideraram valores acima de 200 mil clulas/ml, indicativos de mastite subclnica. Fonseca e Santos (2000), admitiram o intervalo de 200 a 400 mil clulas/ml; entretanto Paschoal et al. (2003) e Spexoto (2003), indicaram apenas valores acima de 300 mil clulas/mL. Desta forma, o

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presente estudo considerou o limite de 200 mil clulas/mL, como limite mximo para animais sadios. Com relao ao diagnstico de infeco mamria, considerou-se que a sntese e secreo do leite nos alvolos mamrios um processo praticamente assptico, e que em geral a principal via de infeco a ascendente pelo canal do teto (HILLERTON, 1996). Porm, uma vez alcanado o interior da glndula mamria, pequeno nmero de microrganismos j suficiente para desencadear a infeco, j que as condies so extremamente favorveis ao seu desenvolvimento e proliferao. Dessa forma, assim como considerado por Sargeant et al. (2001), para o presente estudo, o mnimo de crescimento bacteriano observado nos meios de cultivo, foi relacionado ocorrncia de infeco. As medidas descritivas referentes CCS foram avaliadas entre os grupos (Tabela 2); observando-se diminuio significativa apenas aps 14 dias do tratamento, entretanto, essa diminuio ocorreu dentro dos grupos avaliados. Em relao ao momento anterior aos tratamentos (T0), observou-se diminuio na contagem de clulas somticas em todos os grupos, inclusive no grupo controle, e este fato provavelmente ocorreu devido aos maiores cuidados higinicos despendidos pelos ordenhadores, durante o perodo experimental. Provavelmente este fato foi decorrente da presena de nossa equipe no ambiente da ordenha. Tabela 2. Medidas descritivas (mdia aritmtica, desvio padro e mediana) nmeros absolutos da contagem de clulas somticas (CCS x 10) segundo o grupo e o momento de avaliao (T0 - imediatamente anterior ao tratamento; T7 - sete dias e T14 - 14 dias aps o incio dos tratamentos). Momentos de avaliao T7 574,67 693,74 314,50 aB 886,53 1087,64 482,50 aC 589,68 696,91 0394,00 aB 528,46 510,03 445,50 aB

Grupo Oral Oral e Imerso lcool Controle

T0 583,60 668,61 395,50 aB 514,00 677,01 263,50 aB 543,08 547,59 394,00 aB 535,03 511,93 402,50 aB

T14 134,32 168,76 67,00 aA 141,37 190,60 41,00 aA 158,64 426,59 49,00 aA 97,96 111,71 65,00 aA

Mdias com mesma letra na coluna e linha no diferem entre si Mdias com letra diferente na coluna e linha diferem entre si

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Murakami (2007) utilizando prpolis para controle da mastite bovina observou uma diminuio na CCS de 83% dos tetos aps sete dias de tratamento quando submetidos imerso com prpolis. Corroborando com o presente estudo, que apresentou uma diminuio de 84,45% na CCS aps quatorze dias de tratamento, porm, nenhuma diferena significativa entre os grupos foi encontrada. O manejo de desinfeco antes e aps a ordenha e medidas de higiene como manter tetos limpos e secos so medidas que contribuem profilaticamente para amenizar o problema. A imerso de tetos em solues anti-spticas pode reduzir novas infeces em 50 a 90% dos casos (PEDRINI e MARGATHO, 2003), desta forma, um manejo preventivo utilizando o EAP a 30% na imerso dos tetos antes e aps a ordenha, demonstrou efetivo no controle da mastite. Correlao entre CMT e CCS Os resultados provenientes do CMT correspondem s variveis qualitativas ordinrias e os da CCS so variveis quantitativas (Tabela 3), para se efetuar os clculos de correlao (r), procedeu-se a codificao da CCS conforme Barbosa, et al. (2002) e realizou-se anlise no paramtrica de Spearman 5 % de significncia. Tabela 3- Correlao do Califrnia Mastite Teste (CMT) e Contagem de Clulas Somticas (CCS) nos momentos avaliados: imediatamente anterior ao tratamento (T0), sete dias (T7) e 14 dias (T14) aps o incio dos tratamentos

Associao CMTT0xCCST0 CMTT7xCCS T7 CMTT14xCCST14

Oral (28) 0,839(P<0,01) 0,839(P<0,01) 0,532(P<0,05)

Prop+Pre (32) 0,814(P<0,01) 0,580(P<0,01) 0,588(P<0,01)

lcool (25) 0,823(P<0,01) 0,721(P<0,01) 0,265(P>0,05)

Controle (26) 0,856(P<0,01) 0,838(P<0,01) 0,124 P>0,05)

A correlao desses exames foi demonstrada em bovinos (BRITO et al., 1997; BARBOSA et al., 2002), bubalinos (JORGE et al., 2005), caprinos (SILVA et al., 2001), assim como pelo presente experimento, onde apresentou valores oscilantes, conforme o momento de avaliao. Esses valores corresponderam a 0,71, 0,61 e 0,32 para os momentos imediatamente anterior aplicao dos tratamentos, 7 e 14 dias aps, respectivamente. Correlaes variadas tambm foram registradas por Brito et al., (1997). Esses autores relataram que, apesar do CMT ser um timo teste para o diagnstico de mastite subclnica, possui carter subjetivo e dependente da interpretao de quem o

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realiza. Relataram que sua classificao em escores pode ocasionar tanto resultados falsos positivos quanto falsos negativos, sendo indicada a CCS como mtodo diagnstico mais seguro. Alm disso, nem sempre foi possvel demonstrar similaridade entre os resultados do CMT e CCS (ZAFALON et al., 2005; FERREIRA et al., 2007). Zafalon et al., (2005) observaram ainda que a eficincia diagnstica de 81,0% e 87,1% para ambas as provas foi maior quando a mastite subclnica era causada por Staphylococcus aureus. Porm quando comparada com infeces causadas por Corynebacterium bovis demonstrou eficincia de 60,5% para CMT e 76,7% para CCS. Enquanto Ferreira et al., (2007) avaliaram 26 animais em trs momentos e no observaram correlao entre os resultados do CMT e CCS. 4.3. Anlise Microbiolgica do Leite A qualidade microbiolgica do leite pode indicar a qualidade sanitria do rebanho e condies higinicas da produo (FONSECA e SANTOS, 2000), sendo que a identificao dos microrganismos causadores da mastite importante tanto para implementao de mecanismos de controle como para monitoramento do rebanho (SANTOS, 2005c). Brito e Brito (2000), recomendaram o acompanhamento dos rebanhos, por meio de exames microbiolgicos e testes quantitativos (CCS) como medida preventiva mastite, alm da realizao de exames bacteriolgicos em animais de reposio, antes de serem incorporados ao rebanho. A pesquisa de agentes causadores da mastite contribui para taxa de cura, uma vez que h relao entre os microrganismos encontrados e os locais nos quais esto presentes, possibilitando a implantao de medidas de controle especficas e direcionadas (VEIGA, 1998). A mastite bovina caracteriza-se por processo inflamatrio da glndula mamria, podendo ser de origem traumtica, infecciosa, txica e alrgica (HOLANDA JNIOR et al., 2005), contudo, a causa bacteriana considerada mais frequente. Corroborando com essas informaes, no momento imediatamente anterior ao incio do presente estudo, registrou-se crescimento bacteriano em 79,81% das amostras, aps anlise individual do leite proveniente de 109 tetos mamrios. Entretanto, esse crescimento bacteriano, ocorreu apenas nas amostras inoculadas no meio de cultura Agar sangue, ressaltando que 100% das amostras foram negativas para o cultivo em Mc Conkey gar. Considerando-se que o meio Agar sangue apropriado para o crescimento de bactrias aerbias, principalmente enterobactrias e considerando-se ainda que o 18

meio Mac Conkey gar destina-se deteco e isolamento de coliformes, geralmente presentes na mastite clnica, a ausncia de crescimento neste meio concorda com os resultados apresentados pelo CMT e teste da caneca preta; uma vez que um dos critrios utilizados para seleo dos animais foi ausncia de mastite clnica. Os patgenos mais comuns da mastite podem ser divididos naqueles que causam infeces subclnicas, de longa durao, como Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactie, Mycoplasma bovis, Corynebacterium bovis e os que esto presentes no ambiente, por no encontrarem-se totalmente adaptados glndula mamria, causam mastite clnica de curta durao, como Escherichia coli, espcies de Klebsiella, Enterobacter alm de outros Streptococcus (no agalactie). Esses ltimos so os coliformes gram-negativos mais comumente associados mastite bovina (HILLERTON, 1996; BRITO e BRITO, 2000). Corroborando com esses achados, a Tabela 4 apresenta os patgenos e suas respectivas frequncias, em percentagem, nos diferentes momentos experimentais, na qual o Staphylococcus aureus continua sendo apontado como principal agente causador de mastite bovina (SANTOS, 2000, ALBERTON, 2000). O presente estudo observou ocorrncia de Staphylococcus aureus em 47,22% das amostras, valor este semelhante ao encontrado por Vieira-da-Motta et al. (2001), que foi de 39,7%. Tabela 4. Principais microrganismos isolados das amostras de leite com suas respectivas ocorrncias em porcentagem nos diferentes grupos experimentais, antes da aplicao dos tratamentos (T0), sete (T7) e 14 (T14) dias aps Momentos T7 24,03 33,65 3,84 12,5 8,65 1,92 10,57

Microrganismos Staphylococcus ssp Staphylococcus aureus Streptococcus agalctiae Streptococcus dysgalactiae Streptococcus uberis Streptococcus intermedius Corynebacterium bovis

T0 20,19 42,3 19,23 8,65 14,42 0,00 6,73

T14 20,19 40,38 3,84 8,65 3,84 0,00 8,65

*T0 - antes da aplicao dos tratamentos, T7 - sete e T14 - 14 dias aps aplicao dos tratamentos.

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4.4. Anlise Fsico-qumica da Prpolis 4.4.1. Teores de Compostos Fenlicos e Flavonides O presente estudo utilizou prpolis, proveniente da regio de Marechal Cndido Rondon PR, e indicou teores de 55,5% e 11,92% de compostos fenlicos e flavonides, respectivamente. O mnimo de compostos fenlicos e flavonides, exigido 0,50% e 0,25% respectivamente (BRASIL, 2001). Dessa forma, pode-se observar que a amostra avaliada enquadra-se nos padres de qualidade. Alm disso, esses valores esto de acordo com as mdias encontradas por diferentes pesquisadores, embora haja variao dependente de inmeros fatores como: poca do ano (SILVA et al., 2006; CASTRO et al., 2007), tipo de abelha (FERNANDES JNIOR et al., 2001), regio onde a prpolis foi produzida (KOSALEC et al., 2005; FERNANDES JUNIOR et al., 2006; MULI et al., 2007) e procedimento utilizado no preparo do extrato (CUNHA et al., 2004; SAWAYA et al., 2004; MULI et al., 2007). Bonhevi e Cool (1994) encontraram valores de compostos fenlicos em torno de 10,1% para prpolis brasileira, valor semelhante ao encontrado neste estudo. Maldonado (2000) que encontra valores de compostos fenlicos, variando entre 0,42% a 36,04%. Massuda (2003) obteve porcentagem de compostos fenlicos, em extratos alcolicos de prpolis, variando de 5,09 a 5,48%, e Sato (2003) observou variao entre 0,01% e 9,30%. Cunha et al., (2004) verificaram variao entre 6,41% e 15,24%, nos teores de fenis totais de extrato etanlico de prpolis a 70%, proveniente de So Paulo e Minas Gerais, enquanto Silva et al., (2006) encontraram valores de cidos fenlicos variando de 2,93 a 8,13% e de flavonides 0,19 a 0,38% em amostras de prpolis do Estado da Paraba. Gonsales et al. (2006), verificaram variaes entre 0,5 a 0,63% nos teores de flavonides em extrato etanlico de prpolis a 70%, em So Paulo, e Pavanelli et al. (2007), analisaram trs tipos de extrato etanlico de prpolis coletados em Campo Grande MS, e encontraram valores mdios de 40,15 % para compostos fenlicos e 3,16% para flavonides. Souza et al. (2007) verificaram o teor de flavonides totais em amostras de prpolis provenientes do Estado de So Paulo (regio de Franca) e Minas Gerais (regio de Passo) e encontraram valores de valores de 0,06% a 0,38% para So Paulo e entre um amplitude de variao de 0,12 a 2,11% para os teores de flavonides totais, tambm nas regies de So Paulo e Minas Gerais.

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Essa elevada variabilidade de compostos fenlicos na prpolis deve-se provavelmente a diferentes fontes de exsudado vegetal, bem como localizao do apirio (MOURA, 2001). Entretanto, apesar dessa variao, verificou-se que prpolis de diferentes regies, mantiveram suas propriedades antibacteriana (KUJUMGIEV et al., 1999; GONSALES et al., 2006), antifngica (KUJUMGIEV et al., 1999) e antiviral na maioria das amostras avaliadas (KUJUMGIEV et al., 1999). Dessa forma a ao qumica e biolgica da prpolis, depende de diferentes combinaes (FARNESI, 2007). Sforcin et al. (2005) e Scazzocchio et al. (2005), j haviam abordado mltiplos mecanismos sinrgicos envolvidos na atividade antimicrobiana da prpolis, indicando interao entre seus constituintes. Assim, apesar do esforo de diferentes grupos de pesquisa nesta rea, a farmacodinmica da prpolis ainda no foi completamente elucidada (SALANTINO, et al. 2005). Dessa forma, apesar dos valores aqui determinados terem sido de mdio teor, e semelhantes s mdias estabelecidas por diferentes pesquisadores, esses teores isoladamente podem no ter sido eficientes para avaliao quanto eficcia biolgica das amostras de prpolis analisada, pois mediram a quantidade e no a qualidade (ADELMANN, 2005) e este fato provavelmente contribuiu para os resultados aqui alcanados. 4.4.2. Propriedade Antioxidante Substncias flavonides e compostos fenlicos, presentes nos extratos de prpolis, so reconhecidos pela ao antioxidante (KROL et al., 1990, MARCUCCI, et al., 2005, SOUZA e GONALVES, 2008). Para confirmar esses resultados, o presente estudo, verificou atividade antioxidante do EAP a 30% pela solubilidade positiva para acetato de chumbo e ao NaOH. Atividade antioxidante para extratos alcolicos de prpolis foi confirmada na Argentina (MALDONADO, 2000) e em diferentes estados brasileiros (GONSALES et al., 2005). Souza et al. (2007) registraram essa atividade em amostras provenientes de So Paulo (regio de Franca) e Minas Gerais (regio de Passo).

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5. CONSIDERAES FINAIS

As atividades biolgicas da prpolis propiciam grandes perspectivas ao tratamento de diferentes afeces, tanto na medicina humana como na veterinria. A alta diversidade em sua composio qumica, alm da complexidade dos mltiplos mecanismos sinrgicos envolvidos em suas atividades biolgicas, faz-se necessrios outros ensaios clnicos a fim de se determinar, dose, dosagem e vias da administrao capazes de determinar seus benefcios teraputicos in vivo.

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6. CONCLUSO

Para as condies avaliadas, no foi possvel observar diferenas entre os tratamentos nas atividades teraputicas e anti-spticas da prpolis no controle da mastite bovina.

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6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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