XII CONGRESO LATINOAMERICANO DE PERFORACIN

BIODEGRADABILIDAD AEROBIA DE ADITIVOS EMPLEADOS EN FLUIDOS DE PERFORACIN

Liz Elia Domnguez Cuellar1, Karen T. Ambriz Rivas2*, Jos Octavio Rodiles Lpez3*, Alicia Espinosa Lara3, Victor M. Luna Pabello2

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Instituto Mexicano del Petrleo. Gerencia de Perforacin; Facultad de Qumica, UNAM; 3 Escuela de Ciencias Biolgicas, IPN. * Estudiantes becarios del proyecto FIES IMP-UNAM 97-03-I

INTRODUCCIN Desde un punto de vista de salud, seguridad y medio ambiente es importante que todo el fluido de perforacin y sus aditivos individualmente sean seguros en su manejo, tengan baja ecotoxicidad y sean rpidamente biodegradables. Es tambin deseable que el sistema tenga requerimientos de dilucin bajos para que los volmenes de descarga sean mnimos (Reid et al, 1993). La industria petrolera ha tenido el propsito durante mucho tiempo de desarrollar fluidos base agua que encuentren los criterios sealados anteriormente. El progreso en los ltimos aos ha sido particularmente rpido y esta en relacin con la legislacin ms estricta para la descarga de fluidos base aceite y los recortes impregnados en estos. Dentro de los fluidos base agua se encuentran los formulados con inhibidores de hidratacin de arcillas. Estos se adicionan al fluido para prevenir el ensanchamiento del agujero, para la perforacin de lutitas, y funcionan bsicamente en disminuir la tendencia de la arcilla a adsorber el agua. Muchos de los estudios se han concentrado en el mejoramiento del nivel de inhibicin ya que los fluidos que se utilizan, tales como los de cloruro de potasio/poliacrilamida (KCL/PHPA), son claramente menos inhibitorios que los fluidos base aceite y su uso incrementa notablemente los costos de perforacin. Al suprimir la hidratacin de las arcillas y prevenir su consiguiente hinchamiento, el producto inhibidor ayuda a estabilizar la pared del pozo, asegura la integridad de los recortes y reduce la tendencia de la barrena al embolamiento. Minimiza tambin problemas tales como los causados por la excesiva dilucin que impide controlar debidamente los recortes, el aumento de torsin y arrastre de la sarta, las altas presiones de succin y de rompimiento de circulacin y el embolamiento del conjunto de fondo. Actualmente, las legislaciones ambientales internacionales prohiben la descarga de residuos txicos con el propsito de reducir el impacto ambiental. Por lo tanto, determinaciones de pruebas tales como biodegradabilidad, en conjuncin con pruebas de toxicidad, incluyendo las de genotoxicidad, debern aplicarse a los fluidos para clasificarlos en funcin de su impacto ambiental. A nivel nacional, la inexistencia de un procedimiento oficialmente avalado que permita conocer el nivel de biodegradabilidad de un determinado compuesto, limita la inclusin de este criterio en la seleccin de los mismos y no obstante la existencia y reconocimiento oficial de pruebas de toxicidad, resulta importante la aplicacin de procedimientos alternos. En ese sentido el presente trabajo presenta los resultados obtenidos de la aplicacin tanto de la prueba de biodegradabilidad aerobia rpida (basada en la OECD 301-A), como de una prueba complementaria de genotoxicidad

basada en la prueba de AMES sin activacin, a productos empleados como inhibidores de hidratacin de arcillas de fluidos de perforacin. Eventualmente este tipo de pruebas podran ser tiles para la clasificacin, en funcin de su impacto ambiental, de materias primas o residuos asociados con la industria del petrleo.

INFORMACIN BSICA DE INTERS Inhibidores de Hidratacin de Arcillas Actualmente, los fluidos de perforacin base agua que incluyen inhibidores de hidratacin de arcillas pueden dividirse en 3 grandes grupos (Jarrett, 1995 y Stamatakis et al., 1995): Fluidos de perforacin base agua con polmeros catinicos: Estn ampliamente disponibles en el mercado y proporcionan un grado de inhibicin de arcillas mayor que otros sistemas convencionales. Existen polmeros catinicos orgnicos que presentan buenas caractersticas de inhibicin de arcillas y que cuentan con baja toxicidad, alta biodegradabilidad, son estables a altas temperaturas, en el intervalo de pH de los fluidos de perforacin y compatibles con los aditivos comnmente empleados. Incrementan la eficiencia del proceso de perforacin pero pueden hacer aumentar su costo, ya que estos polmeros presentan altas velocidades de consumo. Debe tenerse cuidado con la seleccin e inclusin de otro tipo de aditivos (por ejemplo, reaccionan con polmeros aninicos como los lignosulfatos y la poliacrilamida parcialmente hidrolizada). Tambin han sido incorporados otros tipos de sales inorgnicas tales como el KCl y el CaCl2 para la estabilizacin por intercambio catinico con las superficies de arcilla, reduciendo su hidratacin lo que previene la dispersin de las arcillas y la desintegracin del pozo. Sin embargo presentan el inconveniente de aumentar la salinidad del sitio donde son descargados, por lo que su uso no es recomendable de acuerdo con algunas regulaciones agrcolas; adems de que pueden ocasionar un impacto negativo en los organismos marinos. Fluidos de perforacin base agua con polmeros anfteros: Presentan como ventaja adicional un costo menor (tanto del material anftero como la reduccin en los volmenes de consumo) y son no txicos. Generalmente son completamente compatibles con los aditivos aninicos convencionales lo que extiende su aplicacin a situaciones con altas temperaturas. Se piensa que los polmeros anfteros funcionan por un mecanismo similar al de los materiales catinicos; sin embargo, dada su naturaleza anftera, sus caractersticas catinicas son menos intensas que las verdaderas sustancias catinicas, particularmente a valores altos de pH. Fluidos de perforacin base agua con glicoles: Los poliglicoles (se consideran en forma general a los glicoles, gliceroles, glicoles polietilenos y polialquilenos, alcoholes etoxilados y sus derivados) son empleados actualmente en

concentraciones que van del 3 al 10% (Reid et al, 1995). Estos funcionan mejor en combinacin con niveles de sales de moderado a alto, el cloruro de potasio es el mas usado, aunque puede ser reemplazado por cloruro de sodio o calcio o por sales ms caras de acetato o formiato. En comparacin con otros fluidos base agua, los fluidos de poliglicoles mejoran las condiciones de los pozos y producen recortes mas firmes que no se dispersan fcilmente en el fluido. Estos atributos generalmente resultan en velocidades de perforacin ms rpidas, pocos problemas severos y disminucin en diluciones, lo que se traduce en reduccin de los costos de perforacin. Todos los poliglicoles y poligliceroles que son al menos parcialmente solubles en agua ayudan a estabilizar las arcillas a travs de la formacin de complejos estables con la arcilla. De manera adicional, la mayora de los polioles se consideran como rpidamente biodegradables (Reid , 1995). Los encapsulantes polimricos y copolimricos muestran mejor estabilidad a electrolitos, pH, temperatura y slidos comparada con los polmeros como la poliacrilamida parcialmente hidrolizada. Adicionalmente, se han desarrollado fluidos de perforacin base agua que utilizan el efecto sinrgico de copolmeros y propilenglicol para promover la encapsulacin y la estabilidad de las formaciones que componen el pozo. Sin embargo, cabe destacar que el mecanismo de inhibicin de arcillas por encapsulacin se considera menos efectivo que el mecanismo por intercambio catinico. La poliacrilamida parcialmente hidrolizada (PHPA) es el inhibidor de hidratacin de arcillas ms vendido y efectivo para evitar la dispersin de los recortes, puede actuar al mismo tiempo como viscosificante, reductor de filtrado y dispersante. Se emplea hidrolizada al 30% y tiene un peso molecular de aproximadamente 2,000,000 y constituye cerca del 0.5% del fluido de perforacin (Bleir et al., 1993). Sin embargo presenta como limitante el ser sensible a iones divalentes, valores de pH extremos y alto contenido de slidos en el fluido de perforacin. Las teoras principales postuladas el mecanismo de inhibicin de glicoles en fluidos base agua, en forma resumida se explica cuando las molculas de ste reaccionan con las partes activas presentes en las placas de los minerales de la arcilla, los cuales enlaza electrostticamente con la consiguiente disminucin de la tendencia de la arcilla a absorber el agua que la rodea. Esta accin limita la aptitud de las lutitas sensitivas al agua, especialmente las que contienen apreciables cantidades de esmectita, a hidratarse e hincharse en presencia de los lodos base agua (Bland, 1994).

Concepto de biodegradacin Se denomina biodegradacin a la descomposicin de la materia orgnica natural o sinttica causada por la accin de los microorganismos para la obtencin de molculas ms simples. En consecuencia, la biodegradabilidad sera la capacidad de una sustancia para transformarse en compuestos ms sencillos por accin de los microorganismos. Dicha biotransformacin implica un proceso mediante el cual el organismo modifica un compuesto que ha absorbido previamente, para dar

posteriormente productos que puedan ser excretados o reabsorbidos (Albert et al, 1995). Los procesos de biodegradacin pueden ser agrupados en dos categoras: biodegradacin primaria que implica pequeas alteraciones en la estructura qumica del compuesto, debida a la accin de los microorganismos, resultando en la prdida de propiedades especficas de la sustancia y la biodegradacin ltima cuando los compuestos originales son destruidos en productos mas simples, resultado dixido de carbono, agua, sales minerales y biomasa (OECD, 1992a). De acuerdo al tipo de atmsfera existente es posible distinguir dos procesos de biodegradacin (Trtora et al., 1992): Biodegradacin aerobia: Es la degradacin biolgica que se lleva a cabo en ambientes con suficiente aireacin, en los cuales se busca mantener una concentracin de oxgeno molecular libre disuelto de al menos 2 mg/L. Los principales productos de la biodegradacin de materia orgnica son dixido de carbono, agua (debido a la reduccin de oxgeno molecular) y biomasa microbiana. Biodegradacin anaerobia: Este tipo de biodegradacin se lleva a cabo por microorganismos que no requieren oxgeno molecular libre en solucin, por lo que la concentracin de oxgeno es muy baja o inexistente. Los microorganismos emplean compuestos inorgnicos aceptores de electrones como nitratos, nitritos y sulfatos, entre otros. Se promueve el crecimiento de bacterias anaerobias, especialmente metangenas (que degradan la materia orgnica soluble originando metano y dixido de carbono). Los ambientes contaminados muy rara vez presentan un slo tipo de contaminante orgnico. Por consiguiente, la biodegradacin de compuestos orgnicos puede ser lenta debido a que uno o ms nutrimentos inorgnicos indispensables para el crecimiento microbiano se encuentra solamente en bajas concentraciones ambientales. Los factores que afectan la biodegradabilidad de las sustancias pueden ser divididos en tres grupos (Pitter, 1976): i. Parmetros fisicoqumicos: Temperatura, solubilidad, grado de dispersin del compuesto en el medio, pH y oxgeno disuelto. ii. Caractersticas qumicas: Largo de la cadena, clase, nmero y posicin de los sustituyentes en la molcula, estereoqumica y tonicidad del medio. iii. Caractersticas biolgicas: Origen del cultivo microbiano, edad, tiempo y forma de adaptacin, tolerancia a la toxicidad del compuesto de prueba y efecto de otros sustratos.

Pruebas de biodegradabilidad

Las pruebas de biodegradabilidad tienen como objetivo simular, en un ambiente controlado de laboratorio, el proceso de biodegradacin que ocurre en la naturaleza (Bland et al, 1993). El mtodo clsico para demostrar la biodegradabilidad de una sustancia consiste en incubar una solucin o suspensin de la misma en un medio mineral con un inoculo bacteriano, bajo condiciones ambientales controladas, durante un lapso determinado (usualmente 28 das). El curso de la biodegradacin es monitoreado mediante tcnicas analticas que cuantifican (Grady, 1985): (a) La desaparicin del compuesto de prueba medido como carbono orgnico disuelto (COD); (b) La actividad metablica bacteriana medida como demanda bioqumica de oxgeno (DBO) y (c) La produccin de dixido de carbono. Las determinaciones son realizadas a intervalos frecuentes de tiempo para permitir la identificacin del principio y fin de la biodegradacin. La realizacin de anlisis qumicos especficos permite determinar la concentracin de compuestos o metabolitos intermediarios formados durante el proceso (Slater et al, 1995). Todas las pruebas de biodegradabilidad se basan en tcnicas de cultivo de enriquecimiento donde se favorece la multiplicacin celular de un grupo microbiano con caractersticas metablicas especficas. Este enriquecimiento celular se logra a travs del control de factores como temperatura, pH, aireacin y fuente de inoculo, entre otros. La poblacin inicial est compuesta por variedades de microorganismos tolerantes a un ambiente en particular, a efecto de disponer de varias rutas metablicas para la biodegradacin del compuesto de inters. Las pruebas de biodegradabilidad diseadas para agua dulce utilizan un inoculo bacteriano normalmente derivado de lodos activados, aunque tambin puede derivarse de agua superficial y/o suelo. La eleccin del mtodo a seguir, implica la necesidad de conocer la solubilidad, presin de vapor y caractersticas de adsorcin de la muestra. De igual manera, es deseable conocer la estructura qumica o frmula de la sustancia ensayada, con objeto de contar con una base de clculo para el porcentaje de biodegradacin alcanzado a travs del tiempo. La aplicacin de este tipo de pruebas presenta como desventaja la obtencin de resultados difciles de extrapolar a pruebas de campo, debido a que las condiciones de ensayo pueden no ser similares a las del ambiente del que proviene la muestra. Las principales causas que conducen a esta dificultad son: Condiciones ambientales especficas, esenciales para el inicio de la biotransformacin de contaminantes en su medio natural. Cometabolismo: Existen sustancias que por ellas mismas no pueden servir como nica fuente de carbono pero pueden ser degradadas por una comunidad microbiana compleja en presencia de otros sustratos. Aclimatacin del inculo: El microorganismo aislado en el medio elegido puede no ser el ms activo en el medio nativo, por lo que se requieren inculos representativos, como por ejemplo suelo biolgicamente activo.

 Desarrollo de mtodos analticos especficos para el seguimiento de la biodegradacin debido a metabolitos intermediarios o sustancias desconocidas presentes en la muestra una vez iniciado el proceso. En general, las pruebas de biodegradabilidad se pueden clasificar en dos tipos (Grady, 1985; OECD, 1992a): Pruebas de biodegradabilidad aerobia rpida - Su objetivo es evaluar la facilidad con que una sustancia puede ser mineralizada bajo condiciones experimentales estrictas. Una sustancia es considerada como rpidamente biodegradable cuando alcanza ya sea un 70% de remocin de materia orgnica medida como carbono orgnico disuelto, o bien un 60% del correspondiente al valor de demanda terica de oxgeno o produccin de dixido de carbono, en un lapso de 28 das de evaluacin. El nivel de aceptacin es menor, cuando se emplea un mtodo respiromtrico, ya que una proporcin del carbono de la sustancia de prueba es incorporada como biomasa; por lo que el porcentaje de dixido de carbono producido es menor que el porcentaje de carbono utilizado. En este tipo de ensayos la sustancia de prueba es la nica fuente de carbono y energa disponible. Se utiliza un inculo de baja concentracin celular que no ha tenido contacto previo con la sustancia de prueba. Las pruebas realizadas de esta manera, tienen oportunidad limitada de que ocurra la aclimatacin del inculo. Un resultado positivo en estas pruebas, permite suponer que la sustancia evaluada podr ser biodegradada rpida y completamente en el ambiente. Sin embargo, deben considerarse los factores fisicoqumicos y microbiolgicos del sitio (por ejemplo temperatura, pH y potencial redox), as como el flujo de la sustancia en estudio, ya que pueden generarse subproductos de la biodegradacin ms txicos o bien, depsitos de sustancias peligrosas dentro del ecosistema. En esta prueba, la obtencin de bajo porcentaje de biodegradacin no necesariamente significa que la sustancia evaluada no sea biodegradable, sino que las condiciones experimentales en las que se realiz no fueron las adecuadas para ello. Pruebas de biodegradabilidad aerobia intrnseca - Este tipo de ensayos permite la exposicin prolongada de la sustancia de prueba con los microorganismos, por lo tanto hay una mayor posibilidad de que ocurra la adaptacin del inculo, as como una relacin biomasa/sustancia de prueba ms equilibrada y otras condiciones que promueven la biodegradacin. Un resultado positivo indica que la sustancia no permanecer indefinidamente en el ambiente, pero no puede suponerse que la cintica de biodegradacin ocurra de la misma manera en el sitio contaminado, ya que no necesariamente fueron proporcionadas las condiciones favorables para el ensayo.

Pruebas de genotoxicidad En la vida cotidiana los seres vivos estamos expuestos a muchos agentes qumicos que pueden interaccionar con los cidos nucleicos (DNA), y por lo tanto tener una actividad mutagnica. El dao al DNA por compuestos mutagnicos, probablemente sea una de las principales causas de cncer, defectos hereditarios y de

malformaciones durante el desarrollo embrionario (Valencia, 1986). Este dao se conoce como mutagnesis o genotoxicidad . Una mutacin se define como el cambio heredable en la secuencia de bases del cido nucleico que constituye el genoma de un organismo. Esto es, una mutante difiere de su cepa original en su genotipo (Madigan, 1998). Los agentes que causan mutaciones se les llama mutgenos o agentes genotxicos, y pueden ser de origen fsico, qumico o biolgico. Los agentes qumicos mutagnicos se clasifican en dos tipos dependiendo de la forma en que actan sobre el DNA de un organismo. Los mutagnicos de accin directa por si mismos daan al DNA, en tanto que los de accin indirecta necesitan primeramente ser metabolizados va enzimtica, es decir, necesitan ser biotransformados por el organismo, para que posteriormente tengan actividad genotxica. La demostracin de que una sustancia es genotxica se basa en varias observaciones, entre ellas estn los estudios epidemiolgicos y las pruebas de las sustancias utilizando animales de laboratorio; pero tiene los inconvenientes de tiempos largos de experimentacin y altos costos (Ames, 1973). Ante esta situacin han surgido mtodos para la deteccin de mutgenos utilizando microorganismos, como bacterias, virus o levaduras. Estos sistemas arrojan resultados en muy poco tiempo, con bajos costos y con alta fidelidad. Uno de los sistemas microbianos ms usados es el Sistema de Ames el cual fue , desarrollado por el Dr. B. N. Ames en 1971 y la cepa original es Salmonella thyphimurium. La prueba mide la reversin a la prototrofia de un conjunto especial de mutantes auxtrofas a la histidina. Se basa en usar una bacteria mutada que al sufrir una segunda mutacin, por un agente genotxico, pierde su calidad de mutante y por lo tanto suprime el efecto de la primera mutacin. Existen diferentes cepas de Ames, pero todas ellas tienen una mutacin en el opern de histidina, as como las mutaciones rfa y uvrB. La mutacin rfa causa una prdida parcial de la barrera membrenal de las bacterias, lo cual permite que los toxones (cualquier agente txico) puedan atravesar la membrana celular ms fcilmente. La mutacin uvrB causa la prdida de uno de los genes involucrados en la reparacin del DNA por el sistema de escisin, lo cual permite detectar daos mutagnicos al no ser reparados por las clulas de manera natural. Algunas cepas contienen el plsmido pKM101 que da resistencia a ampicilina y lleva el gen muc+ involucrado en el sistema de reparacin tipo SOS. Esta caracterstica capacita a las cepas a ser ms resistentes al mutgeno. La determinacin de la genotoxicidad se da por el ndice de mutacin que resulta de la relacin entre mutantes inducidas por el agente genotxico y las mutantes espontneas. Se considera un compuesto mutagnico cuando la frecuencia de mutacin es igual o mayor a 2.

MTODOLOGAS Objetivos Caracterizar fisicoqumicamente los inhibidores de hidratacin de arcillas seleccionados. Evaluar la biodegradabilidad aerobia rpida y de manera complementaria el grado de toxicidad (LD90) y mutagenisidad de dichos inhibidores

Caracterizacin fisicoqumica de las muestras Las muestras de los productos inhibidores se seleccionaron en funcin de su uso y disponibilidad de aplicacin en los campos petroleros nacionales, denominados A, B, C y D. Una de las caractersticas principales de las muestras evaluadas fue que son solubles en agua, lo cual es un requisito indispensable para que una sustancia pueda ser evaluada con las pruebas de biodegradabilidad aerobia rpida consultadas, lo que facilitara su eventual metabolismo por medio de microorganismos presentes en el medio. As mismo, el pH medido en general se encuentra dentro del intervalo aceptable para el crecimiento de las bacterias degradadoras. Para la determinacin de demanda qumica de oxgeno (DQO), se emple el mtodo de reflujo cerrado y posterior cuantificacin de la oxidacin del dicromato por espectrofotometra ( = 600 nm). Posteriormente, se realiz una prueba de demanda bioqumica de oxgeno (DBO) a 5 das empleando un respirmetro automtico. Cada matraz tiene una capacidad de 250 mL que se repartieron de la siguiente manera: 25 mL de inculo microbiano (mezcla de aguas residuales industriales y aguas residuales domsticas) que representa un 10% del volumen total, 15 mL del inhibidor a evaluar, lo que corresponde a un 6% del volumen total y el volumen restante se complet con agua destilada. La determinacin de slidos y cenizas se realiz por los mtodos analticos tradicionales, observndose un rango de variacin muy amplio entre los difrentes productos. Estudio fisicoqumico complementario A fin de obtener datos que permitan evaluar mejor el proceso de biodegradacin, as como reconocer su influencia en la velocidad de oxidacin de sustratos y el porcentaje de biodegradacin alcanzado con respecto al tiempo, fueron incluidas determinaciones de parmetros fisicoqumicos complementarios, de acuerdo a los mtodos APHA:

medicin potenciomtrica del pH, slidos totales (STT) y suspendidos (SST), amoniaco, nitrito, nitrato y ortofosfatos. Prueba de biodegradabilidad aerobia rpida

Preparacin de las muestras La preparacin de las muestras para la prueba de biodegradabilidad aerobia rpida, incluy lo siguiente: Preparacin del medio mineral (MM) con la siguiente composicin: KH2PO4 85 mg/L, K2HPO4 217.5 mg/L, Na2HPO4.2H2O, 33.40 mg/L, NH4Cl 5 mg/L, CaCl2 27.5 mg/L, MgSO4.7H2O 22.5 mg/L y FeCl3. 6H2O 0.25 mg/L. El inculo fue tomado del tanque de aireacin de la planta de tratamiento de Ciudad Universitaria. La mezcla anterior se mantuvo en un recipiente de 4 000 mL cerrado, con aireacin constante hasta su uso. Posteriormente fue centrifugado a 400 g durante 5 minutos. Se efectuaron diluciones del inhibidor hidratacin de arcillas con medio mineral (MM) y a partir de ellas se llev a cabo la preparacin de las soluciones de prueba. La composicin de cada solucin se describe en las tablas 1 y 2. El pH de las soluciones fue ajustado a 7.4 unidades aproximadamente, empleando una solucin de H2SO4 0.1N. Tabla 1. Composicin de las soluciones preparadas con Inhibidor A
Nmero de matraces 4 4 Solucin Control de inculo Inhibidor A Composicin 125 mL inculo + 1125 mL medio mineral 125 mL inculo + 7 mL dilucin 1:10 inhibidor A + 1118 mL medio mineral

Tabla 2. Composicin de las soluciones preparadas con Inhibidor B

Nmero de matraces 4 4 Solucin Control de inculo Inhibidor B Composicin 125 mL inculo + 1125 mL medio mineral 125 mL inculo + 1.8 mL dilucin 1:10 inhibidor B + 1123 mL medio mineral

El estudio de biodegradacin se bas en el procedimiento indicado en la prueba OECD 301-A, usando un equipo respiromtrico automtico, bajo condiciones de ausencia de luz, temperatura, agitacin controlada y con aporte de oxgeno acorde con el requerimiento de la muestra. A cada uno de los doce matraces empleados se le adicionaron 250 mL de la solucin. El consumo de oxgeno se monitoreo diariamente y de acuerdo con las curvas de consumo generadas, se establecieron 4 tiempos de muestreo, tomndose un matraz de control de inculo y un matraz con inhibidor para realizar la correspondiente evaluacin fisicoqumica de las muestras. Inmediatamente despus de sacar los matraces del respirmetro, la biomasa se separa a travs de filtracin en membrana de acetato de celulosa de 0.45 m. El porcentaje de degradacin fue evaluado a travs de la disminucin de concentracin de carbono orgnico disuelto en cada punto de muestreo. Para ello la muestra se filtr y acidific a pH <2, antes de ser analizada.

Pruebas de genotoxicidad Para las pruebas experimentales de genotoxicidad se utilizaron cinco cepas del Sistema de Ames, de Salmonella thyphimurium. Las cepas fueron TA1535, TA1537, TA1538, TA98 y TA100. Se procedi a confirmar los genotipos de cada una de stas cepas incluyendo como testigo la cepa LT2. Para esto se verific el crecimiento de las cepas en medio con histidina y biotina, histidina sin biotina, y biotina sin histidina, emplendose la tcnica de vaciado con agar blando. Posteriormente, cada una de las cepas se hizo crecer en medio rico y se determin su respuesta al cristal violeta (mutacin rfa), luz ultravioleta y ampicilina empleando las cepas en fase de crecimiento logartmico (1.5 x 108/ml 75 Unidades Klett), y las concentraciones apropiadas de cada compuesto y luz ultravioleta. Se realiz tambin una prueba con mutgenos conocidos para determinar la capacidad de reversin de las cepas de Ames, los cuales fueron 9-aminoacridina,etil metano sulfonato, e hidroxilamina. Las pruebas de genotoxicidad con el sistema de Ames solo son vlidas siempre y cuando haya un 10% de sobrevivientes al aplicar el mutgeno. En base a esto se determin la capacidad letal al 90% (CL90), de los cuatro inibidores para cada una de las cepas de Ames.

RESULTADOS Y DISCUSION Caracterizacin fisicoqumica de las muestras Los resultados de los anlisis de la caracterizacin fisicoqumica efectuados a los productos inhibidores estudiados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Caractersticas fisicoqumicas de los inhibidores de hidratacin seleccionados

Muestra % slidos totales % cenizas Viscosidad (centipoise) pH (unidades) A 70.70 + 1.0 1.79 20 6.5 B 95.27 + 0.2 0 22 5.5 C 19.03 + 0.4 0.03 5 7.7 D 76.41 + 1.0 51.43 23 10.0

DQO (mg/L) DBO5 (mg/L) DBO5/DQO

141 450 + 14016 15532 + 1411 0.109

579 090 + 39385 166+ 43 0.00086

161 640 + 19873 5398 + 1461 0.033

141 000 + 3012 117 + 0 0.00082

Los inhibidores de hidratacin de arcillas estudiados cuentan con valores de DQO muy altas, lo que significa que estas muestras cuentan con una alta concentracin de materia orgnica que es susceptible de ser oxidada por el dicromato de potasio; cabe recordar que tambin es factible la oxidacin de materia inorgnica al verificarse la reaccin de la DQO, lo que tambin explicara los altos valores obtenidos. Por otro lado, los valores de las determinaciones de demanda bioqumica de oxgeno fueron muy bajos en comparacin con los de demanda qumica de oxgeno, lo que ocasiona que al obtener la relacin DBO5/DQO y aplicarla en este caso como una aproximacin a grosso modo se trate de valores indicativos de baja biodegradabilidad aerobia del compuesto. Se realiz un anlisis elemental de diversos inhibidores de hidratacin de arcilla, reportndose la presencia en porcentajes relativos en la Tabla 4. Tabla 4. Anlisis elemental de los inhibidores de hidratacin de arcillas Muestra A B C D % carbono 59.42 27.90 54.84 41.95 % nitrgeno 20.17 10.57 19.47 0.15 % hidrgeno 16.8 7.92 17.03 3.60 % azufre 0.0 0.0 0.0 0.0 % otros 3.61 53.61 8.66 54.3

Como se observa en los resultados obtenidos, el carbono es el principal componente de todos los inhibidores de hidratacin de arcillas estudiados, seguido por el nitrgeno y en ninguna muestra se detect la presencia de azufre. Los inhibidores A y C guardan una relacin similar en sus porcentajes de carbono, nitrgeno e hidrgeno, as como en el porcentaje de "otros". Finalmente, los productos denominados B y D tienen los ms

bajos porcentajes de carbono en su composicin y ms del 50% de su composicin no corresponde a ninguno de los elementos cuantificados. Cabe aclarar que el espectro de infrarrojo de un compuesto es esencialmente la superposicin de bandas de absorcin de sus grupos funcionales especficos. Para el anlisis cualitativo, uno de los mejores aspectos de un espectro de infrarrojo es que la absorcin en regiones especficas de frecuencia pueden correlacionarse con movimientos especficos de estiramiento o de flexin y en algunos casos, con la relacin de estos grupos y el resto de la molcula; entonces al interpretar un espectro es posible establecer la presencia de ciertos grupos funcionales y la ausencia de otros (Willard et al., 1991). Por esta razn se realizaron los anlisis, va espectro de infrarrojo, de las muestras de inhibidores de hidratacin de arcillas seleccionados, empleando para ello celdas de selenuro de zinc, las cuales son transparentes hasta los 556 cm -1. A partir de la interpretacin de los espectros de infrarrojo obtenidos, es posible afirmar que no se observaron patrones similares entre los inhibidores estudiados. Ya que de acuerdo a la interpretacin de los grupos funcionales, se encontraron compuestos que son a base de aminas, glicoles, y cidos carboxlicos.

Prueba de biodegradabilidad aerobia rpida La prueba de biodegradabilidad aerobia rpida se realiz nicamente a dos de los cuatro productos selecionados. En las tablas 5 y 6 se presentan los resultados de una corrida para evaluar la biodegradabilidad aerobia rpida de los inhibidores A y B. El comportamiento del pH durante los 7 das de duracin de la prueba de biodegradabilidad aerobia rpida para el caso de los controles de inculo, fluctu de 7.4 a 7.8 a lo largo de las pruebas lo que podra considerarse como prcticamente constante mientras que en el caso de las diluciones del inhibidor, el pH sufri un descenso significativo en el punto donde se alcanza un mayor porcentaje de degradacin del inhibidor (Figura 1). El descenso del pH podra estar relacionado por un lado con la degradacin del inhibidor de hidratacin de arcillas o con la produccin de algn metabolito que pudiera bajar el pH. Posteriormente se observa una tendencia a aumento del pH en los matraces con inhibidor. Ello podra deberse a la saturacin de la cal sodada que se encuentra en un dispositivo dentro de los matraces y que sirve para atrapar el dixido de carbono producto de la respiracin microbiana. En cuanto a los STF no se present un cambio significativo de los mismos, lo cual si ocurri con los STT, STV y SST los cuales se incrementaron gradualmente en los primeros das de evaluacin y despus disminuyeron tambin de manera progresiva, describiendo as el perfil de una curva gaussiana (siendo el eje de las X el tiempo y el de Y la biomasa), lo cual equivale a una primera fase de aumento en la biomasa y despus a una etapa de decrecimiento como consecuencia de condiciones ambientales no favorables (falta de alimento, existencia de compuestos metablicos secundarios ihnibidores, etc).

Tabla 5. Valores promedio de los parmetros fisicoqumicos obtenidos de la aplicacin de la prueba OECD 301-A al producto A
Parmetro/ Muestra COD (mg/L) pH (unidades) STT (mg/L) STV (mg/L) STF (mg/L) SST (mg/L) N-NH3(mg/L) N-NO2 (mg/L) N-NO3(mg/L) P-PO43(mg/L) Prod. A (0 d) 188 + 1 7.4 1560 + 85 1000 + 28 560 + 56 120 + 28 4.62 + 0.83 26 + 2 3.6 + 0.1 104.5 + 3.5 Inculo Prod. A Inculo Prod. A Inculo Prod. A Inculo Prod. A Inculo (0 d) (1 d) (1 d) (2 d) (2 d) (3 d) (3 d) (7 d) (7 d) 21 + 1 7.4 850 + 14 310 + 14 540 + 14 150 + 14 11.24 + 0.72 31 + 1 2.9 + 0.2 104.5 + 5.6 169 + 2 19 + 0.5 7.4 1510 + 127 960 + 56 550 + 42 140 + 14 7.19 + 0.99 52 + 3 3.9 + 0.2 105 + 1.3 7.6 840 + 56 290 + 14 550 + 42 130 + 14 9.18 + 0.67 48 + 2 2.6 + 0.2 102.6 + 0.8 61+ 1 6.6 1100 + 14 550 + 14 560 + 28 180 + 28 37.48 + 3.8 41 + 2 4.9 + 0.3 103.3 + 3.4 20 + 1 7.7 750 + 14 210 + 14 530 + 14 130 + 14 9.69 + 0.86 78 + 5 2.4 + 0.3 101.5 + 1.3 31 + 2 7.0 1100 + 28 550 + 42 550 + 14 180 + 28 38.77 + 1.9 48 + 2 3.7 + 0.06 103.9 + 3.8 20 + 1 7.7 720 + 28 170 + 28 550 + 14 100 + 28 11.1 + 0.47 55 + 2 2.1 + 0.1 102.8 + 1.1 24 + 2 7.4 780 + 0 260 + 28 520 + 28 120 + 28 63.74 + 1.80 170 + 2 2.3 + 0.1 66.2 + 4.1 19 + 1 7.8 710 + 42 200 + 0 510 + 42 90 + 28 9.69 + 0.72 87 + 3 2.2 + 0.1 70.5 + 0.3

d = das; COD= Carbono orgnico disuelto; STT = Slidos totales totales; STV = Slidos totales voltiles; STF = Slidos totales fijos; N-NH3-= Amoniaco; N-NO 2- = Nitrito; N-NO3- = Nitrato; P-PO43 -= Ortofosfato

De acuerdo con los resultados obtenidos para el producto A, hay un continuo incremento en el contenido de compuestos amoniacales y nitritos a lo largo del periodo de prueba. Aparentemente el fenmeno de nitrificacin se vio parcialmente interrumpido, ya que los nitritos no fueron oxidados a nitratos. Este aspecto deber revisarse con detalle en las prximas pruebas a realizar. Con respecto a los fosfatos, se nota una progresiva disminucin de dichos compuestos en solucin, los cuales probablemente se encuentren acumulados como polifosfatos en la biomasa celular. Los 2 inhibidores de hidratacin de arcillas evaluados resultaron ser rpidamente biodegradables de acuerdo con los lineamientos de la OECD; esto es, se alcanz ms del 70% de remocin de materia orgnica, medida como carbono orgnico disuelto en menos de 28 das. Como se puede observar, al partir de concentraciones semejantes del inhibidor (100 mg COD/L), se alcanzaron porcentajes de degradacin superiores al 90% en 7 das. Sin embargo, el inhibidor A result ser ms fcilmente biodegradable que el inhibidor B, de acuerdo con lo que se presenta en la figura 2. El inhibidor B requiri 13 das de prueba para alcanzar un 94% de biodegradacin mientras que para el inhibidor A se obtuvo un porcentaje similar a los 3 das de prueba.

Tabla 6. Valores promedio de los parmetros fisicoqumicos obtenidos de la aplicacin de la prueba OECD 301-A al producto B
Parmetro/ Muestra COD (mg/L) pH (unidades) STT (mg/L) STV (mg/L) STF (mg/L) N-NH3 (mg/L) N-NO2(mg/L) N-NO3(mg/L) P-PO43(mg/L) Prod. B (0 d) 109 + 0.6 7.4 770 + 14 210 + 14 560 + 14 12.83 + 0.36 48 + 3 3.0 + 0.5 110.3 + 0.6 Inculo (0 d) 7+1 7.4 680 + 28 150 + 14 530 + 14 12.32 + 0.36 59 + 2 4.0 + 0.4 110.8 + 0.8 Prod. B (2 d) 77 + 1 7.0 1240 + 28 710 + 42 530 + 14 2.03 + 0.29 150 + 8 2.0 + 0.1 102.4 + 2.1 Inculo (2 d) 8+1 7.3 670 + 14 130 + 14 540 + 0 7.82 + 0.27 99 + 5 1.8 + 0.07 103.2 + 0.7 Prod. B (3 d) 38 + 1 6.8 1060 + 28 490 + 42 570 + 14 0.29 + 0.07 28 + 1 1.6 + 0.07 101.2 + 0.5 Inculo (3 d) 8+1 7.2 670 + 28 110 + 28 560 + 14 10.33 + 0.36 87 + 3 1.6 + 0.07 100.2 + 1.5 Prod. B (6 d) 16 + 1 7.1 950 + 14 360 + 28 590 + 14 0.43 + 0.13 10+ 1 1.7 + 0.3 100.5 + 2.1 Inculo (6 d) 7+1 7.2 650 + 42 60 + 28 550 + 14 12.22 + 0.7 51 + 1 2.9 + 0.07 103 + 5.6 Prod. B Inculo (13 d) (13 d) 11 + 1 7.1 740 + 0 210 + 14 530 + 14 0.38 + 0.06 20 + 2 1.2+ 0.07 101.6 + 0.5 7+1 7.3 630 + 42 90 + 14 540 + 28 11.28 + 0.08 32 + 2 1.2 + 0.2 103.4 + 1.1

d = das; COD= Carbono orgnico disuelto; STT = Slidos totales totales; STV = Slidos totales voltiles; STF = Slidos totales fijos; N-NH3-= Amoniaco; N-NO 2- = Nitrito; N-NO3- = Nitrato; P-PO43 - = Ortofosfato

El comportamiento de los slidos para el caso del inhibidor B fue similar a lo observado para el producto A. En cuanto a los compuestos amoniacales estos fueron prcticamente oxidados de manera total a nitritos. De igual forma que para el producto A, la oxidacin result incompleta ya que no se logr la fase de nitrificacin. En cuanto a los fosfatos, aparentemente no se present una acumulacin en la biomasa ya que los valores de dichos compuestos permanecieron prcticamente constantes en la fase lquida de la muestra. En la Figura 3, se presentan las grficas de consumo de oxgeno obtenidas con el respirmetro. Como puede observarse hay una corta fase de latencia, seguida de una etapa de consumo de oxgeno exponencial, que en ambos casos se relaciona con mayor produccin de biomasa medida como slidos suspendidos y cuenta de hetertrofos, as como mayor remocin de sustrato medida como carbono orgnico disuelto. Finalmente, se presenta una fase donde casi no hay consumo de oxgeno, ello debido a que el sustrato se agota, en este punto se obtiene el mayor porcentaje de degradacin posible partiendo de una concentracin de 100 mg COD/L del inhibidor.

8 7.8 7.6 7.4 7.2 7 6.8 6.6 6.4 0 1 2 3 7

7.6 7.4

pH (unidades)

pH (Unidades)

7.2 7 6.8 6.6 6.4 0 2 3 6 13

Tiempo (Das) Inculo Inhibidor A

Tiempo (Das)

Inculo

Inhibidor B

Figura 1. Comportamiento del pH de los inhibidores de hidratacin de arcillas

180

100 80 60

120 100 80

100 80 60 40 20 0 0 2 3 Tiempo (Das) 6 13

mgCOD/L Inhibidor A

150 120

90 40 60 30 0 0 1 2 Tiempo (Das) 3 7 20 0

60 40 20 0

mgCOD/L

% biodegradacin

mgCOD/L

% biodegradacin

Figura 2. Porcentaje de degradacin de los inhibidores de hidratacin de arcillas

Consumo de O2 corregido (mg)

600
Consumo corregido de O2 (mg)

400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

500 400 300 200 100 0 0 1 2 3 4 5 6 7

Tiempo (Das)

Tiempo (Das)

A1

A2

A3

A4

B1

B2

B3

B4

Figura 3. Perfiles de consumo de oxgeno de los inhibidores de hidratacin de arcillas

Pruebas de genotoxicidad Los resultados de la determinacin de toxicidad (CL90) de los inhibidores con cada cepa de Ames, se reportan en la Tabla 7. Tabla 7. Capacidad Letal (CL 90) g/ml
CEPA TA1535 TA1537 TA1538 TA98 TA100 A 567 519 642 541 623 B 55 65 98 86 126 C 518 372 545 538 664 D 100 365 311 521 743

Las cepas TA98 y TA100 fueron las ms resistentes, lo cual coincide con lo reportado en la bibliografa. Estas cepas contienen el plsmido pk101 que les confiere mayor resistencia a las sustancias txicas. Los productos menos txicos fueron A y C, mientras que el B fuel mas txico, y el inhibidor D se encuentra en una situacin intermedia. Los resultados del grado de genotoxicidad sin activacin reportados (Tabla 8) indican que los productos A y C presentaron el mayor grado de genotoxicidad, siendo el compuesto C el de mayor mutagnesis. El inhibidor D no present y el B present una ligera mutagnesis;. Tabla 8. Genotoxicidad Ames sin activacin CEPA TA1535 TA1537 TA1538 TA98 TA100 A 1.9 1.0 2.5 0.8 2.1 B 0.8 0.5 0.4 0.5 0.8 C 4.8 1.0 2.1 0.9 2.4 D 0.7 0.7 0.2 0.3 0.8

* Se considera genotxico un ndice 2

De los resultados obtenidos, se observa que aunque el producto C result el ms mutagnico fue el menos txico, por lo que se puede establecer que la toxicidad y la mutagnesis son daos no interrelacionados. La toxicidad es un dao metablico, mientras que la genotoxicidad es un dao al DNA.

CONCLUSIONES Los dos inhibidores de hidratacin de arcillas evaluados resultaron ser rpidamente biodegradables de acuerdo con los lineamientos de la Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). La velocidad de biodegradacin tiene implicaciones importantes para el establecimiento de metodologas de disposicin de desechos y tratamiento de efluentes, entre otras cosas porque determina el volumen y/o tiempo requerido para la estabilizacin de ese tipo de compuestos. El grado de toxicidad (CL90) de mayor a menor grado fue: B > D > C > A. Los inhibidores A y C mostraron genotoxicidad y los compuestos B y D no fueron genotxicos a las concentraciones evaluadas. Se puede establecer que no existe relacin entre el grado de toxicidad y el de mutagnesis, ya que si bien se present dao metablico (toxicidad), por ejemplo para el compuesto B, no se detect dao en el DNA (mutagensis) en los organismos de prueba. No obstante habr que continuar con el desarrollo de este tipo de estudios para tener un entendimiento mas profundo del fenmeno y poder hacer recomendaciones con mayores fundamentos. Finalmente, debe sealarse que para que un determinado compuesto genere un mnimo impacto en el ambiente, los componentes de los fluidos de perforacin debern degradarse bajo las condiciones del ecosistema receptor. En este sentido, si bien las pruebas de laboratorio son tiles para el entendimiento del fenmeno y clculo de la velocidad de biodegradacin bajo condiciones controladas, resultan insuficientes para inferir con certitud el efecto o impacto real que puedan causar en un determinado ambiente natural, por lo que es altamente deseable la realizacin de pruebas controladas pero simulando las condiciones prevalecientes en los cuerpos naturales receptores.

RECONOCIMIENTOS La realizacin del presente trabajo cont con apoyo econmico del Proyecto FIES IMP-UNAM 97-03-I "Desarrollo de un mtodo de biodegradabilidad aerobia rpida para inhibidores de hidratacin de arcillas empleados en fluidos de perforacin", bajo la direccin de la Ing. Liz Elia Domnguez Cuellar y del Dr. Vctor M. Luna-Pabello.

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