Procedimientos experimentales

Tcnicas para medir niveles estacionarios de RNA Caracterizacin del patrn de expresin Northern blot
A un cultivo bacteriano, se le extrae el RNA en las diferentes condiciones a ensayar. Extraer el RNA es muy complicado, debido a que las RNasas son muy estables y degradan rpidamente el RNA; por ello, se debe utilizar siempre dietilpirocarbonato ( DEPC ) que inhibe la funcin de estas enzimas por unin a los residuos de Histidina de sus sitios activos. Al RNA obtenido se le debe realizar una electroforesis en gel , observando el patrn logrado, y luego pasando a una membrana para realizar un Northern Blot . Ya en la membrana se realiza la identificacin del RNA buscado utilizando una sonda por hibridacin .

Surge la pregunta de cmo nos aseguramos que los resultados obtenidos se puedan relacionar con la expresin celular y que no hay ningn problema tcnico. Para ello, junto con la hibridacin del gen buscado, se realiza la hibridacin de un gen de expresin constitutiva , denominado: ESTNDAR INTERNO. Utilizando un contador de pixeles, se puede comparar la cantidad de gen constitutivo y obtener as un resultado en cuanto a la cantidad de RNA buscado que tenemos. El gen de control interno debe expresarse en iguales o similares cantidades en la mayora de los tipos celulares y su expresin no debe ser estimulada o modificada por factores ambientales o por las condiciones en las que se realiza el ensayo.

Ejemplos de genes estndar son: actina, GAPDH (gliceraldehido 3fosfato deshidrogenasa), MHC I (complejo de histocompatibilidad mayor I), RPLPO, housekeeping genes, rRNA del 28 S o del 18S etc.

La contra que tiene este mtodo es que solo permite analizar un gen por vez, aunque se lo pueda ver a este gen en diferentes condiciones. Mtodos que incluyen el anlisis de muchos genes a la vez son los utilizados hoy en da.

Hibridacin y proteccin de nucleasas

Este puede darse entre DNA molde y cDNAs obtenidos a partir del mRNA por retrotranscripcin, tal como lo indica la siguiente figura, o puede realizarse una hibridacin entre RNA blanco y sondas de RNA o DNA; es decir, los componentes a hibridar pueden variar, pero solo se unirn si son complementarios entre s. El experimento de hibridacin en solucin se basa en la utilizacin de endonucleasas que degradan el DNA simple cadena, sin degradar el DNA de doble cadena, por eso tambin se lo conocemos como ensayo de proteccin a endonucleasas.

Filter binding

Otro tipo de hibridacin para reconocimiento de mRNA es el filter binding en donde los hbridos quedan unidos a un filtro y pueden ser reconocidos.

PCR real time

Se realiza la retrotranscripcin del mRNA extrado previamente, obteniendo un conjunto de cDNAs. Esta se realiza en una PCR cuantitativa o real time. Esto permite detectar la cantidad de molde original de mRNA a partir del cual surge el cDNA. Hay que controlar especficamente que no haya DNA en la mezcla de reaccin, dado que esto afectara a todo el ensayo. Utilizando sondas marcadas con fluoruros que se van uniendo al DNA formado por hibridacin y marcando la aparicin de producto (cDNA). A mayor cantidad de DNA vamos a observar mayor fluorescencia y ambas dependen de la cantidad de RNA inicial (molde). Graficando:

FISH
Se realiza un FISH, hibridacin in situ, en las clulas expuestas a las diferentes condiciones a ensayar, en las cuales se quiere ver la variacin en la expresin de un gen en particular. Permite obtener resultados in vivo.

Estudio de promotores
Se puede clonar el gen al cual le quiero estudiar la expresin en diferentes condiciones. A este gen se lo puede mutar o modificar, adicionando un gen reportero (este gen codifica para una protena de fcil cuantificacin, cuya expresin no est regulada a nivel traduccional). Ese DNA modificado es transfectado a la bacteria de la cual se extrajo el gen y all se observa la expresin del gen reportero. Esto permite dar una idea general en cuanto a que tipo de promotor contiene dicho gen que factores modifican su expresin.

Cuando se usa el gen reportero lac Z, se expresa la -galactosidasa, pero no se utiliza el compuesto Xgal que la reconoce y tie las colonias, sino que se utiliza el ortonitrogalactosidasa, que acta como sustrato de la enzima, y luego se mide la deplecin de dicho sustrato. El gen reportero utilizado puede no dar lugar a una enzima, sino a una protena fluorescente como la GFP. Esto permite monitorear in vivo cmo se expresa el gen y cunto tarda en expresarse en diferentes condiciones. La contra del mecanismo es que no permite ver la desaparicin del mRNA porque la protena tiene una vida media ms larga que l. Adems hay sistemas de protelisis dirigida por ubiquitina que llevan la desaparicin en el tiempo del GFP. Para suprimir este defecto se pueden utilizar plsmidos que reducen la posibilidad de protelisis. Otra estrategia general aplicable a todos los sistemas incluye la clonacin del promotor a estudiar y mediante tcnicas de recombinacin, la obtencin de plsmidos con partes del promotor (siempre contienen el sitio +1 de inicio de la transcripcin) y un gen reportero. Todos los plsmidos obtenidos se transfectan a las clulas y se observa la expresin del gen reportero a partir de cada promotor. Aquel promotor que este completo dar lugar a una mayor expresin que el promotor que no lo est.

Qu determina ese patrn de expresin? Promotor o zona de regulacin:

Se utiliza un fragmento de DNA que contenga la zona promotora de la transcripcin del gen estudiado y se realiza un Gel Shift Assay (EMSA). En este ensayo se

estudia la interaccin protena-DNA y se caracteriza el complejo para ver si la unin es fuerte y si es especifica. Se desplaza con DNA heterologo.

Finger print
Con el mismo fragmento de DNA se puede realizar un Finger Print (Footprinting) en el cual se corta el DNA con DNasas y se ve que cambia el patrn de corte al ensayar DNA solo y DNA con la protena de unin. Tambin se lo conoce como tcnica de la huella, y est basado en los principios de la secuenciacin del DNA. Los pasos son: 1. 2. 3. 4. Aislar y marcar radiactivamente en un extremo de una de las cadenas de un fragmento de DNA que supuestamente contiene las secuencias reconocidas por una protena de unin al DNA. Se usan DNasas para producir roturas al azar obteniendo diferentes fragmentos de DNA. Se separan los productos de corte radiactivos mediante la electroforesis de alta resolucin y se pone en manifiesto una escalera de bandas radiactivas. Los pasos 1, 2 y 3 se repiten o se realizan para dos muestras diferentes: una con el fragmento de DNA libre y otra con el fragmento unido a protenas. Estas protenas impiden el corte del DNA en la regin en la que estn unidas y por lo tanto cambian el patrn de corte o la escalera de fragmentos. Los dos productos de conjuntos de corte se analizan y comparan por electroforesis. En la escalera de bandas radiactivas de la muestra que contena la protena se observa un agujero o huella, debido a la proteccin del DNA por la protena unida. De esta forma se identifican las zonas reconocidas por las protenas, secuencias de unin y de regulacin.

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Se puede determinar la localizacin precisa de este sitio de unin de la protena por secuenciacin directa del mismo fragmento de DNA. Como control se utiliza un fragmento de DNA marcado cortando con un reactivo que produce un patrn de bandas uniforme.

Primer extensin
Permite saber donde se da el inicio de la transcripcin, es decir el nucletido +1. Tambin se lo puede hallar observando el primer aminocido de la protena y sus posibles codones de traduccin. (a) (b) (c) (d) Se transcribe la secuencia de DNA del gen en estudio obtenindose un mRNA Utilizando la protena codificada por dicho mRNA se disea un primer usando su Nt y se hibrida el mRNA con la sonda Se realiza la retrotranscipcin con NTPs marcdos in vitro Se obtiene el segmento de RNA con el primer + Nt marcado con un determinado PM.

Para conocer el PM de dicho fragmento se utiliza el mtodo de Sanger. En este mtodo se usan los 4 tipos de NTPs y dioxiNTPs para producir fragmentos de diferentes largos que terminan en el dioxiNTP adicionado, de tal manera que en una electroforesis de alta definicin (poliacrilamida) se pueden diferenciar los fragmentos por su tamao y conocer cul es el nucletido en cada posicin. Si la banda aparece a la misma altura que A, +1 = A

DOT BLOT
El DOT BLOT slo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolcula o biomolculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo. Se utiliza porque sirve para analizar ms de un gen por vez. Una muestra radiactiva puede ser hibridada para permitir al investigador detectar la variacin entre muestras. Alternativas: 1. Depositar en cada posicin una muestra de RNA de clulas sometidas a diferentes estmulos e hibridar con una nica sonda de DNA correspondiente al gen de inters (anlisis de mltiples situaciones para un nico gen). 2. Depositar en cada posicin un exceso de DNA clonado con la secuencia de los genes de inters (uno diferente en cada posicin) e hibridar con una sonda (mezcla de sondas) extrada de clulas incubadas en presencia de precursores radiactivos, o de cDNA (RNA extrado de clulas y usado para generar una sonda por transcripcin reversa en presencia de precursores radiactivos)

ARRAYS y MICROARRAYS
Es una superficie slida a la cual se une una coleccin de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy variables y pueden ser de vidrio, plstico e incluso de silicio. Se usan para analizar la expresin diferencial de genes, monitorizndose los niveles de miles de ellos de forma simultnea. Su funcionamiento consiste, bsicamente, en medir el nivel de hibridacin entre la 6

sonda especfica y la molcula diana, indicndose generalmente mediante fluorescencia y analizndose por anlisis de imagen, lo cual nos indicar el nivel de expresin del gen. Suelen utilizarse para identificar genes con una expresin diferencial bajo condiciones distintas. Por ejemplo, para detectar genes que producen ciertas enfermedades mediante la comparacin de los niveles de expresin entre clulas sanas y clulas que estn desarrollando ciertos tipos de enfermedades. Tambin se utilizan para identificar y estudiar el TRANSCRIPTOMA que son todos los RNAs transcriptos de un tipo celular. Esto se relaciona directamente con que aunque las clulas de un mismo organismo tengan el mismo genoma, la expresin gnica se regula diferencialmente en ellas y por lo tanto tienen diferentes transcriptomas. La expresin diferencial est determinada por muchos factores, los cuales pueden incluir: acetilacin, metilacin, Fosforilacin del DNA y de las histonas, grado de compactacin del DNA, presencia de activadores y receptores, estmulos del medio, etc.

Algunas de sus aplicaciones ms frecuentes son: Estudio de genes que se expresan diferencialmente entre varias condiciones (sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados). Clasificacin molecular en enfermedades complejas. Identificacin de genes caractersticos de una patologa. Prediccin de respuesta a un tratamiento. Deteccin de mutaciones y polimorfismos de un nico gen (SNP).

Para cargar la muestra se utilizan cabezales y tcnicas de micro-inyeccin.

CHIPS DE AFIMETRIX
Las tecnologas para fabricar microarrays utilizan dos tipos de tcnicas diferentes: (1) Fabricar las sondas in vitro para sembrarlas despus sobre el chip. (2) Fabricar las sondas in situ, sobre el chip. Los primeros corresponden a los ya mencionados ARRAYS y MICROARRAYS, mientras que los segundos se corresponden los con chips de AFIMETRIX. Affymetrix es la compaa lder en este tipo de chips. Se denominan genricamente "GeneChips" en donde cada gen es representado por un conjunto de secuencias cortas que lo caracterizan. Algunos chips contienen genomas completos con ms de 50.000 grupos de sondas. Permite estudiar la expresin global de todo un genoma y como se relacionan en funcin a su expresin. La fabricacin in situ se realiza utilizando nucletidos que requieren activacin por luz a diferentes longitudes de onda, para exponer sus grupos reactivos y unirse al siguiente nucletido de la secuencia. Esta polimerizacin da lugar a diferentes secuencias en cada spot porque se usan mascaras que dejan pasar la luz activante solo en el spot correspondiente, para excitar al nucletido y permitir la polimerizacin.

Sntesis de RNA
Ensayo de transcripcin Run-ON
(1) (2) (3) (4) (5) Clula eucariota en transcripcin. Aislado de ncleos. 32 Incubacin de los mismos con nucletidos marcados ( P-GTP). Extraccin de RNA transcripto Run-On. Dot Blot para ver qu genes se estaban transcribiendo/ que RNA se estaba sintetizando.

Tcnicas para identificar interacciones DNA-protena

Filter Binding
Se utiliza un filtro de nitrocelulosa, a travs del cual se hacen pasar tres soluciones distintas: 1. 2. 3. La solucin con DNA de doble cadena con la secuencia a ensayar, el cual pasa libremente por la membrana y es recolectado por debajo. La solucin de protena, la cual queda retenida en la membrana. La solucin con el complejo DNA-protena. Solo aquellos segmentos de DNA que estn unidos a protenas quedaran en la membrana y los dems sern recolectados por debajo.

Mtodos 2 y 3 explicados previamente en Cmo se determina el patrn de expresin?

Tcnicas para identificar interacciones DNA-protena y otras interacciones entre macromolculas

Yeast-one-hybrid system
Esta tcnica permite estudiar la interaccin protena-DNA y requiere de dos componentes: 1. Biblioteca de expresin de cDNA: estos se obtienen por una reaccin de transcripcin reversa a partir del mRNA extrado de la clula a estudiar sus protenas. Cada cDNA debe ser fusionado con el DNA que codifica para un dominio de activacin conocido, por ejemplo Gal4, en un plsmido, el cual tiene las partes: Promotor: de expresin regulada por el factor de activacin del cual se utiliza el dominio de activacin y reconocido por la DNA polimerasa del husped (levadura). AD: dominio de activacin del DNA (Gal4) DBD: dominio de unin al DNA, que en este caso sern las cDNAs de la biblioteca genmica.

Cuando cada plsmido se transcriba y traduzca dar lugar a un factor de transcripcin distinto cada uno, porque los cDNAs son diferentes.

2.

Un gen reportero: que contiene la secuencia target a estudiar su interaccin con una protena. Esta secuencia se localiza Upstream y adyacentemente al promotor activado por el AD del factor de transcripcin previamente ideado (Gal4) y al gen reportero, el cual puede ser lacZ.

Si alguno de los plsmidos recombinantes contiene cDNA tal que codifica para una protena de unin al DNA target, el factor de transcripcin producido se unir a dicha secuencia y reclutar dominios de activacin Gal4 que promocionan la transcripcin del gen reportero lacZ. Las colonias transfectadas con el plsmido en las cuales aparezca el producto de lacZ, se tien de azul al ser expuestas a X-gal y de esta manera son seleccionadas.

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