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MBITO FARMACUTICO

GENTICA

Animales clnicos para usos biomdicos

SANDRA TORRADES
Biloga.

Desde que, en julio de 1996, los cientficos del Instituto Roslin comunicaron el nacimiento de la oveja Dolly, la posibilidad de clonar seres vivos es un tema candente en nuestra sociedad. Los xitos parciales en la clonacin de embriones humanos han suscitado muchos debates ticos. Pero, y la clonacin de otros mamferos? Es simplemente un capricho? Est claro que no. Constituye el punto de partida de una nueva era: la del uso de las tcnicas de la clonacin para usos biomdicos.

roducir organismos genticamente idnticos a otros no es algo nuevo en la naturaleza. Muchos seres vivos utilizan esta forma de reproduccin asexual para perpetuarse. El trmino clon procede del griego y significa rama. Desde hace millones de aos las plantas pueden reproducirse por clonacin mediante esquejes. Basta cortar un tallo o una rama y plantarlo.

Cuando el esqueje enraza, se obtiene un individuo nuevo genticamente idntico a la planta original. Las bacterias tambin se pueden reproducir de forma asexual, ya que una nica bacteria puede dar lugar a miles de millones de descendientes idnticos, como si se tratara de una clonacin a escala industrial. Sin embargo, tambin las bacterias, al igual que las plan-

tas, pueden reproducirse de forma sexual. Intercambian material gentico entre ellas mediante la conjugacin. Este proceso es imprescindible para aportar la diversidad gentica necesaria para su supervivencia. Tambin son clnicos los gemelos univitelinos u homocigotos. Son genticamente idnticos puesto que proceden de la divisin de los primeros estadios del embrin.
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Sin embargo, de los 2 millones, aproximadamente, de especies descritas hasta ahora, slo alrededor de 2.000 se reproducen habitualmente de forma asexual. A la vista de estas cifras, la pregunta es por qu la mayora de animales ha elegido la reproduccin sexual para perpetuar su especie? La respuesta es muy simple: porque la principal ventaja de la reproduccin sexual es aportar diversidad gentica a la descendencia y conferir ventajas adaptativas y evolutivas. Conociendo las ventajas de la reproduccin sexual respecto a la asexual, resulta difcil entender por qu existen algunas especies que se reproducen de forma asexual, mediante clonacin natural. La verdad es que las especies facultativas (con capacidad de reproduccin sexual y asexual) saben aprovechar muy bien ambos tipos de reproduccin dependiendo de las condiciones ambientales de cada momento. Esto es lo que estn haciendo los cientficos. Aunque saben que la mejor opcin para la perpetuacin de una especie es la reproduccin sexual, la tcnica de la clonacin animal puede ofrecer ventajas en aspectos muy concretos que vamos a comentar ms adelante. Tcnicas de clonacin animal A finales de la dcada de los setenta y principios de los ochenta, los cientficos ya consiguieron obtener ovejas, vacas, caballos y otros animales genticamente iguales. Desarrollaron experimentalmente lo que ocurre de forma natural cuando se originan los gemelos univitelinos. Esta tcnica consiste en dividir un embrin y los productos de esta divisin se introducen en el tero donde se desarrollan los gemelos. As se pueden obtener dos, cuatro y hasta ocho individuos clnicos (gemelos), pero de este modo, el nmero de clnicos se limita al nmero de clulas que se puede dividir el embrin. La alternativa es la clonacin por transferencia nuclear, puesto que permite producir un nmero ilimitado de clones. Esta tcnica consiste en fusioVOL 22 NM 11 DICIEMBRE 2003

Oveja adulta blanca

Clula de tejido de una mama

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Fusin de Clula Divisin de la clulas mediante fusionada clula nueva corriente elctrica y formacin del embrin 5

Implantacin Madre adoptiva del embrin de a luz a un clon en la madre de oveja blanca adopiva

Oveja adulta de cara negra

Ovoncito no fecundado

Ncleo extrado (material gentico)

De una clula, obtenida del tejido mamario de una oveja adulta, se extrae el ncleo. ste se fusiona con un ovocito al que previamente se le ha extrado el ncleo. A partir de ah se obtiene un embrin que se implantar en la madre adoptiva. Puesto que el ncleo (material gentico) proviene de una oveja blanca, la madre adoptiva negra dar lugar a una oveja blanca.

Fig. 1. Clonacin por transferencia nuclear.

nar una clula donante con un ovocito anucleado al que se le ha extrado el ncleo previamente. Se realiz con xito por primera vez en 1952 con anfibios. Desde entonces, se ha utilizado de forma habitual para estudiar el desarrollo embrionario de stos. As, se demostr la totipotencia (clulas capaces de originar cualquier linaje celular adulto) de las clulas resultantes de la primera divisin del ovocito. Sin embargo, la transferencia nuclear en mamferos es mucho ms compleja. La investigacin en el campo de la transferencia nuclear en especies estabuladas y, en particular, en el ganado vacuno ha sido alentada por los beneficios econmicos que se derivan de la multiplicacin ilimitada de embriones con un inters especial, como por ejemplo, obtener de forma ilimitada animales transgnicos. A mediados de los aos ochenta varios grupos de investigacin haban conseguido clonar ovejas y otras especies de ganado vacuno transfiriendo directamente ncleos de embriones muy tempranos. Sin embargo, para lograr una substitucin dirigida de genes (para obtener animales modificados genticamente) en especies estabuladas se deba de producir animales vivos a partir de clulas procedentes de cultivos in vitro (en el laboratorio). No fue hasta 1996 cuando lo consiguieron. En el Instituto Ros-

lin lograron el nacimiento de dos ovejas Megan y Morgan engendradas mediante transferencia nuclear de clulas de embriones tempranos cultivadas in vitro durante varios meses. ste fue el inicio de las investigaciones con distintos tipos celulares derivados de embriones con estadios ms tardos. Y en febrero de 1997 se public en la prestigiosa revista Nature el nacimiento de un cordero clonado por transferencia nuclear a partir de una clula mamaria adulta, la oveja Dolly. Se confirm su origen por medio del anlisis de marcadores de ADN. Paradigma de la reprogramacin nuclear El nacimiento de Dolly cuestiona uno de los principios fundamentales de la biologa evolutiva, puesto que la mayora de los cientficos crean que la diferenciacin celular era irreversible; es decir, se crea que una vez las clulas embrionarias totipotentes inician la diferenciacin a un linaje celular especfico, el proceso ya no es reversible. El nacimiento de una oveja a partir de una clula adulta puso en entredicho esta teora. A partir de este experimento muchos investigadores han demostrado que existen distintos linajes celulares, como las clulas epiteliales o las clulas neuronales capaces de ser reprogramadas y originar otro tipo celular distinto.
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El caso de la oveja Dolly ha abierto nuevas lneas de investigacin, quiz ms interesantes que la propia clonacin, como conocer cmo afectan las mutaciones somticas en el proceso de envejecimiento e incluso el desarrollo de los tumores. Entender los procesos de reprogramacin podr aportar nuevos datos sobre el control de la expresin gnica en clulas diferenciadas y abrir nuevas perspectivas en la terapia celular. Clonar animales transgnicos El instituto Roslin es tambin lder en el desarrollo de la tecnologa de animales transgnicos. A mediados de los aos ochenta, el Dr. Clark y sus colaboradores demostraron que era posible dirigir la expresin de un gen humano en la glndula mamaria de otro mamfero. Este xito y la sntesis de una oveja transgnica, Tracy, que secretaba 35 g de una protena humana, la alfa-1-antitripsina (AAT) en cada litro de leche, proporcion la creacin de PPL Therapeutics. PPL se dedica hoy a la produccin de protenas recombinantes humanas, entre ellas la AAT sintetizada a gran escala por animales transgnicos. Esta molcula se est probando en ensayos clnicos para el tratamiento de la fibrosis qustica. En un principio, la nica manera de conseguir animales de granja modificados genticamente era mediante el mtodo de la inyeccin pronuclear. Consiste en inyectar directamente en vulos recin fecundados de 200 a 300 copias del gen que se desea transferir. Posteriormente, las clulas microinyectadas se implantan en madres adoptivas. Pero slo el 2-3% de los animales que nacen son transgnicos de lnea germinal (es decir, transmiten el gen incorporado a la siguiente generacin) y adems, slo una pequea proporcin de stos, muestran valores suficientemente altos de expresin del gen transmitido para ser comercialmente interesantes. La inyeccin pronuclear es simplemente una metodologa para
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Fig. 2. Xenotransplantes.

incorporar genes. En cambio, la manipulacin gentica de clulas en cultivo permite realizar modificaciones mucho ms complejas, como la substitucin o delecin de genes concretos. La metodologa de substitucin dirigida de genes, conocida como gene targeting, se utiliza de forma rutinaria en clulas madre embrionarias de ratn. Pero el Instituto Roslin ha sido pionero en la transferencia nuclear con objeto de disear una ruta alternativa al gene targeting en ganado.

Finalidades biomdicas La industria biotecnolgica parece que, de momento, es la ms beneficiada del conocimiento de las tcnicas de transferencia nuclear, puesto que proporciona mtodos ms fiables para conseguir animales transgnicos y reducir el nmero de animales necesarios para establecer una lnea transgnica. Los cientficos del Instituto Roslin, usando clulas embrionarias clnicas en cultivo, lograron incorporarles el gen del factor IX
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humano, protenas de la coagulacin sangunea usadas para el tratamiento de la hemofilia B. As, nacieron, en 1997, las primeras ovejas clnicas transgnicas, como Polly. Estas ovejas son capaces de segregar esta protena humana como si fuera un componente normal de su leche. Ello demostr que mediante la clonacin se pueden introducir genes especficos de otros mamferos y, tambin, la posibilidad de obtener verdaderos rebaos portadores y capaces de expresar los genes exgenos. A partir de ah empez una carrera, llena de obstculos, para conseguir otros animales de ganado vacuno y porcino mediante la tcnica del gene targeting y la transferencia nuclear, puesto que los beneficios pueden ser enormes, tal como veremos a continuacin. Una de las posibilidades que ofrece la tcnica de la clonacin por transferencia nuclear son los xenotrasplantes. Las reacciones inmunitarias hiperagudas imposibilitan, por ahora, los trasplantes de rganos de origen animal. Mediante las tcnicas de manipulacin gentica se pretende eliminar la reaccin autoinmunitaria. A partir de ah, se podran obtener animales clnicos, como el cerdo, con rganos trasplantables a pacientes humanos. Otra de las posibilidades de la clonacin es la obtencin de modelos animales con enfermedades humanas. En ocasiones la insercin de mutaciones especficas en ratones ha resultado ser de gran utilidad para la creacin de modelos de enfermedades genticas humanas como la fibrosis qustica o la obesidad. La transferencia nuclear permite aumentar el abanico de modelos animales para experimentar terapias para los hombres. Otra posibilidad es la terapia celular. Actualmente, se utilizan clulas de dadores para tratar enfermedades como la leucemia o la enfermedad de Parkinson, pero adems, normalmente, para evitar el rechazo deben ser de parientes prximos. La idea es obtener clones del propio paciente para obtener la estirpe celular necesaria para la terapia y evitar los rechazos de las clulas exgenas.
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Finalmente, ya en un marco distinto del biomdico, la clonacin por transferencia nuclear est abriendo nuevas perspectivas para los animales de granja (con el fin de mantener linajes que tienen caractersticas como la alta produccin de leche), la clonacin de animales de compaa e incluso la clonacin de especies en extincin. Obstculos en la clonacin Aunque cada semana escuchamos los logros en distintos centros de investigacin de la obtencin de un clon de vacuno, un clon de caballo o un clon de gato, lo cierto es que an quedan muchos problemas tcnicos por resolver. Los investigadores an se mueven, en gran parte, de modo emprico, con numerosas tentativas de ensayo y error para mejorar los protocolos. Por un lado, se da una alta incidencia de nacimientos muertos y abortos. Wilmut et al han descrito que existe un patrn de muertes durante el desarrollo embrionario y fetal, llegando al trmino slo 1-2% de los embriones. Por otro lado, tambin se dan malformaciones y anomalas en el desarrollo. En el ganado bovino los intentos de clonacin se saldan, a menudo, con gestaciones complicadas, abortos y nacimientos de terneros con tamao anormalmente grande. De los terneros clnicos de tamao anormal, muchos presentan hipercalemia (alta concentracin de potasio) y pulmones poco maduros. Tambin se ha planteado la cuestin de la edad biolgica de los clones. Qu edad gentica tiene el clon? Corresponde a la edad de la clula dadora? Supone esto un mayor peligro de acumulacin de mutaciones y de envejecimiento celular? Hay informes sobre estas anomalas, como el acortamiento de los telmeros, lo que parece un indicio de edad celular. Parece ser que uno de los mayores problemas est en los genes que se conocen como genes de impresin. Estos genes son indispensables para la expresin gnica en el desarrollo embrionario. El grupo de investigacin del Centro de Investigacin Biomdi-

ca del Instituto Whitehead observ que clones que parecan normales presentaban graves anomalas que afectan a la expresin gentica y que no se manifiestan en las caractersticas externas. Estos investigadores se han centrado en analizar los mecanismos de la escasa supervivencia y el sobrecrecimiento de los animales clonados. Mediante ratones clonados obtenidos a partir de clulas embrionarias, monitorizaron la actividad de estos genes impresores. El estudio sirvi para discernir si los problemas de los clones venan dados por alteraciones en las clulas donantes o en el procedimiento de la clonacin. Y observaron que muchos de los problemas procedan de las clulas madre donantes, puesto que provenan de cultivos extremadamente inestables. En definitiva, la clonacin an no es una tcnica eficaz, pero parece que puede ofrecer importantes oportunidades mdicas. Como sociedad, debemos adoptar actitudes crticas ante los cambios que se nos avecinan, pero, por otro lado, no debemos desaprovechar las posibilidades que nos ofrece la ciencia para mejorar nuestra calidad de vida y la de las generaciones futuras.

Bibliografa general Casado M. Gonzlez-Duarte R. Los retos de la gentica en el siglo XXI: gentica y biotica. Barcelona: Universidad de Barcelona, 1999; p. 203-13. Cloning uses and ethics [consultado 29/08/2003]. Disponible en: http:// www.klsnet.com/clone.html El proceso de la clonacin [consultado 29/08/03]. Disponible en: http://www. geocities.com/CapeCanaveral/Hangar/9713/clon4.htm Esponda P. Aspectos biolgicos de los animales clnicos [consultado 29/08/03]. Disponible en: www.ciencia.cl/CienciaA1Dia/volumen5/numero1/articulos/articulo3.html Iaez E. Seguridad en las clonaciones [consultado 29/08/03]. Disponible en: www.ugr.es/einez/Biotecnologia/clonseg.htm Xenotrasplantes [consultado 29/08/03]. Disponible en: http://www.angelfire.com/ scifi/xenofermi/transgenicos.htm
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