UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA E BIOLOGIA MOLECULAR CURSO DE BIOTECNOLOGIA DISCIPLINA DE BIOPROCESSOS

TCNICAS DE MICROBIOLOGIA

EMANUEL FRANCELINO GEORGE MEREDITE GUILHERME NASCIMENTO HUGO LEITE VICTOR TEIXEIRA YASMINE LIMA

Laboratrios de microbiologia so, com freqncia, ambientes singulares de trabalho que podem expor as pessoas prximas a eles ou que neles trabalham a riscos de doenas infecciosas identificveis.

Inmeros casos foram atribudos falta de cuidados ou a uma tcnica de manuseio ruim de materiais infecciosos.

A exposio aos aerossis infecciosos considerada como sendo uma fonte de infeco, entre a dcada de 70 e 80 3.921 casos de infeco por Tuberculose, Hepatite e Tifo foram relatados.

Critrios para a avaliao de risco Quanto ao Microorganismo:

- Patogenicidade do microrganismo infectante/ virulncia/ dose infectante;
- Alterao gentica ou recombinao gnica cepas (variantes) ; - Modo de transmisso;

- Endemicidade;
- Disponibilidade de medidas profilticas e de tratamento eficaz;

- Concentrao e volume;
- Estabilidade do agente no ambiente.

Quanto ao uso de EPIs:

recomendado o uso de jalecos, aventais ou uniformes prprios, para evitarem a contaminao ou sujeira de suas roupas normais. Antes de sair do laboratrio para as reas externas (cantina, biblioteca, escritrio administrativo), a roupa protetora dever ser retirada e deixada no laboratrio, ou encaminhada para a lavanderia.

Nunca pipetar com a boca!!

A bancada o seu local de trabalho, logo livros, casacos e outros materiais no envolvidos na pesquisa no devem ficar sobre a bancada.

Higienizao de vidrarias
Material contaminado Os resduos que so passveis de destruio/neutralizao no prprio laboratrio para posterior descarte na pia, no devero ser acumulados. sempre mais fcil e menos perigoso o tratamento de pequenas quantidades de resduos. A Potassa Alcolica um agente desengordurante muito eficaz, considerado como de ao mais rpida do que a mistura sulfocrmica.

As cabines de segurana biolgica e outros dispositivos de conteno fsica devero ser usados ao conduzir procedimentos que possuam um alto risco de criao de aerossis.

Os laboratrios devem ser equipados com sistema de ventilao, exausto e capelas para diminuir os riscos de poluio do ambiente de trabalho por microrganismos..

CONCEITO : Associao quantitativa e qualitativa de substncias que permitem o cultivo de microrganismos fora do meio natural.

Presso Osmtica

Umidade Atmosfera

pH

Meio de cultura

Nutrientes

Funes

Nutrir

Selecionar

Identificar

Multiplicar

Transportar
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Preparo do meio(Quantitativa) Preparo do meio(Qualitativa) Esterilizao Inoculao Acondicionamento

Seleo

Clculo

Pesagem Finalidade

Distribuio

Microrganismo Calor mido Inculo pH

Calor seco Tcnicas asspticas Temperatura

Nutrientes termolbeis Mtodo inoculao Crescimento

de

10 MADIGAN, M. T., MARTINKO, J. M., PARKER, J.. Brock Biologa de los Microorganismos. 10ed. Madri: Pearson Education, 2004.

Esterilizao por filtrao

Usado para esterilizar substncias que no podem ser autoclavadas. Baseia-se na passagem de lquido ou gs atravs de material semelhante a uma tela, com poros pequenos o suficiente para reter os microrganismos.

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Composio
MACRONUTRIENTES:
Carbono (C) Nitrognio (N) Enxofre (S) Fsforo (P)

MICRONUTRIENTES (Utilizados como cofatores essenciais para atividade de algumas enzimas.) :

Cromo Cobre Molibdnio Nquel Tungstnio Vandio Cobalto Mangans Selnio Zinco
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GAR

Quanto ao estado fsico

Meios Slidos Meios Lquidos Meios Semi-slidos

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Quanto Origem dos Constituintes Meios Complexos. Meios Sintticos (Quimicamente Definidos).

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Quanto funo
Meios redutores. Meios seletivos. Meios diferenciais. Meios de enriquecimento.

gar Sangue

gar Sabouraud
gar MacConkey

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- Conjunto de medidas para prevenir a infeco de modo a garantir a segurana dos manipuladores da cultura.

Zona de esterilidade

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Instrumentos

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Inculos lquidos em meios lquidos

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Inculos slidos em meios lquidos

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Semeadura em estrias

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Semeadura em profundidade e superfcie

Condio anaerbica

Condio aerbica
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Semeadura com espalhamento em superfcie

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Semeadura em camada

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Semeadura por derramamento

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Tcnicas de isolamento permitem a obteno de culturas de uma determinada espcie. Exemplo: E. coli

O exemplo a seguir descreve o isolamento de E. Coli a partir de uma amostra de gua de esgoto:

Primeiramente, a amostra semeada em gar e incubada por 18-24 horas, a 37 C de forma invertida. Durante a incubao, as clulas que esto separadas e que forem capaz de crescer nesse meio originaro colnias individuais. Aps 24 horas em gar, clulas de E. Coli originaro colnias vermelhas e redondas. Entretanto nem todas as colnias com este aspecto sero de E. coli.

Escolhem-se ento, algumas cultura para estudo mais detalhado. Cada cultura subcultivada ou repicada, ou seja, as clulas so transferidas para um novo meio estril. Um pequeno inculo dessas culturas so semeadas em um novo meio gar. Aps a incubao, se cada colnia vermelha repicada representa uma nica espcie, teremos vrias culturas puras, e uma delas poder ser E. Coli, devendo ser examinada por procedimentos de identificao de microrganismos.

I Incubao anaerbia em jarras.

II- Meios de cultura para anaerbios. Podem crescer em meios apropriados, como o caso do meio de Robertson (10 g/L), peptona (10 g/L), cloreto de sdio (5 g/L), e um agente redutor. III- Cmaras para trabalho com anaerbios. Permite que as amostras sejam retiradas em condies controladas (ausncia de O2, temperatura, umidade e CO2).

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Tcnicas de diluio

Dificuldades de contagem geradas por alta concentrao de microrganismos. Fator de diluio = Volume da amostra Volume Total

Contagem do nmero total de clulas (vivas e mortas)

Facilidade e rapidez. No distino entre clulas vivas e mortas.
Cmaras de contagem

Mtodo da turbidimetria

Contagem do nmero total de clulas (vivas e mortas)

Contagem

em Coultercounter

Contagem em esfregao corados

Contagem do nmero total de clulas (vivas e mortas)

Cmaras de contagem Simplicidade e rapidez na execuo. Adeso do micro-organismos a pipeta uso de detergentes aninicos

Contagem do nmero total de clulas (vivas e mortas)

Contagem em Coulter-counter

Partculas devem ser suspensas em um fluido condutor. Ao passar pelo orifcio, a partcula muda a resistncia do sistema. Mudana detectada por eletrodos e quantificada.

Contagem do nmero total de clulas (vivas e mortas)

Contagem em esfregao corados

Gota de volume conhecido espalhado sobre lmina. A gota seca, fixada e corada. Realizao da contagem.

Contagem do nmero total de clulas (vivas e mortas)

Mtodo da turbidimetria (comparao visual com tubos de turvao padro)

Amostras so comparadas visualmente com solues de cloreto de brio que apresentam turvao similar a solues com valor aproximado de bactrias conhecido.

Escala de MacFarland

Contagem de colnias aps espalhamento do inculo na superfcie do meio de cultura

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Mtodo do Pour Plate e Spread Plate

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Medio de biomassa microbiana

Pesagem direta Material mido Separao do material biolgico do meio de cultura (filtrao, centrifugao)

Lavagem e ressuspenso do material

Pesagem

Secagem

Medio de biomassa microbiana

Quanto maior o nmero de micro-organismos, maior a disperso da luz. Maior disperso de luz, menor quantidade de luz atravessando a amostra. Maior absorbncia

Necessidade de curva de calibrao

Dosagem de componente celulares

Dosagem de nitrognio, protenas moleculares, DNA ou RNA.

Conhecimento prvio da porcentagem do componente analisado e sua relao na massa total

Medio de compostos resultantes da atividade metablica

Anlise da concentrao de compostos consumidos ou produzidos durante o crescimento microbiano.

Ex.: Consumo de acares (tcnicas colorimtricas, HPLC); consumo de O2 (polarografia), produo de cidos orgnicos, produo de CO2.

Volume de material aps centrifugao

Utilizao de tubos de centrfuga especialmente calibrados. Centrifugao em condies que no promovam lise celular. Utilizado na impossibilidade do emprego da filtrao.

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I- Esfregaos e fixao pelo calor (no achei uma imagem boa ainda)

II- Colorao de Gram