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ANTIOXIDANTES EN ALIMENTACIN: DIFERENTES FORMAS DE EXPRESAR SU ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE. TIPOS DE UNIDADES Y MTODOS DE ANLISIS.

Barcelona, 20 Junio 2007 ARRATE LACALLE

1-. INTRODUCCIN

RADICALES LIBRES
Un radical libre es cualquier especie que contiene uno o ms electrones desapareados y que es capaz de mantener una existencia independiente. El radical libre, en estas condiciones, busca a toda costa otro electrn para poder parearse. Es esta intensa bsqueda la que hace a estos radicales libres extremadamente reactivos.
Hidroxilo, Peroxilo, Superxido, Hidroperxilos

ANTIOXIDANTE
Molculas que a bajas concentraciones, respecto a las de un sustrato oxidable, retardan o previenen su oxidacin. El antioxidante al chocar con el radical libre cede un electrn, se oxida y se transforma en un radical libre dbil no txico.

Vitamina E, Vitamina C, Selenio, Flavonoides

1-. GENERACIN ENDGENA DE RADICALES LIBRES

Los procesos fisiolgicos del organismo generan cierta tasa de estas sustancias oxidantes:

Respiracin Mitocondrial Sistemas de defensa Retculo Endoplasmtico Enzima Xantina DHS-a

RESPIRACIN MITOCONDRIAL
El la formacin de ATP el oxgeno se reduce normalmente hasta agua. As, el O2 se reduce en cuatro etapas en cada una de las cuales se transfiere un electrn. Sin embargo, el transporte electrnico mitocondrial es imperfecto y la reduccin del oxgeno genera O2-..

Se estima que entre 1-3% del oxgeno consumido por el organismo no llega a formar agua y acaba generando ROS y radicales libres.

SISTEMAS DE DEFENSA: Clulas fagocticas

Las clulas fagocticas del sistema inmune -neutrfilos, monocitos, macrfagos y eosinfilos- que defienden al organismo contra la agresin de agentes extraos, producen grandes cantidades de radicales libres como parte del mecanismo que les permite destruir dichos agentes.

2-. GENERACIN EXGENA DE RADICALES LIBRES

Radiaciones Contaminantes Actividad Fsica intensa Humo del tabaco Dietas Metabolizacin de frmacos

TIPOS DE RADICALES LIBRES


NO-RADICALES RADICALES Hidroxilo Peroxilo Hidroperoxilo Superxido xido Ntrico Alcoxilo Dixido Nitrgeno Perxidos orgnicos Oxgeno singlete Perxido hidrgeno c. Hipocloroso

OH. ROO. HOO. O2.NO. RO. NO2.

Ac. Nitroso Catin nitrilo Peroxinitrilo Ac. Peroxinitroso Alquil peroxinitritos Ozono Ac. Hipobromoso

ROOH O2 H2O2 HClO HNO2 NO2+ ONOOONOOH ROONO O3 HBrO

ANIN SUPERXIDO Una molcula de oxgeno que ha adquirido 1 electrn adicional.

HIDROXILO Una molcula de oxgeno que ha adquirido 3 electrones y un protn adicional. PEROXILO Molcula de oxgeno radical carbono +

PERXIDO DE HIDRGENO Radical superxido adquiere 2 electrones que

Molculas diana de los radicales libres

LPIDOS ADN PROTEINAS CARBOHIDRATOS

LPIDOS
Los lpidos, especialmente los que contienen cidos grasos poli-insaturados, son susceptibles a desarrollar procesos de oxidacin no controlados, inducidos por radicales libres. sto se traslada en daos significativos en las membranas celulares, desestabilizndolas y alterando todos los procesos bioqumicos celulares LIPOPEROXIDACIN

ADN
Radicales libres

Antioxidante

Radical libre neutralizado

Molcula de ADN daada

PROTENAS
Los aminocidos que forman protenas pueden verse afectados por los ataques de los radicales, originando modificaciones que alteran su estructura impidiendo su accin biolgica

CARBOHIDRATOS
La proporcin de ataques es inferior, pero azcares como la glucosa pueden reaccionar con radicales hidroxilo y originar sustancias reactivas.

ESTRS OXIDATIVO
Antioxidantes

Radicales libres

Vitamina E Selenio SOD

Hidroxilo Peroxilo Peroxilo Hidroperoxilo Hidroperoxilo

CLASIFICACIN DE ANTIOXIDANTES
Podemos clasificar los antioxidantes en 4 grande grupos:

Enzimas antioxidantes (SOD, CAT) Antioxidantes de alto peso molecular (Albmina, Ferritina) Antioxidantes de bajo peso molecular (Carotenoides, Ascrbico) Algunas hormonas (Angiotensina)

MECANISMOS DE DEFENSA ENDGENOS MECANISMOS DE DEFENSA EXGENOS

MECANISMOS DE DEFENSA ENDGENOS


(A) SUPERXIDO DISMUTASA (SOD)

Radical superxido
(B) CATALASA (CAT)

Perxido de hidrgeno

Perxido de hidrgeno

Oxgeno + agua

(C) GLUTATIN PEROXIDASA (GSH-Px) Y TRANSFERASA (GST)

Proteccin frente al agua oxigenada y compuestos inestables

MECANISMOS DE DEFENSA EXGENOS

VITAMINA E (-tocoferol) VITAMINA C (ac. ascrbico) -CAROTENO (provitamina-A) OLIGOELEMENTOS FLAVONOIDES LICOPENO

VITAMINA E (alfa-tocoferol)
La vitamina E es un antioxidante natural que reacciona con RL solubles en lpidos de la membrana celular-----------INTEGRIDAD Cada molcula de Vitamina E es capaz de proteger 500 molculas de fosfolpidos. Acta junto con otros sistemas antioxidantes: CAT, SOD Captura radicales hidroxilo y aniones superxido y neutraliza perxido de hidrgeno Fuentes: Hortalizas, verduras, frutos secos, aceites (soja, girasol..), arroz integral, lentejas, mantequilla

VITAMINA C (cido ascrbico)


Antioxidante hidrosoluble que figura en primera lnea de defensa del plasma. Poderoso inhibidor de la oxidacin de lpidos. Regenera la Vitamina E. El cuerpo no fabrica Vitamina C por si solo ni la almacena. Reacciona fcilmente con RL-s actuando como antioxidante y pasando el mismo a ser un radical ascorbilo, que rpidamente se descompone para producir cido ascrbico y cido dehidroascrbido. Captura radicales hidroxilo y aniones superxido y neutraliza oxigeno singlete.

Fuentes: Frutas (ctricos), acelgas, tomates, perejil, coles

BETA-CAROTENO
Es el carotenoide ms abundante de la naturaleza y el ms importante para la dieta humana. Al ser ingerido es transformado en vitamina A. Elimina los radicales libres y protege al ADN de su accin mutagnica. Pigmentos vegetales de coloracin amarilla-naranja.

Neutraliza oxigeno singlete.


Fuentes: Vegetales de hojas verdes, verduras y frutas amarillas

OLIGOELEMENTOS ( Cu/Zn/Mn/Se/Fe)
Forman parte del ncleo activo de muchos antioxidantes:
SOD

Necesita Zn, Mn y Cu para poder eliminar radicales hidroxilo. El Se forma parte del ncleo activo de esta enzima. El Fe constituye el ncleo activo de la catalasa.

GSH-Px

CAT

Fuentes: Se (ajo, cebollas, brcoli, lcteos, salmn ), Zn (pescados,


carnes, legumbres, frutos secos, Mn (frutos secos, cereales, t, pia ), Cu (vsceras, frutos secos, cacao y derivados )

FLAVONOIDES
Pigmentos vegetales no nitrogenados. Metabolitos secundarios de las plantas. Se les atribuyen ms de 5000 estructuras. Se emplean como colorantes naturales. Su efecto antioxidante reside tanto en su capacidad para secuestrar radicales como en su capacidad para formar quelatos con metales. La mayora (catequnas) tienen una alta capacidad de neutralizar RL-s. Fuentes: ajo, cebolla, t, manzanas, peras , espinacas, naranjas, limones, pomelos

MECANISMOS DE ACCIN ANTIOXIDANTE 1-. Antioxidantes primarios o preventivos Previenen la formacin de nuevos RL, convirtiendo los RL-s existente en molculas menos perjudiciales antes de que puedan reaccionar y generar as una mayor tasa de RL_s. Este mecanismo de accin es el que emplean los antioxidantes de naturaleza enzimtica (SOD, CAT, GSH-Px) 2-. Antioxidantes secundarios chain breaking Capturan los RL-s evitando as que se produzcan reacciones en cadena. 3-. Antioxidantes terciarios Reparan biomolculas daadas por los ataques mediados por RL-s.

2-. MTODOS

MTODOS DETERMINACIN DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

1-. HAT (HYDROGEN ATOM TRANSFER)

Generador sinttico de radicales + Molcula oxidable que acta como sonda + antioxidante.
ORAC/TRAP/CROCIN/LINOLEICO/CARS

Sustrato oxidable (sonda) + antioxidante -----------------sustrato oxidado 2-. ET (ELECTRON TRANSFER)

Sonda (oxidante) + e (antioxidante)---------------------sonda reducida + antioxidante oxidado


ABTS/DPPH/DMPD

MTODOS
1
ABTS-TEAC DPPH DMPD
ORAC TEST COMPETICIN CINTICA CARS TOSC ENSAYO LINOLICO TRAP B-CAROTENO

2
FRAP VOLTAMETRA CCLICA

4
COBAS FARA

ABTS-TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) Miller & Rice-Evans 1993

El compuesto cromgeno ABTS presenta color azul/verde con mximo de absorcin a 342nm, es soluble en agua y disolventes orgnicos y qumicamente estable. El radical ABTS+ una vez generado por medio de enzimas o qumicamente pasa a presentar nuevas caractersticas con mximos de absorcin a 414, 645, 734 y 815nm.

Generacin del radical catin ABTS 1-. En la generacin por reacciones enzimticas, el ABTS se incuba con perxido de hidrgeno y con metamioglobina, hemoglobina o peroxidasa de rbano. 2-. En la generacin por reacciones qumicas, el ABTS se hace reaccionar con dixido de manganeso, persulfato potsico, ABAP. Estas reacciones por lo general requieren tiempos largos de incubacin o altas temperaturas.

ABTS-TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) Miller & Rice-Evans 1993

INHIBICIN

Los antioxidantes se aaden previamente a la generacin del radical ABTS, y se determina la inhibicin en la formacin del radical, que se traduce en un retraso en la aparicin de la coloracin verdeazulada.

Interferencias: FALSOS RESULTADOS


DECOLORACIN Los antioxidantes se aaden una vez formado el radical ABTS, y se determina la disminucin de la absorbancia debida a la reduccin del radical (decoloracin)

Evita interferencias debidas a compuestos intermedios y evita una errnea estimacin.

ABTS-TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) Miller & Rice-Evans 1993

PEGA: el radical ABTS no se encuentra en nuestro organismo, por lo que representa una fuente no-

fisiolgica.
Algunas reacciones requieren de un mayor tiempo para alcanzar el estado final. El radical

generado

qumicamente

(persulfato

fue validado por su estabilidad, reproducibilidad y por ser una alternativa mucho ms viable econmicamente al mtodo anteriormente descrito.

potsico),

cido 2-2 azinobis (3-etilbenzoatoazolin-6-sulfnico)


Persulfato potsico

: 734 nm

mol TROLOX/g eq TROLOX/g


TROLOX AO-s

Radical catin ABTS+

TEAC %AA

16h

Oscuridad

Reduccin Radical catin ABTS+

Decoloracin y Disminucin en la absorbancia

ENSAYO DPPH (C. Berset el al.) 1994

Este mtodo se basa en la reduccin del radical DPPH por los antioxidantes de la muestra El radical es estable y tiene una coloracin prpura que se pierde progresivamente cuando se aade la muestra conteniendo sustancias antioxidantes. La decoloracin del radical se determina a 515 nm y la cuantificacin se realiza empleando soluciones patrn de ac. ascrbico o trolox.

En general la reaccin se puede medir a los 2, 3, 4, 5 y 10 minutos del inicio, ya que en este intervalo, la mayora de sustancias completan la reaccin con el DPPH,.

ENSAYO DPPH (C. Berset el al.) 1994

VENTAJAS: El ensayo DPPH es un mtodo rpido y sencillo, que no requiere de un equipamiento sofisticado. A diferencia del ensayo ABTS (TEAC), no es necesario generar el radical puesto que el DPPH se comercializa

Slo puede disolverse en medio orgnico


No obstante, en algunos casos la interpretacin resulta complicada, ya que algunos antioxidantes/molculas pueden causar interferencias si poseen un espectro de absorcin similar al DPPH . carotenoides

2,2-Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)

Metanol

mol ac. ascrbico/g eq ac. ascrbico/g


AC. ASCRBICO AO-s

Radical anin DPPH.

AEAC %AA

: 515 nm

Reduccin Radical DPPH

Decoloracin y Disminucin en la absorbancia

DMPD ( Fogliano et al.) 1999

Este mtodo se basa en la reduccin del radical catin DMPD por los antioxidantes de la muestra. La generacin de este radical requiere un pH adecuado (5.25) y la adicin de una solucin de cloruro frrico. La absorbancia del radical se determina a 505 nm y los compuestos antioxidantes, una vez adicionados, son capaces de transferir un tomo de H+, provocando su decoloracin (proporcional a su concentracin). Slo puede disolverse en medio acuoso.

Dicloridrato de N,N-Dimetil-p-fenilendiamina (DMPD)


Cloruro frrico

: 505 nm

mol TROLOX/g eq TROLOX/g


TROLOX AO-s

Radical catin DMPD+

TEAC %AA

pH 5.25

Reduccin Radical catin DMPD+

Decoloracin y Disminucin en la absorbancia

FRAP (ferric reducing activity/antioxidant power) Benzie & Strain 1996

Determina la capacidad de la muestra para reducir un complejo de frrico con la molcula tripiridil s-triazina (TPTZ) a su forma ferrosa (pH bajo).

Fe 3+

Fe 2+

De este modo se genera una coloracin azul, de intensa proporcionalidad a la capacidad reductora de la muestra (se genera un complejo ferroso-TPTZ) que puede cuantificarse por colorimetra (593nm) en base a un patrn de sulfato ferroso. La capacidad de reducir el hierro se considera un ndice del poder antioxidante de la muestra.

FRAP (ferric reducing activity/antioxidant power) Benzie & Strain 1996

El ensayo FRAP es sencillo y fcilmente automatizable. Es rpido, generalmente la reaccin se completa entre 4 y 8 minutos. Sin embargo, en el caso de algunos polifenoles se han descrito reacciones ms lentas, llegando incluso a requerir 30 minutos hasta completar la reduccin del complejo. La reaccin no es especfica, y por tanto, cualquier reaccin con un potencial redox menos positivo originar la reduccin del complejo Fe 3+-TPTZ.
Medir la capacidad reductora no significa medir la capacidad antioxidante

TPTZ (2,4,6-tri-(2 piridil)-s-triazina) Fe3+


SULFATO FERROSO pH bajo AO-s

Reduccin

TPTZ-Fe 2+

Sulfato Ferroso/g
593 nm

Coloracin azulada

Demuestra la presencia de un agente REDUCTOR

VOLTAMETRA CCLICA Kohen et al. 1997

Este ensayo evala el poder reductor total de molculas de bajo peso molecular. Una vez procesada la muestra se introduce en una celda donde se sitan 3 electrodos: electrodo de trabajo, electrodo de referencia, y un electrodo auxiliar. Se aplica un potencial constante (100 mV/seg) al electrodo de trabajo, bien hacia el potencial positivo (con lo que evaluaremos agentes reductores) o hacia el potencial negativo (con lo que evaluaremos agentes oxidantes). Durante este proceso se monitoriza una curva de corriente (voltamograma cclico).

VOLTAMETRA CCLICA Kohen et al. 1997

Desventaja: no todos los antioxidantes donan sus electrones a cualquier electrodo de trabajo seleccionado. Se necesitan varios electrodos para determinar antioxidantes concretos: glutatin no se detectara con este electrodo Au/Hg. La compuesto de referencia empleado en este ensayo suele ser el cido ascrbico.

Unidades: AEAC (ascorbic acid equivalent antioxidant capacity)

CARS (Capacidad Atrapadora Radicales Superxido) Benov et al. 1998

La hidroetidina (HE) se oxida dando lugar al compuesto fluorescente Etidio (E+) en presencia del radical anin superxido (que puede ser aadido como KO2 o producido por activacin de leucocitos).
exc:465nm oxidacin
em: 585 nm

HE

E+

Adems la oxidacin de HE es rpida cuando el oxidante el O2- y no cuando intervienen O2, H2O2, HOCl, ONOO-. Por eso, este mtodo se aplica como detector de O2- intracelular).

CARS (Capacidad Atrapadora Radicales Superxido) Benov et al. 1998

La deteccin lminognica y cromognica es propensa a generar radicales O2-, dando lugar a falsos resultados. La tasa de radical producido no es proporcional a la tasa de producto fluorescente determinado, lo cual indica que no todo el radical generado est oxidando el HE.

Dismutacin del O2-

HIDROETIDINA (EH)
O2KO2 Activ. Leucocitos O2O2O2O2AO-s

Oxidacin

TEAC
O2-

TROLOX

O2O2O2-

O2O2-

mol TROLOX/g eq TROLOX/g Compuesto fluoresecnte


exc: 465 nm em: 585 nm
Perxido de hidrgeno y oxgeno molecular

ETIDIO (E+)

(Dismutacin)

TOSC (Total oxyradical scavening capacity) Winston et al.1998

Oxidacin del KMBA a etileno mediante la accin de radicales peroxilo generados a partir del AAPH. La formacin de etileno (parcialmente inhibida por la presencia de antioxidantes) se monitoriza por GC.
KMBA AAPH
oxidacin

ETILENO

ROO.

Se cuantifica la inhibicin que ejerce un antioxidante sobre la produccin de etileno respecto a una reaccin control.

TOSC (Total oxyradical scavening capacity) Winston et al.1998

Ventajas
VERSATILIDAD ----- El KMBA presenta la propiedad

de reaccionar con numerosos oxidantes que son capaces de transformarlo en etileno. Radicales hidroxilo, peroxilo y peroxinitrito. Sistema de cuantificacin.

Desventajas

Se necesita un equipamiento muy especfico (Cromatgrafo de gases).

Reacciones Fenton
OH. OH. OH. OH.

AAPH
ROO.

Descomposicin
ONOO. ONOO. ONOO. ONOO. ONOO.

ROO. OH.OH.

ROO. ROO.ROO.

AO

mol TROLOX/g Etileno eq TROLOX/g


Oxidacin

TEAC KMBA

trolox

TEST COMPETICION CINTICA (Crocin) Tubaro et al.

Este ensayo se basa en la oxidacin del carotenoide crocin por radicales peroxilos generados a partir del AAPH. La decoloracin del crocin en ausencia (Vo) y en presencia (V) de antioxidantes se monitoriza durante 10 minutos a 443nm. La decoloracin del carotenoide crocin debida a la interaccin con radicales peroxilo, disminuye cuando se introduce otro antioxidante en el sistema.

Este mtodo determina la habilidad de un antioxidante en competicin con otro.

TEST COMPETICION CINTICA (Crocin) Tubaro et al.

En algunos casos no queda claro si estamos ante una fase de retardo o un periodo de mxima proteccin del carotenoide crocin. Crocin es una mezcla de pigmentos vegetales extrados a partir del azafrn, cuya composicin esta sujeta a una variabilidad dependiente del lote de produccin .

Dificulta su aplicacin industrial en anlisis cuantitativos.

CAROTENOIDE CROCIN
ROO. ROO. ROO. ROO. ROO.

443 nm

AO-s TROLOX

AAPH

TEAC

mol CAROTENOIDE CROCIN TROLOX/g OXIDACIN eq TROLOX/g


Disminucin en la absorbancia

LINLICO

Este mtodo induce artificialmente la oxidacin del cido


linoleco o LDL mediante la adicin de Cu (II) o un azo iniciador (generalmente APPH). El progreso de la oxidacin se monitoriza a 234 nm (longitud de onda a la cual la absorbancia de los perxidos de dieno derivados de la oxidacin del ac. Linoleico es mxima). La reaccin se puede llevar a cabo en micelas o en disolventes orgnicos. En el primero de los casos la preparacin de la muestra resulta mucho ms compleja y adems el progreso de la reaccin no puede ser seguido directamente a travs de un espectrofotmetro UV.

LINLICO
VENTAJAS

El uso de cido linoleco como sustrato acerca el ensayo a condiciones biolgicas reales.
DESVENTAJAS

Existen numerosos compuestos orgnicos que absorben a 234nm (catecol y la hidroquinona reaccionan con radicales peroxilo para dar compuestos (0-quinona y p-quinona) con absorbancia a esa longitud de onda. En presencia de agua el ac. Linoleico forma micelas, que complican el ensayo ya que la distribucin de los compuestos se repartir en dos fases.

-CAROTENE BLEACHING TEST (Velioglu et al. 1998)

Se basa en la capacidad de diversos extractos de disminuir la decoloracin oxidativa del betacaroteno en una emulsin cida de betacaroteno/linoleico. El cido linolico se oxida fcilmente en presencia de agua oxigenada y los radicales generados atacan el betacaroteno provocando su oxidacin con la correspondiente perdida de absorbancia a 470 nm. Este ensayo esta indicado para compuestos liposolubles. El patrn utilizado suele ser Trolox o c. Glico.

470nm

Solucin Solucin orgnica cido linoleico Betacaroteno

TEAC
GAE

mol TROLOX/g Agua oxigenada eq TROLOX/g


50C 2h.

eq AC. GLICO/g
AO-s

OH. OH.HOO.OH. HOO. OH.

TROLOX

Oxidacin betacaroteno

Disminucin en la absorbancia (decoloracin)

TRAP (Total radical trapping power) Wayner et al. 1985

Este ensayo emplea radicales peroxilo que se generan mediante la descomposicin trmica de un compuesto hidrosoluble: ABAP Una vez adicionado a la muestra a estudio (plasma originariamente), la oxidacin de las molculas es monitorizada, mediante la determinacin de oxgeno consumido. El periodo de induccin, en el que la oxidacin se inhibe mediante la accin de los compuestos antioxidantes en la muestra, se compara con el generado por el Trolox en iguales condiciones.

TRAP (Total radical trapping power) Wayner et al. 1985

MODIFICACIONES (a) introducir en el ensayo un lpido que reaccionaba con los radicales peroxilo producindose una peroxidacin.. (b) otra modificacin introdujo una protena (PE) en lugar del lpido como sustrato, que al mostrar seal fluorescente facilitaba la monitorizacin.

Descomposicin trmica del ABAP o AAPH


ROO. ROO. ROO. ROO.

37C
ROO. ROO. ROO.

Electrodo de oxgeno

TEAC mol TROLOX/g eq TROLOX/g


Muestra a estudio Oxidacin de molculas oxidables Determinacin del oxgeno consumido

AO-s

TROLOX

ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) Prior et al. 2005


El ensayo ORAC usa como diana a una protena (ficoeritrina: PE) que, por su sensibilidad, permite evaluar los pasos iniciales del proceso de oxidacin. Este ensayo utiliza la protena como un sustrato oxidable y AAPH como generador de radicales peroxilo o Cu2+/H2O2 como generador de radicales hidroxilos. Si se emplea el cobre como generador de radicales, no podemos utilizar el trolox como Standard de referencia porque el mismo trolox puede interaccionar como pro-oxidante con el cobre.

ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) Prior et al. 2005


Utiliza la tcnica del rea bajo la curva de descenso para la cuantificacin (AUC). Por lo tanto combina tanto el porcentaje de inhibicin como el periodo de inhibicin a lo largo del tiempo producido por los antioxidantes a estudio.

S e a l

A muestra- A blanco

Muestra

Blanco

Tiempo incubacin (min)

ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) Prior et al. 2005

VENTAJAS: (a) El uso de una protena como sustrato impide que el propio sustrato genere radicales libres debido a su oxidacin. (b) Sirve para determinar la capacidad de muestras acuosas y hidrofbicas (simplemente cambiando la fuente generadora de radicales y el disolvente)

ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) Prior et al. 2005


INCONVENIENTE: (a) Reside en la PE, que vara de lote a lote, no es fotoestable y puede blanquearse tras su exposicin a una luz de excitacin. (b) la PE es capaz de interaccionar con polifenoles dando lugar a valores errneos.
Una modificacin de este ensayo utiliza fluorescena (no interacciona con polifenoles, es fotoestable y reduce los costes del experimento) como sonda fluorescente en lugar de PE.

(c) El tiempo tambin es un factor limitante (1h: aunque esta pega ya ha sido solucionada a travs de ensayos de alto rendimiento) (d) El empleo de marcadores fluorescentes aumenta la sensibilidad del mtodo pero implica disponibilidad de un fluormetro.

Fluoresceina
ROO. ROO. ROO. ROO. ROO. AO-s

AAPH

ORAC
TROLOX

OH..OH.. OH.. OH.. OH..

H2O2/Cu 2+

OH..

Oxygen radical Absorbance Oxidacin de la fluoresceina capacity


exc:484nm em: 515 nm

Disminucin en la fluorescencia

COBAS FARA
Ensayo ORAC automatizado mediante espectrofluormetro denominado COBAS FARA II (La Roche), que emplea diferentes filtros fluorescentes.

Mediante una pipeta robotizada dispensa la muestra en diferentes pocillos, centrifuga mezcla e incuba. Determina la capacidad de la muestra para protegerse frente al ataque de los radicales.

Este aparato emplea una fuente que genera radicales peroxilo, uno de los radicales ms comunes. Utiliza el trolox a modo de control. Recoge medidas cada 2 minutos una vez aadida la muestra. Se mide la capacidad antioxidante total de la muestra (antioxidantes de rpida, media y larga actuacin).

Mtodo

Unidades TEAC umol trolox/g AA% AE mg (ueq) ac. Ascrbico/g TEAC mg (ueq) trolox/g. AA% TEAC umol trolox/g. AA% ORAC Umol peroxil radical trapped/L TEAC, GAE, AA% TEAC, AA% TEAC, AA% TEAC, AA%

Matriz Liposolublehidrosoluble Liposoluble

ABTS-TEAC DPPH

DMPD ORAC TRAP TOSC CARS LINOLEICO B-CAROTENO

Hidrosoluble Liposolublehidrosoluble Hidrosoluble Liposoluble Hidrosoluble Hidrosoluble Hidrosoluble Liposoluble Liposoluble Hidrosoluble Hidrosoluble

TEST. COMP. CINTICA TEAC, AA%

VOLTAMETRA CCLICA AA% FRAP


uM sulfato ferroso/g

Mtodo
ABTS-TEAC DPPH DMPD ORAC TRAP TOSC CARS TEST. COMP. CINTICA LINOLEICO B-CAROTENO VOLTAMETRA CCLICA FRAP

Alimentos
Aceite, vegetales, vino, zumos, frutas, bebidas alcohlicas Fruta, vegetales, aceites, bebidas alcohlicas, polifenoles Vino, vegetales, t, frutas Frutas, vegetales, frutos secos, cereales, chocolate, bebidas alcohlicas, zumos Vino, t, fruta, bebidas alcohlicas Frutas, zumos Ajo, plantas Vino Aceites, Aceite oliva, frutas, vegetales, alimentos integrales Vino Vegetales, zumos, bebidas alcohlicas

ORAC
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 Ciruela pasa Pasas Zarzamora Fresa Frambuesa Naranjas

ORAC

10000

15000

20000

25000

30000

5000 0

Uvas Cereza Kiwi Pomelo Espinacas Coles Brcoli Remolacha Pimientos rojos Cebolla Maiz Berenjena Tomate Zanahoria Patatas Vino tinto T verde Manzana Banana Melocotn

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE ALIMENTOS

Cacao Chocolate negro Chocolate con leche

Moltes grcies

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