PRTICA DE ISOLAMENTO DE DNA DE CLULAS DE CEBOLA 1.

Introduo Nos organismos eucariontes e procariontes a informao gentica est localizada nas molculas de cido desoxirribonuclico (DNA), que so polmeros de nucleotdeos, nos quais o acar a desoxirribose. O DNA est localizado principalmente no ncleo dos eucariontes, associado com protenas (principalmente histonas) e dentro de organelas como mitocndrias e cloroplastos. Os mtodos utilizados para a deteco e dosagem do DNA celular nuclear de eucariontes (pois o de cloroplastos e mitocndrias no em geral, detectado pelas tcnicas rotineiras) implicam no rompimento das membranas citoplasmtica e nuclear. Neste experimento, o rompimento das membranas plasmtica e nuclear ser realizado com o tratamento do detergente aninico duodecil sulfato de sdio (SDS). Os tratamentos com detergentes, inicos ou no, so largamente utilizados na solubilizao de protenas e lipdeos de membrana. Nestes processos de solubilizao por detergentes, so formadas micelas, que consistem de protenas, lipdios e detergentes. O tratamento das clulas com uma concentrao relativamente alta de SDS resulta no rompimento das membranas celulares com a conseqente liberao das nucleoprotenas. A atividade da enzima digestiva (DNAase) ser inibida pela ao do EDTA em meio alcalino que altera pH e quela os ons divalentes necessrios ao da DNAase. A adio de etanol sobre a fase aquosa, contendo os cidos nuclicos dissolvidos, resultar na precipitao destes, uma vez que o etanol diminui a constante dieltrica da gua, promovendo uma menor solubilizao das molculas de DNA. Nas tcnicas de biologia molecular, o DNA deve estar livre de protenas, para isto, estas devem ser extradas. Normalmente, esse procedimento realizado utilizando-se uma soluo de clorofrmio/lcool isoamlico, que desnatura as protenas e, aps centrifugao, estas so retiradas da soluo de DNA. 2. Objetivo Isolar DNA de clulas de cebola. 3. Material Cebola. Soluo salina-EDTA: NaCl 0,15 M EDTA 0,1 M (pH=8,0). SDS 2% (P/V). Etanol absoluto 95%. Soluo Tris-EDTA (TE)* 10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA - pH 7,5.

Obs: *Esta soluo mantm a fora inica, dissolvendo o DNA, alm de quelar ons divalentes, necessrios para a ao da DNase. 4. Procedimentos Cortar 5 g de cebola (fatia fina e bem picotada); Colocar a cebola picada em um tubo Falcon de 15mL; Adicionar 2.5 mL de soluo salina EDTA;

Adicionar 1.0 mL de SDS 2%; Macerar a cebola com ajuda de um basto de vidro durante 5 minutos; Filtrar a soluo com gaze para retirar os fragmentos de cebola; Colocar o filtrado em um tubo de vidro; Adicionar, lentamente, com pipeta, 4 mL de lcool etlico 95% de modo que os dois lquidos no se misturem. Notar que na interface, forma-se um material insolvel filamentoso, o DNA; Introduzir um basto at a regio de interface. Imprimir-lhe um movimento circular e verificar que o material filamentoso ir aderir ao mesmo; Retirar o basto e dissolver o precipitado a ele aderido em 2 mL da soluo de Tris-EDTA.

Desproteinizao (No realizada durante a aula prtica): Aps a dissoluo do DNA, adicione igual volume (2 mL) da mistura de clorofrmio:lcool isoamlico 24:1 (V/V), e agite vigorosamente por 30 minutos; Centrifugue a emulso resultante a 3000 rpm durante10 minutos; A emulso ser separada em 3 camadas;

A camada superior (aquosa) contm os dois tipos de cidos nuclicos (DNA e RNA) que devem coletados para posterior utilizao.

5. Questes para discusso: 5.1 - Qual a funo da soluo de SDS? 5.2 - Ao romper a clula e, tambm, suas organelas, pela tcnica descrita acima, o DNA no seria degradado por enzimas lisossomais?

PRTICA CINTICA ENZIMTICA 1. Introduo Enzimas so catalisadores biolgicos: aceleram a velocidade das reaes qumicas, diminuindo a energia de ativao. Possuem, em geral, estrutura protica, sendo que foram descritas algumas molculas de RNA com atividade cataltica. As enzimas no alteram a constante de equilbrio nem a variao de energia livre das reaes, sendo regeneradas, sob a forma original, ao final da catlise. As molculas reagentes so denominadas substratos (S) e produtos (P) so formados ao final. As enzimas so, geralmente, bastante especficas com relao aos substratos, formando um complexo com estes durante a catlise: E + S ES E + P Algumas teorias procuram explicar esta especificidade: 1- teoria de Fischer (chavefechadura), onde enzima e substrato seriam complementares; 2- teoria de Koshland do encaixe induzido, ou seja, o substrato durante a catlise se encaixa na enzima; 3- teoria que prope o perfeito encaixe no estado de transio, estado onde a barreira energtica (energia de ativao) foi vencida. Diversos so os fatores que influenciam a velocidade de uma reao enzimtica. Por terem estrutura protica, alteraes no pH, na temperatura, na fora inica do meio reacional podem modific-las (s vezes, at a estrutura dos substratos alterada), modificando, assim, a velocidade das reaes. Como esperado, a concentrao de substrato e de enzima no meio reacional so determinantes para a velocidade reacional. A velocidade de uma reao catalisada pode ser determinada, em instantes iniciais, atravs da determinao do produto formado por unidade de tempo (caso mais comum) ou atravs da mensurao do substrato consumido por unidade de tempo. O produto formado pode ser medido diretamente atravs de alguma propriedade fsico-qumica caracterstica, ou ento fazer uma reao qumica com este produto produzindo um outro que possua propriedades apropriadas para medida. Uma propriedade freqentemente usada para tal fim a capacidade do produto a ser quantificado de absorver determinados comprimentos de onda de

radiaes luminosas (o que no deve, em princpio, acontecer com qualquer outra substncia encontrada no meio reacional), aplicando-se os princpios da fotometria. Os ensaios de atividade enzimtica desenvolvidos na aula prtica sero realizados com a enzima FOSFATASE, presente no extrato aquoso da batata inglesa. No ensaio, a enzima catalisar a reao de desfosforilao do para-nitrofenil fosfato, resultando na formao de um composto de cor amarelada em meio alcalino, o para-nitrofenol. Portanto, a atividade enzimtica ser detectada pelo aparecimento da colorao amarela no meio reacional.

2. Objetivos Avaliar o efeito de alguns fatores que interferem na atividade enzimtica, tais como, o tempo de reao, a concentrao de substrato e a concentrao de enzima. 3. Reagentes Uma batata inglesa mdia (cerca de 110g). Substrato: para-nitrofenilfosfato de sdio 1mM (soluo fresca). NaOH 0,02N. Liquidificador.

4. Preparo de frao com atividade de fosfatase alcalina Descascar a batata; Homogeneizar a batata descascada em 200mL de gua, usando um liquidificador; Filtrar o homogeneizado em algodo. IMPORTANTE: O homogeneizado deve ser usado no prazo mximo de 30 minutos.

5. Procedimentos Enumerar os tubos de ensaio que seu grupo vai usar; Colocar sempre os reagentes na mesma ordem em todos os tubos; O HOMOGENEIZADO DEVER SER ADICIONADO SEMPRE POR LTIMO. Aps adicionar o homogeneizado, agite a mistura suavemente; A incubao ser realizada temperatura ambiente.

*Adicionar 2mL de NaOH 0,02N antes da adio do homogeneizado (SOMENTE NO TUBO 1) Observe a cor desenvolvida em todos os tubos. Anote os resultados.

Aps 5 minutos de reao, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo. Observe a cor desenvolvida nos tubos (7-10). Anote os resultados.

5.3. INFLUNCIA DA CONCENTRAO DO SUBSTRATO. (curva [S] x velocidade da reao)

Aps 10 minutos de reao, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo. Observe a cor desenvolvida nos tubos (11-16). Anote os resultados.

6. Questes para discusso: 6.1- Por que a enzima (homogeneizado) s deve ser adicionada por ltimo? 6.2- Como so fixadas as condies de dosagem de uma determinada enzima em condies timas? 6.3- Explique os resultados de cada item.

7. Exerccios complementares 7.1- A variao da velocidade de reao de uma enzima em funo de sua concentrao foi analisada em 5 tubos conforme o indicado na tabela abaixo. Cada tubo recebeu 0,8 mL de uma soluo de substrato 0,01mM. A enzima usada (E) estava contida num homogeneizado heptico a 10g% e na tabela abaixo esto indicados os volumes deste homogeneizado adicionado a cada tubo. O volume final em cada tubo foi o mesmo, ajustado com tampo apropriado. Ao final de 30 minutos de reao a quantidade de produto formado foi igual em todos os tubos, exceto no tubo 5 que foi mantido a 0C durante toda a experincia. Com estas informaes, discuta: a) o fato de ter sido obtida a mesma quantidade de produto nos quatro primeiros tubos; b) sem alterar o tempo de reao, como seria possvel aumentar a quantidade de produto formado nesses quatro tubos? c) o que teria acontecido no tubo 5?

7.2 - Ao estudar-se in vitro a cintica da reao onde a formao do produto P (fumarato), a partir do substrato S (succinato) catalisada pela enzima E (succinato desidrogenase) verificou-se que: I) no sendo possvel obter-se a enzima pura, usou-se, sempre, um mesmo volume do mesmo extrato celular; II) a quantidade de substrato inicial estava em ligeiro excesso; III) o pH tinha sido previamente estudado e escolheu-se aquele que proporcionava o mximo de atividade enzimtica; IV) a formao de produto cresceu entre o instante zero (incio da reao) at 20 minutos da reao; V) a partir do 20o minuto de incubao, a velocidade de reao medida pela quantidade de produto formado por minuto, diminuiu. VI) todas as observaes acima foram obtidas em temperatura tima de reao. Pede-se: discutir os fatores, dentre aqueles analisados, que poderiam acarretar a diminuio da velocidade a partir do 20 minuto de incubao.