Microbiologa Clnica

CONCEPTOS BSICOS MICROBIOLOGIA

Ciencia que se encarga del estudio de los microbios (Hongos, Bacterias y Virus).

MICROBIO O MICROORGANISMO
Son organismos muy pequeos, de tamao microscpico, dotados de individualidad, con una organizacin biolgica elemental. Pueden ser unicelulares multicelulares (los conformados por clulas indiferenciadas, que al asociarse no forman tej. , pues cada una de ellas constituye un organismo completo, independiente y dotado de la capacidad de reproduccin). MICROBIOLOGIA CLNICA: Es una disciplina aplicada de la medicina que estudia los microorganismos capaces de provocar enfermedades en los seres vivos. TEORIA MICROBIANA DE LAS INFECCIONES La misma resulta de las semejanzas existentes entre los procesos fermentativos y las enfermedades infecciosas (por ej Ambos se producen por causa de microorganismos) POSTULADO DE KOCH Por el se establecen las condiciones que debe reunir un microorganismo para ser considerado como agente causal de una determinada enfermedad infecciosa. Tales condiciones son : 1. Demostrar la presencia del microorganismo en todas las personas enfermas y su ausencia en las personas sanas. 2. Que el microorganismo pueda ser aislado en un cultivo slido a partir de las lesiones producidas en el enfermo. 3. Que el microorganismo pueda reproducir la enfermedad, al ser inoculado en un animal de experimentacin susceptible. 4. Que el microorganismo pueda ser aislado nuevamente a partir de las lesiones producidas en dicho animal. 5. Que el microorganismo induzca una respuesta inmune especifica en el husped detectada por serologa (por la aparicin de anticuerpos especficos). INOCULO Es la Cantidad o Nmero de Grmenes infectantes que son introducidos accidental o voluntariamente en los tejidos vivos o en medios de cultivos especiales.

PROFILAXIS Conjunto de medidas, medios yo teraputica que se emplean para preservar al individuo y/o la comunidad de determinada enfermedad.

ORGANIZACION ESTRUCTURAL DE LOS MICROORGANISMOS

CELULAS EUCARIOTAS Este tipo de clula est dividida en compartimientos limitados por membranas internas. Sus principales caractersticas son : a. Membrana Citoplasmtica: Es una bicapa lipdica, compuesta por protenas, fosfolpidos y esteroles. Acta como membrana limitante (ayuda a mantener la forma) y como barrera osmtica. En cierto tipo de clulas podemos visulizar Cilios y Flagelos. En los Hongos adems de esta membrana pueden presentar Pared o Cubierta Celular, la cual est compuesta de polisacridos. b. Citoplasma: Presenta organelas (compartimientos internos rodeados por una membrana propia); entre estas encontramos Retculo endoplasmtico, Aparato de Golgi, Vacuolas, Lisosomas; Mitocondrias, Cloroplastos (realizan la fotosntesis en las plantas), Centrolos, Ribosomas (80 s). Adems el citoplasma cuenta con una estructura reticular denominada citoesqueleto, compuesto por microtbulos y microfilamentos. c. Ncleo: Contiene el material hereditario. Este decimos que es verdadero puesto que el compartimiento nuclear se halla verdaderamente separado del citoplasma por la membrana nuclear. El ADN est organizado en 2 o ms cromosomas que codifican el material hereditario; cada cromosoma est compuesto por filamentos en doble hlice de ADN, donde cada cadena presenta uniones proticas y de histonas. d. Divisin: La divisin celular puede ocurrir ya sea por mitosis o por meiosis, segn el tipo celular. e. Motilidad:La movilidad por parte algunos tipos celulares puede llevarse a cabo mediante Flagelos, Pseudpodos, Fagocitosis, Endocitosis,y Pinocitosis CELULAS PROCARIOTAS Este tipo de clulas no estn divididas en compartimientos ni poseen ncleo verdadero. Sus principales caractersticas son : a. Pared Celular: Es una estructura gruesa y rgida (a excepcin de los micoplasmas) que sirve para dar forma a la clula procariota, evitar la lisis osmtica y la accin de agentes externos nocivos. En su estructura se halla un polmero especfico, la murena o Pptidoglicano. b. Membrana Citoplasmtica: Esta no presenta esteroles en su composicin. Asociada a ella hay mesosomas (repliegues internos) y enzimas generadoras de ATP. c. Citoplasma: No presenta organelas . Es de aspecto granular, donde se distinguen granulaciones mayores (sustancias de reserva) y granulaciones submicroscpicas (ribosomas 70 s). Inmersos en el citoplasma encontramos ADN extracromosmico

(Plsmido) enrollado en forma circular, los cuales contienen informacin gentica para la sntesis de sustancias no indispensables. d. Nucleoide: Contiene el material hereditario y de especificidad (ADN cromosmico), conformando 1 solo cromosoma dispuesto como 1 filamento en doble hlice, apelotonado en algn sitio del citoplasma. En las cadenas hay ausencia de Histonas. Decimos que no es un ncleo verdadero porque no posee una membrana que lo separe netamente del citoplasma e. Divisin: La divisin celular ocurre por divisin o fisin binaria , la cual puede ser por fisin , conjugacin o por medio de un bacterifago (virus que infecta a una bacteria , y por lo que el genoma viral se recombina con el genoma de la bacteria) f. Motilidad :Por Flagelos g. Pilis o Fimbrias: Permiten la Adherencia a receptores de las Clulas huspedes y la transferencia de material gentico entre algunas bacterias BACTERIAS Son Microorganismos procariotas, unicelulares, de tamao microscpico (del orden de los micrones). CARACTERSTICAS PRINCIPALES :

Estn contenidas en una Pared Celular Poseen ambos tipos de cidos nucleicos (ADN y ARN) Se multiplican por fisin binaria (tipo de reproduccin asexual, donde la replicacin es lineal, comenzando en un extremo de la cadena de ADN y terminando en el otro, decimos que es semiconservadora ya que c/u de las cadenas complementarias sirven de molde para la sntesis de otra). Pueden ser : Aerobias o Anaerobias a. Mviles o Inmviles b. Patgenas (causan enfermedades en el organismo al que invaden) o Saprofitas (es decir, viven libres en la naturaleza, se nutren de materia inorgnica u orgnica, siendo responsables de la transformacin de la materia orgnica en mineral y de los ciclos del N y del C en la naturaleza).

ESTRUCTURA BACTERIANA: Los diferentes componentes bacterianos se dividen en :

ELEMENTOS OBLIGADOS: 1. PARED CELULAR 2. MEMBR. CITOPLASMTICA 3. CITOPLASMA 4. RIBOSOMAS (CONSTANTES) 5. NUCLEOIDE

ELEMENTOS FACULTATIVOS: A. GLUCOCALIX B. FLAGELO C. FIMBRIAS D. CAPSULA E. ESPORAS (INCOSTANTES) F. PLASMIDOS

1.- PARED CELULAR : Es una estructura gruesa y rgida presente en casi todas las especies bacterianas dando forma a la bacteria; se halla separada de la Membrana Citoplasmtica por el Espacio Periplasmtico (este espacio virtual es ms manifiesto en las bacterias Gram negativo y all encontramos protenas y enzimas como la fosfatasa alcalina y cida, desoxiribonucleasas, ribonucleasas y penicilinazas). Se pone en evidencia utilizando la Tincin de Gram (la que permite distinguir bacterias Gram - , bacterias Gram + y bacterias sin pared (gnero Micoplasma y formas L Bacterianas) o bien utilizando tincin de Ziehl Neelsen podemos observarla en el caso de los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR). Composicin:

Su principal componente es el Pptidoglicano o Murena (en el caso de las Gram : N- Acetilglucosamina + N Acetilmurmico; y en el caso de las BAAR : N Acetilglucosamina + N Glicosil murmico)

Propiedades y funciones: 1) Brinda proteccin y resistencia a la bacteria frente a los posibles cambios de presin osmtica del medio en el que se encuentra y a la accin de ciertos agentes externos. 2) Presenta Poros que actan como filtros, permitiendo el pasaje de agua y metabolitos esenciales. 3) Presenta antgenos de tipo y grupo especficos. 4) Participa en la divisin (multiplicacin) bacteriana (se invagina junto con la membrana plasmtica) 5) En las bacterias Gram tiene poder patgeno debido a que presenta endotoxinas (Lpido A). 6) Es el sustrato donde actan los b - Lactmicos y otros antimicrobianos. 7) Resulta ser el fundamento del mtodo de Gram.

Sntesis de la Pared: Los precursores son sintetizados en el citoplasma bacteriano, luego son transportados a travs de la MP, se forma y elonga un polmero lineal y finalmente se establecen puentes de unin entre los polmeros constitutivos. La sntesis de la pared es inhibida por los b - Lactmicos. ESQUEMA DE LOS DIFERENTES TIPOS DE PARED CELULAR: 2.- MEMBRANA CITOPLASMTICA (MP): Es una bicapa lipdica sin esteroles, que presenta inclusiones de protenas y glicolpidos que forman poros. Tambin presenta enzimas , bajo control cromosmico, como Fosfatasa alcalina, Hidrolasas, Penicilinasas. Su cara externa presenta la protena fijadora de penicilina (dicha protena interviene en la formacin del peptidoglicano o murena y funciona como sitio diana para la accin de los b - Lactmicos); su cara interna se relaciona con el ARNm, Ribosomas y el Nucleoide.

Propiedades y Funciones : 1 Acta como una activa y selectiva barrera osmtica 2 Participa en la sntesis de la pared celular y la cpsula 3 Realiza sntesis de ATP 4 Es el sustrato donde actan ATB como la Polimixina B (que alteran su permeabilidad) En las bacterias Gram + podemos distinguir repliegues de la MP, denominados Mesosomas. - Mesosomas : - Mesosomas Septales Estos repliegues participan en la divisin celular. - Mesosomas Laterales Participan en funciones de secrecin (Ej. Secrecin de b - Lactamasa).

3.- CITOPLASMA : Es una masa coloidal constituida por agua (85 %), minerales y fermentos. No contiene sistemas membranosos (organelas). Presenta un aspecto granuloso, distinguindose: a.- Granulaciones mayores o microscpicas : Son vacuolas que almacenan sustancias de reserva, glucgeno, lquidos o gases. b. Granulaciones Submicroscpicas : Son ribosomas. 4.- RIBOSOMAS : Son grnulos de unos200 A de dimetro, ricos en ARN y protenas. Poseen un coeficiente de sedimentacin de 70s (30s 50s). Su funcin es realizar la sntesis de protenas. Son el sitio diana donde actan varios antimicrobianos como loa Aminoglucsidos, tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrlidos y Lincosaminas (inhiben la sntesis protica de la bacteria). 5.- NUCLEOIDE : (ADN CROMOSMICO) Consiste en un nico cromosoma (filamento de ADN) que se encuentra apelotonado (en su estructura en doble hlice no presenta puentes de histonas). En algunos puntos entra en relacin con la MP o con sus Mesosomas. Propiedades y Funciones : 1. 2. 3. 4. 5. Confiere a la bacteria sus peculiaridades genticas. Interviene en el mecanismo de transferencia hereditaria. Regula la Sntesis Proteica. Induce los cambios que llevan a la divisin celular Es el sitio de accin donde actan antibiticos como las Quinolonas (Ac. Nalidixico, Norfloxacina,etc) , la Rifampicina y el Metronidazol. Tipo de Replicacin :

La replicacin es lineal, comenzando en un extremo y terminando en el otro. El ADN Cromosmico se autoreproduce por un mecanismo semiconservador , donde la cadena complementaria se separa y sirve de molde para la sntesis de otra cadena.

A.- GLUCOCLIX Es una delgada capa externa compuesta por Polisacridos (Levano o Dextrano) que facilitan la adherencia de la bacteria. B.- FLAGELO Se trata de una estructura helicoidal que se comporta como rgano locomotor de la bacteria, adems presenta el Ag H (especfico de tipo) que es el responsable de la aglutinacin flagelar.

C.- FIMBRIAS O PILIS Se trata de estructuras filamentosas carentes de movilidad, constituidas por una protena llamada Pilina. Por lo general estn presentes en las bacterias Gram NEGATIVAS, mientras que en las bacterias Gram POSITIVOS slo se describen en el Corinebacterium Renale y algunos Streptococos.

Propiedades y Funciones: 1. Propiedad Antignica 2.- Brindan Adherencia : ya sea a superficies de ltex , hemates y/o al glucoclix de las clulas epiteliales. 3.Algunos tipos de Pilis (F e I) intervienen en la transferencia de material gentico por conjugacin

Pili F: Filamento Sexual, largo, responsable de transmisin hereditaria

Pili I: Filamento corto, responsable de la transmisin del factor Col bacteriocinas). (productor de

D.- CAPSULA Estructura compleja, de grosor variable que rodea a una o ms bacterias. Puede estar presente tanto en bacterias Gram negativo, como Gram positivo. Composicin: Agua (90%) y polmeros orgnicos (en el gnero Bacillus : polisacridos y polipptidos) Propiedades y Funciones: 1. Propiedad Antifagocitaria : Dificulta o impide la fagocitosis, lo cual potencia su virulencia ya que favorece la multiplicacin y facilita la invasin. 2. Brinda Proteccin frente a Fagos y ATB : Dificulta la fijacin de bacterifagos e impide el pasaje de ATB que puedan afectar a la bacteria. 3. Propiedades Antignicas : * Induce la produccin de anticuerpos protectores (esto es til en la produccin de algunas vacunas)

*Permite la diferenciacin de tipos serolgicos dentro de la misma especie ya sea por aglutinacin con sueros tipo o por el fenmeno de vitrifaccin o de Quellung (hinchazn de la cpsula) A) Orienta a la clasificacin mediante : Pruebas bioqumicas o inmunolgicas. Microscopa de contraste de fase (donde se la observa como un halo claro y refringente) Tincin negativa con Tinta China. Sintesis de Cpsula: Se realiza a partir de la MP. (menbrana citoplasmatica) E.- ESPOROS Son elementos de reproduccin y/o de resistencia a un medio adverso que presentan algunas bacterias , especialmente del gnero bacilar. Su forma, tamao y ubicacin vara segn la especie. Tipos :

Endosporas : Espora presente en el interior de la bacteria. Destinada a germinar originando la forma vegetativa de la que deriva

Exosporas : Esporo que permanece libre en el ambiente, constituyendo la forma de resistencia bacteriana ante condiciones adversas o desfavorables (nutricin, desecacin, temperatura, presencia de agentes qumicos, presiones, etc.)

Propiedades y Funciones: Son resistentes al calor, a la desecacin, a las presiones, a los agentes qumicos, a los rayos U.V. y radiaciones ionizantes. Mantienen la virulencia de la forma vegetativa de la que derivan.Tiene un muy bajo metabolismo, que les permite permanecer viables por perodos tiempo indefinidos. Tiene propiedades inmunognicas. GERMINACIN ESPORA, Condiciones del Medio forma vegetativa.

ESPORULACIN: F.- PLASMIDOS (ADN EXTRACROMOSOMICO) Se trata de una estructura esfrica, que codifica independiente del nucleoide y que contiene informacin gentica para sintetizar sustancias que no son indispensables para la bacteria. El ADN extra cromosmico se transmite por Herencia a las bacterias hijas Conjugacin a otras bacterias (no hijas).

Tipos y Funciones : Los Plsmidos se clasifican por los caracteres que expresan y se designan segn esas propiedades

Plsmido "Ent" : Codifica la sntesis de enterotoxinas. Plsmido "Inv" : Da a las bacterias enteroinvasivas la capacidad de penetracin a las clulas epiteliales del intestino. Plsmido "K" : Codifica la Produccin de los Ag de superficie de la Escherichia Coli. Plsmido "Hly" : Codifica la produccin de a - Hemolisina, responsable de la lisis de hemates Factor F (sexual) : Son plsmidos autotransferibles, responsables de la transferencia de genes por conjugacin que codifican la produccin de pilis sexuales o F. Factor Col : codifican la produccin de bacteriocinas (compuestos similares a los ATB) que resultan letales para otras bacterias . Factor R (de resistencia) : Es un plsmido, presente en ciertas bacterias Gram , que codifica los mecanismos de resistencia a uno o ms ATB.

MECANISMOS DE LA ACCION PATGENA : COLONIZACIN: Es la capacidad de llegar a la superficie del husped por una puerta de entrada (piel o mucosas), formar o establecer una coloniaen el epitelio y resistir la accin de los sistemas locales de defensa . Se entiende por colonia bacteriana a la agrupacin de bacterias originadas a partir de una bacteria madre que se establecen y extienden por determinado medio. Las bacterias patgenas pueden proceder :

Del Exterior: Llegan al organismo por una puerta de entrada causando infecciones exgenas. Del Propio Organismo: Son bacterias oportunistas, que integraban la poblacin de la flora normal, y que por determinados factores alcanzaron la capacidad de producir infecciones endgenas.

En cualquier caso, para iniciar la infeccin, los microorganismos deben fijarse o adherirse a las clulas y colonizar el epitelio.

PENETRACIN: Se denomina as a la capacidad de las bacterias para atravesar la barrera cutneo mucosa, alcanzar los tejidos subyacentes y ponerse en contacto con el medio interno del husped, manifestando su accin patgena. Respecto a este punto, podemos decir que existen : A. Ejemplos (Bordetella Pertusi, Vibrio Cholerae; Corinebacterium Diphtheriae) B. Bacterias Sin poder de Penetracin : Estas bacterias No Precisan atravesar el epitelio para Expresar su Accin Patgena. Estas se adhieren, se multiplican, colonizan el epitelio donde liberan una exotoxina soluble que al ser absorbida en la mucosa puede ejercer o una accin local o general. a travs del epitelio intacto. 2.- heridas, quemaduras, catteres, etc.: las bacterias atraviesan un epitelio que presente alteraciones anatmicas y funcionales C. Bacterias con capacidad de Penetracin Pasiva : Estas bacterias atraviesan pasivamente el epitelio, ya sea mediante : 1.- un vector de transmisin (artrpodos y otros insectos) : las bacterias son inoculadas D. Bacterias con Capacidad de Penetracin Activa : Estas bacterias penetran activamente el epitelio, mediante endocitosis realizada por la clula husped. Ej. Escherichia Coli, Shigella, etc. MULTIPLICACIN E INVACION: MULTIPLICACIN : Hace referencia a la capacidad de reproducirse y alcanzar un N crtico que les permita para invadir y desarrollar su accin patgena, sorteando los mecanismos defensivos del husped. Para ello necesitan obtener del organismo los elementos nutritivos, necesarios para su crecimiento y reproduccin; cuando no los encuentran, no pueden multiplicarse y por ende no pueden desarrollar la infeccin o sta es controlada con mayor facilidad en un lapso de tiempo breve. INVASIN : Es la Capacidad de favorecer la difusin de la infeccin bacteriana en el organismo (sta se debe a la produccin de algunos metabolitos, enzimas y otras sustancias) ya sea interfiriendo los mecanismos defensivos del husped o facilitando la penetracin del microorganismo.

Factores que favorecen la Invasin : En su mayora son enzimas hidrolticas que actan sobre :

a.- Clulas y tejidos : Colagenazas Hialuronidasa (Staphylococo Aureus, Streptococo Pyogenes, etc.) b.- Desdoblamiento de : Protenas (por parte de proteasas) Mucina (Mucinasas) Lpidos (lipasas) Ac. Nuclicos (Nucleassa) c.- Proceso de Coagulacin: Coagulasa (transforma fibringeno en fibrina) Ej. : Staphylococo Aureus Quinasa (Transforma plasmingeno en plasmina) Ej. : Streptococo Pyogenes, Staphylococo Aureus.

CAPACIDAD LESIONAL Es aquella capaz de producir alteraciones y/o lesiones en las clulas y tejidos del husped, responsables del cuadro patolgico. Estas alteraciones pueden ser producidas por accin directa (presencia de Antgenos capsulares, somticos o flagelares) o por mecanismos de accin Indirectos (produccin de Sust. Txicas para las clulas huspedes), lo cuales producen un proceso inflamatorio y ponen en marcha mecanismos inmunolgicos responsables del cuadro clnico. Factores Intervinientes: 1. ACCION TOXICA : Determinada por la produccin de Exotoxinas y/o Endotoxinas Exotoxinas: Son sustancias de naturaleza proteica que se liberan de forma directa o a travs de vesculas, sin que se produzca lisis bacteriana. Frecuentemente estn codificadas por plsmidos o fagos; a veces consisten en 2 o ms subunidades (una de las cuales sirve para adherirse y entrar a la cl. husped , mientras que otra activa o inhibe determinada funcin celular). Tiene una accin Especfica y las podemos clasificar en Neurotoxinas (toxina : diftrica, tetnica, botulnica, etc) y Enterotoxinas.(toxina de : Bordetella Pertusis, Clostridium Perfringes, Clostridium Difficile, Shigella Dysenteriae, etc.). Algunas toxinas al ser inactivadas (con formaldehdo)no alteran su antigenicidad, y los toxoides resultantes proporcionan algunas de las vacunas ms eficaces (Ej. Toxoide tetnico y toxoide diftrico).

Endotoxinas: Son sustancia de naturaleza lipopolisacrida, localizadas en la superficie celular del microorganismo y que son liberadas por lisis bacteriana. Son producidas principalmente por las bacterias Gram de los gneros Escherichia, Salmonella, Shigella y Klebsiella. Los lipopolisacridos (LPS)estimulan una gran variedad de respuestas por parte del husped. Desde el punto de vista clnico, los efectos ms importantes de los LPS son la fiebre y el colapso vascular o shock. La fiebre, actualmente se atribuye a la accin de citoquinas sobre el hipotlamo (principalmente la IL-1 y el factor tumoral o TNF) y puede beneficiar al husped, al microorganismo o a ambos . En respuesta a los LPS, los macrfagos son quienes producen estsas2 citoquinas. El shock por Endotoxinas (shock sptico) se suele asociar con la diseminacin sistmica del microorganismo y, el ejemplo ms comn es las septicemia por bacterias Gram - como Escherichia Coli, Nesisseria meningitidis, etc. 1. MECANISMOS INFLAMATORIOS : Ya sea por mecanismos de accin directa o indirecta, las bacterias ponen en marcha el proceso inflamatorio; permitiendo que lleguen al foco inflamatorio los Fagocitos. Si el microorganismo fuere capaz de producir la destruccin de los Fagocitos, la liberacin de enzimas lisosmicas desde estos ltimos, ampliarn an ms la reaccin inflamatoria y llevando a alteraciones patolgicas como la formacin de granulomas.

2. MECANISMOS INMUNOLGICOS : Las alteraciones patolgicas tambin pueden deberse a fenmenos de hipersensibilidad. La simple Rta. Inmune ya representa la produccin de una serie de reacciones como vasodilatacin, edema, hiperplasia ganglionar, infiltracin celular, etc.; estas en condiciones normales apenas influyen en el cuadro clnico , pero si se produce un fenmeno de hipersensibilidad (respuesta inmune exagerada) el mismo puede ser el responsable de procesos patolgicos graves o incluso causales de muerte. FACTORES DETERMINANTES DE LA ACCIN PATGENA : Son la Adherencia, la Accin Txica y otros componentes bacterianos :

ADHERENCIA: Es el factor ms importante en el momento de la colonizacin. Se lleva a cabo mediante la utilizacin de adhesinas que interactan con los receptores superficiales de la clula husped. ACCION TOXICA: Como vimos sta se debe a la produccin de Exotoxinas y/o Endotoxinas, por ejemplo :

Toxinas de Amplia Accin.

*Neurotoxinas *Enterotoxinas (citotnica y citotxica).

OTROS COMPONENTES BACTERIANOS : Como por ejemplo los antgenos flagelares, capsulares, de pared o somticos; que son capaces de favorecer la Respuesta Inmune. x ejm. Tifoidea. FACTORES DE VIRULENCIA : FERMENTACION: Son enzimas como Mucinasas, Glicosidasas o Neuraminidasas que descomponen las protenas del moco, facilitando la penetracin. FACTORES DE SUPERFICIE Como la Cpsula y/o los Antgenos de Pared que inhiben la fagocitosis y la accin de sustancias bactericidas de la mucosa. PROTEASAS INMUNOGLOBULINAS A (Ig A). Es una Enzima proteoltica que descompone la Ig A (subclase 1) desactivando el sistema local de defensa de la mucosa. La sintetizan microorganismos como Neisseria Meningitidis, Neisseria Gonorrhoeae, Streptococo Pneumaoniae y Haempophylus Influenzae, etc. BACTERIOCINAS Son sustancias que actan como antibiticos frente a otras bacterias , lo que les permite competir con bacterias integrantes de la flora normal microbiana del husped. CLASIFICACION DE LAS BACTERIAS Se basa en la afinidad o no por la tincin de Gram, su morfologa y en la utilizacin o no de O2 en su metabolismo, las bacterias son divididas en 3 grandes grupos : Gram - , Gram + y aquellas que no se tien con Gram (ej. Las BAAR); a su vez estos grupos pueden estar conformados por bacterias Aerobias o Anaerobias facultativas y bacterias Anaerobias Estrictas.

BACTERIAS AEROBIAS O ANAEROBIAS FACULTATIVAS Revisar libros. BACTERIAS ANAEROBIAS ESTRICTAS Revisar libros. BACTERIAS QUE NO SE TIEN CON GRAM:

Bacterias resistentes a la tincin gram

La siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tien como gramnegativas: Mycobacterias (estn encapsuladas). Mycoplasmas (no tienen pared). Formas L (prdida ocasional de la pared). Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).

A. MYCOPLASMAS : No tienen Pared. B. MICOBACTERIUM (TUBERCULOSO Y LEPRAE) : Son BAAR (bacilos cido alcohol resistentes), se tien con Ziehl Neelsen. No pedir Cultivo C. ESPIRILOS (TREPONEMA PALIDUM) : Es una espiroqueta, que se tie con Giemsa o impregnacin Argntica; visibles a la microscopa de campo oscuro o de contraste de fase. No pedir Cultivo. D. CHLAMIDEAS (PNEUMONIAE Y TRACHOMATIS) : Son de Parsitos Intracelular Obligados RELACION HUSPED BACTERIA :

CONCEPTO DE : INFECCIN BACTERIANA Es la entrada, establecimiento y multiplicacin de bacterias en la superficie o interior del husped que va asociada a una Respuesta especfica; pudiendo o no ser acompaada de manifestaciones clnicas.

COLONIZACIN BACTERIANA Capacidad de las bacterias para establecerse y multiplicarse en la piel y/o mucosas del husped en cantidades suficientes que permitan mantener un cierto nmero poblacional; sin que su presencia establezca o determine Respuestas clnicas ni inmunolgicas. INFECCIN INAPARENTE o SUBCLNICA (ASINTOMTICA) : Es aquel establecimiento de bacterias , que si bien induce una respuesta orgnica especfica, no va seguida de manifestaciones clnicas. Esto se debe a que hay un escaso N de Bacterias, a que stas son poco virulentas o a que el husped presenta un normal funcionamiento de sus defensas. ENFERMEDAD INFECCIOSA: Son aquellas enfermedades causadas por mltiples agentes patgenos (bacterias, virus, hongos y parsitos). Dichos agentes interactan con el organismo humano de diferentes maneras, resultando as una relacin que est dada por: Las enfermedades infecciosas se produce cuando tras el establecimiento de las bacterias surgen alteraciones y/o manifestaciones clnicas. Esto se debe a que hay un gran N de Bacterias, a que estas son muy virulentas o a que determinadas circunstancias produjeron una depresin de los mecanismos defensivos del husped, lo que interfiere con la Respuesta Inmunitaria. PATOGENICIDAD O PODER PATGENO Es la capacidad de producir dao o enfermedad por parte de una determinada especie de microorganismo. Hace referencia a la especie. El poder patgeno no solo depende de la especie de microorganismo sino tambin de las caractersticas del husped: N de Bacterias + Virulencia (Mecanismos de Accin Patgena y factores de virulencia) Enfermedad, Grado de Resistencia Organica, (Grado de Resist. Especfica e Inespecfica del Husped).

VIRULENCIA Es el mayor o menor grado de Patogenicidad que posee un microorganismo. Hace referencia a la cepa de determinado microorganismo.

CONCEPTO DE FLORA BACTERIANA NORMAL: Es la poblacin de microorganismos que residen en piel y/o mucosas de las personas sanas. Tales microorganismos en su mayora son bacterias, hongos, virus y parsitos. La composicin de la FN es variable y depende de factores como las caractersticas zonales del organismo, la edad, el sexo, su alimentacin, la higiene personal, el clima, las condiciones socioeconmicas de la poblacin y el grado de saneamiento ambiental. Respecto a las caractersticas zonales del organismo, diremos que estas difieren segn : Condiciones fsico qumicas (humedad Temperatura y pH) Potencial de oxido reduccin Condiciones nutritivas (cantidad y calidad de nutrientes) Presencia de receptores especficos en la MP de las clulas huspedes. Presencia de Sust. Inhibidoras (Lisozimas, Bacteriocinas, Ac. Grasos no saturados, Ig A secretoria) Cabe destacar que los microorganismos estn ampliamente os en la naturaleza, por ello el hombre se encuentra expuesto constantemente a los mismos desde su nacimiento (en el pasaje por el canal vaginal) y luego por contacto y exposicin. El hombre presenta zonas potenciales de colonizacin que renen las condiciones fisico- qumicas, nutricionales, etc. que pueden resultar adecuadas o no para la supervivencia y multiplicacin de diversas especies de microorganismos. IMPORTANCIA DE LA FLORA NORMAL 1. Sirve como Barrera frente a microorganismos patgenos u oportunistas 2. En el tubo digestivo es beneficiosa para la digestin de productos no atacables por los fermentos digestivos del sujeto, as como tambin contribuyen a la sntesis de algunas vitaminas como la vit. K CONCEPTO DE BACTERIOFAGO o FAGO : Virus cuyo husped natural son las bacterias, en las que se reproducen. En algunas especies bacterianas los Fagos juegan un papel importante en la trasmisin de informacin gentica de una bacteria a otra, pudiendo (mediante trasduccin) ser los encargados de trasmitir factores de resistencia a los antibiticos, como ocurre con los Staphylococos. En otros casos el ingreso de un fago a una bacteria determina que el genoma viral se integre al de la bacteria, de tal forma que los genes parasitados por el fago pueden determinar que se expresen nuevos caracteres en el fenotipo (Lisogenia por fagoconversin); as el Corinebacterium Diphtheriae slo ser patgeno ( por lo tanto toxignico) cuando se halle parasitado por un fago.

AGENTES ANTIMICROBIANOS (ANTIBITICOS O ATB)

TIPOS: Pueden ser Bactericidas o Bacteriostticos 1. Bactericidas: ATB con capacidad para destruir microorganismos sensibles o susceptibles, sin que medie la participacin de las defensas humorales o celulares del husped. 2. Bacteriostticos: ATBG que inhiben de forma reversible los procesos metablicos esenciales de cierta bacteria. Origen de Agentes Microbianos: ATB Verdaderos: Son sustancias de origen biolgico como por ej. las penicilinas, quienes derivan de un Son sustancias que derivan de sntesis qumica, como por ej. las sulfamidas, las cuales surgieron de los estudios realizados sobre las anilinas. Agentes Antimicrobianos Nuevos: Son Sustancias obtenidas por manipulacin molecular de ATB verdaderos y/o Quimioterpicos verdaderos, con el fin de ampliar sus espectros de accin sobre microorganismos o bien para mejorar sus caractersticas farmacolgicas. CLASIFICACIN SEGN SU SITIO DE ACCIN : Para ver el grfico seleccione la opcin "Descargar" del men superior RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ATB: Debido al uso excesivo, inadecuado, frecuente e irracional de los ATB, las bacterias las bacterias se volvieron ms resistentes a ellos; esto contribuy a la seleccin de especies resistentes y a la aparicin de microorganismos multiresistentes, que ante el vaco ecolgico creado por el mal uso de ATB, encuentran condiciones favorables para la multiplicacin y proliferacin Los diferentes tipos de resistencia son : a. b. c. d. Resistencia Natural Resistencia Secundaria Resistencia Mutacional Resistencia Transferible.

SUSCEPTIBILIDAD DE LAS BACTERIAS A LOS ATB : Cuando la resistencia bacteriana comenz a ser un fenmeno frecuente (debido al mal uso de los ATB) adquiri gran importancia el empleo de pruebas de sensibilidad antimicrobianas, ya que estas nos permiten determinar la respuesta a ellos por parte de cepas individuales dentro de cada especie. El empleo de ATB para cada antibiograma se debe decidir en funcin de : la especie aislada, de los ATB disponibles en la institucin y del foco de la infeccin. CONCEPTO DE ANTIBIOGRAMA : Conjunto de procedimientos que permiten determinar la sensibilidad in vitro de un microorganismo ante un determinado ATB. Las pruebas de sensibilidad o susceptibilidad antimicrobianas que se utilizan para determinar la actividad de un ATB frente a una cepa en particular, son principalmente de 2 tipos :

DILUCIN EN CALDO: Puede realizarse en medios de cultivos lquidos o slidos. Es un mtodo cuantitativo que sirve para determinar la sensibilidad y resistencia de las bacterias. Consiste en determinar el crecimiento de una bacteria en presencia de concentraciones decrecientes de ATB. Este mtodo permite determinar la CIM (concentracin Inhibitoria mnima) y la CBM (concentracin bactericida mnima). Para determinar la CIM se utilizan una serie de tubos de ensayo en los cuales se va colocando sucesivamente el ATB a doble dilucin; luego se siembra el microorganismo. La CIM corresponder al primer tubo de ensayo donde no se observe turbidez (la turbidez indica que existe crecimiento bacteriano). Para determinar la CBM seleccionamos los tubos donde no observemos turbidez y sembramos su contenido sobre un medio de cultivo slido, luego observaremos si hay o no desarrollo de colonias. LA CBM corresponder a aquella dilucin donde no ha crecimiento bacteriano alguno.

DIFUSIN EN DISCOS DE AGAR Se realiza en medios slidos y es la prueba ms usada (de rutina) en los laboratorios. Permite probar la eficacia de varios ATB al mismo tiempo. Con este mtodo determinamos la CIM . Para ello se siembra, en un medio de cultivo slido (Agar), una suspensin de microorganismos (108 UFC/ml ) y sobre esto se colocan discos o monodiscos de papel embebidos en concentraciones arbitrarias y conocidas de ATB. En el Agar hmedo, el ATB difunde desde los discos, con lo cual su concentracin va decreciendo a partir del disco. Luego se incuba adecuadamente (EJ. 24 48 HS) y a continuacin observaremos los Halos

de Inhibicin del Crecimiento Bacteriano; inmediatamente medimos (en mm) el dimetro que poseen los halos de inhibicin. El Punto de corte de los halos , corresponde a un valor de CIM equivalente a la concentracin de ATB que se alcanza en suero. Finalmente se compara la lectura realizada con tablas internacionales y se determina la sensibilidad o resistencia del microorganismo, clasificando a la cepa como Sensible (S) o Resistente y/o Intermedia (R) para ese ATB.

CIM: (CONCENTRACION INHIBITORIA MINIMA) Es la concentracin ms baja de un ATB capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo en condiciones estandarizadas. CIM por ETest: (disco de difusin). Consiste en aplicar sobre un medio de cultivo, donde se encuentra el microorganismo a ensayar, tiras plsticas que llevan incluidas un gradiente de concentracin de un determinado ATB. Luego se incuba adecuadamente y se observa la formacin de una elipse de inhibicin de crecimiento. Las Ventajas de este mtodo frente al de CIM por Dilucin: a. Brinda un resultado de la CIM ms exacto b. Es en mtodo menos laborioso Las Desventajas de CIM por E Test frente al de CIM por Dilucin : a. No se puede determinar CBM b. Es un mtodo muy costoso CBM: (CONCENTRACION BACTERICIDA MINIMA) Es la concentracin ms baja de un ATB capaz de destruir una porcin predeterminada de un inculo (en general el 99,9 %) en un tiempo determinado. Corresponde a la dilucin donde no se observa crecimiento alguno de microorganismos. Es importante que la concentracin de ATB en el foco de infeccin supere por lo menos 10 veces la CBM. Las situaciones clsicas que requieren realizar una CBM son : Infecciones en pacientes neutropnicos severos. Meningitis Endocarditis Osteomielitis

Como gua para seleccionar la dosis adecuada a ser administrada, puede utilizarse la medicin de la concentracin de ATB en el suero del paciente; para lo cual se toma una muestra de suero del paciente (bajo tratamiento ATB) antes de la administracin de una nueva dosis endovenosa (en el valle de la curva de concentracin) y luego se toma otra muestra al terminar la infusin endovenosa (en el pico de la curva de concentracin). Esto permite determinar el PIS y el PBS para monitorear y eventualmente corregir la dosificacin del ATB emplea (PODER INHIBITORIO DEL SUERO) Es la mayor dilucin de un ATB en el suero del paciente, capaz de inhibir el desarrollo visible de un microorganismo. (PODER BACTERICIDA DEL SUERO) Es la mayor dilucin de un ATB en el suero del paciente, capaz de matar al inoculo en un 99,9 %

TUBERCULOSIS DEFINICION:

COLORACION GRAM

Tcnicas de tincin. Fundamentos El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus

ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depstos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas. Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Preparacin de un frotis Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no est estril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con la cual se toca la colonia obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero que no queme.

Examen de muestras al microscopio Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y segn los colorantes que empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tincin. Examen microscpico directo de las muestras clnicas Tincin No se utiliza ningn tipo de colorante. Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observacin. El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solucin salina fisiolgica estril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parsitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc En la imagen: Candida sp en un examen en fresco. Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas Tincin Simple Sin

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos. En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china. Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas Tincin Diferencial Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica. Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de ZiehlNeelsen En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM

La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tincin de GRAM

Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar. Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula grampositiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gramnegativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su funcionamiento. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se

debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. 2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.

Morfologa ultramicroscpica de las bacterias: estructuras internas Pared celular Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cpsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que est en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rgida que da forma a la clula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales. Constituyentes importantes de la pared celular son los aminocidos, aminoazcares, azcares y grasas. Estas sustancias (protenas, Hidratos de carbono, grasas) estn enlazadas formando el polmero complejo que forma la pared celular.

Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-positivas contienen menos aminocidos que las gram-negativas; el contenido graso es mucho ms elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicacin del mecanismo de la reaccin al gram (ver las dos imgenes juntas). Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de cidos teicoicos. cido Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplsmica. Y cido teicoico de la pared que est en la superficie y se une slo a la capa de peptidoglicano. El cido Teicoico es el responsable del determinante antignico del organismo.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la porcin de lpido est embebida en el fosfolpido y el antgeno O polisacrido est en la superficie. El lpido se llama Lpido A y es txico, pero el lipopolisacrido entero se llama Endotoxina. La pared de la clula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplsmica y la pared celular hay un espacio periplsmico con enzimas hidrolticas, enzimas inactivadoras de antibiticos y protenas de transporte.

Tambin existen diferencias en la composicin de la pared entre las clulas de las diversas especies. Membrana Citoplsmica (citoplasmtica o protoplasmtica) Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se denomina membrana citoplsmica o protoplsmica y est formada por una bicapa de fosfolpido

integral y protenas perifricas empotradas. La membrana citoplsmica tiene una significacin funcional de suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la clula y la salida de los productos de desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la divisin celular el cromosoma se une a la membrana de la clula en el sitio llamado Mesosoma. Citoplasma El material celular contenido dentro de la membrana citoplsmica puede dividirse en tres partes, regin citoplsmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, regin nuclear o cromatnica, que es rica en DNA, y la parte lquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El RNA, combinado con protenas, forma partculas o corpsculos macromoleculares, de unos 200 A de dimetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. Estas partculas de RNAprotena se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas, o partculas que se encuentran en las clulas animales y vegetales. Estructuras Citoplasmticas Nucleoide (cuerpo cromatnico) Las clulas bacterianas no contienen el ncleo caracterstico de las clulas de las plantas y animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una estructura nuclear, el ADN de la clula bacteriana se encuentra confinado en este espacio, es nico y circular, doble hlice sin protenas. Como no se trata de un ncleo discreto, se ha sugerido que se d a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatnico, nucleoides, equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se demuestra con el mtodo de tincin de Feulgen, especfico para el DNA, y por microscopia electrnica, porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma cincundante. Ribosomas Tienen estrecha relacin con la sntesis de protenas (30S y 50S para formar un complejo 70S). Plsmidos Lazos extracromosmicos de ADN, algn cdigo para la resistencia a drogas, toxinas y otros factores. Endosporas Algunas bacterias pueden transformarse en pequeos ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. Tambin tienen esta propiedad otros gneros de bacterias verdaderas, pero slo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de clulas vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en

cierto perodo del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la sntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.

Tincin GRAM: Morfologa Bacteriana Ya hemos visto que la tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la deficinin "taxonmica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas. En lo relativo a la coloracin, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado. Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin GRAM: Cocos Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao

Divisin a lo largo del mismo forma plano, formando cadenas cortas esfric a: se llama 2 cocos 4 - 20 en cadenas: Coco juntos: Estreptococos Diplococos Bacilos

Divisin a lo largo de 2 planos diferentes: Ttradas

Divisin a lo largo de 3 planos

regularmente: Sarcinas

irregularmente: Estafilococos

Grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Forma de vara: se llaman Bacilos

Dos bacilos juntos: Diplobacilos

Cadenas de bacilos: Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos lado con lado o en figuras en X, V o Y

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Forma espiral rgida se llama: Espirilo

Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta

Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una misma especie.

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas

Cocos Gram-positivos Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B

Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

Finos: forma tpica de Listeria sp

Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Cocos Gram-negativos Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis Tambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfologa de diplococos. Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo, y, a menudo, Gramvariable.

Bacilos Gram-negativos Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni

Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp

Otras tinciones de uso habitual

RODAMINA-AURAMINA Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes. Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la diferenciacin morfolgica. NARANJA DE ACRIDINA El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tincin de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin inicial de hemocultivos positivos. ZIEHL-NEELSEN (BAAR) Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol

resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no cido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles. El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar BLANCO DE CALCOFLOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoros ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.

Tincin de esporas (Wirtz-Conklin)

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters.

FUNDAMENTO Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin. La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.