PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE FARMCIA BIOFRMACOS E PROCESSOS BIOTECNOLGICOS

CLONAGEM DE JAGUATIRICA (LEOPARDUS PARDALIS) UTILIZANDO CLULAS DA GLNDULA MAMRIA

Ana Carolina Jacoby Cristiane Souza Vieira Debora de Castro Lima Fernanda Caumo Luiza Reali Nazario

Porto Alegre 2012 1

Ana Carolina Jacoby Cristiane Souza Vieira Debora de Castro Lima Fernanda Caumo Luiza Reali Nazario

Clonagem de Jaguatirica (Leoparduspardalis) utilizando clulas da glndula mamria

Este projeto foi desenvolvido com o intuito de salvar um dos animais smbolo do Brasil, Leopardus como

pardalis, mais conhecida

Jaguatirica, atravs de clonagem.

Orientadora: Prof Dra. Virgnia Minghelli Schmitt

Porto Alegre 2012

SUMRIO

INTRODUO ..................................................................................................... 4

1.1 Clonagem reprodutiva ........................................................................................... 4 1.2 Clonagem teraputica ........................................................................................... 5 2 3 4 5 JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 6
OBJETIVOS ........................................................................................................... 7 HIPTESE ............................................................................................................. 8

MATERIAIS E MTODOS .................................................................................... 9

5.1 Obteno de animais ............................................................................................ 9 5.2 Preparao da clula e cultura ............................................................................. 9 5.3 Preparao de ocito e transferncia nuclear ...................................................... 9 5.4 Fuso da unidade de transferncia nuclear e ativao....................................... 10 5.5 Transferncia de embies .................................................................................. 10 5.6 Parto ................................................................................................................... 11 6 7 8 CRONOGRAMA ................................................................................................. 12 ORAMENTO .................................................................................................... 13 REFERNCIAS .................................................................................................. 14

1. INTRODUO

1.1 Extino

Extino pode ser definida como o evento pelo qual o ltimo representante de uma espcie deixa de existir. Ou ainda, de modo mais abrangente, como o momento a partir do qual os indivduos remanescentes de uma espcie mostram-se incapazes de produzir descendentes viveis ou frteis (Frankel & Soul, 1981). A extino de espcies um fenmeno natural tanto quanto o surgimento de novas espcies por meio da evoluo biolgica. A maior parte das espcies de plantas e animais que j povoaram a face da Terra se extinguiu devido a causas naturais antes mesmo do aparecimento do homem, e os paleontlogos reconhecem cinco perodos em que extines em massa reduziram a biodiversidade no planeta (Gibbs, 2001). Segundo o Decreto N 41.672, de 11 de junho de 2002 que declara as espcies da fauna silvestre ameaadas de extino no Estado do Rio Grande do Sul, a espcie Leopardus pardalis (Linnaeus, 1758) est com risco e classificada segundo a lista de vulnervel: categoria de ameaa que inclui as espcies que no se encontram criticamente em perigo nem em perigo, mas correm um alto risco de extino a mdio prazo (MARQUES, A. A. B. et al., 2002). Jaguatirica, ocelote ou gato-do-mato um felino cujo nome cientfico Leopardus pardalis, originariamente encontrado na Mata Atlntica e outras matas brasileiras. Distribuda por toda a Amrica Latina, encontrada tambm no sul dos Estados Unidos. De hbitos noturnos, passa a maior parte do dia dormindo nos galhos das rvores ou escondido entre a vegetao. Vivem aos pares, o que raro entre os felinos. As fmeas tm de um a quatro filhotes a cada gestao. Supe-se que se reproduzem a cada dois anos. O perodo de gestao varia de 70 a 95 dias. As fmeas chegam idade adulta em um ano e meio, os machos aos dois anos. Em cativeiro estima-se que viva cerca de 20 anos, mas possvel que viva menos na natureza. Alimenta-se de mamferos pequenos e mdios, como roedores, macacos, morcegos e outros. Come tambm lagartos, cobras e ovos de tartarugas. Caa aves, e alguns so bons pescadores. A jaguatirica mede entre 65 cm e um metro de comprimento, fora a cauda, que pode chegar a 45 cm. Pesa entre 8 e 16 kg. Tambm chamado ona-pintada, no entanto a ona (Panthera onca) maior, podendo atingir 2,10m. 4

1.2 Clonagem

O termo clone foi criado em 1903 pelo botnico Herbert J. Webber enquanto pesquisava plantas no Departamento de Agricultura dos Estados Unidos. Segundo Webber, o termo vem da palavra grega Kln, que significa broto vegetal. basicamente um conjunto de clulas, molculas ou organismos descendentes de uma clula e que so geneticamente idnticas a clula original (Hongbao Ma, 2004). Clonagem uma reproduo assexual que tem por finalidade produzir um organismo com caractersticas fsicas e biolgicas idnticas s de outro ser vivo. Esta duplicao pode acontecer de forma natural ou induzida. O primeiro caso comum entre vegetais, alguns protozorios e fungos. Em resumo, a clonagem artificial ou induzida, em animais, feita a partir da fuso do ncleo de uma clula somtica, retirada do indivduo que se deseja clonar, com um vulo no fecundado e sem ncleo. Tambm pode ser realizada com a separao de clulas embrionrias em estgio inicial, sem que tenham passado por algum processo de diferenciao celular. Nos vegetais, a duplicao induzida pode acontecer quando h uma aplicao de brotos, de plantas selecionadas, em caules de outros vegetais. O primeiro animal a ser clonado na histria foi uma r, em 1952, gerada de clulas de girino. Em maro de 1997, Ian Wilmut, no Instituto Roslin da Esccia, clonou o primeiro mamfero obtido de uma clula adulta: a ovelha Dolly. Cinco meses depois nasceram Neti e Ditto, macacos clonados de clulas fetais pelo Centro de Pesquisas de Primatas de Oregon, nos EUA. Em janeiro de 1998 anunciou-se o nascimento dos bezerros George e Charlie, clonados por James Rohl e Steven Stice, de clulas fetais contendo um gene humano. Por uma nova tcnica de clonagem (produo artificial de gmeos), em setembro de 1999 nasce Tetra, nica sobrevivente de uma gestao de quatro clones de macaco. H dois tipos de clonagem, so elas:

1.2.1 Clonagem Reprodutiva Uma das tcnicas bsicas usadas por cientistas a transferncia nuclear da clula somtica (SCNT). Esta tcnica foi usada por cientistas, por muitos anos para clonar animais atravs de clulas embrionrias. Como o nome da tcnica implica, a transferncia de uma clula somtica est envolvida neste processo. Esta clula somtica introduzida, ento, numa clula retirado de um animal (ou humano), logo 5

depois da ovulao. Antes de introduzir a clula somtica, o cientista deve remover os cromossomas, que contm genes e funcionam para continuar a informao hereditria, da clula recipiente. Aps de ter introduzido a clula somtica, as duas clulas fundem. Ocasionalmente, a clula fundida comear a tornar-se como um embrio normal, produzindo a prole se colocado no tero de uma me-de-alugel para um desenvolvimento mais adicional. Os problemas associados com a tcnica de SCTM so o stress em ambas as clulas envolvidas no processo. Isto resulta numa taxa elevada de mortalidade de ovos recipientes. Alm disso, o processo inteiro um consumo de tempo e de recursos, porque as partes dele requerem o trabalho manual sob microscpio. Similar a outra tcnica, ela tambm ineficiente, pois, s aproximadamente 2% dos embries sobrevivem para assentar bem na prole viva, e nivela ento, muita daquelas que sobrevivem dado logo aps o nascimento (Zatz, Mayana, 2004).

1.2.1 Clonagem Teraputica

A Clonagem "Teraputica" um procedimento cujos estgios iniciais so idnticos a clonagem para fins reprodutivos, difere no fato do blastocisto no ser introduzido no tero. Ele utilizado em laboratrio para a produo de clulas-tronco a fim de produzir tecidos ou rgo para transplante. Esta tcnica tem como objetivo produzir uma copia saudvel do tecido ou do rgo de uma pessoa doente para transplante. As clulas-tronco embrionrias so particularmente importantes porque so multifuncionais, isto , podem ser diferenciadas em diferentes tipos de clulas. Podem ser utilizadas no intuito de restaurar a funo de um rgo ou tecido, transplantando novas clulas para substituir as clulas perdidas pela doena, ou substituir clulas que no funcionam adequadamente devido a defeito gentico (ex: doenas neurolgicas, diabetes, problemas cardacos, derrames, leses da coluna cervical e doenas sanguneas etc). As clulas-tronco adultas no possuem essa capacidade de se transformar em qualquer tecido. (Zatz, Mayana, 2004)

2. JUSTICATIVA O Leopardus pardal, tem um status pouco preocupante pela Unio Internacional para a Conservao da Natureza e dos Recursos Naturais (2002) e em perigo pela USDI (1980), apndice 1 da Conveno sobre o Comrcio Internacional das Espcies da Fauna e da Flora Silvestres Ameaadas de Extino. A espcie est desaparecendo pela ao dos caadores que querem sua pele. O que ocasionou a sua introduo na lista de animais em extino publicada pelo IBAMA anualmente. O mercado negro alimentado pelo costume adaptado em muitos pases de transform-lo em animal extico e de estimao, alm de utilizar sua pele para criao de roupas e sapatos.

3. OBJETIVOS O seguinte trabalho tem como objetivo, fazer a clonagem de uma espcie especfica de animais chamada Leopardus pardalis, conhecida como Jaguatirica, um dos animais smbolos do Brasil que est fortemente ameaado de extino no mundo inteiro.

4. HIPTESE

Espera-se com esse trabalho, que seja possvel a aplicao de tcnicas de clonagem em Jaguatiricas, tornando vivel a criao de clones adultos saudveis e suficientes para uma tentativa de reintroduo da espcie natureza e sua excluso da lista de animais ameaados de extino.

5. MATERIAIS E MTODOS

5.1 Obteno de animais Atravs de parcerias entre zoolgicos brasileiros e a universidade onde ser realizada a pesquisa, sero obtidos os animais necessrios para o estudo..Inicialmente utilizaremos quatro animais, porm futuramente poderemos aumentar esse nmero.

5.2 Preparao da clula e cultura

Uma clula primria isolada de um animal adulto. Depois de isoladas as clulas so lavadas em DMEM (um meio de culturas para clulas de mamfero, suplementada com soro fetal bovino 10%, que so suplementos para fazerem as clulas crescerem em cultivo, so promotores de crescimento celular, e penicilina/estreptomicina 1% (v/v). As clulas so semeadas em placas de cultura com 6 poos seguindo as tcnicas tpicas de culturas celulares. Seguindo a primeira passagem, as clulas so crescidas ate a

confluncia e congeladas em DMEM-F12, suplementadas com SFB 20% e dimetilsulfoxido 10%. Depois do descongelamento, as clulas so colocadas em cultura no DMEM suplementado com SFB 10% e penicilina/estreptomicina 1% (v/v) para aproximadamente 80% da confluncia. Aproximadamente metade das clulas so alocadas para serem tratadas com o meio de cultura contendo 15 microMolar de roscovitina (um novo inibidor clico kinase dependente), por aproximadamente 24h antes da transferncia nuclear. As clulas remanescentes so cultivadas com um meio suplementado com SFB 0,5% (por 72h antes da transferncia nuclear). As clulas tratadas com roscovitina foram expostas ao inibidor pelo processo de transferncia nuclear. As clulas doadoras foram submetidas a classificao pela citometria de fluxo e foram tripsinizadas, centrifugadas e ressuspendidas em 1mL de PBS. As clulas foram primeiramente incubadas em RNAse livre de DNAse por 30min a 37oC e depois com 1mg/mL de iodeto de propidio por 10 min a 25oC antes de serem processadas na citometria de fluxo (Campbell, 1999).

5.3 Preparao de Ocito e Transferncia Nuclear

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Os ocitos receptores foram lavados e selecionados aps a retirada dos animais. Somente os ocitos que tem um citoplasma homogneo e pelo menos trs camadas de clulas cummulus foram selecionados para a maturao in vitro. O meio para a maturao in vitro consistiu de meio de cultura tecidual TCM 199 suplementado com SFB 10%, 50 microgramas/mL de piruvato de sdio, penicilina/estreptomicina 1% (v/v), um nanograma/mL de fator de crescimento semelhante a insulina recombinante 1, 0,01U/mL de hormnio luteinizante (e 0,01U/mL de hormnio estimulante de folculos. Os ocitos selecionados so colocados em 0,5mL de meio de maturao sobreposto com o,4mL de leo mineral e incubado por 16-18h a 37oC em 5% de CO2 e ar. Depois da maturao, o ocitos eram vortexados para remover as clulas cumulus expandidas e tingidas com Hoechst 33342 para observao da cromatina. Para ter certeza da

enucleao, luz UV usada para checar o DNA localizado no corpo polar e na placa de metfase. As clulas do doador so tripsinizadas, peletizadas e ressuspendidas em DMEM suplementado com SFB 0,5% (soro faminto) ou SFB 10% e 15micromolar de roscovitina antes das transferncia nos ocitos recipientes. As clulas doadoras (uma por ocito) so micro cirurgicamente colocadas no espao perivitelineo evacuado durante a enucleo, garantindo contato intimo entre a clula doadora e o ocito recipiente (Houdebine, 2003).

5.4 Fuso da unidade de transferncia nuclear e ativao A clula doadora e o citoplasma recipiente dsticos de transferncia nuclear so fundidos aproximadamente 22-24h aps a maturao por um nico pulso eltrico direto (40V) entregue pelos eletrodos tipo agulhas. A fuso foi feita no meio de fuso de clulas Zimmermann, colocando um eletrodo em cada lado do dstico de transferncia nuclear (aproximadamente 0,15mm de distncia) e arranjando o dstico para que o pulso de 20 microsegundos seja entregue perpendicularmente para o espao compartilhado da membrana da clula doadora/citoplasma. Uma amostra dos dsticos e examinada por 1 hora aps o pulso para determinar a eficincia da fuso. A ativao dos dsticos e feita usando TCM 199 mais SFB 1% suplementado com citocalasina B (5microgramas/mL), ciclohexemida (10 microgramas/mL) e inforo de clcio (5microM) por 10 minutos seguidos por TCM 199 mais SFB 10% suplementado com somente citocalasina B (5microgramas/mL) e ciclohexamida (10microgramas/mL) por uma hora em 5% de Co2 e ar. Uma cultura por um perodo de 5h no TCM 199 mais SFB e ciclohexamida 11

(10microgramas/mL) e conduzida com baixa tenso de oxignio (5% O2, 5% CO2, 90 N2). Seguindo a ativao, os embries reconstrudos so cultivados em meio de cultura de embries abaixo de pouco oxignio (5%) por 7-8 dias (Chesne, 2002; Faurie, 2003).

5.4 Transferncia de embries Os embries que chegaram ao estagio de blastocisto so transferidos para o recipiente animal depois de aproximadamente 7 dias depois do estro sincronizado. Conjunto de fenmenos e comportamentos que precedem e acompanham a ovulao nos mamferos de sexo feminino. Um ou dois embries por recipiente so introduzidos sem cirurgia na trompa uterina ipsilateral ao ovrio contendo um corpus luteum palpvel. A avaliao da gravidez e feita usando um ultrasomtransretal

aproximadamente 21 dias depois da transferncia do embrio (Dia 28 da gestao). Recipientes diagnosticadas como grvidas so avaliadas semanalmente ate

aproximadamente 100 dias de gestao e ento mensalmente depois do estudo do desenvolvimento fetal. Durante o ultimo ms de gestao, os recipientes so monitorados varias vezes cada semana pela palpamento para avaliar a sade do feto. Recipientes que so cetoticos no terceiro semestre so tratadas com os protocolos, incluindo uma rao alta em protenas e propilenoglicol (Hill, 2000).

5.5 Parto O parto e feito com a rota cirrgica padro, aproximadamente no dia 272 da gestao. A induo do parto comea aproximadamente 36 horas antes da cesariana agendada, com 5mg/kg de dexametasona (3 injees IM a cada 12 horas) suplementada com 25mg de prostaglandina (IM) ate o momento da segunda injeo de esteroides. Se o mecnio esta presente ate o momento do parto, uma abordagem mais agressiva (seja com lotao ou suco ativa) e adotada consistindo de mltiplas tentativas de remover o fluido dos pulmes. E dado oxignio nasal aos animais a quantidade de 2-10 l/min dependendo dos valores de gs sanguneos. Plasma (2 L/bezerro; iv), antibiticos e colostro (10-15% do peso corporal, seja por aleitamento ou tubo alimentar) so dados nas primeiras 4 horas de vida. Tratamentos mais agressivos (ex: surfactante, esterides inalatrios e broncodilatadores) so administrados com base em cada caso. O umbigo e cirurgicamente removido para evitar infeces. Os animais so alimentados com

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mamadeiras e desmamados depois de algumas semanas de vida, segundo o padro de praticas de criao animal (John Gibbons, 2002).

6 CRONOGRAMA

Semestral Elaborao do projeto Pesquisa e atualizao bibliogrfica Seleo de profissionais Treinamento de bolsistas Compra de material para o desenvolvimento Monitoramento dos testes Concluso da pesquisa Elaborao do relatrio final Reviso de texto Entrega da pesquisa

01/12 X

02/12

01/13

01/13

01/14

02/14

01/15

02/15

X X X X X X X X X X X X X X X X

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7 ORAMENTO PRODUTO Bioqumicos Bolsistas Auxiliar de Lab. gua/Luz/ Internet/ Telefone Materiais de Escritrio Materiais de Lab. Manuteno dos Animais ps nascimento Veterinrio Congressos/ Eventos DMEM SFB DMEM F12 DMSO penicilina estreptomicinA roscovitina 50mg Tripsina-EDTA 500mL 500mL $370,00 R$ 134,00 Selleckchem sigmaaldrich + Quantidades 3 4 2 1 ms 1 ms 1 ms 1 animal/ms 1 Ao ano 10L 500mL 3L 500mL VALOR R$3,000 R$400,00 R$ 700,00 R$ 1,000 R$200,00 R$ 1.500,00 R$1. 700,00 R$ 1,500,00 R$ 3,000,00 R$154,00 $135,00 R$ 628,00 R$ 176,00 R$ 77,00 sigmaaldrich sigmaaldrich sigmaaldrich sigmaaldrich sigmaaldrich

Marca

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PBS 1000mL Iodeto Propridio TCM 199

1000mL de 25mg

R$ 343,00 R$ 238,00

sigmaaldrich sigmaaldrich

500 mL

R$ 90,00

Sigmaaldrich

OBS: O laboratrio que ser utilizado para os experimentos um laboratrio de gentica que j possui a estrutura necessria para este tipo de pesquisa.

8 REFERNCIAS

Campbell KH. Nuclear transfer in farm animal species. Semin Cell Dev Biol ,1999,10(3):245-52.

Chesne P, Adenot PG, Viglietta C, Baratte M, Boulanger L,Renard JP. Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat Biotechnol, 2002,20(4):3669.

Faurie C, Golzio M, Moller P, Teissie J, Rols MP. Cell and animal imaging of electrically mediated gene transfer. DNA Cell Biol, 2003,22(12):777-83.

Frankel, O. H. & M. E. Soul. 1981. Conservation and evolution. Cambridge, Cambridge University Press. 327 p.

Gibbs, W. W. 2001. On the termination of species. Scientific American, 285(5):2837.

Hill JR, Burghardt RC, Jones K, Long CR, Looney CR, Shin T, Spencer TE, Thompson JA, Winger QA, Westhusin ME. Evidence for placental abnormality as the major cause of mortality in first-trimester somatic cell cloned bovine fetuses. Biol

Reprod ,2000,63(6):1787-94.

Houdebine LM. Animal transgenesis and Cloning. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ, USA, 2003,34-73. 15

John Gibbons, Sezen Arat, Jacek Rzucidlo, Kazuchika Miyoshi, Rachel Waltenburg, Donald Respess, Alison Venable, and Steve Stice. Enhanced Survivability of Cloned Calves Derived from Roscovitine-Treated Adult Somatic Cells, BIOLOGY OF REPRODUCTION 66, 895900, 2002.

MARQUES, A. A. B. et al. Lista de Referncia da Fauna Ameaada de Extino no Rio Grande do Sul. Decreto no 41.672, de 11 junho de 2002. Porto Alegre: FZB/MCT PUCRS/PANGEA, 2002. 52p. (Publicaes Avulsas FZB, 11) Zatz, Mayana. Clonagem e clulas-tronco. Cienc. Cult., jun. 2004, vol. 56, n 3, pp. 23-27, ISSN 0009-6725.

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