Faculdade de Sade, Cincias Humanas e Tecnolgicas do Piau NOVAFAPI Curso de Biomedicina - 5 Perodo Disciplina: Citogentica Professor (a): MSc.

. Elisa Aparecida Alves Paiva

Teste Allium cepa

Aluna: Mara Rejane de Oliveira Marques Colho

TERESINA PIAU 2011

Mara Rejane de Oliveira Marques Colho

Teste Allium cepa

Documento produzido como parte dos requisitos para aprovao na disciplina de Citogentica, oferecida no Bloco 5, pelo da curso de

Biomedicina NOVAFAPI. Orientadora:

Faculdade

Prof

MSc.

Elisa

Aparecida Alves Paiva

TERESINA PIAU 2011

SUMRIO:

1. INTRODUO__________________________________________________4 2. OBJETIVOS____________________________________________________5 3. MATERIAIS E MTODOS ________________________________________6 4. RESULTADOS_________________________________________________10 5. DISCUSSO___________________________________________________11 6. CONCLUSO__________________________________________________12 7. REFERNCIAS________________________________________________13

1. Introduo:

Grande

parte

dos

produtos

qumicos

apresenta

potencial

de

mutagenicidade e cancergeno podendo ser tambm encontrados nos alimentos e na gua utilizada para consumo humano. No entanto, convm ressaltar que esses contaminantes acumulam-se e permanecem no meio acarretando uma ameaa para os organismos vivos. necessria a utilizao de marcadores biolgicos confiveis para contribuir na identificao da relao causal entre a exposio a contaminantes e o aumento dos riscos dos efeitos, sobre os indivduos e as populaes, que ocasionam a diminuio da integridade do ecossistema e correlacionam-se com o desenvolvimento de doenas em especial em humanos. Em seguida, os biomarcadores apresentam-se como indicadores sensveis que detectam tanto a exposio a substncias txicas, quanto os seus efeitos devido distribuio dos xenobiticos pelos tecidos. Os biomarcadores so teis e podem ser definidos como sistemas indicadores que geralmente incluem subsistemas de um organismo completo, usados para identificao de um alvo especfico. O mtodo de avaliao de alteraes cromossmicas em razes de Allium validado pelo Programa Internacional de Segurana Qumica (IPCS, OMS) e o Programa Ambiental das Naes Unidas (UNEP) como um eficiente teste para anlise e monitoramento in situ da genotoxicidade de substncias ambientais. Esse sistema de Allium cepa tem importncia no monitoramento da poluio ambiental e avaliao do potencial mutagnico de muitos compostos qumicos. Esse estudo, portanto, tem como finalidade informar a respeito da importncia do teste de Allium cepa para avaliao preliminar da citotoxicidade/ genotoxicidade de analisar pores de gua do Aude Grande em Campo Maior, PI.

2. Objetivo:

Analisar a presena de microncleos em clulas de Allium cepa de gua de pores de gua do Aude Grande em Campo Maior, PI, onde a utilizao do teste do microncleo poder detectar e quantificar a ao genotxica de agentes carcinognicos bem estabelecidos em vrios sistemas, tanto in vitro, como in vivo. .

3. Materiais e Mtodos:

O protocolo de Allium cepa de pores de gua do Aude Grande em Campo Maior, PI foram: a escolha cebolas de tamanho mdio e uniformes; a retirada de razes secas e camadas externas secas, bem como do parnquima central da coroa de brotamento (fazendo uma pequena inciso circular) para aumentar a absoro das solues e a uniformidade de brotamento e crescimento das razes; lavagem em gua corrente, por cerca de 20 min; colocao em gua da torneira em frascos de vidros,no podendo usar copos plsticos, a aerao com bombas de aqurio razo constante de ~80 bolhas/min e troca sem completar gua a cada 24 horas; Foram mantidas as cebolas por 48 horas no escuro, com troca de gua a 25 1C; bulbos com razes de aproximadamente 1,2 a 2 cm podero ser usados no incio do experimento. As razes maiores, bem como aquelas deformadas foram eliminadas antes do incio do tratamento; a realizao do tratamento substituindo a gua da torneira pela amostra e os tempos sugeridos servem para tratamentos temperatura constante de 25 1C. Durante este tempo, at de 48h, no foi necessrio a aerao ou troca da substncia-teste. O tempo de exposio gua de rio/lagos = 48 a 72 h de exposio, se in vitro e se houvesse necessidade de tempo de exposio maior do que 48 h, trocar, preferentemente, a gua de tratamento. Caso for observada toxicidade, fazer diluio da amostra. Usar, pelo menos, 3 concentraes diferentes; o controle negativo: gua da torneira (sem cloro) no foi usada destilada ou miliQ, pela ausncia de micro-nutrientes necessrios para o metabolismo normal das razes; o controle positivo: MMS e/ou sulfato de cobre; Para cada ponto do experimento ou concentrao foi usado 5 bulbos. Para aumentar a observao de microncleos, logo aps a exposio soluo teste, foi substituda a mesma por gua de torneira no clorada, sendo trocada a gua a cada 24 hs. Aps o tempo de recuperao, foi removido as razes e fixadas em um soluo Carnoy por 24 hs. Aps este tempo, as razes

podero ser estocadas em etanol 70% por um longo perodo de tempo, e recolocadas em uma nova Soluo Carnoy a 4C at a sua utilizao. Para a preparao das lminas, foi lavada as razes com gua destilada, com 3 banhos de 5 min cada, para a retirada do fixador do material. Realizouse a hidrlise com 1N HCl a 60 C por 11 min, seguido de um novo banho em gua destilada a temperatura ambiente; (Obs: Nesta etapa, deve-se colocar os meristemas em vidros contendo o HCl 1N j pr-aquecido no banho. O tempo e a temperatura devem ser precisos). Com o auxlio de uma pina de ponta fina, secaram-se as razes em papel de filtro, tomando o cuidado para no encostar a regio meristemtica no papel. Depois, transferiu as razes para frascos escuros (mbar), contendo o reativo de Schiff, por aproximadamente 2 horas. Lavaram-se as razes em gua corrente, at a total retirada do corante. Quanto mais lmpida saiu gua da lavagem, maior foi a reatividade do Schiff e melhor colorao do material gentico. Colocaram-se as razes sobre uma lmina e separou a regio meristemtica de um dos lados da Lmina e a regio F1 do outro lado da lmina. A regio F1 se localiza 1mm acima da regio meristemtica da raiz. Adicionou-se sobre os materiais seccionados, uma gota de carmim actico 2% e cobrir com lamnulas, sendo uma lamnula para a regio meristemtica e uma lamnula para regio F1. Depois, pressionou com auxlio de um estilete os locais onde esto dispostos os materiais seccionados. Extraram-se as lamnulas em nitrognio lquido. Montaram-se as lminas com resina sinttica, para serem, posteriormente, analisadas. E para anlise, usouse aumento de 400X. O uso de lente de imerso recomendado. Contagem de microncleos quando: i) a intensidade e colorao da cromatina so similares ao ncleo; ii) limites distintos indicando a presena de membrana nuclear; iii) estruturas so redondas e separadas do ncleo principal; iv) encontrados no mesmo plano do ncleo; v) esto no mesmo citoplasma que o ncleo principal; vi) tamanho no limitante. Contou-se 5.000 clulas por ponto (1000 clulas/lmina). Usou-se folha de contagem com a presena de clulas totais, clulas normais, clulas com 1, 2, 3, 4 ou mais microncleos.

1. Protocolos das solues Carnoy 3:1: Misturar 1 parte de cido actico glacial PA em trs partes de etanol PA . Usar como fixador no momento do preparo. Reativo de Schiff: 1,5 g de fucsina bsica 4,5 g de metabisssulfito de K ou Na 45 mL de HCl 1N 10 g de carvo ativado (pode ser at mais: 2 colheres de sopa) 300 mL de H2O torneira (50C). Dissolver a fucsina em gua a 50C Esperar resfriar um pouco a soluo Acrescentar o metabissulfito e o HCl Agitar Guardar no escuro completo (envolver em plstico preto ou

papel alumnio) por 24 horas Adicionar o carvo ativado Filtrar (a luz) Guardar na geladeira, em frasco escuro e envolvido por

papel alumnio Obs: 1. A soluo deve ficar incolor, levemente mbar ou palha. Se ficar rosa, tentar corrigir com mais carvo ativado (10g) e filtrar novamente. Caso fique ainda rosa, deve-se descartar a soluo, pois no servir para corar o DNA. 2. Quando a soluo estiver pronta, test-la pingando uma gota da mesma em papel de filtro, que deve ficar com uma aureola rosa em volta da gota. Caso j perceba a aureola rosa j na borda do papel de filtro da filtragem, pode-se dispensar o teste acima. O vidro que ser usado para armazenar a soluo deve ser mbar e estar extremamente limpo e seco, pois impurezas ou unidade estragam a soluo (deixa-a rsea, sem possibilidade de correo).

3. Preparar o Schiff com cautela, em lugar aberto, pois o metabissulfito irritante de mucosa. O cuidado deve ser maior no momento da filtragem.

Carmin-ctico 2%: 2 gramas de carmim 100 mL de cido actico 45% - Ferver a mistura em um condensador de refluxo por 30 a 45 minutos. - Deixar esfriar, filtrar em papel de filtro comum e guardar em recipiente mbar bem fechado. Manter em geladeira. OBS: Caso no possua um condensador de refluxo, juntar o carmim e o cido actico em um Becker de vidro, tampar com uma placa de Petri e ferver por cerca de 30 a 45 minutos (pode tirar do fogo de vez em quando, pois ele ferve e pode extravasar do vidro). Aps a fervura, deixar esfriar e filtrar com papel de filtro comum. Guardar em frasco mbar, bem fechado, e armazenar em geladeira.

4. Resultados:

A anlise de alteraes cromossmicas serve

como teste de

mutagenicidade e um dos poucos mtodos diretos para mensurar danos em sistemas expostos a mutagnicos ou carcinognicos potenciais. Para possibilitar a avaliao dos efeitos ou danos que agentes mutagnicos podem causar, faz-se necessrio que a amostra esteja em constante diviso mittica, objetivando identificar os efeitos txicos e alteraes ocorridas ao longo de um ciclo celular, e o teste de Allium cepa tem sido amplamente empregado com esse propsito. O ndice mittico e ndice de replicao so usados como indicadores de proliferao adequada das clulas, o que pode ser medido atravs do sistema teste vegetal de Allium cepa.

Figura 1: Achados microscpicos da pesquisa realizada no Aude Grande em Campo Maior, PI; contemplando atrasos cromossmicos (A, D, C e G), aneugenia e clastogenia (B, D, E, e F), pontes cromossmicas (C) e microncleos (H e I). (GOMES JUNIOR et al., 2010)

5. Discusso:

A presena de microncleo nas clulas um reflexo de aberraes cromossmicas induzidas durante a mitose celular, por isso esse teste pode ser usado como marcador do potencial de carcinogenicidade de um agente.

6. Concluso:

O sistema teste vegetal de Allium cepa apresenta-se como um bioindicador ideal para o primeiro screening da genotoxicidade de anlise de gua, devido ao seu baixo custo, confiabilidade e concordncia com outros testes de genotoxicidade, auxiliando os estudos de preveno de danos sade humana. Os fatores oncognicos podem induzir alteraes citogenticas nas clulas, que podem ser detectadas atravs da tcnica de microncleo. Este teste utilizado para avaliar os efeitos genotxicos produzidos por baixas doses de substncias carcinognicas ou misturas carcinognicas s quais as populaes humanas esto usualmente expostas. Os microncleos so formados de fragmentos cromossmicos ou cromatdicos acntricos e de cromossomos inteiros que se atrasam, em relao aos demais, em migrao para os plos do fuso na anfase, sendo, portanto, excludos do novo ncleo formado na telfase. Estes microncleos so corpsculos contendo DNA encontrados no citoplasma, um ou mais por clulas, e no possuem qualquer conexo estrutural com o ncleo principal.

7. Referncias:

1. BAGATINI, M. D., SILVA,A. C. R., TEDESCO. S. B. Uso do sistema teste de Allium cepa como bioindicador de genotoxicidade de infuses de plantas medicinais. Revista Brasileira de

Farmacognosia.N 17. Vol 3. 444-447, Jul./Set. 2007 2. HARA, R. V., LOPES, B. P. V., SANTOS, F. P., OLIVEIRA, R. J. Aplicabilidade de ensaios da gentica toxicolgica no

biomonitoramento de ambientes aquticos e promoo da sade humana. TERRA E CULTURA - No 48 e 49 - Ano 25 - Janeiro a Dezembro de 2009.