Cromatografa de lquidos HPLC Tcnicos responsables

Marta Isabel Ozores Belmonte martaisabel.ozores@uva.es Nora Carrera Aguado nora.carrera@uva.es Tlf: 983.184682

Principios de la tcnica
En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y estacionaria A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin. HPLC preparativa Es la tcnica escogida para aislamiento y purificacin de productos de valor en las industrias qumicas y farmacuticas as como en la biotecnologa y la bioqumica. La cromatografa preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el aislamiento de 1g de muestra para identificacin espectroscpica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g.

Aplicaciones
Campos de Aplicacin de HPLC

Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos

Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos. Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

Separacin y purificacin de metabolitos Separacin y purificacin de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de orina Purificacin y separacin de enantimeros Purificacin de compuestos naturales Purificacin y caracterizacin de enzimas y protenas

Funcionamiento del servicio

Las muestras deben ir acompaadas de la hoja de solicitud de servicios generada en esta pgina web una vez realizado el registro en la misma. El ususario debe rellenar todos los campos de la solicitud de servicios que conozca, con el fin de obtener el mejor resultado posible.

Equipos
HPLC analtico 1200 Series de Agilent Technologies

Bomba cuaternaria G1311 Detector de longitud de onda variable G1314B Detector de diodo y de longitud de onda variable G1315D Detector de ndice de refraccin G1362A Detector de fluorescencia G1321A HPLC preparativo 1200 Series de Agilent Technologies

Dos Bombas preparativas G1361A Detector de diodo y de longitud de onda variable G1315D Muestreador automtico G1329A Colector de fracciones G1364B

Cromatografa lquida de alta eficacia

De Wikipedia, la enciclopedia libre

Saltar a: navegacin, bsqueda La Cromatografa lquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada frecuentemente en bioqumica y qumica analtica. Tambin se la denomina a veces Cromatografa lquida de alta presin o High pressure liquid chromatography (HPLC), aunque esta terminologa se considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatogrfica.

Contenido
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1 Principio o 1.1 Tipos de HPLC o 1.2 Cromatografa de fase normal o 1.3 Cromatografa de fase reversa o 1.4 Cromatografa de exclusin molecular o 1.5 Cromatografa de intercambio inico o 1.6 Cromatografa basada en bioafinidad 2 Parmetros o 2.1 Dimetro interno o 2.2 Medida de las partculas o 2.3 Tamao de poro o 2.4 Presin del sistema 3 Fabricantes de aparatos de HPLC 4 Fabricantes de columnas de HPLC y accesorios 5 Vase tambin 6 Enlaces externos

[editar] Principio
HPLC Cromatografa lquida de alta resolucin' En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con ciertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencin y se considera una propiedad

identificativa caracterstica de un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la cromatografa. Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos. Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la composicin de la fase mvil durante el anlisis, conocida como elucin en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografa de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado vara en funcin de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor concentracin de agua, mientras que los compuestos ms hidrofbicos eluirn a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separacin de los compuestos.

[editar] Tipos de HPLC [editar] Cromatografa de fase normal

La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de absorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin. La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de inters, sino tambin en factores estericos de forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin. La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC de fase reversa o Reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la silica o almina de la cromatografa.

[editar] Cromatografa de fase reversa

La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa es la silica tratada con RMe2SiCl, dnde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente. El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y disminuye con la introduccin de disolventes mas hidrofobicos. La cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente.Este efecto hidrofbico est dominado por la disminucin de la energa libre de la entropa asociada con la minimizacin de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica el coeficiente de particin de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante en la retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molcula. Aun as, las molculas muy grandes pueden ver reducida la interaccin entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retencin aumenta con el rea de superficie hidrofbica que suele ser inversamente proporcional al tamao del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida. Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modificaciones de la fase mvil pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como que la entropa de la interfase compuesto-disolvente est controlada precisamente por la tensin superficial, la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo de retencin. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la separacin cromatogrfica. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que stas podran daar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden

utilizar en cidos en medio acuoso pero no deberan estar expuestas demasiado tiempo al cido porque puede corroer las partes metlicas del aparato de HPLC.

[editar] Cromatografa de exclusin molecular

La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como cromatografa por filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en funcin de su tamao. Generalmente se trata de una cromatografa de baja resolucin de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificacin. Tambin es muy til para la determinacin de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas purificadas. La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en columna por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes. En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines prcticos, la columnas se empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados. En consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las molculas que acceden al interior de esta.

[editar] Cromatografa de intercambio inico

Artculo principal: Cromatografa de intercambio inico.

En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la atraccin electrosttica entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores inicos son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores inicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamao de poro controlado. En general los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones elevada carga y radio pequeo. Un incremento en la concentracin del contrain (respecto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retencin. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio catinico mientras que una disminucin del pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio aninico. Este tipo de cromatografa es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones: purificacin de agua, concentracin de componentes traza, Ligand-exchange chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.

[editar] Cromatografa basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de las sustancias biolgicamente activas de formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de estos complejos implica la participacin de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la fase estacionaria.

[editar] Parmetros
[editar] Dimetro interno
El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin influye en su sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificacin de compuestos para su utilizacin posterior. En cambio, las columnas de dimetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analtico y normalmente estn asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un dimetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometra de masas.

[editar] Medida de las partculas

La mayora de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partculas esfricas de silica. Estas partculas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5\mum de dimetro las ms utilizadas. Partculas ms pequeas ofrecen una mayor superficie y una mejor separacin, pero la presin que se requiere por obtener una velocidad lineal ptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del dimetro de la partcula. Esto significa que disminuir la medida de las partculas a la mitad, aumentara la resolucin de la columna, pero a la vez, aumentara la presin necesaria en un factor de ocho.

[editar] Tamao de poro

Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros pequeos proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan una cintica mejor, especialmente para los compuestos de tamao ms grande; por ejemplo, una protena que sea ligeramente ms pequea que el tamao de los poros puede entrar, pero difcilmente saldr con facilidad.

[editar] Presin del sistema

La presin de las bombas es variable segn el modelo y fabricante, pero su rendimiento se mide en su habilidad para generar un flujo constante y reproducible. La presin puede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmsferas). Los aparatos ms modernos de

HPLC incorporan mejoras para poder trabajar a presiones ms altas y, por lo tanto, poder utilizar partculas de tamao ms pequeo en las columnas (< 2 micrometros). Estos nuevos aparatos, denominados Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) pueden trabajar con valores de hasta 100 MPa de presin (unas 1000 atmsferas). (Hay que tener en cuenta que las siglas UPLC son una marca registrada de Waters Corporation aunque a veces se utilizan de forma general para designar este tipo de aparatos).

Los tomos de Demcrito

Un humilde intento de mostrar la qumica desde un lado agradable

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Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (HPLC)

Posted on 7 febrero, 2008 by J-at-X

Cromatografa de Lquida de Alta Eficiencia

(High Performance Liquid Chromatography)

Qu es Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia? La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil. En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija.

La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual est rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad.

Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones, lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

* Tipos de Cromatografa Lquida o

Cromatografa de Particin. *

Cromatografa de Adsorcin *

Cromatografa Inica * Cromatografa de Exclusin

Diagrama Bsico de un sistema de HPLC

* Elecccin del Solvente

Caractersticas: o

Disponible comercialmente *

Precio *

Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza cromatogrfica. Bajo contenido de impuresas. *

Disolver la muestra *

Misible con otros solventes para formar mezclas tiles *

No degradar o disolver la fase estacionaria *

Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin * Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia ptica (cuando se usan detectores UV)Filtracin y Desgasificacin de solventes o + #

Filtro a la Entrada del Solvente

Mtodos de Filtracin de Solventes en HPLC

Hay tres(3) mtodos comunes que se utilizan hoy para la filtracin previa de los Solventes en HPLC :

En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Tcnicas del Laborario Moderno ms importantes como herramienta analtica para separar y detectar compuestos qumicos. Como en todas las tcnicas analticas, los pequeos problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y durabilidad del sistema. Aun con la evolucin de los cromatografos lquidos en la era de la computadora, hay aun problemas que sta no puede resolver.

Hasta los Solventes para HPLC, tods filtrados cuidadosamente en la fbrica, pueden acumular partculas en suspencin que pueden ser perjudical a los componentes del sistema HPLC. Estas partculas en suspencin pueden venir de varias fuentes, incluso de la exposicin al polvo en el aire durante el trasegado de solvente en el depsito para solvente, la exposicin a partculates del aire durante el almacenamiento del solvente en el depsito del solvente, la degradacin lenta del recipiente solvente, o de condensacin y polimerizacin del solvente. Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.

En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el interior del solvente a la atmsfera y empieza a acumular gases disueltos que se encuentran en la atmsfera. El trasegado del solvente en el depsito solvente y su almacenamiento en estos depsitos mseste fenmeno. El Oxgeno Disuelto que constituye el 21% de la atmsfera puede producir mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y electroqumicos. El Nitrgeno Disuelto es el otro componente de la atmsfera que puede producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la lnea base. El Dixido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente. *

Filtracin al Vaco * Filtracin en Lnea Sonificacin

Mtodos de Desgasificacin de Solventes en HPLC

Existen cuatro(4) mtodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso: *

Burbujear Helio *

Desgasificacin Electrnica en la Lnea del Flujo * Desgasificacin al Vaco en LneaBombas

Requisitos o aspectos ms importantes que debe reunir una bomba o sistema de bombeo: o

Debe producir presiones estables hasta 6000 psi. *

Mantener el flujo libre de pulsaciones *

Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min) *

Control y reproducibilidad del flujo de solvente * Componentes de la bomba resistentes a la corrosinLas bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar segn su funcionamiento y diseo en: o

Mecnicas +

Recprocantes *

De desplazamiento contnuo o Neumticas

Programacin del Solvente

Existen dos mtodos de programacin de Solvente en HPLC: o Isocrtico

* o

Gradiente de Elucin. Es un trmino que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual se cambia la composicin de la fase mvil. Pueden efectuarse de dos maneras: +

A baja presin * A alta presin o +

Obtener la mejor resolucin de los componentes de la muestra en el menor tiempo posible.

Cuando se desarrolla un anlisis usando el mtodo de gradiente se debe tener presente dos objetivos: * Asegurar alta presicin y exactitud. o +

Determinar la composicin inicial y final del solvente

Para obtener buenos resultados con el mtodo de gradiente debemos seguir 5 pasos fundamentales: *

Ajustar el tiempo del gradiente *

Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa) *

Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolusin * Regresar a las condiciones iniciales la columna.Sistemas de Inyeccin de muestra

Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un principio de utilizaba la inyeccin de la muestra con jeringas de alta presin cuales ya estn de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Vvulas inyectoras.

Columnas y Fases Estacionarias

Tipos de Columna: Fuentes de dao de una columna de HPLC: * Obstruccin por partculas pequeas en los solventes o fases mviles * Obstruccin por materiales no eludos en las muestras * Variacin de las caractersticas de retencin por incremento de materiales no eludos

Deteccin

La eficiencia de un detector cromatogrfico depende de la relacin entre la cantidad fsica medida y la composicin del efluente, as como tambin de lascaractersticas de las seal de transferida.

Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en: o

Detectores basados en una propiedad de la fase mvil . Ejemplo: Detector de Indice de Refraccin * Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector UltravioletaLos detectores ms utillizados en HPLC son: o

Detector UV. Hay bsicamente tres tipos: +

Detector de Longitud de Onda Fija *

Detector de Longitud de Onda Variable *

Detector de Arreglo de Diodos o

Detector de Indice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos: +

Tipo Deflexin *

Tipo Fresnel o

Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacin . *

Detector de Fluorescencia Inducida por Laser o +

Segn la Fuente de Excitancin *

Segn el sistema ptico o

Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: +

Detector Amperomtrico *

Detector Conductimtrico *

Detector Potenciomtrico

Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroqumicos para asegurarse anlisis reproducicbles: o + #

Chequear que esten conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registrador (integrador. *

Usar bombas reciprocantes de doble piston *

Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil en el detector. *

Operar con el voltaje adecuado *

Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la efiencia que nos indique la necesidad de reacondicionar los electrodos. *

Tener electrodos de referencias extras en solucin 3M de NaOH y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 2 veces a la semana. *

Desconectar el detector electroqumico cuando este llimpiando las columnas. * Utilizar agua, buffers y solventes orgnicos de alta pureza.Derivatizacin

Existen dos tendencias : o

Pre-Columna * PostColumnaAnalisis Cualitativo y Cuantitativo

Problemas ms comunes encontrados en HPLC

Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus posibles causas posibles, y cmo solucionarlos. o

Presin Alta +

Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o Guarda Columna por partculas. *

Solucin: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del detector. Si sto no funciona reemplaze el fritado a la entrada de la columna. Si la presin sigue alta reemplaze la columna. *

Solucin a largo plazo: Asegurese que todas las fases mviles se filtren apropiamente antes que entren a la bomba de HPLC . Tambin filtre todas las muestras antes de inyectarlas. o

Prdida de la Resolucin +

Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC del Guarda Columna por partculas. *

Solucin: vea la seccin de Presin Alta *

Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles en el sistema de HPLC. o

Picos Hendidos +

Posible causa : Obstruccin de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por partculas. *

Solucin: Marcha atrs columna roja con presin baja est al lado de abre. Si es necesario reemplaze el fritado de la entrada o la columna. *

Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles en el sistema de HPLC. o

Variacin en los Tiempos de Retencin +

Posible causa : Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase mvil. *

Solucin: Bomba primera y est fases seguras tan mviles es propiamente [degassed] *

Solucin a larga plazo: Asegurese fase tan mvil est propiamente y adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificacin electrnica en lnea asegura esa cadencia del flujo no es demasiado alto para evita [degassing] completo. o

Variaciones de la Lnea Base +

Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una mala desgasificacin de los solventes de la fase mvil. *

Solucin: Asegurese que todas las fases mviles estn debidamente desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presin a toma de corriente del detector. o

Lnea Base con mucho Ruido +

Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba. *

Solucin: Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC . Use Solventes desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase movil del sistema. o

Picos Falsos (Detectores Electroqumicos y de Fluorescencia) +

Posible causa: Oxgeno Disuelto *

Solucin: Desgasificar adecuadamente las fases mviles para reducir la concentracin de oxgeno disuelto. *

Solucin a largo plazo: Agregar un sistema de filtracin al vaco en lnea. Peridicamente chequear el nivel de oxgeno disuelto. o

Baja Ninguna Presin +

Posible causa: Trabajar con bombas, sellos pistones expuestos por mucho tiempo a partculas en suspencin en la fase mvil. * Solucin: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.Recomendaciones para adquirir un sistema de HPLC

Estos son algunos consejos para adquirir un sistema de HPLC ajustado a sus necesidades: o

Cuntas muestras y tipos de ensayos *

La facilidad para reemplazar los sellos de las bombas (mantenimiento) *

La exactitudad y presicin del sistema de bombas *

El Sistema de Gradiente. La suavidad y reproducibilidad de la mezcla *

Que tipo de servicio ofrecen puede ofrece la casa vendedora *

Suministro de software y compatibilidades