MICROBIOLOGIA APLICADA Manual de Laboratorio

PRACTICA Nm. 6 TINCION DE FLAGELOS BACTERIANOS POR EL METODO DE LEIFSON I. OBJETIVO Demostrar la presencia de flagelos mediante tincin y observar la movilidad que presentan algunas bacterias diferencindola del movimiento browniano.

II. INTRODUCCION Muchos microorganismos son mviles, desplazndose de un lugar a otro para obtener nutrientes, crecer y reproducirse. Muchas de las bacterias poseen esta capacidad, debido a la presencia de unos rganos de locomocin denominados flagelos. Estos son filamentos simples qumicamente compuestos de protena conocida como flagelina. Tienen su origen en el protoplasma de la clula bacteriana y su espesor es alrededor de 0.01 micrones. El nmero y disposicin de los flagelos es variable en las diferentes bacterias, pero generalmente es constante para cada especie. Algunas tienen solamente un flagelo, otras dos o ms y pueden ser polares o pertricos - alrededor del cuerpo de la clula -. (Fig. 6.1) Las bacterias flageladas cuando estn suspendidas en una gota de lquido son activamente mviles. Sin embargo, es muy importante distinguir entre el movimiento real debido a los impulsos originados por los flagelos permitiendo el desplazamiento de la bacteria dentro del campo microscpico y el llamado movimiento browniano que se produce siempre que se suspenden en un lquido, partculas pequeas y que presentan las bacterias inmviles debido al bombardeo molecular sobre la superficie de la clula. Los flagelos pueden ser teidos, pero debido a su dimetro tan pequeo, se requieren tcnicas especiales. Los flagelos de organismos eucariticos, como algas y protozoarios, son mucho ms gruesos y pueden observarse en preparaciones en fresco con tinciones simples.

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III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS Suspensin bacteriana. Solucin salina agua destilada estril. 1 Portaobjetos excavado. 1 Portaobjetos normal perfectamente limpio en mezcla crmica y desengrasado. 1 Cubreobjetos perfectamente limpio y desengrasado. Pipetas Pasteur estril. Gradilla. Asa bacteriolgica. Lpiz graso. Mechero Bunsen. Cerillos encendedor. Aplicadores. Vaselina. Papel absorbente. Colorante de Leifson. Mezcla crmica. Microscopio. Aceite de inmersin.

IV. TECNICA A. OBSERVACION AL FRESCO EN GOTA PENDIENTE 1. Depositar en condiciones aspticas tres o cuatro asadas de la suspensin bacteriana en el centro del cubreobjetos limpio y libre de grasa. Tambin se puede usar una pipeta Pasteur estril para este fin, procurando que la gota quede lo suficientemente grande para facilitar la observacin. NOTA: Los cubreobjetos se pueden limpiar frotndolos cuidadosamente entre los dedos con agua y jabn y enjuagndolos en agua caliente. Luego sumergirlos en alcohol y secarlos con un trapo limpio sin pelusa. Finalmente, el calentamiento suave a la flama quitar los ltimos restos de grasa. 2. Cuando se trata de un cultivo slido, colocar una gota de solucin salina agua destilada estril en el centro del cubreobjetos limpio y emulsionar una pequea

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cantidad del material. Se puede hacer una pequea marca cerca de la gota en el cubreobjetos para facilitar la observacin. 3. Poner un poco de vaselina alrededor de la concavidad del portaobjetos utilizando para ello un aplicador. 4. Invertir y colocar el portaobjetos sobre el cubreobjetos que contiene la gota de la suspensin bacteriana cuidando que quede bien centrado para que la excavacin quede directamente encima de la gota. La gota no debe tocar el portaobjetos. 5. Presionar suavemente portaobjetos. para que se adhieran perfectamente cubre y

6. Invertir rpidamente. La gota que contiene el material a examinar pende del cubreobjetos sobre la excavacin del portaobjetos. (Fig. 6.2) 7. Observar al microscopio con el objetivo seco dbil y enseguida con el seco fuerte. Al localizar a marca hecha en el cubreobjetos, el borde de la gota se l encontrar fcilmente. 8. Determinar si hay movilidad real - desplazamiento de las clulas de un lado a otro dentro del campo microscpico -, movimiento browniano. 9. Si se desea observar clulas individuales, colocar una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos y observar con objetivo de inmersin.

B. TINCION DE FLAGELOS 1. Hacer un crculo en un portaobjetos perfectamente limpio para lo cual previamente fue sumergido en mezcla crmica durante 24 horas, lavado posteriormente con agua destilada, enjuagado con alcohol y secado con un trozo de tela limpio. Desengrasarlo pasando por una flama varias veces. 2. Colocar dentro del crculo con pipeta Pasteur, una gotita de la suspensin bacteriana e inclinar el portaobjetos de uno y otro lado para extender la muestra. 3. Fijar la preparacin al aire ya que si esta operacin se hace usando la flama del mechero se pueden destruir los flagelos.

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4. Humedecer la preparacin con el Colorante de Leifson y dejarla en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso o en la incubadora en tiempo fro. 5. Lavar con agua corriente. 6. Secar y observar con objetivo de inmersin. INTERPRETACION: Los flagelos se tien bien de color rojo en aquellas bacterias que no presentan flagelos extremadamente delicados. 7. Dibujar las observaciones hechas:

Observacin A.

Observacin B.

V. CUESTIONARIO 1. Dar la clasificacin de las bacterias de acuerdo al nmero y localizacin de sus flagelos. 2. Dibujar la estructura de un flagelo bacteriano. 3. Consultar otro mtodo de tincin para flagelos. 4. Diferenciar los flagelos bacterianos de los de clulas Eucariticas. 5. De qu otra manera se puede demostrar la movilidad de una bacteria?

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