KATA PENGANTAR Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa dengan terselesainya penyusunan Buku Petunjuk Praktikum

Blok 3. Blok Sel & Molekul merupakan blok ketiga dari keseluruhan blok belajar dalam Kurikulum Pendidikan Dokter di Fakultas Kedokteran Universitas Jember.. Pada blok ini peserta didik belajar menyiapkan diri sebagai seorang mahasiswa kedokteran dan calon dokter dengan membangun suatu pemahaman yang komprehensif tentang sel dan molekul sebagai dasar ilmu kedokteran, untuk menunjang karirnya di masa depan. Dalam blok 3, terdapat 6 kegiatan praktikum yang menunjang materi tutorial dimana diskusi tutorial sebagai jantung dari seluruh kegiatan. Materi praktikum blok 3 yaitu. Buku petunjuk praktikum disusun untuk memudahkan dan menunjang kegiatan praktikum mahasiswa supaya tujuan pembelajaran tercapai. Terima kasih kepada narasumber, sejawat, dan seluruh pihak yang terlibat dalam penyusunan buku petunjuk praktikum ini. Semoga buku ini dapat digunakan sesuai tujuan yang diharapkan. Kritik dan saran untuk perbaikan sangat diharapkan demi kesempurnaan buku ini.

Jember, Nopember 2012

Tim Penyusun

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

ii

DAFTAR ISI

halaman HALAMAN JUDUL ....................................................................................................... KATA PENGANTAR .................................................................................................... i ii

DAFTAR ISI ................................................................................................................... iii 1. Praktikum 1: Histologi Jaringan Ikat & Epitel ............................................................ 2. Praktikum 2: Farmakokinetik ...................................................................................... 3. Praktikum 3: Jejas Sel & Adaptasi .............................................................................. 1 6 8

4. Praktikum 4: Pengaruh PH Dan Suhu Terhadap Reaksi Enzimatik ............................ 18 5. Praktikum 5: Isolasi DNA............................................................................................ 23 6. Praktikum 6: Statistik Uji Komparatif Tidak Berpasangan ......................................... 28

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

iii

PRAKTIKUM 1 HISTOLOGI JARINGAN IKAT & EPITEL

I.

Judul Blok Blok 3 (Sel & Molekul)

II. Topik Praktikum Jaringan ikat & epitel

III. Laboratorium Pelaksana Laboratorium Histologi

IV. Tujuan Belajar Setelah menyelesaikan proses pembelajaran ini, mahasiswa akan mampu: a. b. Menjelaskan perbedaan secara histologi jenis jaringan ikat & epithel Menunjukkan ciri-ciri histologi macam-macam jaringan ikat dan epithel pada preparat praktikum c. d. Menyebutkan macam-macam sel yang terdapat pada jaringan ikat Menunjukkan ciri-ciri histologi sel-sel yang terdapat pada jaringan ikat pada preparat praktikum

V. Alat dan Bahan 1. Slide demo 2. preparat praktikum 3. mikroskop cahaya

VI. Prosedur Tahap Pendahuluan Kegiatan Pengajar 1. Membuka pertemuan 2. Menjelaskan cakupan materi 3. Menjelaskan kompetensiKegiatan Mahasiswa Memperhatikan Media & Alat Belajar Pengeras suara

kompetensi TIK Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 1

Penyajian

1. Menyebutkan jenis jaringan ikat & epithel 2. Menjelaskan ciri histologi

Brainstrorming materi yang pernah didapatkan sebelumnya Aktif

Slide Demo Preparat praktikum

jenis jaringan ikat dan epithel 3. Menjelaskan macam-macam sel pada jaringan ikat 4. Menjelaskan histologi sel-sel ciri-ciri

Mendengarkan

yang Mencatat

terdapat pada jaringan ikat kembali Mendengarkan belum Mencatat Menjawab pertanyaan praktikum Slide Demo Preparat praktikum

Penutup

1. Menjelaskan materi yang

dimengerti mahasiswa 2. Merangkum

yang telah diberikan 3. Menunjuk mahasiswa diberi beberapa secara acak yang

pertanyaan

berkaitan dengan materi 4. Menutup pertemuan

VII. Metode 1. Ceramah. 2. Pengamatan. 3. Diskusi.

VIII. Dasar Teori JARINGAN EPITEL Epitel Epitel selapis pipih capsula bowman pada ginjal [52] Epitel selapis kubis TC I, TC II, ductus colligentes pada ginjal [52] Epitel selapis silindris dengan striated border usus halus (intestinum) [20,21] 2

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

kinocilia Epitel berlapis piph tanpa tanduk bertanduk

tuba falopii [62] vagina, oesophagus [58, 12-14] kulit tebal & tipis [82-86]

Epitel berlapis kubis kelenjar keringat pars ekskretoris [82,85] Epitel berlapis silindris Epitel berderet silindris dengan stereocilia Kinocilia epididimis [49] trachea, cavum nasi [36, 38]

Epitel peralihan vesica urinaria [55]

Berdasarkan Cara Membentuk Sekret Kelenjar merokrin lingualis [29] Kelenjar apokrin Kelenjar holokrin kelj keringat axila [85], kelj seruminous kel sebacea kulit [82, 85] kelj pancreas [30], parotis [27], submaxilaris [28], sub

Berdasarkan Jenis Sekret Kelenjar serous Kelenjar mucous pancreas [30], parotis [27] kelj weber (lidah) [7]

Kelenjar seromucous kelj submaxilaris [28], sub lngualis 29]

Berdasarkan Cara Mengeluarkan Sekret Kelenjar eksokrin Kelenjar endokrin thyroid [74], hypofise [72], adrenal [76], parathyroid [75], pulau langerhans [30] Sel Sel payung Sel raket Sel basal [55]

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

BAS (BAHAN ANTAR SEL) DAN JARINGAN IKAT BASA (Bahan Antar Sel Amorf) Cairan jaringan jaringan ikat umum

Bahan dasar setengah padat jaringan ikat embryonal [3, 66, 71] Bahan dasar padat lunak Bahan dasar padat keras jaringan tulang rawan [91-93] jaringan tulang muda & dewasa [90, 88]

BASB (Bahan Antar Sel Berbentuk) Sabut kolagen dalam jaringan ikat kendor [82-85] jaringan ikat teratur tendon, ligamentum nuchae [96, 95] jaringan ikat tak teratur Pada pewarnaan HE: merah Pada pewarnaan MA: biru Sabut elastis dinding pembuluh darah [43, 44] tulang rawan elastis [92] ligamentum nuchae [95] Pada pewarnaan VvG: hitam, bergelombang Sabut retikuler kelenjar getah bening [97] Pada pewarnaan Ag impregnasi: coklat kehitaman, halus bercabang

JARINGAN Jaringan ikat embrional Jaringan ikat padat teratur tendon, ligamentum nuchae [96, 95]

Jaringan ikat padat tidak teratur pada dermis kulit [82-85] Jumlah sabut banyak, arah tidak teratur

Jaringan ikat kendor

pada lamina propria, subcutis [12-14]

Sabut kolagen sedikit, arah tak beraturan Sel fibrosit/fibroblast + Jaringan limforetikuler Jaringan lemak kelenjar getah bening [97] payudara, subcutis [70, 82-85] 4

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

Jaringan berpigmen Jaringan tulang rawan Jaringan tulang muda Jaringan tulang dewasa

mata chondrosit [91-93] trabekel [90] sistem havers [88]

Sediaan Sel Stellate fibroblast Fibroblast Fibrosit Makrofag Mast cell (=basophil jaringan) Sel plasma Lmfosit T [97] Tissue eosinophyl Sel tendon Winged cell potongan membujur potongan melintang Tendon [96] Ligamentum nuchae [95]

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

PRAKTIKUM 2 FARMAKOKINETIK

I.

Judul Blok Blok 3 (Sel & Molekul).

II. Topik Praktikum Farmakokinetik.

III. Laboratorium Pelaksana Laboratorium Farmakologi.

IV. Tujuan Belajar 1. Menjelaskan perjalanan obat dari mulai absorbsi, distribusi, metabolisme, dan ekskresi 2. Menjelaskan hubungan waktu dengan proses absorbsi, distribusi, metabolisme, dan ekskresi 3. Membuat dan melakukan inform concent untuk praktikum menggunakan manusia sebagai subyek

V. Alat dan Bahan 1) Probandus (subyek yang diamati) 2) Obat: rifampisin atau eritromisin kaplet 3) Kantong plastik ukuran 1 kg 20 buah 4) Tabung reaksi 10 buah 5) Spuit 5 cc /pipet 6) Kolorimeter 7) Lembar inform concent

VI. Pengantar Farmakokinetik adalah ilmu yang mempelajari perjalanan obat mulai dari absorbsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi.

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

Absorbsi obat dapat melalui berbagai cara tergantung pada jalur pemberiannya. Obat dapat diberikan melaluo oral, suntikan intravena, suntikan intramuskular atau subkutan, serta jalur lain (inhalasi, rektal, sublingual, topikal). Proses absorbsi dipengaruhi banyak faktor, namun yang paling berperan adalah kelarutan obat dalam lemak. Obat dapat melewati membran sel dengan cara difusi pasif atau transporta aktif. Bioavailabilitas adalah jumlah obat yang diabsorbsi setelah pemberian melalui jalur tertentu dibandingkan dengan jumlah obat yang diabsorbsi jika diberikan secara intravena (iv). Dengan kata lain bioavailabilitas adalah proporsi obat yang diberikan yang mencapai sirkulasi sistemik. Distribusi obat ke seluruh tubuh terjadi saat obat mencapai sirkulasi. Selanjutnya obat akan masuk ke jaringan untuk bekerja. Waktu paruh (t) adalah waktu yang dibutuhkan sehingga konsentrasi obat dalam darah berkuang setengah dari jumlah awal. Volume distribusi (VD) adalah volume yang menunjukkan distribusi obat. Bersihan (Clearance) adalah volume darah atau plasma yang dibersihkan dari obat dalam satuan waktu. Hati merupakan organ utama untuk metabolisme obat. Metabolisme obat mempunyai dua efek penting yaitu
a. obat menjadi lebih hidrofilik, hal ini mmepercepat eksresi melalui ginjal b. obat menjadi kurang aktif daripada obat asalnya, namun sebagian obat justru menjadi lebih aktif (prodrug)

Ekskresi ginjal memegang tanggung jawab utama untuk eliminasi sebagian besar obat. Obat terdapat dalam filtrat glomerulus, tetapi bila larut lemak obat ini dapat direabsorbsi dalam tubulus ginjal melalui difusi pasif. Metabolisme obat sering menghasilkan senyawa yang kurang larut lemak sehingga membantu ekskresi ginjal. Ekskresi bilier dilakukan bila obat terkonsentrasi dalam empedu sehingga diekskresikan ke dalam usus halus.

VII. Tugas 1) Tetapkan pemimpin kelompok sebelum memulai bekerja 2) Pemimpin kelompok membagikan tugas dalam kelompok 3) Tetapkan probandus atau subyek penelitian (bisa salah satu dari anggota kelompok) 4) Buatlah inform concent untuk probandus. 5) Selesai makan siang probandus mengosongkan urine dan ditampung dalam kantong plastik, setelah itu minum obat yang sudah ditetapkan

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

6) Selanjutnya setiap kali mengosongkan urine probandus menampung dalam kantong plastik dan dicatat waktunya. 7) Pindahkan masing-masing urine tampung ke tabung reaksi menggunakan spuit atau pipet sebanyak 3 cc. 8) Lakukan pengamatan warna menggunakan kolorimetri 9) Laporkan hasil diskusi kelompok dengan sistematika sebagai berikut: a) Judul b) Pendahuluan c) Metode d) Hasil pengamatan e) Pembahasan f) Kesimpulan dan Saran

g) Kepustakaan h) Lampiran (foto-foto)

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

PRAKTIKUM 3 JEJAS SEL & ADAPTASI

I.

Judul Blok Blok 3 (Sel & Molekul)

II. Topik Praktikum Jejas sel & adaptasi

III. Laboratorium Pelaksana Laboratorium Patologi Anatomi

IV. Tujuan Belajar Mahasiswa dapat menjelaskan gambaran makros & mikroskopis jejas, adaptasi, & kematian sel yang terdapat pada sediaan: pielonefritis kronik chorio carsinoma mola hidatidosa hiperplasia endometrium BPH hidrosalfing polip servix

V. Alat dan Bahan 1. Slide demo 2. preparat praktikum 3. mikroskop cahaya

VI. Prosedur Pengamatan preparat

VII. Metode 1. Ceramah. Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 9

2. Pengamatan. 3. Diskusi.

VIII. Tugas PIELONEFRITIS KRONIK Makroskopik : Ginjal mengalami kontraksi dengan pembentukan jaringan parut Besarnya tidak teratur Perlekatan kapsul

Mikroskopik : Degenerasi hyaline Epitel tubuli kontorti bengkak, batas sel tidak jelas, sitoplasma eosinofilik dan granular Lumen tubuli sempit Epitel rupture Hyaline bodies dalam lumen tubuli (silinder albumin)

Pembesaran Obyektif 10 x :

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

10

Pembesaran Obyektif 40 x :

CHORIO CARSINOMA Makroskopik : Tumor lunak putih kekuningan pada dinding uterus Didapatkan daerah nekrosis, perdarahan dan peradangan

Mikroskopik : Degenerasi mukoid Musin terdiri dari glikoprotein dan asam asetat, disekresi epitel Infiltrasi sel trofoblas yang proliferatif dan anaplasi ke miometrium Sel-sel trofoblas anaplasi, bengkak, sitoplasma berisi musin Hemoragik karena menginvasi vaskular Pembesaran Obyektif 10 x :

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

11

Pembesaran Obyektif 40 x :

MOLA HYDATIDOSA Makroskopik : Uterus lebih besar dari umur kehamilan normal Terdapat gelembung-gelembung mola, bentukan buah anggur Pada umumnya tidak ada janin

Mikroskopik : Stroma vili korealis renggang, avaskular Degenerasi hidrofik Gangguan membran sel vakuola intrasel Proliferasi trofoblas

Pembesaran Obyektif 10 x :

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

12

Pembesaran Obyektif 40 x :

HIPERPLASIA ENDOMETRIUM Mikroskopik: Kelenjar endometrium bertambah banyak karena pengaruh hormon estrogen Epitel kelenjar normal sampai atypic Kelenjar lebih banyak, berkelok-kelok dan berdesakan Lumen kelenjar melebar dan tidak sama besar Proliferasi struma sehingga tampak padat

Pembesaran Obyektif 10 x :

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

13

Pembesaran Obyektif 40 x :

BENIGN PROSTAT HIPERPLASIA Makroskopik : Ukuran prostate membesar Nodul pada lobus medius berwarna putih kekuningan atau putih abu-abu Pseudokapsul

Mikroskopik : Hyperplasia nodular Proses fisiologis Pengaruh dihidro testosterone Kelenjar hiperplasi Sel epitel kuboid, sitoplasma jernih, membentuk papil-papil Sel basal normal Proliferasi sel otot dan fibroblast pada struma Terdapat corpora amilacea (degenerasi hyaline), atau secret pada lumen

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

14

Pembesaran Obyektif 10 x :

Pembesaran Obyektif 40 x :

HIDROSALFING Makroskopik : Ukuran tuba fallopi membengkak Dinding tipis Lumen berisi cairan serous

Mikroskopik : Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 15

 Atrofi tekan Lumen tuba fallopii terisi eksudat, jaringan nekrotik, sel lekosit Epitel tuba atrofi Sel epitel selapis silindris berubah menjadi sel epitel pipih

Pembesaran Obyektif 10 x :

Pembesaran Obyektif 40 x :

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

16

POLIP SERVIKS Makroskopik : Massa bertangkai, berasal dari endoserviks Permukaan licin Mikroskopik: Metaplasia epitel Kelainan pada endoserviks Metaplasia epitel kolumnar menjadi epitel squamosa Tangkai polip +/Pembesaran Obyektif 10 x :

Pembesaran Obyektif 40 x :

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

17

PRAKTIKUM 4 PENGARUH PH DAN SUHU TERHADAP REAKSI ENZIMATIK

I.

Judul Blok Blok 3 (Sel & Molekul)

II. Topik Praktikum Pengaruh pH dan suhu terhadap reaksi enzimatik

III. Laboratorium Pelaksana Laboratorium Biokimia

IV. Tujuan Belajar 1. Mahasiswa dapat menjelaskan perjalanan reaksi enzimatis (progess curve) 2. Mahasiswa dapat mengetahui perbedaan antara kecepatan sesaat, keceaptan awal dan kecepatan rata-rata reaksi enzimatik 3. Mahasiswa dapat mengetahui pengaruh pH dan suhu terhadap reaksi enzimtis. 4. Mahasiswa dapat menjelaskan pH optimum dan suhu optimum

V. Alat dan Bahan Reagen yang digunakan pada praktikum ini, adalah: Larutan enzim amilase Larutan NaCl 0,9 % Larutan amilum 1 % Larutan penyangga, masing-masing kelompok dengan satu macam pH ( 4; 5; 6,5; 8 dan 10 ) Larutan KI-KIO3 : KI KIO3 NaOH 1 N Aqua ad 5,0 g 0,357 g 2,0 ml 1L

Larutan HCL 0,05 N Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 18

VI. Prosedur 1. Prosedur Pengaruh pH terhadap Reaksi Enzimatik Sediakan 5 tabung reaksi, berilah tanda masing-masing 0, 5, 10, 15, dan 20. Masukkan ke dalam sebuah labu erlenmeyer 15 ml larutan penyangga dengan berbagai pH yang telah ditentukan, 3 ml larutan amilum dan 6 ml larutan NaCl 0,9 %. Kocoklah agar semua larutan tercampur. Isilah masing-masing tabung reaksi yang telah diberi tanda dengan 1 ml larutan HCl 0,05 N. Ambillah 1 ml cairan dari labu erlenmeyer dan masukkan ke dalam tabung reaksi dengan tanda 0, kocok sebentar. Tambahkan 1 ml larutan enzim ke dalam labu erlenmeyer dan campur dengan cepat. Tepat pada saat penambahan enzim ini catatlah waktunya (jalankan stopwatch). Mendekati 5 menit setelah enzim dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer, pipetlah 1 ml larutan dari labu erlenmeyer. Masukkan larutan dalam pipet tersebut ke dalam tabung reaksi bertanda 5 tepat pada saat penunjuk waktu menunjukkan 5 menit. Kocok sebentar. Demikian seterusnya : tepat setiap 5 menit kemudian masukkan 1 ml larutan dari labu erlenmeyer berturut-turut ke dalam tabung-tabung reaksi dengan tanda 10, 15, dan 20 seperti di atas. Kocok sebentar. Setelah semua selesai, ke dalam tiap tabung reaksi tambahkan 1 ml larutan KI-KIO3, campur baik-baik sampai merata, tunggu 5 10 menit. Tentukan intensitas warna yang terjadi dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm. Jumlah substrat yang dicerna pada setiap waktu yang telah ditentukan dapat dihitung dengan rumus: (Absorbance) waktu t % Substart yang dicerna = 100% -------------------------- X 100% (Absorbance) waktu to

Catat hasil yang didapat, kemudian berdasarkan data tersebut buatlah gafik hubungan antara % subtrat yang dicerna ( ordinat ) dengan waktu ( absis ).

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

19

2 Prosedur Pengaruh Suhu Terhadap Reaksi Enzimatik Isilah labu erlenmeyer dengan: 15 ml larutan penyangga pH 6,5; 3 ml larutan amilum, 6 ml larutan NaCl 0,9%. Campur baik-baik, lalu letakkan pada suhu yang telah ditentukan selama kira-kira 30 menit. Sediakan 5 tabung reaksi, beri tanda 0, 5, 15 dan 20. Isilah masing-masing dengan 10 ml larutan HCl 0,05 N. Ambillah 1 ml larutan dari erlenmeyer, masukkan ke dalam tabung reaksi tanda 0.Lalu masukkan 1 ml larutan enzim ke dalam erlenmeyer. Campur dengan cepat dan jalankan pencatat waktu. Setiap 5 menit setelah ini, masukkan 1 ml, larutan dari erlenmeyer berturut-turt ke dalam tabung 5, 10 15 dan 20. Setelah semua selesai, tambahkan 1 ml larutan KI-KO3 ke dalam tiap-tiap tabung reaksi, campur baik-baik dan tunggu 5-10 menit. Tentukan intensitas warna yang timbul dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm. Buat gafik yang menunjukkan hubungan antara % substrat tercerna (ordinat) dengan waktu (absis) pada bermacam suhu di atas.

Prinsip Praktikum Enzim sebagai katalisator ikut bereaksi dan mempercepat reaksi kimia, tetapi pada akhir reaksi akan didapatkan kembali dalam bentuk semula, sehingga dapat mengkatalisis reaksi kimia berikutnya. Kenyataan ini mengakibatkan tubuh tidak perlu memproduksi enzim dalam jumlah yang besar (kadar enzim di dalam tubuh kecil), sehingga pengukuran enzim tidak bisa dilakukan secara langsung. Pengukuran jumlah enzim dilakukan berdasarkan kecepatan reaksi yang dikatalisisnya. Pengukuran tersebut dilakukan dengan cara :(1) dibandingkan dengan enzim murni yang diketahui kadarnya (satuan: g); (2) berdasarkan jumlah substrat yang bereaksi atau produk yang terbentuk per satuan waktu (Satuan: unit).

Satu internasional unit merupakan jumlah enzim yang mengkatalisis pembentukan 1 mol produk per menit pada kondisi tertentu. Untuk mengetahui pengaruh pH pada reaksi enzimatik, dilakukan pengamatan reaksi antara amilum sebagai substrat dan amilase sebagai enzim yang dilakukan pada beberapa pH yang berbeda. Faktor-faktor lain yang dapat mempengaruhi reaksi enzimatik dibuat sama. Amilum merupakan suatu polisakarida yang berwarna biru bila bereaksi dengan yodium. Enzim amilase mencerna amilum secara bertahap, menghasilkan produk diantaranya suatu Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 20

disakarida yang tidak berwarna bila direaksikan dengan yodium. Perubahan warna yang terjadi (berkurangnya warna biru) menunjukkan sebagian substrat telah dicerna oleh enzim amilase. Perubahan warna tersebut dapat diukur menggunakan alat spektrofotometer. Untuk mengetahui pengaruh suhu terhadap reaksi enzimatik dilakukan percobaan seperti diatas menggunakan pH 6,5 dan dilakukan pada beberapa macam suhu yang berbeda yaitu, 0, 27, 40 dan 70o Celsius sedangkan faktor-faktor lain yang berpengaruh pada reaksi enzimatik dibuat sama. Dasar Teori Untuk mempercepat reaksi kimia dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu (1) Menaikkan suhu; (2) menambahkan katalisator. Manusia mempunyai suhu yang cenderung konstant (normal), karena itu untuk mempercepat reaksi kimia tergantung pada cara ke-dua. Katalisator mempercepat reaksi kimia dengan cara menurunkan energi aktivasi. Energi aktivasi adalah jumlah energi yang diperlukan untuk membawa semua molekul dalam satu mole suatu bahan pada suatu suhu tertentu dari keadaan awal menuju keadaan transisi. Pada keadaan transisi kemungkinan terbentuk dan terputusnya ikatan kimia sangat besar. Secara umum katalisator mempunyai sifat-sifat sebagai berikut: 1. Ikut bereaksi 2. Mempercepat reaksi dan tercapainya keseimbangan 3. Tidak merubah Keq dan perubahan energi bebas (G). 4. Tidak mempunyi hubungan stoikiometrik 5. Pada akhir reaksi didapat kembali dalam bentuk semula. Enzim merupakan protein yang bertindak sebagai biokatalisator. Reaksi enzimatik dipengaruhi oleh pH, suhu, kadar substrat, kadar enzim, aktivator dan inhibitor. Enzim merupakan protrein jadi peka terhadap perubahan pH. Enzim hanya aktif dalam batas-batas pH tertentu, pH dapat mempengaruhi muatan enzim maupun subtrat. Pada pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah, enzim akan mengalami denaturasi. Pada umumnya reaksi kimia berjalan lebih cepat pada suhu yang lebih tinggi, tetapi pada suhu yang tinggi enzim dapat mengalami denaturasi ( pada suhu 70C, sebagian besar enzim menjadi inaktif). Kenaikan suhu akan menyebabkan energi kinetik dari molekulmolekul yang bereaksi menjadi semakin besar, sehingga kecepatan suatu reaksi kimia Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 21

menjadi bertambah besar. Suhu yang tinggi juga dapat menyebabkan perubahan stuktur molekul protein. Enzim merupakan suatu protein yang pada suhu tertentu dapat mengalami denaturasi.

VII. Tugas Pendahuluan 1. Buatlah bagan dari percobaan yang akan saudara lakukan secara singkat/jelas. 2. Sebutkan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas suatu reaksi enzimatik ? 3. Jelaskan perbedaan antara kecepatan sesaat, kecepatan awal (initial velocity) dan kecepatan rata-rata suatu reaksi enzimatik? 4. Apa yang dimaksud dengan pH optimum pada reaksi enzimatik? 5. Apa fungsi larutan NaCl, HCl, HGCl2 dan KI-KIO3 pada percobaan di atas ?

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

22

PRAKTIKUM 5 ISOLASI DNA

I.

Judul Blok

Blok 3 (Sel & Molekul)

II. Topik Praktikum Sel & molekul

III. Laboratorium Pelaksana Laboratorium Biomol

IV. Tujuan Belajar Mahasiswa dapat menjelaskan prosedur isolasi DNA genom Mahasiswa dapat menjelaskan prosedur isolasi DNA plasmid Mahasiswa dapat menjelaskan fungsi masing-masing reagen & tahapan dalam proses isolasi DNA genom & DNA plasmid

V. Alat dan Bahan ISOLASI DNA GENOM Bahan: Tanaman sampel, alkohol 70%, alkohol 96 %, akuades, CTAB (cetyltrimethylammonium bromide), -merkaptol, KIA (kloroform: isoamilalkohol= 24:1), isopropanol, bufer TE, SDS,RNA-se RNAse, amonium asetat. Alat: Tabung reaksi, beaker glass, spatula, mikropipet beserta tipnya, tabung mikrosentrifuga 1,5 ml, vortex, waterbath, mikrosentrifuga, LAF, freezer, dan sarung tangan.

ISOLASI DNA PLASMID A. 1. 2. 3. 4. BAHAN Solution I (150mM glukosa, 25mM Tris C1 (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0)) Solution II (0,2 n NaOH, 1% SDS) Solution III (60 ml 5M potassium acetate, 11,5 ml Glacial acetic acid, 28,5 ml H20) PCI/phenol : chloroform Isoamylalcohol (24:1) 23

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

5. 6. 7.

Buffer TE Ethanol pa NaAc

B. 1. 2. 3. 4.

ALAT Mini sentrifuge berpendingin Micropipet Vortex Pengering DNA

VI. Prosedur A. CARA KERJA ISOLASI DNA GENOM 1. 2 gram sampel gerus dengan N2 2. Pindahkan serbuk sampel halus dalam kondisi beku ke tabung sentrifugasi 3. add 8 ml buffer ekstraksi, 10 l betamercopto, 400 l 20% SDS 4. Vortex sampai homogen, inkubasi pada suhu 65C for 10min 5. Tambahkan 2,6 ml 5 M potasium acetat, mix dengan membolak-balik 6. Inkubasi on ice 20 min 7. Sentrifugasi 10.000 rpm, 20 min, 40C 8. Take supernantan + 5 ml 1sopropanol, mix gentle 9. Jika DNA tampak melayang-layang, keringkan, larutkan dengan 600 l TE buffer 10. Bila tidak inkubasikan suhu -20C, for 30 min 11. Sentrifugasi 10.000 rpm, 10 min 4C 12. Take pellet, keringkan +600 l TE buffer PURIFIKASI DNA 13. +5 l RNA-se (10 mg/ml), inkubasi suhu 37C, for 15 min 14. +PCI 700 l, vortex, 15. Sentrifugasi 10.000 rpm, 20 min, 40C 16. Kloroform equal volume, kemudian sentrifugasi seperti PCI 17. Pindahkan larutan bagian atas + 0,8 vol isoprapanol dan 0,2 vol 3M sodium asetat 18. Campur, inkubasi suhu -80C, for 15 h 19. Sentrifugasi 10.000 rpm, 20 min, 40C 20. Pellet cuci dengan 70% ethanol, kemudian disentrifugasi lagi. Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 24

21. Pellet DNA dikeringkan dengan vacum + 200 l TE buffer 22. Estimasi kandungan DNA dengan spektrofotometer.

CARA KERJA ISOLASI DNA PLASMID 1. Transfer single koloni bakteri pada media LB 2 ml yang mengandung antibiotik dan diinkubasi selama satu malam pada suhu 37C di dalam penggojok dengan kecepatan 120 rpm 2. Masukkan 1,5 ml kultur bakteri pada ependolf. Sentrifuge pada 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4C, kemudian supernatan dibuang 3. Tambahkan 100 l solution I, padfa pellet bakteri dan di vortex sampai bakteri benarbenar tersuspensi 4. Tambahkan 200 l fresh solution II, kemudian dibolak-balik 5c (swirling) dan jangan di vortex. Inkubasi selama 5 menit sampai bening (menunjukkan lisis terjadi) 5. Tambahkan 150 l solution III, lakukan swirling dan letakkan dalam es selama 5 menit 6. Sentrifuge 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4C. Transfer supernatan pada tube sentrifuge baru. 7. Selanjutnya ukur volume supernatan dan tambahkan PCI equal volume, lakukan vortex dan sentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm selam 10 menit 8. Ambil supernatan (lap. Atas) lalu tambahkan ethanol pa dan 3M NaAc, ditambahkan masing-masing sebanyak 2,5 dan 0,1 dari volume supernatan. Selanjutnya dipresipitasi pada suhu -20C selama satu jam 9. Kemudian di sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm 10 menit pada suhu 4C 10. Pellet dicuci dengan 1ml 70% ethanol dan disentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm 5 menit pada suhu 4C 11. Pellet dikeringkan dan diresuspensi dalam 20 l buffer TE dan disimpan pada suhu 4C dan disimpan sampai siap digunakan

VII. DASAR TEORI Komponen utama kromosom pada eukariota adalah DNA dan protein histon. Protein histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat asam dari DNA. Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan DNA. DNA yang terdapat di nukleus disebut DNA kromosomal, sedangkan DNA lain yang terdapat di dalam sel dan di luar nukleus yaitu

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

25

DNA mitokondria, DNA kloroplas, dan DNA plasmid, ketiganya disebut DNA ekstrakromomal. Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel, yaitu pada motokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA, diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti, yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sela yang lain. Pada saat melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang.

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Ekstraksi DNA Proses pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria maupun organel lain dengan cara diekstraksi atau dilisiskan biasanya dilakukan dengan homogenasi dengan penambahan bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA rusak. Pada kondisi sampel tertentu, untuk membantu lisis dari membran sel/nukleus/organel atau juga dinding sel, maka sampel daun dimasukkan dulu ke nitrogen cair dan langsung digerus sebelum ditambahkan bufer ekstraksi. Senyawa yang biasa digunakan untuk memaksimalkan hasil isolat DNA yang murni ditambahkan yaitu fenol, kloroform, dan isoamil alkohol. Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan yang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen sela yang lain, termasuk debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi. Kontaminan yang umum ditemukan di antaranya adalah polisakarida yang dapat mengganggu proses lanjutan seperti PCR, dimana terjajdi hambatan aktifitas Taq polimerase, atau kontaminan lainnya yaitu polifenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA secara kovalen. Untuk menghindari terjadinya hal ini, maka jaringan yang digunakan dijaga tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi. Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan presipitasi DNA dengan menggunakan etanol absolut atau isopropanol. Selain DNA, semua bahan yang lain akan larut dalam etanol dingin. Dengan demikian, saat dilakukan sentrifugasi, maka DNA akan mengendap dan terpisah dari senyawa-senyawa atau bahan lain. Pada sampel darah, presipitasi dilakukan dengan salting-out yaitu supernatan dipisahkan dari protein dan debris sela dengan pemberian larutan garam berkonsentrasi tinggi. Biasanya akan diperoleh supernatan DNA yang kental pada saat dimasukkan ke etanol absolut. Bila hal ini terjadi, Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 26

siapkan tabung yang berisi 70%-etanol, dan segera ambil DNA tadi dengan mikropipet 1000 L, dan pindahkan ke tabung yang berisi 70%-etanol. Sebagai bahan dasar untuk analisis lanjutan seperti PCR, RFLP, kloning atau sekuensing, maka DNA yang digunakan harus bersih dari kontaminan (mempunyai kemurnian tinggi) dan memiliki berat molekul yang tinggi. Selama proses ekstraksi DNA, beberapa hal yang dapat terjadi antara lain : DNA patah-patah selama proses isolasi. DNA terdegradasi oleh enzim nuklease. Terjadi kontaminasi oleh polisakarida. Metabolit sekunder ikut terisolasi.

Denaturasi dan Renaturasi DNA Proses denutarasi dan renaturasi melekul DNA tergantung pada banyak faktor, antara lain: 1. Suhu. Suhu leleh (melting temperature, Tm) yang tinggi menyebabkan untai ganda DNA akan terurai menjadi untai tunggal, tetapi bila suhu ini diturunkan secara perlahan, maka akan terjadi renaturasi menjadi untai heliks ganda DNA seperti semula. 2. Derajat keasaman (pH) yang ekstrem (pH<3 atau pH>10) dapat menyebabkan DNA terdenaturasi. 3. Konsentrasi isoelektrolit seperti Na+ dan K pada larutan ekstraksi yang digunakan. 4. Perbandingan kandungan antara basa nukleotida GC terdapat AT. Tingginya kandungan GC akan memperlambat proses denaturasi molekul DNA. Sebaliknya, kandungan AT yang tinggi akan menyebabkan pita DNA mudah putus/patah.

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

27

PRAKTIKUM 6 STATISTIK UJI KOMPARATIF TIDAK BERPASANGAN

I.

Judul Blok

Blok 3 (Sel & Molekul)

II. Topik Praktikum Sel & molekul

III. Laboratorium Pelaksana Laboratorium IKM/biostatistika

IV. Tujuan Belajar 1. Memahami dan dapat menggunakan Uji T tidak berpasangan 2. Memahami dan dapat menggunakan Uji Mann-Whitney 3. Memahami dan dapat menggunakan Uji One Way ANOVA 4. Memahami dan dapat menggunakan Uji Kruskal-Walis

V. Alat dan Bahan : a. b. c. d. e. f. Media audiovisual Program Statistik SPSS v.17 Laptop instruktur yang telah teristall SPSS Laptop mahasiswa yang telah terinstall SPSS Set data untuk latihan Alat Tulis (ATK) dan Papan tulis

VI. Prosedur Umum Pelaksanaan Praktikum : 1. Mahasiswa sebanyak 60 orang dengan didampingi oleh 3 istruktur dan 1 asisten

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

28

2. Mahasiswa terlebih dahulu menginstal serta meng-copy set data latihan sebelum praktikum 3. Intsruktur dan asisten menmeriksa dan memastikan setiap mahasiswa sudah menginstall SPSS dan set data latihan pada laptop mahasiswa sebelum memulai praktikum 4. Saat praktikum Instruktur terlebih dahulu menjelaskan dasar teori dan langkahlangkah pengujian statistik komparatif data numerik tidak berpasangan 5. Instruktur memberi contoh pengujian statistik komparatif variabel data numerik tidak berpasangan 6. Mahasiswa berlatih melakukan pengujian statistik dibantu oleh instruktur dan asisten 7. Melakukan diskusi dan tanya jawab 8. Membuat kesimpulan atas praktikum yang telah dilakukan

VII.

Metode

Uji T Tidak Berpasangan : 1) Data yang akan diuji adalah set data 2 kelompok dengan variabel numerik tidak berpasangan 2) Memeriksa syarat uji T Tidak berpasangan : i. Data harus Berdistribusi Normal (WAJIB) ii. Varians data boleh sama, boleh juga tidak sama 3) Jika memenuhi syarat (data berdistribusi normal), maka dipilih uji T tidak berpasangan 4) Jika tidak memenuhi syarat uji (data tidak berdistribusi normal) dilakukan dahulu Transformasi data 5) Jika data hasil transformasi berdistribusi normal, maka dipakai uji T tidak berpasangan 6) Jika variabel baru hasil transformasi tidak berdistribusi normal, maka dipilih uji MannWhitney 7) Langkah pengujian dengan uji T tidak berpasangan adalah sebagai berikut : i. Bukalah file Unpaired t-test Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 29

ii. Lakukanlah uji normalitas terlebih dahulu : Lihat variable View dab Data View terlkebih dahulu, pilih mana yang akan diuji Noramliatasnya AnalyzeDescrptives StatisticsExploreMasukkan Variabel dependent dalam Dependent List Pilih Both pada displaybiarkan kotak Statsitics sesuai defaultklik Plotspilih Factor levels together pada Boxplots, pilih Histogram pada Descriptives, pilih Normality with testContinueOK iii. Buka lagi file Unpaired T-testAnalyzeCompare meansIndependent-sample T iv. Masukkan variabel dependent pada kotak Test variable v. Masukkan faktor/variable independent pada kotak Grouping Variable vi. Aktifkan Define Group vii. Masukkan angka 1 untuk grup 1 dan angka 2 untuk grup 2 viii. Continue OKlakukanlah interpretasi hasil uji

Uji Mann-Whitney : 1) Data yang akan diuji adalah set data 2 kelompok dengan variabel numerik tidak berpasangan 2) Memeriksa syarat uji T Tidak berpasangan : i. Data harus Berdistribusi Normal (WAJIB)

ii. Varians data boleh sama, boleh juga tidak sama 3) Karena data tidak memenuhi syarat (data berdistribusi normal), maka dipilih MannWhitney 4) Karena variabel baru hasil transformasi tidak berdistribusi normal, maka dipilih Mann-Whitney, langkahnya adalah sebagai berikut : i. Buka file Mann-Whitney ii. AnalyzeNonparametrics test2 independent samples iii. Masukkan variabel yg diuji kedalam Test variables Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul 30 uji

iv. Masukkan faktor kedalam Grouping Variable v. Aktifkan uji Mann-Whitney vi. Klik Define groupmasukkan angka 1 pada kotak grup 1 dan 2 pada kotak grup 2 vii. ContinueOKinterpretasilah hasil uji

Uji One Way ANOVA : 1) Data yang akan diuji adalah set data > 2 kelompok dengan variabel numerik tidak berpasangan 2) Memeriksa syarat Uji One Way ANOVA untuk >2 kelompok tidak berpasangan : i. Distribusi data harus normal (WAJIB) ii. Varians data harus sama (WAJIB) 3) Jika tidak memenuhi syarat diupayakan melakukan transformasi data supaya distribusi menjadi normal dan varians menjadi sama 4) Jika syarat terpenuhi, maka dipilih uji one way ANOVA 5) Jika syarat tidak terpenuhi maka alternatifnya dipakai uji Kruskal-Wallis 6) Jika pada Uji ANOVA atau Kruskal-Wallis menghasilkan nilai p<0,05 maka dilanjutkan dengan melakukan analisis Post Hoc 7) Langkah pengujian data dengan One Way ANOVA adalah sebagai berikut : i. Bukalah file One Way ANOVA ii. AnalyzeCompare meansOne-Way ANOVA iii. Masukkan variabel dependen kedalam Dependent List iv. Masukkan variabel independent kedalam Factor list v. Aktifkan kotak Options vi. Pilih Homogenity of Variance vii. Klik ContinueOKlakukan analisis hasil uji

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

31

8) Analisis Post Hoc : i. Analyze Compare meansOne-Way ANOVA ii. Masukkan variabel Dependent 1 dalam Dependent list iii. Masukkan variabel kelompok Independent kedalam Factor list iv. Aktifkan kkotak Post hoc v. Pilih LSD pada kotak Equal variances Assumed vi. Klik ContinueOKlakukan analisis

Uji Kruskal-Wallis : 1) Data yang akan diuji adalah set data > 2 kelompok dengan variabel numerik tidak berpasangan 2) Memeriksa syarat Uji One Way ANOVA untuk >2 kelompok tidak berpasangan : 3) Distribusi data harus normal (WAJIB) 4) Varians data harus sama (WAJIB) 5) Jika syarat tidak terpenuhi maka alternatifnya dipakai uji Kruskal-Wallis 6) Jika pada Uji ANOVA atau Kruskal-Wallis menghasilkan nilai p<0,05 maka dilanjutkan dengan melakukan analisis Post Hoc 7) Langkah uji Kruskal-Wallis adalah sebagai berikut : i. Bukalah file data Kruskal-Wallis ii. Analyze non-parametric testsk-independent samples iii. Masukkan Variabel Independen kedalam Test Variable list iv. Aktifkan Uji Kruskal-Wallis v. Masukkan faktor dependent dalam Grouping Variabel vi. Aktifkan Define range vii. Masukkan angka 1 (sebagai kode buruk/lemah) pada kotak Minimum

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

32

viii. Masukkan angka 3 (sebagai kode baik/kuat) pada kotak Maksimum ix. Klik ContinueOKlakukan analisis hasil uji

Modul Praktikum Blok 3 : Sel & Molekul

33