Quim. Nova, Vol. 25, No.

5, 835-841, 2002 A UTILIZAO DE MATERIAIS OBTIDOS PELO PROCESSO DE SOL-GEL NA CONSTRUO DE BIOSSENSORES Antonio A. S. Alfaya e Lauro T. Kubota* Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas - SP Recebido em 17/8/01; aceito em 31/10/01

THE UTILIZATION OF MATERIALS OBTAINED BY THE SOL-GEL PROCESS IN BIOSENSORS CONSTRUCTION. The use of sol-gel materials to develop new biosensors has received great attention due to its characteristics and versatility of sol-gel process. An overview is presented of the state-of-the-art of electrochemical biosensors employing sol-gel materials. Lowtemperature, porous sol-gel ceramics represent a new class for the immobilization of biomolecules. The rational design of solgel sensing materials, based on the judicious choice of the starting alkoxide, encapsulated reagents, and preparation conditions, allows tailoring of material properties in a wide range, and offers great potential for the development of electrochemical biosensors. Keywords: biosensors; sol-gel process; electrochemical sensors.

INTRODUO Atualmente muitos procedimentos analticos necessitam de uma instrumentao complexa e pessoal altamente especializado. Os sensores qumicos so dispositivos pequenos, robustos, portteis, de fcil manipulao e no necessitam da adio contnua de reagentes para a sua operao podendo, assim, fornecer informaes confiveis continuamente. Portanto, o sensor qumico tem sido um elemento chave na instrumentao analtica dispensando, em muitos casos, a utilizao de aparelhos complexos e a necessidade de uma enorme infra-estrutura de suporte. Os sensores eletroqumicos tm apresentado maior desenvolvimento nos ltimos anos, devido crescente necessidade de testes analticos simples, rpidos e baratos para a determinao de importantes compostos qumicos e biolgicos em concentraes muito baixas. Os principais sensores eletroqumicos podem ser classificados como: potenciomtricos, amperomtricos, voltamtricos e condutomtricos, sendo os sensores amperomtricos os de maior destaque1-7. Devido crescente necessidade de identificao e quantificao de metablitos de forma rpida, especfica e em quantidades de amostras muito pequenas (lquidos corpreos) no campo da medicina, ocorreu o desenvolvimento dos biossensores. OS BIOSSENSORES Os biossensores podem ser definidos como um sensor qumico cujo reconhecedor um componente biolgico ativo, o que significa que um processo bioqumico a fonte do sinal analtico. Assim uma das caractersticas dos biossensores, a sua alta seletividade com relao a um determinado analito8,9. A construo de um biossensor baseia-se na comunicao de duas partes: o componente biolgico ativo (o reconhecedor) e um transdutor. A primeira faz o reconhecimento de uma determinada substncia por meio de uma reao bioqumica especfica, gerando uma variao na concentrao de prtons, a liberao de gases, a emisso ou a absoro de luz, a emisso de calor, uma variao de

*e-mail: kubota@iqm.unicamp.br

massa, uma mudana no estado de oxidao do analito, etc; e a segunda, converte a energia destes eventos numa forma mensurvel, como uma variao de corrente, potencial, temperatura e outros10. Assim, diferentes componentes biolgicos podem ser utilizados na construo de biossensores, tais como organismos, tecidos, clulas, organelas, membranas, enzimas, receptores, anticorpos, cidos nuclicos e macromolculas orgnicas11-15. Apesar de suas limitaes em termos da sua susceptibilidade ao pH, fora inica, a inibidores e sua baixa estabilidade, as enzimas so amplamente utilizadas na construo de biossensores eletroqumicos16-20. Vrios mtodos so utilizados na imobilizao da enzima no material suporte para a construo de um biossensor. Entre eles, os mais utilizados so aqueles envolvendo adsoro, ligao covalente, ligao covalente cruzada com um reagente multifuncional e a ocluso em gis ou membranas21-25. O mtodo de adsoro para a imobilizao de enzimas sobre materiais inorgnicos apresenta a grande vantagem da simplicidade de execuo; no entanto, este processo apresenta grandes dificuldades, tais como: (1) a reproduo da forma da enzima adsorvida sobre o material utilizado, pois a enzima s pode manter a sua atividade se os seus centros ativos encontrarem-se em uma forma disponvel sobre a superfcie do material, para que a reao com o analito especfico possa ocorrer; (2) a lixiviao da enzima durante o processo de medida, uma vez que a enzima se fixa ao substrato, geralmente por ligaes fracas passveis de serem rompidas durante o uso do biossensor pela interao com o solvente e/ou a variao de pH e temperatura; (3) o envenenamento rpido do eletrodo, devido ao fato da enzima se encontrar bastante exposta ao meio a ser analisado; (4) a baixa estabilidade da enzima, devido aos fatores supramencionados e tambm deformao da estrutura tridimensional da enzima durante o tempo de uso do biossensor. O mtodo da ligao covalente consiste na formao de ligaes entre o substrato e a enzima. Estas ligaes so geralmente feitas pela reao de grupos funcionais especficos da enzima, os quais no so essenciais para a sua atividade cataltica com grupos reativos especficos presentes no suporte sendo, portanto, necessrio um conhecimento prvio da estrutura qumica da enzima e da natureza do

Divulgao

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suporte. As grandes vantagens deste mtodo so a minimizao da lixiviao e uma maior estabilidade do complexo enzima-suporte em relao aos efeitos da variao do pH, da fora inica, do solvente. Entretanto, o mtodo apresenta alta possibilidade de perda da atividade enzimtica devido reao com grupos funcionais do centro ativo da enzima, como tambm pela deformao da estrutura tridimensional da mesma. O terceiro processo o mais amplamente utilizado e baseia-se na formao de ligaes cruzadas entre os grupos amino do suporte com os grupos amino da enzima, ou da formao de ligaes cruzadas intermoleculares com a formao de partculas insolveis macroscpicas, pela utilizao de reagentes bi- ou multifuncionais. As principais vantagens deste mtodo so a simplicidade de execuo e a forte interao da enzima com o suporte, diminuindo drasticamente a lixiviao e proporcionando ao eletrodo uma maior estabilidade. Entretanto, tambm apresenta grandes desvantagens, como a dificuldade do controle da reao, o uso de grandes quantidades de enzima, baixa atividade enzimtica e dificuldades na reprodutibilidade do eletrodo, levando assim a uma baixa reprodutibilidade no desempenho do eletrodo. O procedimento de imobilizao por ocluso em gis ou membranas orgnicas corresponde ao confinamento do material biolgico em uma matriz polimrica ou em uma membrana semipermevel, sendo o sistema revestido por uma membrana polimrica permevel, para reduzir a lixiviao do material biolgico. Este tipo de imobilizao apresenta a grande vantagem de se poder utilizar qualquer tipo de enzima. No entanto, exibe a desvantagem de lixiviao do material enzimtico, devido aos diferentes tamanhos de poros nos polmeros, como tambm problemas de tempo de resposta, pela dificuldade de difuso das espcies envolvidas atravs das membranas. O PROCESSO DE SOL-GEL O uso do processo de sol-gel para produzir materiais sensores para aplicaes analticas tem atrado considervel interesse dos pesquisadores26. Isto devido a numerosos fatores, como a facilidade de fabricao, a flexibilidade do projeto de sntese e o fato das enzimas ocludas na matriz de sol-gel manterem a sua respectiva atividade cataltica27-31. O processo de sol-gel pode ser facilmente reconhecido, pois trata de qualquer rota de sntese de materiais onde num determinado momento ocorre uma transio do sistema sol para um sistema gel. O termo sol empregado para definir uma disperso de partculas coloidais (dimenso entre 1 e 100 nm) estvel em um fluido, enquanto o termo gel pode ser visto como sendo um sistema formado pela estrutura rgida de partculas coloidais (gel coloidal) ou de cadeias polimricas (gel polimrico) que imobiliza a fase lquida nos seus interstcios. Desse modo, os gis coloidais resultam da agregao linear de partculas primrias (Figura 1a), que s pode ocorrer pela alterao apropriada das condies fsico-qumicas da suspenso. Por outro lado, os gis polimricos so, geralmente, preparados a partir de solues onde se promovem reaes de polimerizao. Neste caso a gelatinizao ocorre pela interao entre as longas cadeias polimricas lineares (Figura 1b)27. O processo de sol-gel pode ser dividido em duas classes, dependendo da natureza do precursor inorgnico utilizado: a dos sais (cloretos, nitratos, sulfetos, etc.) e a dos alcxidos. A rota que envolve o uso de precursores do tipo alcxido aparece como a mais verstil atualmente. A hidrlise de uma soluo de tetraalcoxissilanos em um solvente orgnico, como o lcool, leva formao de partculas com funo silanol, as quais formam um sol pela polimerizao via condensao, e a continuao do processo leva a um gel. Esta transformao designada transio sol-gel. Aps secagem do gel, um

Figura 1. Esquema da transio sol-gel: (a) formao de gel particulado e (b) formao de gel polimrico

xerogel formado. As reaes qumicas que ocorrem durante a formao do sol, do gel e do xerogel influenciam fortemente a composio e as propriedades do produto final28-30. Uma compreenso bsica da cintica e das reaes envolvidas no processo de sol-gel de primordial importncia na preparao de materiais com caractersticas controladas. A reao de polimerizao sol-gel pode ser dividida em duas etapas bsicas: (1) a hidrlise do grupo alcxido com a formao de grupos reativos do tipo silanol Si(OR)4 + nH2O Si(OR)4-n(OH)n + nROH,

(2) a condensao do grupo silanol, a qual leva inicialmente formao do sol e, eventualmente, ao gel28-30 Si OH + HO Si ou Si OR + HO Si Si O Si + ROH. Si O Si + H2O

Do mecanismo de sol-gel apenas a primeira etapa, a hidrlise, bem conhecida, pois as reaes de condensao comeam antes das reaes de hidrlise terminarem, tornando o mecanismo muito complexo e envolvendo muitas reaes de hidrlise e condensao ao mesmo tempo28-31. As reaes de hidrlise e condensao ocorrem via substituio nucleoflica bimolecular no tomo de silcio (SN2-Si). Como os alcxidos de silcio possuem uma baixa reatividade (relativa aos alcxidos metlicos), catalisadores cidos (H3O+), bsicos (OH-) e/ou nucleoflicos (F-, N-metilimidazol, hexametilfosforamida - HMPA)

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so adicionados ao processo para promover um aumento na velocidade das reaes de hidrlise e condensao27-30. A reao de hidrlise sob condies cidas envolve a protonao do grupo alcxido, seguida pelo ataque nucleoflico da gua, para formar um intermedirio penta-coordenado. A carga positiva sobre o grupo alcxido confere a ele um carter de um grupo de sada melhor28-31. Sob condies bsicas, acredita-se que o mecanismo envolva o ataque nucleoflico sobre o tomo de silcio pelo nion hidrxido para formar um intermedirio penta-coordenado carregado negativamente, seguido pela sada de um nion alcxido28-31. As propriedades fsicas (isto , rea superficial especfica, tamanho mdio dos poros e sua distribuio) de um gel seco (o xerogel) dependem fortemente dos parmetros utilizados no processo de solgel. A razo molar gua:silano, a natureza e a concentrao do catalisador e o tipo do precursor alcxido so parmetros especficos que afetam fortemente as velocidades relativas das reaes de hidrlise e condensao, as quais, por sua vez, ditam as propriedades do material final. Em geral, preparaes com baixo valor de pH e baixo teor de gua produzem materiais densos com tamanho mdio de poros pequeno, enquanto preparaes com valores altos de pH e altos teores de gua produzem materiais mais porosos28-30,32. Sob condies de catlise cida, a condensao ocorre preferencialmente entre os grupos silanis localizados em monmeros ou no final de cadeias polimricas. Isto leva formao de gis compostos de cadeias polimricas lineares entrelaadas, as quais, aps secagem formam uma matriz de baixo volume de poro. Sob condies bsicas, a condensao ocorre preferencialmente entre oligmeros altamente ramificados, os quais, levam formao de gis particulados que, aps secagem, produzem materiais com alta porosidade28,29,32. A velocidade das reaes de hidrlise e condensao muito influenciada tambm pelo tamanho do grupo alcxido, devido a fatores estricos. O aumento no tamanho do grupo alcxido e o maior nmero de ramificaes diminuem a velocidade de hidrlise28-30. Existe uma certa dificuldade de se combinar compostos orgnicos e inorgnicos, a qual se baseia no fato de que os componentes orgnicos no so estveis nas altas temperaturas em que normalmente se trabalha com os componentes inorgnicos. Para contornar este problema os pesquisadores tm utilizado o processo de sol-gel e obtido timos resultados. Este processo, que tem como caracterstica o processamento a baixas temperaturas, oferece a possibilidade de obteno de materiais hbridos, uma vez que nestas temperaturas os componentes orgnicos no sofrem decomposio33. As maneiras de incorporar materiais orgnicos em matrizes inorgnicas provenientes do processo de sol-gel podem ser convenientemente divididas em trs grupos34. No primeiro grupo, a morfologia contnua do poro da matriz inorgnica explorada para a impregnao de materiais orgnicos e, no segundo grupo, os componentes orgnicos so dispersos no sol e aps a gelatinizao esses materiais orgnicos so presos dentro da matriz do xido. Nestes dois mtodos no existe a formao de ligaes covalentes entre os xidos e os componentes orgnicos. No terceiro grupo, um componente orgnico est ligado covalentemente (R4-xSi(OR)x, onde x=1-4) ao precursor inorgnico, o qual formar uma rede rgida com o componente orgnico ligado quimicamente na estrutura inorgnica, tornandose parte de uma rede integrada; estes materiais so chamados de ORMOSIL (Organically Modified Silicates). Um ormosil , portanto, um material hbrido inorgnico/orgnico em escala molecular, sendo geralmente um nanocompsito. Esses mesmos materiais tm sido chamados tambm de ormocers ou de ceramers 34-36. A complexidade associada com o processo de polimerizao torna-se ainda mais clara quando da preparao de materiais a partir de precursores organoalcoxissilanos31,33. Aqui, as velocidades relativas de hidrlise e condensao so fortemente dependentes de fatores estricos

e indutivos30,31,37. Devido aos mecanismos de reao sob condies cidas e bsicas envolverem a formao de estados de transio carregados positiva ou negativamente, respectivamente, o efeito do substituinte alquila sobre as velocidades de hidrlise dever ser visivelmente afetado pela natureza do catalisador28-30,37. Por exemplo, a substituio de um ou mais grupos metila indutores de eltrons por grupos alcxidos aumenta a densidade eletrnica sobre o silcio. Sob condies cidas, este fato proporciona o aumento da velocidade de hidrlise devido estabilizao do estado de transio que est carregado positivamente28-30,37. No entanto, sob condies bsicas, uma significativa diminuio na velocidade observada, devido desestabilizao do estado de transio carregado negativamente. Assim, a reatividade qumica individual do precursor organoalcoxissilano de suma importncia na formao do material hbrido orgnico/ inorgnico. Se o grupo funcional orgnico possui propriedades cidas ou bsicas ele vai influenciar o processo de hidrlise e condensao, tornando a polimerizao ainda mais complexa38. Precursores de frmula geral, R4-xSi(OR)x, onde x=1-4, so obtidos comercialmente ou podem ser preparados via diferentes rotas sintticas31,38,39. O grupo funcional R est ligado ao tomo de Si por uma ligao Si-C, a qual bastante resistente hidrlise devido baixa acidez de Lewis do silcio. Os trialcoxissilanos (x=3) so utilizados como modificadores de rede para melhorar propriedades especficas, como a hidrofobicidade, a reatividade e a flexibilidade na rede inorgnica. Estes precursores podem ser polimerizados sozinhos ou preferencialmente com tetraalcoxissilanos (x=4), os quais melhoram a conectividade da rede e a estabilidade do slido final. Dialcoxissilanos (x=2) formam espcies cclicas ou cadeias nas condies de hidrlise e condensao no possibilitando a formao de ligaes cruzadas na rede. No entanto, quando se polimerizam estes precursores na presena de tetra ou trialcoxissilanos, eles atuam como modificadores de rede e promovem a flexibilidade na matriz30,38. Embora se possa exercer o controle das reaes de hidrlise e condensao de forma a promover uma distribuio homognea do modificador de rede na matriz, isto no sempre o que ocorre. Por exemplo, quando trialcoxissilanos so polimerizados sem a adio de qualquer outro formador de rede, acredita-se que o grupo orgnico se localize na superfcie e no homogeneamente pela matriz30. Sob condies bsicas, a velocidade de hidrlise para os organoalcoxissilanos pode ser de vrias ordens de magnitude menor que para os tetraalcoxissilanos. Assim, pode-se promover a formao de materiais nos quais os grupos orgnicos esto localizados na superfcie da matriz. A formao de materiais heterogneos, particularmente na escala nanoscpica, no necessariamente um fato desfavorvel, se o fenmeno puder ser controlado. Entretanto, isto dever exigir um conhecimento detalhado das velocidades das reaes dos precursores sob o conjunto de condies especficas utilizadas na rota de sol-gel. A estratgia mais comum nos dias de hoje na preparao de materiais sensores pelo processo de sol-gel tem envolvido, em primeiro lugar, uma boa idia inicial do objetivo a ser alcanado e, em segundo, um processo laborioso combinando tentativas e erros com uma boa intuio qumica. BIOSSENSORES ELETROQUMICOS EMPREGANDO O PROCESSO DE SOL-GEL Braun et al.40,41 ocluram diversas enzimas em silicatos produzidos pelo processo de sol-gel, pela mistura das macromolculas com os precursores adequados em meio reacional com baixo teor de metanol. Surpreendentemente, as enzimas resistiram s condies de polimerizao inorgnica, no sendo totalmente desnaturadas pelo solvente alcolico empregado e permanecendo ativas, mesmo aps a contrao da estrutura porosa durante a etapa de secagem do mate-

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rial. Ellerby et al.42 foram os primeiros a utilizar o ultra-som na soluo de alcoxissilano com o objetivo de preparar o silicato na fase sol, o qual continha muito pouco ou nenhum lcool. As enzimas foram ento misturadas com o sol em um processo de sol-gel convencional. Em muitos casos as enzimas ocludas foram muito mais estveis do que na forma solvel, presumivelmente pela formao de pontes de hidrognio com os grupos silanis, os quais inibem a reconformao trmica43. Uma notvel realizao foi efetuada por Reetz e colaboradores44, pela ocluso de lipases em silicatos hidrofobicamente modificados. As lipases so amplamente utilizadas em reaes de esterificao orgnica em meio hidrofbico. As lipases ocludas pelo processo de sol-gel apresentam alta estabilidade e uma reatividade comparvel com as enzimas isoladas devido interao hidrofbica com o suporte de ormosil. Atualmente, lipases ocludas pelo processo de sol-gel podem ser adquiridas comercialmente. Mais de 35 tipos diferentes de materiais hbridos cermicosbioqumicos foram tabelados, em 1994, numa publicao sobre biocermicas produzidas pelo processo de sol-gel45. Enzimas, anticorpos, clulas inteiras e extratos de clulas e outros materiais biolgicos ativos foram ocludos em uma variedade muito grande de matrizes inorgnicas incluindo slica46-49, zircnia50,51, titnia51, alumina52 e compsitos de celulose-titnia49,53, slica-grafite49,54-56 e slica-ouro57. Muitos estudos eletroqumicos se concentraram nos biossensores para glicose, devido alta estabilidade da glicose oxidase durante o processo de sol-gel e pela importncia no desenvolvimento de um sensor para a glicose no campo das pesquisas mdicas58. Biossensores eletroqumicos baseados na glicose oxidase funcionam conforme o seguinte mecanismo: a D-glicose oxidada para a gluconolactona pela reduo de um grupo flavina. A flavina reduzida pode ento ser oxidada novamente pelo oxignio, o qual convertido em perxido de hidrognio. O consumo do oxignio ou a oxidao andica do perxido de hidrognio pode ser utilizado para a quantificao da glicose. A etapa de regenerao da enzima promovida por um par redox (um mediador de eltrons, na maioria das vezes), o qual pode ser eletroquimicamente regenerado por uma etapa de oxidao sobre a superfcie do eletrodo. Pela utilizao deste mtodo, o sinal no fortemente dependente da concentrao de oxignio, e como possvel ocorrer um processo de deteco e regenerao a baixas voltagens, ento a interferncia de outras espcies qumicas bastante minimizada. Tatsu et al.59 produziram uma slica contendo glicose oxidase e uniram-na a um eletrodo de oxignio por meio de uma membrana de nylon. O decrscimo da concentrao de oxignio foi ento utilizado para quantificar o teor de glicose. Audebert et al.60 desenvolveram um biossensor contendo a glicose oxidase e o ferroceno (como mediador) incorporados a um filme fino de slica, produzido pelo processo de sol-gel, e este foi depositado sobre um suporte metlico inerte. Entretanto, somente 80% da atividade total da enzima foi mantida no gel. Essa tcnica est limitada a gis midos pois, quando o xerogel formado, a enzima perde a sua atividade. Narang et al61 imobilizaram a enzima glicose oxidase entre duas camadas de filmes finos de slica, produzidos pelo processo de solgel, numa construo tipo sanduche depositado sobre um substrato condutor de ITO (ITRIUM TIN OXIDE), sendo o perxido de hidrognio produzido detectado eletroquimicamente. Entretanto, o sinal deste tipo de eletrodo pequeno, na maioria dos casos. Li et al.62 imobilizaram a peroxidase de raiz forte em um eletrodo de pasta de carbono e depositaram uma camada de ormosil sobre o eletrodo; Yang et al.63 prepararam um biossensor em miniatura recobrindo um fio de platina com glicose oxidase imobilizada sobre micro-esferas preparadas por sol-gel. A imobilizao de enzimas no interior de matrizes produzidas pelo processo de sol-gel uma tcnica muito vantajosa, pois preser-

va a atividade enzimtica e evita a lixiviao da enzima e de molculas pequenas dos mediadores de eltrons para a soluo, ao contrrio do que ocorre, na maioria das vezes, com filmes finos ou membranas contendo estes mesmos materiais imobilizados. Park et al.64 desenvolveram um novo processo de sol-gel para prevenir a lixiviao das espcies de interesse como a lactato oxidase e a glicose oxidase e polmeros redox [(Os)(bpi) 2(PVP)10Cl]Cl, partindo de poli(4vinilpiridina) em um filme fino de ormosil produzido por sol-gel. Muitos pesquisadores tm se dedicado a pesquisar materiais suportes para biossensores de natureza diferente da slica e produzidos pelo processo de sol-gel. Glezer e Lev49,65 desenvolveram um mtodo para a ocluso da glicose oxidase e da peroxidase de raiz forte em um gel de pentxido de vandio. Os filmes finos de V2O5 apresentam boa condutividade eltrica, alm de boas propriedades de aderncia a superfcies condutoras como o carbono vtreo e a platina. Liu et al.52 desenvolveram um novo biossensor co-imobilizando o Fe(CN)64- como mediador de eltrons e a tirosinase em uma matriz de Al2O3 porosa, produzida pelo processo de sol-gel. A construo de biossensores com a utilizao de compsitos carbono-cermicos uma variao no processo de sol-gel, a qual visa uma maior proteo para a enzima durante a sntese do sol-gel e tambm contribui para a diminuio da lixiviao das molculas de mediadores de eltrons (molculas pequenas) e das prprias enzimas para a soluo. Os biossensores construdos com compsitos carbono-cermicos apresentam uma lenta lixiviao dos mediadores somente aps longos perodos de utilizao66,67. Existem trs variaes principais utilizadas pelos pesquisadores para a construo de biossensores tipo compsito carbono-cermico, com o objetivo de se minimizar ao mximo a lixiviao dos mediadores de eltrons. (1) Ocluso da enzima quimicamente modificada com o mediador no compsito carbono-cermico68. Nesta construo, muitos grupos ferroceno esto ligados covalentemente na enzima glicose oxidase e, ento, a enzima ocluda na matriz carbono-cermica produzida pelo processo de sol-gel. A lixiviao das molculas de mediador eliminada por elas se encontrarem ligadas covalentemente estrutura da enzima e imobilizada no interior da rede inorgnica. (2) Ocluso de oxidoredutases em compsito carbono-cermico quimicamente modificado com mediadores69,70. O material do eletrodo constitudo de uma disperso de grafite em p e glicose oxidase incorporada em um silicato estrutural multifuncional modificado com ferroceno, contendo grupos amina e metil, preparado pela copolimerizao de vrios precursores em um processo de sol-gel (Figura 2). Cada espcie nesta construo integrada realiza uma tarefa especfica. A

Figura 2. Estrutura de um silicato modificado com ferroceno

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grafite melhora a condutividade por percolao; o silicato fornece uma estrutura rgida altamente reticulada, a qual aprisiona a enzima redox; os grupos ferroceno so responsveis pelo transporte do sinal dos centros ativos da enzima at a superfcie condutora; os grupos amina foram incorporados devido sua alta afinidade ao excesso de cargas negativas sobre a superfcie da glicose oxidase e, finalmente, a combinao dos grupos metil e amina vantajosa para o controle da hidrofilicidade da seco eletroativa do eletrodo. (3) Imobilizao da oxidoredutase em um compsito de grafite modificado com mediador-silicato71. Este mtodo est baseado na ligao covalente do mediador de eltrons sobre a grafite em p. A grafite foi primeiramente recoberta com ouro e, a seguir, uma reao de derivatizao foi realizada (Figura 3). Estudos ciclovoltamtricos demonstram sensibilidade na resposta, mesmo para espaadores longos.

Figura 3. Estrutura da partcula de grafite modificada com ferroceno e o esquema de um biossensor tipo compsito carbono-cermico

A interferncia qumica devido ao sobrepotencial aplicado ao biossensor construdo a partir de um compsito carbono-cermico um dos problemas mais freqentes quando se trabalha com estes Tabela 1. Exemplos de biossensores utilizando materiais sol-gel Analito H2O2 Glicose Fenol H2O2 NO2 Uria Fenol E. coli Acetiltiocolina e Tiocolina Uria Uria Organofosfatos/ Acetilcolina H2O2 PH H2O2 H2O2 lcoois e Aldedos Tipo do biossensor ptico amperomtrico ptico amperomtrico ptico condutomtrico amperomtrico amperomtrico amperomtrico condutomtrico condutomtrico potenciomtrico amperomtrico ptico amperomtrico amperomtrico fluorescncia Enzima HRP GOx HRP HRP Domnio heme da SGC Urease TPH Enterotoxina ACHE/CHO urease urease ACHE/OPH HRP lipossomas HRP HRP ADH

materiais. Este inconveniente pode ser bastante minimizado com a utilizao de catalisadores metlicos no compsito. Os metais mais utilizados com esta finalidade so o paldio72, o rdio73 e o rutnio74, sendo o ltimo geralmente utilizado na fabricao de eletrodos constitudos de um filme fino, produzido pelo processo de sol-gel. Em todos estes casos72-74, o tempo de meia-vida foi superior a 4 meses. Os xidos de rutnio74 e de rdio73 apresentam extraordinria seletividade para a glicose quando na presena de compostos bioqumicos comuns, como o cido ascrbico, acetaminofeno e cido rico. Biossensores para lactato ( base de lactato oxidase) e amino cidos ( base de amino cido oxidase) foram preparados de maneira semelhante72. Um fato muito interessante e de ordem prtica, dos eletrodos compsito carbono-cermico que a seco ativa do eletrodo no destruda por sucessivos polimentos devido dureza da estrutura do silicato formado pelo sol-gel e assim, a seco ativa do eletrodo pode ser renovada por polimento mecnico aps o uso constante ou a contaminao deste. Wang et al.75 demonstraram que tiras teste para deteco de perxido de hidrognio e glicose podem ser produzidas pelo processo de sol-gel utilizando a tcnica screen-printing. A utilizao do processo de sol-gel para a fabricao de biossensores nos ltimos anos tem revelado a grande flexibilidade desta tcnica. Os pesquisadores esto investigando no s as diversas formas de imobilizao das enzimas em diversos materiais inorgnicos, como tambm, uma grande ateno est sendo dirigida para os mais diversos tipos de transdutores. A Tabela 1 mostra alguns exemplos de biossensores obtidos pelo processo de sol-gel. Um fato interessante sobre a versatilidade do processo de sol-gel pode ser demonstrado nos ltimos avanos tecnolgicos para a fabricao de biossensores inteligentes. Os pesquisadores esto se dedicando pesquisa de biossensores com materiais biocompatveis produzidos pelo processo de sol-gel, os quais so capazes de quantificar um determinado metablito na corrente sangnea e com um chip acoplado so capazes de analisar este dado e regular a concentrao

Descrio Membrana de silicato Microeletrodo Membrana de silicato Polmero redox de smio Fibra ptica recoberta screen-printed Medidas a 40o C Filme fino Reator de vidro modificado Microeletrodo Filme fino Microeletrodo Filme fino/FIA Filme fino Filme fino Membrana Enzima ocluda

Limite de deteco 8 x 10 mol L 500 ppm 5 x 10-6 mol L-1 111 x 10-6 mol L-1 30 x 10-6 mol L-1 2,5 x 10-6 mol L-1 3,6 x 10-8 mol L-1 5 x 10-6 mol L-1 2 x 10-4 mol L-1 3 x 10-6 mol L-1 5 x 10-7 mol L-1 0,01 unidade de pH 13,5 x 10-6 mol L-1 9 x 10-7 mol L-1 1 x 10-4 mol L-1 (fase aquosa) 1 x 10-6 mol L-1 (fase vapor)
-6 -1

Ref. 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 90 95 96 97 98 99 100

As siglas utilizadas significam: HRP (peroxidase de raiz forte), GOx (glicose oxidase), SGC (guanilato ciclase solvel), TPH (fenol hidrolase termoestvel), ACHE (acetilcolinesterase), CHO (colina oxidase), OPH (organofosfato hidrolase)

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Alfaya e Kubota

Quim. Nova

deste metablito pela eliminao na corrente sangnea de uma determinada substncia. Um biossensor deste tipo est sendo desenvolvido por Gerritsen et al.76 que estudam a biocompatibilidade de sensores para a glicose, implantados de forma subcutnea e que foram recobertos por materiais inorgnicos produzidos pelo processo de sol-gel. Outro caminho que est sendo seguido pelos pesquisadores para o desenvolvimento de biossensores inteligentes o desenvolvimento de tcnicas de imobilizao de materiais bi-lamelares lipdicos (membranas lipdicas) em matrizes produzidas pelo processo de sol-gel, com o objetivo de desenvolvimento de biossensores pticos de alto desempenho para a anlise e o controle de metablitos importantes na corrente sangnea77. O objetivo destes pesquisadores desenvolver no apenas biossensores, mas sensores inteligentes que, alm de determinar o analito, possam eliminar substncias reguladoras na corrente sangnea para o controle contnuo de certas doenas, como a diabetes. CONCLUSES A tecnologia do sol-gel est provando ser uma ferramenta altamente eficiente na produo de materiais com as mais diversas caractersticas fsico-qumicas, para as mais diversas aplicaes analticas e, principalmente, no desenvolvimento de biossensores. A palavra chave que melhor descreve a tecnologia de sol-gel a versatilidade, pois oferece mtodos simples de manipulao da textura, estrutura, configurao, composio e caractersticas qumicas dos materiais produzidos. A facilidade de manipulao da forma final do material e a capacidade de imobilizar molculas biolgicas mantendo as suas caractersticas funcionais faz do processo de sol-gel uma tecnologia de futuro. Pois abre a possibilidade da miniaturizao dos biossensores para medidas em sistemas in situ em organismos vivos, como tambm se torna uma tecnologia possvel para o desenvolvimento de biossensores eletroqumicos multianalticos. Os materiais sensores produzidos at hoje tm servido praticamente como um suporte microporoso para a deteco de analitos especficos. Pequena ateno foi dedicada construo racional dos materiais produzidos pelo processo de sol-gel, os quais podem ser manufaturados para se obter inmeras propriedades especficas, tais como controle da polaridade superficial; ajuste da acidez do material para facilitar o processo de imobilizao por troca inica, aumentando a fixao de molculas interessantes para a melhoria da atividade sensora; a utilizao de precursores alcxidos modificados78,79 com molculas mediadoras70 para que a lixiviao do material seja eliminada e a utilizao de precursores modificados com longas cadeias hidrofbicas44,80 para possibilitar uma maior flexibilidade na rede inorgnica, proporcionando um controle maior sobre o tamanho dos poros do material, o que facilitaria a difuso do analito at o reconhecedor biolgico, como tambm facilitaria que a integridade da estrutura tridimensional da enzima fosse mantida, preservandose ao mximo a sua atividade cataltica. A polimerizao sol-gel do tipo template (Figura 4) vem apresentando considervel interesse na ltima dcada. Os materiais produzidos por esta tcnica apresentam uniformidade na forma e no tamanho dos poros. Isto obtido graas a um processo de polimerizao sol-gel ao redor de uma molcula ou uma estrutura inerte (um template), a qual pode ser removida aps a formao do material, produzindo neste micro e meso cavidades regulares na forma e no tamanho. Desta forma, o processo produz aps a remoo da molcula hospedeira, materiais micro ou mesoporosos uniformes81,82. A reao sol-gel do tipo template dever ser estudada melhor para aumentar a sensibilidade dos biossensores eletroqumicos81,82, pois a construo de materiais com a forma e o tamanho de poros definidos ir criar uma classe de materiais sensores altamente interessantes, pois ser possvel a seleo das estruturas que podero entrar em

Figura 4. Esquema de polimerizao sol-gel do tipo template

contato com o material biolgico utilizado, criando barreiras de difuso para espcies no desejveis e por conseguinte aumentando a sensibilidade e o tempo de utilizao dos biossensores. A formao de novos compsitos baseados no acoplamento de matrizes sol-gel e outros processos poder ser muito benfica para as futuras aplicaes dos biossensores. Alguns exemplos destes acoplamentos de tcnicas podem ser evidenciados pela fixao de matrizes produzidas por sol-gel sobre eletrodos de ouro atravs da utilizao de precursores alcxidos com a funo tiol 83 ; a eletropolimerizao de filmes (1,2-diaminobenzeno)84 sobre materiais porosos produzidos pelo processo de sol-gel pode criar novos compsitos para a construo de biossensores com elevada sensibilidade; a construo de biossensores com tempo de resposta extremamente curto e com alta sensibilidade pode ser realizada pela polimerizao de polianilinas no interior de redes inorgnicas produzidas pelo processo de sol-gel85. O estudo de materiais diferentes do silicato pelo processo de solgel e a sua aplicao na construo de biossensores um campo muito amplo e de grandes possibilidades futuras de sucesso, entretanto poucos pesquisadores tm se aventurado, devido pouca pesquisa fundamental existente neste campo. Os recentes desenvolvimentos na rea dos biossensores com utilizao de materiais produzidos pelo processo de sol-gel so extremamente promissores, no entanto um grande esforo na pesquisa fundamental para o desenvolvimento de novos materiais sol-gel com caractersticas especficas dever ser realizado pois, uma melhor compreenso da correlao entre o tipo de precursor utilizado, as condies de reao e as propriedades fsico-qumicas do material final so extremamente importantes na construo e no desempenho dos biossensores. No atual nvel de interesse e desenvolvimento de materiais produzidos pelo processo de sol-gel para a construo de biossensores, pode-se observar o incio de um amplo campo de pesquisa, que vem se tornando cada vez mais promissor. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio da FAPESP pelo suporte financeiro.

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A Utilizao de Materiais Obtidos pelo Processo de Sol-Gel na Construo de Biossensores

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REFERNCIAS
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. Alegret, S.; Analyst 1996, 121, 1751. Fleet, B.; Gunasingham, H.; Talanta 1992, 39, 1449. Wring, S. A.; Hart, J. P.; Analyst 1992, 117, 1215. Wang, J.; Electroanalysis 1991, 3, 255. Brett, C. M. A.; Brett, A. M. O. Em Electrochemistry - Principles, Methods and Applications; Oxford University Press: New York, 1994, p. 339. Rieger, P. H. Em Electrochemistry; Chapman & Hall: New York, 1994, p. 109. Bard, A.; Faulkner, L. R.; Electrochemical Methods - Fundamentals and Applications, John Wiley & Sons: New York, 1980, p. 370. Hulanicki, A.; Glab, S.; Ingman, F.; Pure Appl. Chem. 1991, 63, 1247. Fatibello-Filho, O.; Capelato, M. D. ; Quim. Nova, 1992, 15, 28. Mulchandani, A.; Bassi, A. S.; Crit. Rev. Biotechnol. 1995, 15, 105. Turner, A. P. F.; Karube, Y.; Wilson, G. S.; Biosensors. Fundamentals and Applications, Oxford University Press: New York, 1987. Zhang, Y.; Chen, N. Y.; Zhu, L. G.; Chem. J. Chin. Univers. 2000, 21, 675. Iwuoha, E. I.; Kane, S.; Ania, C. O.; Smyth, M. R.; De Montellano, P. R. O.; Fuhr, U.; Electroanalysis 2000, 12, 980. Bottcher, H.; J. Prakt. Chemie-Pract. Appl. Chem. 2000, 342, 427. Bhatia, R. B.; Brinker, C. J.; Gupta, A. K.; Singh, A. K.; Chem. Mater. 2000, 12, 2434. Wolfbeis, O. S.; Anal. Chem. 2000, 72, 81R. Badjic, J. D.; Kostic, N. M.; Chem. Mater. 1999, 11, 3671. Niu, J. J.; Lee, J. Y.; Sens. Actuators, B 2000, 62, 190. Wolfbeis, O. S.; Oehme, I.; Papkovskaya, N.; Klimant, I.; Biosens. Bioelectron. 2000, 15, 69. Li, Q. W.; Luo, G. A.; Wang, Y. M.; Zhang, X. R.; Mater. Sci. Eng., C 2000, 11, 67. Cass, T.; Ligler, F. S.; Immobilized Biomolecules in Analysis: A Practical Approach, Oxford Univ. Press: New York, 1998. Cunninggham, A. J. Em Introduction to Bioanalytical Sensors; John Wiley & Sons, Inc.: New York, 1998, cap. 3. Scouten, W. H.; Luong, J. H. T.; Brown, R. S.; Tibtech. 1998, 13, 178. De La Guardia, M.; Mikrochim. Acta 1995, 120, 243. Arnold, M. A.; Meyerhoff, M. E.; Crit. Rev. Anal. Chem. 1988, 20, 149. Li, J.; Tan, S. N.; Anal. Lett. 2000, 33, 1467. Hiratsuka, R. S.; Santili, C. V.; Pulcinelli, S. H.; Quim. Nova 1995, 18, 171. Brinker, C. J.; Scherer, G. W.; Sol-Gel Science - The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing, Academic Press, Inc.: San Diego, 1990. Brinker, C. J.; J. Non-Cryst. Solids 1988, 100, 31. Hench, L. L.; West, J. K.; Chem. Rev. 1990, 90, 33. Corriu, R. J. P.; Leclercq, D.; Angew. Chem., Int. Ed. 1996, 35, 1420. Buckley, A. M.; Greenblatt, M.; J. Chem. Educ. 1994, 71, 599. Wen, J.; Wilkes, G. L.; Chem. Mater. 1996, 8,1667. Mackenzie, J. D.; Chung, Y. J.; Hu, Y.; J. Non-Cryst. Solids 1992, 147148, 271. Li, X.; King, T. A.; J. Non-Cryst. Solids 1996, 204, 235. Ou, D. L.; Seddon, A. B.; J. Non-Cryst. Solids 1997, 210, 187. Schmidt, H.; Scholze, H.; Kaiser, A.; J. Non-Cryst. Solids 1994, 63, 1. Schubert, U.; Husing, N.; Lorenz, A.; Chem. Mater. 1995, 7, 2010. Deschler, U.; Kleinschmit, P.; Panster, P.; Angew. Chem., Int. Ed. 1986, 25, 236. Braun, S.; Rappoport, S.; Zusman, R.; Avinir, D.; Ottolenghi, M.; Mater. Lett. 1990, 10, 1. Braun, S.; Rappoport, S.; Zusman, R.; Shteltzer, S.; Drukman, S.; Avnir, D.; Ottolenghi, M. Em Biotechnology: Bridging Research and Applications; Kamely, D.; Chakrabarty, A.; Kornguth, S. E., eds.; Kluver Academic Publishers: Amsterdan, 1991, p. 205. Ellerby, L. M.; Nishida, C. R.; Nishida, F.; Yamanaka, S. A.; Dunn, B.; Valentine, J. S.; Zink, J. I.; Science 1992, 225, 1113. Shtelzer, S.; Rappoport, D.; Avnir, D.; Ottolenghi, M.; Braun, S.; Appl. Biochem. 1992, 15, 227. Reetz, M. T.; Zonta, A.; Simpelkamp, J.; Angew. Chem., Int. Ed. 1995, 34, 301. Avnir, D.; Braun, S.; Lev, O.; Ottolenghi, M.; Chem. Mater. 1994, 6, 1605. Peng, T.; Cheng, Q.; Stevens, R. C.; Anal. Chem. 2000, 72, 1611. Lee, W.-Y.; Lee, K. S.; Kim, T.-H.; Shin, M.-C.; Park, J.-K.; Electroanalysis 2000, 12, 78. Yamada, S.A.; Charych, D. H.; Loy, D. A.; Sasaki, D. Y.; Langmuir 1997, 13, 5049. Lev, O.; Tsionsky, M.; Rabinovich, L.; Glezer, V.; Sampath, S.; Pankratov, I.; Gun, J.; Anal. Chem. 1995, 67, 22A.

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