Reviews in Biology and Biotechnology By The Moroccan Society of Biology in Canada

Vol.2, No 2, December 2002. pp.2-11 Printed in Canada

La PCR en temps rel: principes et applications

Elyse Poitras et Alain Houde*

La technologie de PCR en temps rel devient de plus en plus populaire dans diffrents secteurs dactivit. Cette technologie est base sur la dtection et la quantification dun reporter fluorescent dont lmission est directement proportionnelle la quantit damplicons gnrs pendant la raction de PCR. tant donn quelle utilise gnralement des systmes en tubes ferms et que la quantification ne requiert aucune manipulation postamplification, les problmes de contamination post-PCR par les amplicons sont significativement rduits. Le processus complet est automatis du dbut la fin rendant cette technologie trs performante pour des applications danalyses grande chelle. Cet article prsente une description des principes la base de la PCR en temps rel, des diffrentes technologies de dtection des amplicons et des exemples dapplications courantes.

Historique Russell Higuchi fut lun des premiers faire lanalyse des cintiques de la PCR (polymerase Chain Reaction) en laborant un systme qui dtectait le produit de la PCR au fur et mesure quil saccumulait. Ce systme en temps rel utilisait le bromure dthidium comme agent intercalant dans chacune des ractions damplification et un thermocycleur modifi pour stimuler lmission des chantillons par rayonnements UV. Lmission de la fluorescence tait dtecte laide dune camra CCD (charge-coupled device). Une augmentation de lmission de la fluorescence tait observe lorsque le bromure dthidium se fixait lADN double brin produit au cours de lamplification. En traant laugmentation de lmission de fluorescence en fonction du nombre de cycles, le systme produit des courbes damplification exhibant un schma plus complet du processus de la PCR que la simple dtermination damplicons (produits damplification) accumuls en fin damplification (Higuchi et al, 1992). Principe Depuis son invention, la PCR est devenue la technique la plus utilise pour la dtection de lADN et de lARN. partir dune simple copie dune squence particulire dacides nucliques, cette squence peut tre spcifiquement amplifie et dtecte. Sa nature exponentielle rend cette technique attrayante pour des analyses quantitatives. Thoriquement, il existe une relation quantitative entre la quantit de la squence cible

de dpart et la quantit du produit amplifi nimporte quel cycle. En pratique, il nest pas rare que les ractions de PCR en replica donnent des taux diffrents damplicons. Le dveloppement de la PCR quantitative en temps rel a limin les variabilits traditionnelles associes la PCR quantitative et permet la quantification du produit de la PCR de faon fiable et routinire. Au dbut de la raction PCR, les ractifs sont en excs mais en concentration assez faible afin dviter que la renaturation des amplicons nentre en comptition avec lhybridation des amorces (primers). Lamplification est alors ralise de faon constante un taux exponentiel laide dune ADN polymrase thermostable. Aprs la phase exponentielle, la raction damplification entre dans une phase linaire o le taux damplification devient extrmement variable, mme au niveau de replica dun mme chantillon, cause dune comptition entre la renaturation des amplicons et lhybridation des amorces. Suit ensuite une phase plateau o le taux damplification dcrot prs de zro gnrant trs peu damplicons. Afin de recueillir des donnes quantitatives avec prcision, chacun des chantillons doit tre analys dans sa phase exponentielle damplification qui est la phase la plus reproductible de la raction de PCR. La PCR en temps rel fait donc le suivi de la fluorescence mise pendant la raction avec un indicateur de la production des amplicons durant chaque cycle, loppos de la PCR quantitative conventionnelle o les amplicons ne sont dtects qu la toute fin du processus. .

Correspondance : Dr. Alain Houde, Agriculture et Agroalimentaire Canada, Centre de Recherche et de Dveloppement sur les aliments, 3600 boul. Casavant ouest, St-Hyacinthe, Qubec, Canada, J2S 8E3. Courriel: Houdea@agr.gc.ca

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La technologie de la PCR en temps rel est base sur la dtection et la quantification dun reporter fluorescent. Laugmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle la quantit damplicons gnrs durant la raction de PCR. En observant la quantit de fluorescence mise chaque cycle, il devient possible de suivre la raction PCR durant sa phase exponentielle o la premire augmentation significative dans la quantit damplicons est en corrlation directe avec la quantit initiale de la matrice originale cible (template). Plusieurs instruments de PCR en temps rel sont prsentement sur le march. Ces appareils utilisent gnralement un systme en tubes ferms et la quantification ne requiert aucune manipulation postamplification, ce qui minimise ou limine les problmes de contamination par les amplicons suite la raction de PCR et rduit le temps danalyse (Bustin, 2000). Le processus complet est donc automatis du dbut la fin rendant ainsi cette technologie intressante pour des applications danalyses grande chelle (high-throughput) (Martell et al, 1999). Technologies de dtection Tous les systmes de PCR en temps rel reposent donc sur la dtection et la quantification dun metteur fluorescent pendant le processus damplification et laugmentation du signal dmission fluorescente est directement proportionnelle la quantit damplicons produits durant la raction. Il existe deux principes gnraux pour la dtection quantitative des amplicons : les agents se liant lADN double brin (ex. SYBR Green I) et les sondes fluorescentes. Pour cette dernire catgorie, il existe prsentement quatre technologies principales : hydrolyse de sondes (Taqman assay), hybridation de 2 sondes (HybProbes), balises molculaires (Molecular Beacons) et amorces scorpion (Scorpion primers). Selon Wittwer et al. (1997), ces diffrentes technologies de dtection auraient une sensibilit quivalente. Cependant, ces technologies prsentent des diffrences au niveau de la spcificit (Bustin, 2000). 1) Agents se liant lADN double brin (Double-stranded DNA binding dyes: Lightcycler assay) Les molcules qui se lient lADN double brin peuvent tre divises en deux classes: les agents intercalants comme le bromure dthidium (Higuchi et al, 1992), le YO-PRO-1 (Ishiguro et al, 1995; Tseng et al, 1997), le SYBR Green I (Morrison et al, 1998) et les agents se fixant au sillon mineur (minor groove binders) comme le Hoeschst 33258 (Searle et Embrey, 1990; Nielsen, 1991). Leur mission fluorescente augmente lorsque quils sont lis lADN double brin. Pour tre utiliss dans une raction de PCR en temps rel, ces agents doivent rencontrer deux exigences : augmenter en fluorescence lorsque li lADN double brin et ne pas inhiber la raction de PCR. Le SYBR Green I, dont le mcanisme de liaison nest pas bien dfini, est lagent le plus frquemment utilis. Ses avantages sont

quil est conomique, facile utiliser et possde plus de sensibilit que le bromure dthidium sans inhiber la raction damplification. Lors de la raction damplification par PCR, le colorant libre en solution exhibe peu de fluorescence. Durant ltape dlongation, une augmentation de la fluorescence est associe la quantit de colorant se fixant lADN double brin naissant. Lorsque suivi en temps rel, laugmentation du signal de fluorescence est observe pendant ltape de polymrisation et lmission fluorescente dcrot compltement lorsque lADN est dnatur ltape suivante. Consquemment, lmission de fluorescence est mesure la fin de chaque tape dlongation pour chacun des cycles par un systme de lecture intgr lappareil de PCR en temps rel qui permet de suivre laugmentation de la quantit dADN amplifi durant la raction (Bustin, 2000) (figure 1). La technologie base sur le SYBR Green I ne ncessite aucune sonde fluorescente mais sa spcificit repose entirement sur ses amorces (Bustin, 2000). Elle ne requiert donc aucune expertise particulire pour le design des sondes fluorescentes et nest pas affecte par des mutations dans lADN cible qui influencent lhybridation des sondes spcifiques (Mackay et al, 2002). tant donn que le SYBR Green I se fixe nimporte quelle molcule dADN double brin, cette technologie prsente une certaine versatilit puisque le mme agent peut tre utilis pour dtecter plus dun produit damplification dans la mme squence ractionnelle. Cette technologie prsente aussi certains dsavantages: 1) tant donn que lADN double brin total met des signaux, il devient impossible en cours de raction de sassurer de la spcificit des amplicons ou de discriminer les diffrents amplicons dans le cas de multiplexage; 2) le mauvais appariement (mis-primering), gnrant souvent des bandes dADN superflues observables sur gel dlectrophorse, peut conduire des faux positifs ou une surestimation de la quantification; 3) lmission de fluorescence peut tre biaise par la masse molculaire de lADN amplifi par un amplicon plus long qui fixera davantage de molcules fluorescentes par rapport un amplicon plus court dans la mme raction (Bustin, 2000). 2) Hydrolyse de sondes (Hydrolysis probes: Taqman assay) La technologie Taqman est base sur lactivit 5-exonuclasique de la Taq polymrase pour hydrolyser une sonde hybride sa squence cible sur lamplicon durant ltape dhybridation/extension de la PCR. Un fluorochrome metteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxyfluorocein) est fix lextrmit 5 de la sonde dhybridation et son mission est inhibe par un second fluorochrome suppresseur (quencher) prsent lextrmit 3 (ex. TAMRA : 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine). Lorsque stimul, le fluorochrome metteur transfert son nergie au fluorochrome suppresseur voisin par le principe

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a
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c
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: fluorochrome stimul : fluorochrome non stimul libre

: amplicon

: amorce

: ADN double brin cible

Figure 1 : Agents se liant lADN double brin (Double-stranded DNA binding dyes: Lightcycler assay). (a) Durant la dnaturation, le SYBR Green I libre exhibe peu de fluorescence. (b) la temprature dappariement, quelques molcules se lient au double brin dADN naissant rsultant en une mission de fluorescence lors de lexitation. (c) Durant la phase de polymrisation, de plus en plus de molcules se lient au brin naissant et laccroissement de la fluorescence peut-tre suivi en temps rel.

FRET (fluorescence resonance energy transfer) qui dissipe cette nergie sous forme de chaleur plutt que dmettre de la fluorescence (Mackay et al, 2002). tant donn que lactivit 5-exonuclasique de la Taq polymrase est spcifique lADN double brin, les sondes libres en solution demeurent intactes et aucune fluorescence nest mise. Lors de ltape dhybridation, la sonde et les amorces se fixent leurs squences complmentaires respectives. A ltape suivante, la Taq polymrase dbute llongation du nouveau brin dADN partir de lamorce jusqu ce quelle rencontre sur son passage la sonde hybride quelle dplace et hydrolyse avec son activit 5-exonuclasique. Le reporter est alors libr de lenvironnement du suppresseur permettant ainsi lmission de fluorescence qui augmente chaque cycle proportionnellement au taux dhydrolyse de la sonde (figure 2A). Comme la Taq polymrase hydrolysera la sonde seulement lorsque celle-ci est hybride sa squence complmentaire, les conditions de temprature de ltape de polymrisation doivent tre ajustes de faon permettre la sonde de rester hybride durant cette tape. La majorit des sondes ont une temprature de dissociation (Tm) autour de 70C ou de 5 10 oC plus leve que les amorces. Par consquent, la technologie Taqman utilise une tape combine dhybridation et de polymrisation 60-62C assurant lhybridation et la stabilit de la sonde durant lextension. Ceci permet aussi une activit 5-exonuclasique maximale de la Taq polymrase mais, lefficacit de lactivit de

polymrisation de lenzyme sera lgrement rduite cette temprature suboptimale. Pour de longs amplicons, une tape dhybridation/polymrisation plus longue ou encore une augmentation de la concentration en Mn2+ ou Mg2+ pourrait savrer ncessaire pour stabiliser lhybridation de la sonde sa squence cible. Les principes respecter dans le design des sondes Taqman sont aussi applicables aux autres sondes linaires et comprennent comme rgles gnrales : 1) une longueur de 20-40 nuclotides, 2) un contenu en G-C variant de 4060%, 3) aucun patron de squence rpte, 4) aucune squence permettant une hybridation ou un chevauchement avec les amorces, 5) un A, un C ou un T lextremit 5 parce quun G supprime la fluorescence de lmetteur mme aprs clivage et, 6) un Tm de 5 10 oC plus lev que les amorces afin de sassurer quelles shybrideront avant les amorces et quelles demeureront hybrides pendant ltape combine dhybridation et de polymrisation (Bustin, 2000; Mackay et al, 2002). Les sondes fluorescentes possdent comme avantage par rapport aux agents se liant lADN une spcificit accrue et une meilleure capacit de multiplexage. La spcificit dhybridation entre la sonde fluorescente et sa squence dADN cible rduit significativement lmission de fluorescence non spcifique due des mauvais appariements ou des dimres damorces (primer-dimers). Des ractions multiplexes peuvent tre labores en utilisant des fluorochromes metteurs distincts lis des sondes diffrentes dans une mme raction de PCR.

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: sonde TaqMan

: sonde hydrolyse avec suppresseur

: ADN double brin cible

: sonde hydrolyse avec fluorochrome stimul

: amplicon

: amorce

B a
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5

b
5

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3 5

c
3

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: sonde avec fluorochrome donneur : sonde avec fluorochrome metteur

: sondes hybrides avec mission de fluorescence rouge

Figure 2 : A: Hydrolyse de sondes (Hydrolysis probes: Taqman assay) (a) Durant ltape de dnaturation, la sonde est libre en solution. (b) la temprature dappariement, la sonde et les amorces shybrident leurs squences cibles respectives et la proximit des fluorochromes permet linhibition de la fluorescence. La polymrisation dbute. (c) La polymrase dplace et hydrolyse la sonde. Le fluorochrome metteur est libr de lenvironnement du suppresseur permettant ainsi lmission de la fluorescence. B: Hybridation de 2 sondes (Hybridization probes) (a) Durant ltape de dnaturation, les deux sondes demeurent spares et en solution. (b) la temprature dappariement, les sondes shybrident leurs squences cibles respectives et la proximit des fluorochromes permet lmission de fluorescence rouge par le principe FRET. (c) Les sondes retournent libres en solution.

La technologie Taqman est toutefois moins efficace et moins flexible que dautres technologies en temps rel pour la dtection de mutations spcifiques (Bustin, 2000; Mackay et al, 2002). 3) Hybridation de 2 sondes (Hybridization probes) Cette technologie est aussi connue sous le nom de

HybProbes et repose sur lutilisation de deux sondes linaires complmentaires une squence cible pour maximiser la spcificit du signal (Wittwer et al, 1997). Une premire sonde, bloque son extrmit 3 afin de prvenir son extension durant ltape dlongation, transporte en 3 un fluorochrome donneur (FITC) qui produit une lumire fluorescente verte lorsque excit

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par une source de lumire. Son spectre dmission est plus large que celui du fluorochrome accepteur (Red 640 ou Red 705) attach lextrmit 5 dune seconde sonde. En solution, les deux sondes sont libres et spares. tant donn que le transfert dnergie par le principe FRET dpend de la distance entre les deux fluorochromes, il en rsulte alors seulement un bruit de fond de fluorescence verte mis par le fluorochrome donneur. Pendant ltape dhybridation, les deux sondes se fixent leurs squences cibles respectives localises moins de 10 nuclotides (Mackay et al, 2002) dans un arrangement en tte--queue. La proximit des deux fluorochromes permet le transfert nergtique de la fluorescine verte par le principe FRET au fluorochrome accepteur rouge et provoque son mission fluorescente. Pendant ltape de polymrisation, les deux sondes retournent de faon indpendante en solution ce qui supprime lmission de fluorescence rouge (figure 2B). Laccroissement de la fluorescence rouge est proportionnel la quantit dADN synthtis durant la raction PCR et commence diminuer lorsque la quantit damplicons produits devient suffisamment importante pour provoquer une comptition de lADN amplifi avec lhybridation simultane des 2 sondes sur lADN cible (Mackay et al, 2002). Cette technologie possde donc une grande spcificit et permet aussi une grande flexibilit dans le design des sondes. De plus, comme les sondes ne sont pas hydrolyses, elles sont rutilises chacun des cycles (Bustin, 2000). En plus du fait que la squence cible doit tre localise vers lextremit 3 de lamplicon et que le Tm des deux sondes doit tre similaire, les principes gnraux dans le design des sondes Taqman sont applicables pour cette technologie. 4) Balises molculaires (sonde dhybridation en pingle cheveux: Molecular Beacons) Une balise molculaire est une sonde dhybridation dADN en forme dpingle cheveux. La portion de la sonde qui compose la boucle est complmentaire la squence cible dADN. Le tronc de la balise molculaire est form de deux bras avec des squences complmentaires (Tyagi et Kramer, 1996). Un metteur fluorescent (FAM, TAMRA, TET, ROX) est fix lextrmit dun des bras et un suppresseur (quencher) (4-(4-dimethylamino-phenylazo)benzene: DABCYL) est fix lextrmit de lautre bras. Le suppresseur est un chromophore non-fluorescent qui dissipe en chaleur lnergie du fluorochrome metteur par le principe FRET. Les sondes libres adoptent en solution une structure en pingle cheveux et le tronc maintient les bras ensemble pour une suppression efficace de lmission de fluorescence. Pendant ltape dhybridation, lorsque la sonde rencontre une squence qui lui est complmentaire, elle adopte une conformation transitoire qui force le tronc se sparer librant ainsi les 2 bras. La sonde shybride alors prfrentiellement sa squence complmentaire cible sur la matrice. Dans cette conformation, le fluorochrome

metteur est loign de son suppresseur restaurant ainsi lmission de fluorescence qui peut tre dtecte alors que les autres balises molculaires demeurent en structure dpingle cheveux (position ferme). Si la squence dADN cible ne correspond pas parfaitement (mismatch) la squence de la balise molculaire aucune hybridation et, par consquent, aucune mission fluorescente ne survient. Ceci est principalement d aux proprits thermodynamiques de la structure de la balise molculaire qui favorisent surtout la formation de lpingle cheveux sauf en cas dhybridation parfaite des squences (Bustin, 2000) (figure 3A). La spcificit de cette technologie est telle quelle permet de dtecter les diffrences de squences au nuclotide prs, ce qui peut tre parfois difficile raliser avec les technologies de sondes linaires (Giesendorf et al, 1998; Marras et al, 1999). Elle constitue donc une technologie efficace pour la dtection et le criblage grande chelle des SNPs (single nucleotide polymorphisms) (Tyagi et al, 1998; Mhlanga et Malmberg, 2001). Les sondes sont dessines pour demeurer intactes durant la raction damplification et doivent se rhybrider la cible chaque cycle pour mesurer le signal constituant ainsi un autre avantage par rapport aux sondes Taqman hydrolyses chaque cycle. Le dsavantage le plus important associ lutilisation des balises molculaires est le design des sondes dhybridation. Un design optimal du tronc des balises molculaires est crucial. Avec un design non adquat, le tronc pourrait adopter une conformation diffrente qui loignerait le fluorochrome metteur de lenvironnement immdiat du suppresseur rsultant ainsi en une population de sondes mal supprimes et un bruit de fond important. En contrepartie, si les forces dhybridation du tronc (dpendantes de la longueur et de la composition des squences complmentaires des bras) sont trop importantes, elles peuvent interfrer avec lhybridation de la balise molculaire sa squence complmentaire cible et lmission de fluorescence. Un profil de dnaturation thermique prcis de chacune des balises molculaires doit tre tabli pour dterminer les caractristiques de dissociation (melting) des bras. Plusieurs variantes de cette technologie comme les Sunrise primers (maintenant sous appellation commerciale Amplifluor TM hairpin primers) (Nazarenko et al, 1997; Myakishev et al, 2001), les cyclicons (Kandimalla et Agrawal, 2000) et les amorces scorpion (Mhlanga et Malmberg, 2001) ont t proposes pour la dtection dacides nucliques spcifiques dans des solutions homognes. 5) Amorces scorpion (Scorpion primer: self-fluorescing amplicon) Les amorces scorpion reprsentent une variante de la technologie des balises molculaires. Les fluorochromes et la sonde (partie balise molculaire) sont intgrs mme lamplicon de faon irrversible durant lamplification par

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: balise molculaire : suppresseur

: amorce : fluorochrome metteur

: amplicon

: ADN double brin cible

B
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b
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c
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3 5

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e
3

: amorce/sonde scorpion

: bloqueur (HEG)

: amorce

Figure 3 : A: Balises molculaires (Molecular Beacons). (a) Durant ltape de dnaturation, la balise molculaire est sous forme relaxe et libre en solution mais la proximit des fluorochromes permet linhibition de la fluorescence. (b) Lorsque la sonde shybride sa squence cible, le fluorochrome metteur est suffisamment loign de son suppresseur pour permettre lmission de fluorescence. (c) ltape de polymrisation, la balise molculaire retourne en solution sous forme dpingle cheveux. B: Amorces scorpion (Scorpion primer). (a) Durant ltape de dnaturation, la balise molculaire est sous forme relaxe et libre en solution mais la proximit des fluorochromes permet linhibition de la fluorescence. (b) Lamorce scorpion se fixe sa squence complmentaire cible. (c) Polymrisation du brin complmentaire. (d) Dnaturation des brins dADN. (e) Hybridation de la squence complmentaire de la partie balise molculaire sa squence cible permettant lmission de fluorescence.

PCR. Le design dune amorce/sonde scorpion est pratiquement similaire celui des balises molculaires. Lajout dune molcule dhexthylne glycol (HEG), aussi appel bloqueur (stopper), est ncessaire pour empcher la rplication de la balise molculaire par lADN polymrase

pendant la raction de PCR. Le HEG est donc situ aprs le fluorochrome supresseur et est suivi dune rgion amorce. Le fluorochrome metteur port en 5 de la rgion balise molculaire peut tre le FAM ou le ROX et le suppresseur est normalement le rouge de mthyl. La rgion amorce du

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scorpion permet donc dintgrer la balise molculaire dans le nouvel amplicon pendant la raction de PCR. La boucle de lpingle cheveux est dessine dans le but de permettre lhybridation de la sonde sa squence complmentaire cible situe sur lamplicon (figure 3B). Cette hybridation force lpingle cheveux changer de conformation permettant ainsi lmission de fluorescence (Whitcombe et al, 1999; Thelwell et al, 2000; Mackay et al, 2002). Thelwell et al (2000) rapportent que la technologie amorce/sonde scorpion est gnralement plus efficace que les technologies Taqman et balises molculaires, particulirement dans un programme de PCR possdant des cycles trs courts. Cycle seuil (Threshold cycle) Le concept du cycle seuil est la base dune quantification prcise et reproductible pour les techniques fluorescentes en PCR. Les valeurs de fluorescence sont enregistres au cours de chaque cycle et reprsentent la quantit damplicons produits en un point prcis dans la raction (figure 4). Plus il y a de matrices (template) amplifier au dpart de la raction PCR, moins lev sera le nombre de cycle requis pour atteindre un point o le signal dmission de fluorescence sera statistiquement et significativement plus lev que le bruit de fond (Gibson et al, 1996). Ce point est dfini comme tant le cycle seuil (Ct) et apparatra toujours au cours de la phase exponentielle damplification. Par consquent, la quantification nest pas affecte par lpuisement dun des ractifs comme lors de la phase plateau ce qui explique pourquoi le systme en temps rel est si reproductible. La valeur du Ct peut tre traduite en un rsultat quantitatif en la comparant avec les valeurs du Ct gnres avec des matrices de quantification connues (Bustin, 2000). Applications La PCR en temps rel, cause de sa capacit produire des rsultats rapides, spcifiques et quantitatifs, trouve de plus en plus dapplications dans diffrents domaines. Bien que cette liste ne soit pas exhaustive, voici les exemples dapplication les plus courants. La PCR en temps rel permet maintenant de raliser des tudes plus fines dexpression gntique partir de tissus ou de lignes cellulaires comme pour lanalyse quantitative de lexpression de diffrents gnes dans des tudes de modulation du cycle cellulaire avec des tissus exposs des carcinognes non gnotoxiques (cie TNO BIBRA), les analyses de promoteurs dans des lignes cellulaires avec le gne reporter de la chloramphnicol actyl transfrase (Jeyaseelan et al, 2001), les tudes de modifications dexpression gntique dans les expriences drogues/rponses (drug/response), ltude des ARNm variants rsultant dpissage alternatif (alternative splicing) (Vandenbroucke et al, 2001), etc. Elle peut aussi permettre de standardiser la quantit dADN de dpart et dvaluer la quantit dARNm en fin de raction dans des tudes de

transcription in vitro (Liu et al, 2002). La PCR en temps rel savre aussi un outil puissant pour des analyses de mutations comme les SNPs et des tudes de gnotypage grande chelle comme pour le gne du rcepteur dstrogne (Tpp et al, 2000). De plus en plus des tests utilisant la technologie des balises molculaires sont dessins pour la dtection et la quantification rapide dagents pathognes viraux, bactriens et parasitaires. Vet et al (1999) ont dj propos un systme multiplexe qui permet la dtection et la quantification simultanes des rtrovirus HIV-1, HIV-2, des virus lymphotrophiques-T humains de type I et de type II avec un seuil de dtection de 10 copies de gnome et Poddar (1999) pour la dtection dadnovirus. Des tests de dtection ont aussi t mis au point pour Salmonella avec une sensibilit de 2 CFU par raction de PCR en temps rel (Chen et al, 2000) et de 1 CFU/ml aprs 6 h denrichissement pour Escherichia coli O157:H7 partir dchantillons de lait cru et de jus de pomme (Fortin et al, 2001). Chez les parasites, un test de PCR en temps rel a t dvelopp pour Toxoplasma gondii (Lin et al, 2000). Plusieurs laboratoires travaillent prsentement la mise au point de nombreux autres tests diagnostiques pour diffrents agents pathognes. Traditionnellement, lanalyse du nombre de copies dun plasmide pour valuer la stabilit gntique des collections de cellules tait effectue par transfert de Southern (Southern blot). La PCR en temps rel permet maintenant de raliser ces analyses de faon beaucoup plus rapide et plus prcise. Elle peut aussi tre utilise dans lvaluation de la quantit dADN chromosomique contaminant ou rsiduel bactrien ou de mammifres dans la production de protines recombinantes. Lanalyse de la bio-distribution dun vecteur est un lment important dans lvaluation de lefficacit de protocoles de thrapie gnique. La PCR en temps rel simplifie les tudes dvaluation de la prsence/absence dADN ou dARNm cible dans les diffrents tissus et permet de dterminer les conditions dquilibre des ARNm exprims (steady-state expressed mRNA). Conclusion Selon la littrature, la technique la plus frquemment utilise jusqu maintenant est la technologie des sondes dhydrolyse (Taqman assay) bien que sa popularit soit principalement due sa maturit commerciale. Cette technologie sest avre plus efficace que celle des agents intercalants au niveau de la spcificit et du multiplexage. Le dveloppement des technologies de dtection base de balises molculaires amne encore davantage de spcificit et de prcision entre autre pour la dtection des SNPs et des analyses de gnotypage comparativement aux technologies bases sur les sondes linaires. La PCR en temps rel savre trs intressante pour des applications danalyses grande chelle tant donn que le processus complet est

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0,9 0,8 0,7 0,6

Fluorescence

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

1 6 11

Ct : cycle seuil

Ligne de base

16

21

26

31

36

Nom bre de cycles

Figure 4 : Modle graphique de la PCR en temps rel o lintensit de la fluorescence est exprime en fonction du nombre de cycles. Lintensit de la fluorescence chaque cycle est proportionnelle la concentration damplicons, le cycle seuil (Ct) reprsente le nombre de cycles requis o le signal dmission de fluorescence est statistiquement et significativement plus lev que la ligne de base.

automatis du dbut la fin. Comme cette technique comprend gnralement des systmes en tubes ferms et que la quantification ne requiert aucune manipulation postamplification, les problmes de contamination post-PCR par les amplicons sont fortement rduits. Des analyses dexpression de gnes, de rponse cellulaire diffrentes drogues (drug/response), de dtection de mutations, de gnotypage, de dtection et quantification dagents pathognes, de quantification dADN et dARN, dessais dexpression et de distribution pour la thrapie Rfrences
Bustin, S. A. 2000. Absolute quantification of mRNA using realtime reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology # 25: 169-193. Chen, W., Martinez, G. and Mulchandani, A. 2000. Molecular beacons : A real time polymerase chain reaction assay for detecting Salmonella. Analytical Biochemistry # 280: 166-172. Fortin, N. Y., Mulchandani, A. and Chen, W. 2001. Use of real time polymerase chain reaction and molecular beacons for the detection of Escherichia coli O157:H7. Analytical Biochemistry # 289: 281-288.

gnique, de quantification du nombre de copies dans une collection de cellules et, finalement, dvaluation dADN rsiduel sont, prsentement, quelques exemples dapplications de plus en plus rpandus de la PCR en temps rel. La PCR en temps rel est donc un outil puissant et les dveloppements rcents dans les diffrentes technologies de dtection laissent entrevoir des applications plus innovatrices les unes que les autres.

Gibson, U. E., Heid, C. A. and Williams, P. M. 1996. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Research # 6: 995-1001. Giesendorf, B. A., Vet, J. A., Tyagi, S., Mensink, E. J., Trijbels, F. J. and Blom, H. J. 1998. Molecular beacons: a new approach for semiautomated mutation analysis. Clinical Chemistry # 44: 482486. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S. and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and dectection of specific DNA sequences. Biotechnology # 10: 413-417.

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Summary: Real-Time PCR technology is getting more and more popular for different sectors of activity. This technology is based on the detection and quantification of a fluorescent reporter whose emission is directly proportional to the quantity of amplicons produced during the PCR reaction. Because it is generally performed with closed tube systems and that quantification does not require any post-amplification

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handling, amplicons process is rendering

the risks of post-PCR contamination by are significantly reduced. The complete automated from the beginning to the end, this technology very performing for high-

throughput analyses. This paper presents a description of the Real-Time PCR based principles, different amplicons detection technologies and examples of current applications. .

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