Licenciatura em Medicina Veterinria

MICROBIOLOGIA MDICA E IMUNOLOGIA

MICOLOGIA
Apontamentos para as aulas prticas 2006-2007

Elsa Maria Leclerc Duarte Assistente do Departamento de Sanidade Animal e Vegetal

E.L.Duarte UE-DSAV

Nota prvia As aulas prticas de Micologia tm por objectivo conhecer os meios de cultura utilizados para o crescimento dos fungos, o tipo de sementeiras e temperaturas de incubao, as tcnicas de observao microscpica e a identificao de vrias espcies de fungos filamentosos. Este texto de apoio execuo dos trabalhos prticos do mdulo de Micologia da disciplina de Microbiologia Mdica e Imunologia. Este texto no constitui material de estudo suficiente para a avaliao prtica deste mdulo, devendo os alunos consultar a bibliografia recomendada. Princpios Bolores so fungos multicelulares e filamentosos. As tcnicas de cultivar e observar fungos diferem dos mtodos utilizados no estudo de bactrias. Os fungos crescem mais lentamente, requerendo vrios dias ou semanas para formar colnias visveis macroscopicamente. Usualmente, o crescimento espalha-se por toda a superfcie da placa. Produzem esporos numa hifa area fortemente corada. A maior parte dos fungos cresce melhor temperatura ambiente (25 C). As colnias dos bolores podem ser examinadas directamente em cultura com uma lupa. No entanto, melhor prtica retirar uma poro da colnia e colocar sobre uma lmina com uma gota de gua ou corante (montagem hmida). Em alternativa, o mtodo da cultura em lmina, mais vantajosa porque permite o estudo do crescimento do fungo e identificar as estruturas celulares sem perturbar a cultura. A) Meios de cultura utilizados e preparaes microscpicas Existem vrios meios de cultura para o crescimento dos fungos mas o meio mais popular o agar de Sabouraud (glucose 4%, peptona 1%, agar 2%, pH ~5,6) ao qual se acrescenta um antibitico (cloranfenicol ou gentamicina por exemplo) de forma a inibir o crescimento bacteriano. Existem outros meios que permitem o crescimento dos fungos, uns mais enriquecidos para fungos mais fastidiosos (agar sangue, caldo BHI, etc) outros relativamente simples ou muito simples (agar malte, agar PDAPotato dextrose agar, etc.) de forma a favorecer a produo de estruturas de frutificao (esporos). Estes meios mais pobres so muito utilizados como meios de cultura de repicagem, quando no conseguimos observar estruturas reprodutoras na primocultura. A temperatura de incubao para a maioria dos fungos saprfitas ou agentes de micoses superficiais de 25C. Para alguns fungos patognicos (sobretudo agentes de micoses sistmicas) a temperatura de incubao 37C. A generalidade dos fungos desenvolve-se melhor na escurido e com humidade relativa elevada. So quase todos aerbios Existem vrias coloraes para observar os fungos ao microscpio, mas a mais utilizada o lactofenol-azul de algodo. H duas tcnicas para observarmos uma colnia ao microscpio

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1- Tcnica convencional: Com o bico de Bunsen aceso, colocar uma gota de lactofenol azul de algodo numa lmina limpa e desengordurada. Retirar um pequeno bloco de colnia com o fio recto esterilizado e colocar na lmina. Cobrir com uma lamela e observar ao microscpio. Nota: Se o bloco for muito espesso passar a lmina pela chama de forma a derreter o agar. 2- Tcnica da fita-cola Com o bico de Bunsen acesso, colocar uma gota de lactofenol azul de algodo numa lmina limpa e desengordurada. Cortar um pouco de fita cola e colocar no fio recto esterilizado e arrefecido. Tocar na parte area da colnia com a fita-cola. Colar a fita-cola na lmina com o corante. Colocar outra gota de lactofenol- azul de algodo por cima da fita-cola. Cobrir com uma lamela e observar ao microscpio. B) Execuo de cultura em lmina (ou microcultura) B.1) Utilidade da cultura em Lmina A cultura em lmina uma cultura realizada pelos micologistas de forma a observar estruturas fngicas intactas e bem individualizadas o que por vezes difcil nas preparaes usuais (tcnica convencional ou com fita-cola entre lmina e lamela). Quase todas as fotografias de vrios livros de micologia so tiradas a fungos filamentosos deste tipo de cultura.

2) Material necessrio : Cultura do fungo Placa de Petri Vareta de vidro dobrada em V Papel de filtro gua destilada esterilizada Fio recto Pina esterilizada Bisturi com lmina esterilizada Placa de Petri com meio de cultura slido (espesso) Azul de lactofenol

3) Preparao do material :

A cultura do fungo a estudar deve ser recente e estar em meio

slido.

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 Forra-se com o papel de filtro a placa de Petri na qual vai ser feito

a cultura em lmina Colocar a vareta de vidro dobrada, a lmina e as lamelas dentro da caixa, embrulhar em papel e esterilizar. O meio de cultura utilizado pode ser agar de Sabouraud ou qualquer outro meio que seja mais indicado e j deve estar solidificado em placa de Petri com cerca de 6 mm de espessura.

4) Execuo

1.

Com o bico de Bunsen ligado, coloca-se a lmina sobre a vareta em V com a pina esterilizada de forma a ficar estvel e de no tocar no papel de filtro. 2. Molhar o papel de filtro com gua destilada esterilizada (deste modo a placa funcionar como uma cmara hmida). 3. Corta-se com o bisturi um pequeno bloco (paraleleppedo) do meio de cultura espesso com aproximadamente 5 mm de lado (Fig.1-A) e que se coloca depois sobre a lmina (Fig.1-B) 4. Retiram-se pequenas pores da colnia que se semeiam ao centro de cada uma das faces laterais do bloco de agar que est sobre a lmina 5. Com a ajuda de uma pina esterilizada cobrir o bloco com uma lamela esterilizada (Fig1-D) 6. Identifica-se a placa, coloca-se na estufa a 25C e acompanha-se o crescimento da cultura at que as hifas cresam de forma a ficarem aderentes superfcie inferior da lamela. 7. Aps o crescimento retira-se a lamela colocando-a numa nova lmina de microscopia contendo j uma gota de azul de lactofenol 8. Podemos tambm utilizar a lmina da cultura em lmina (se houver crescimento) quando no for possvel a identificao pela lamela colocando uma gota de azul de lactofenol e uma lamela nova

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Fig 1- Execuo de cultura em lmina (ou microcultura)

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C) Identificao dos fungos filamentosos Os fungos podem ser identificados em cultura pelas suas caractersticas morfolgicas microscpicas e macroscpicas. Estas caractersticas so teis para a identificao dos fungos filamentosos (tambm denominados por vezes bolores) pois para as leveduras (unicelulares), pouca informao pode ser retirada da sua morfologia, sendo muitas vezes necessrio identific-las por testes metablicos (por exemplo atravs da utilizao de galerias bioqumicas como para a identificao de bactrias). O facto de um fungo ser unicelular (levedura) ou pluricelular (filamentoso) no tem valor taxonmico (existe estas duas morfologias em vrios filos do reino Fungi) C.1) Caractersticas macroscpicas das colnias nos fungos filamentosos As caractersticas morfolgicas macroscpicas so o 1 passo na identificao dos fungos filamentosos. importante observar e registar:
- A topografia da colnia: plana, elevada, umbeliforme, cerebriforme;

- A textura da colnia: algodonada, aveludada, granulosa, pulverulenta, membranosa, cremosa, mucosa. - A cor da colnia no verso e no reverso - A produo de pigmentos. - O miclio areo e submerso.

C.2) Caractersticas microscpicas dos fungos filamentosos As estruturas que mais auxiliam na identificao so o miclio reprodutivo e eventualmente o miclio vegetativo.

C.2.1) Tipo de hifas Devemos em primeiro lugar observar o tipo de hifa: No septadas (ou cenocticas) caractersticas de filos mais inferiores como dos Zygomicota; Septadas caractersticas dos outros filos

C.2.2) Estruturas reprodutoras- Esporos assexuados

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A seguir devemos observar as estruturas reprodutoras. Normalmente as estruturas da reproduo assexuada so as apresentadas quando cultivamos o fungo em laboratrio. Existem dois grandes tipos de esporos assexuados: - Endsporos ou esporangisporos: - Exsporos ou condeos

C.2.2.1) Esporangiporos So esporos internos e esto localizados no interior de uma estrutura denominada ESPORNGIO. So caractersticos do filo Zygomicota.

Fig.2 A- Aspecto geral de um fungo das estruturas reprodutoras nos Zygomicota. B- Estruturas observveis ao microscpio em Rhizopus sp.

Exemplo observado na aula: Rhizopus stolonifer (Mucorales) Observar as hifas no septadas, os esporngios, esporangisporos e os rizodes

C.2.2.2) Exsporos ou condeos

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A conidiognese a forma como se formam os condeos. As clulas que produzem os condeos so denominadas clulas conidigenas e podem estar assentes em estruturas chamadas conidiforos. Existem dois tipos de conidiognese: tlica e blstica Na conidiognese tlica, uma parte de uma hifa j existente se transforma num ou em vrios condeos. Na conidiognese blstica, uma clula da hifa (a clula conidigena) cria uma ou mais tumefaces mais ou menos esfricas que iro formar clulas filhas. A clula filha separada da clula me por um septo e designada por Blastsporo. Este processo denomina-se gemulao no caso das leveduras

Exemplos de conidiognese estudados na aula: 1- Conidiognese tlica solitria Microsporum canis

2- Conidiognese tlica rtrica Geotrichum candidum

3- Conidiognese blstica solitria

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Humicola sp.

4- Conidiognese blstica acrpeta Cladosporium sp. Alternaria sp.

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5- Conidiognese blstica sncrona Botrytis sp.

6- Conidiognese blstica simpodial Beauveria sp. (no observado na aula) Beauveria sp.

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7- Conidiognese blstica aneldica Scopularopsis sp.

8- Conidiognese blstica fialdica Aspergillus sp. Aspergillus niger Penicillium sp.

Aspergillus sp.

Penicillium sp.

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