ANIMALES TRANSGNICOS

Esther Camacho Cano

3ro Biotecnologa

Para Francesca

Tema 1: Introduccin a las tcnicas de manipulacin gentica animal

Los animales transgnicos sirven para entender aspectos de la biologa ya que permiten conocer las funciones, hasta entonces desconocidas, de muchos genes. As, las diferentes secuencias de los genes tendrn una funcin que se detectara mediante modelos animales. La idea es crear 20.000 ratones (tantos como nmero de genes humanos), cada uno con una mutacin en un gen diferente de manera que se cubran todos. Despus, se observara que les pasa a los ratones en ausencia del gen concreto y se podra, entonces, determinar la funcin del gen. En la actualidad se tienen 8.000 stem cells con una mutacin en un gen diferente. Para determinar el fenotipo del ratn mutado, este tendr que pasar por una serie de pruebas que evalan diferentes capacidades, para as determinar con exactitud que parte se ve alterada por la ausencia del gen. Estos ratones se denominan mouse clinics. En el mundo existe un gran nmero de enfermedades raras en las que no se sabe que genes se encuentran alterados. Mediante esta tecnologa se podran estudiar estos genes, como afecta su alteracin a los pacientes y, finalmente, establecer una terapia adecuada para su cura. La sustitucin gnica, nos permite crear estos modelos animales. Otra manera es hacer animales transgnicos en los que se aumenta la dotacin gnica.

Microinyeccin de DNA Los animales transgnicos se pueden obtener por microinyeccin de vulos fecundados. Para microinyectar a un animal se necesitan meses de entrenamiento. Los vulos fecundados se deben microinyectar en estadio de una clula con los dos proncleos formados. Se puede inyectar el DNA de inters directamente en el ncleo. Para ello, la pipeta debe entrar dentro del ncleo pero sin tocar el nuclolo. Durante este proceso el embrin est sujeto mediante una pipeta ms grande que crea el vaco. La pipeta de microinyeccin tiene extremos romos que sirven para sujetar el embrin sin daarlo. El sistema en si es muy complejo. Un paso clave en l es la obtencin de micropipetas, deben estar bien hechas ya que es imprescindible inyectar muy rpido. Hay modelos de mquinas que hacen micropipetas con un tamao determinado. En estas mquinas el dimetro de las pipetas se puede especificar por ordenador. Con el uso las micropipetas se obturan. Se deben hacer muchas. Una microforja permite dar un ngulo determinado a las micropipetas, esta curvatura permite pinchar bien los embriones.

Imagen: Punta de micropipeta curvada

En el proceso de microinyeccin se usa el microscopio invertido. Tiene un sistema lleno de parafina, tambin hay un microinyector que se puede regular. Dentro del ncleo, se microinyecta una cantidad de DNA muy pequea, es un sistema muy artesanal. Los embriones se obtienen fecundando un macho con una hembra que se ha estimulado. De este modo se obtienen muchos embriones. Cuando los embriones estn listos se ponen en un receptculo del microscopio invertido. Estos receptculos son portas perforados en los que se engancha un cubre: La parafina sirve para que las gotas que contienen el DNA y los embriones no se unan. Las micropipetas se unen a una barra metlica. Como el espacio entre el porta y el cubre estn llenos de parafina se consigue ejercer una presin. Entonces la pipeta ya se puede cargar de DNA y se van pinchando los embriones desde arriba. La gestacin tiene lugar en hembras pseudogestantes. Estas hembras han sido previamente cruzadas con machos vasectomizados para inducir la produccin de hormonas. Esta monta le provoca a la hembra un paro en su ciclo estral cosa que las prepara hormonalmente para gestar. Se sabe las hembras pseudogestantes que hay por el tapn vaginal Por lo tanto se han dado dos cruces, uno entre una hembra y un macho para obtener los embriones en los que se les inyecta el DNA, y el otro que se realiza entre la hembra a la que transferiremos los embriones y un macho vasectomizado. Se debe tener en cuenta que para este proceso es muy importante utilizar hembras de una cepa pacfica para que gesten los embriones. El motivo es que las cepas normales tienden a comerse a las cras si estas son muchas o tienen alguna anomala. La transferencia a hembras receptoras se hace por detrs mediante cirugia, metiendo la pipeta por el infundibulum. Se hacen dos operaciones, una en cada lado; de modo que se inyectan 20

embriones por lado. De este nmero, no todos se implantan, pero as se garantiza que el nmero de implantados sea elevado. Los blastocistos se transfieren preferentemente al tero de la hembra. La transferencia a tero se hace 2,5 dpc (das post coitum, que se cuentan a partir del tapn vaginal), en cambio si la transferencia es en oviducto se hace 0,5 dpc. La microinyeccin del DNA se ha realizado en el proncleo masculino.

Se debe tener en cuenta que la incorporacin del DNA es al azar en el genoma y en un mismo embrin el DNA se puede incorporar en varios puntos. Solo se microinyecta el gen que, cuando se incorpora, normalmente lo hace cabeza-cola:

De todos los ratones que nazcan no todos sern transgnicos. Habr algunos que no habrn incorporado el transgen. Los que lo hayan incorporado sern o mosaicos o transgnicos. El animal transgnico se caracterizar por tener el gen incorporado en todas sus clulas, esto es porque la incorporacin se ha dado en estadio de una cllula. Se puede saber si una cra tiene el transgen o no, o si es mosaico o transgnica a las tres semanas de vida. Es el momento en que los ratones se destetan. Entonces, se corta una parte de la cola y se hace un Southern-Blot. A continuacin se muestra un ejemplo de Southern-Blot para este fin:

Para saber si los animales que han incorporado el transgen son transgnicos o no, se cruzan con un wild type. Es ms beneficioso que los ratones sean machos porque se va ms rpido. Un un transgnico verdadero y un wild type dar en la F1 el 50% de las cras transgnicas y el otro 50 no transgnicas. Si es mosaico la proporcin ser distinta y, aproximadamente un 10% ser transgnico y un 90% no transgnico. Este cruce se debe hacer con tres lneas de transgnicos para comprobar que el fenotipo es el esperado y que no presenta variaciones. Los ratones que componen la F1 obtenida del cruce se utilizan de sementales y se van cruzando con hembras. Todo este proceso es muy caro. Se debe tener en cuenta los animales que se necesitan para el experimento. Los ratones tienen que mantenerse, controlar los que nazcan Lo ms importante es el diseo del animal que debe expresar el gen en el sitio que queremos. Adems de eso el gen ha de funcionar in vivo. Queremos que el gen se exprese dando lugar a la actividad que queremos, al crear animales transgnicos es muy posible que el fenotipo sea inesperado. Ejemplo de animal transgnico con fenotipo inesperado: Ratones que sobreexpresan la hormona del crecimiento (IGF-1, factor de crecimiento insulnico), tienen tamao ms grande del normal. Se utiliz el promotor de la insulina. Se quiso poner la hormona de crecimiento en el pncreas, pero la insulina adems de expresarse en el pncreas lo hace en el ojo. El resultado son animales con retinopata similar a la que padecen los diabticos humanos. El fenotipo inesperado sirvi como modelo de ceguera y as se pudo avanzar en el intento de crear tratamientos que les devolvieran la visin a los pacientes. Los animales transgnicos son herramientas para mejorar la medicina. Si se manipula un gen de un embrin y este tiene una gran expresin en el desarrollo embrionario, la alteracin puede llegar a ser letal, de manera que no nazcan transgnicos sin ese gen. Para estos casos es interesante inducir la expresin del transgen cuando interese. Se necesita un vector para introducir el DNA de inters en el DNA del husped. Muchas veces es un plsmido en el que se han eliminado las secuencias bacterianas y se ha puesto el gen de inters.

El proceso de creacin de un transgnico es largo, de al menos un ao. Una equivocacin implica una gran prdida de tiempo y dinero. El diseo y la construccin del gen quimrico es la parte ms importante del diseo. Esta parte depender de la pericia de los trabajadores teniendo en cuenta que, a veces, se ha de hacer subclonaciones. Antes de colocarlo en un animal, el constructo se ha de probar en clulas in vitro, de esta manera se garantiza su funcionamiento. Si no funciona in vitro, se debe disear otro constructo. Si funciona es muy buena seal para continuar con el proyecto. Para probar el constructo se debe utilizar las clulas en las que in vivo se expresara. Por ejemplo, si se va a trabajar con hgado, probar en hepatocitos. Del primer al segundo paso se tardan unos seis meses. Luego va la etapa de microinyeccin, nacer la Fo y se determinarn los transgnicos y los no transgnicos. La microinyeccin tarda, como mnimo, tres meses. Contando todo el proceso, entre unas cosas y otras se tarda un ao en obtener el animal transgnico. Economicamente, el proceso desde que se disea hasta que se obtienen el animal cuesta 12000 euros. Es importante tener en cuenta que la mayora de transgnicos no se distinguen de los controles. Se deber hacer, pues, un Southern-Blot con un trozo de la cola.

Fenotipo buscado Se debe tener claro la naturaleza del gen que se va a introducir o truncar (si se trata de un receptor, de una hormona del cerebro, de un oncogen). Otra cosa importante es determinar el tamao del gen ya que influenciar en la eleccin del vector a utilizar. En principio, interesa que el gen sea pequeo. De todos modos, si es muy grande se puede utilizar un YAC o un BAC. En caso de usar BAC o YAC, estos no se integran en el genoma sino que quedan sueltos como si de un cromosoma ms se trataran. Otra opcin es realizar un minigen:

Esta posibilidad quita tiempo.

Tambin se puede obtener el cDNA del gen, que no tiene intrones. El problema es que los cDNA in vivo no funcionan bien. Se tiene que crear un gen artificial. El vector de expresin se realiza poniendo colas poliA, fragmentos de otro gen (como promotores) al lado de nuestro gen de inters. Si este es pequeo se puede enganchar directamente al promotor sin necesidad de crear un gen artificial. Un ejemplo de gen artificial es el que se crea uniendo el segundo y el tercer exn de la globina. Este gen da lugar a un mRNA muy estable. As pues, el gen de la -globina solo sirve para estabilizar el mRNA mensajero. En cambio, la regin promotora ser la de nuestro gen de inters u otra que interese. El fenotipo buscado vendr determinado en gran medida por el promotor que utilicemos: Cuando: en qu momento del desarrollo queremos que se exprese. PROMOTOR Cmo: si se quiere de manera regulada o no Dnde: especfico de un lugar o no

Codones optimizados En la clula hay tRNAs ms comunes que otros. Lo ideal es ajustar las bases de manera que den el mismo aa pero para el tRNA mayoritario de la especie que utilicemos. Esto permite obtener ms protena ya que el sistema no se colapsa.

Tema 2: Transgnesis sustitutiva, Knock-out/ in

Transgnesis por Adicin: se aaden nuevos genes al genoma. El constructo se insertar al azar. Permiti descubrir mltiples genes con funcin desconocida. Transgnesis Sustitutiva: se introduce una mutacin en un lugar concreto del genoma, no al azar. Si esta mutacin corresponde a la supresin del gen hablaremos de animales knock-out. Si se elimina la secuencia interesante del genoma podemos ver la funcin que falta. Si no se elimina el gen hablaremos de knock-in.

La modificacin especfica se hace por un proceso de recombinacin homloga. La recombinacin se dar entre el targeting vector i el genoma. No se puede hacer directamente inyectando el vector en el genoma. Primero se debe modificar el genoma de unas clulas madre embrionarias. Se aprovecha para generar un animal que lleve la mutacin gentica en todas sus clulas. La invencin de este proceso supuso que tres investigadores recibieran el premio Nobel. El Dr. Evans descubri como cultivar clulas madre y como obtenerlas de un blastocisto sin que perdieran pluripotencialidad. La pluripotencialidad define a las clulas que pueden diferenciarse dando lugar a todos los tipos celulares. Una vez en las placas de Petri, se podan reintroducir en otro blastocisto sin que perdieran la funcin generando animales quimera. Otro investigador descubri que a travs de la recombinacin homloga se poda crear variabilidad y mutaciones en clulas de mamfero. En el ao 1981 se demostr que poda existir recombinacin homloga entre un DNA exgeno y el genoma de una clula de mamfero. Hasta entonces se desconoca su existencia en mamferos. Las investigaciones de unos investigadores que se pusieron de acuerdo permitieron el surgimiento de los animales knock-out (KO). La modificacin que se hace del genoma puede estar presente en todas las clulas del animal, desde que este se genera. Si se escoge en que tejido especfico i en que momento de la vida se hace la mutacin, se habla de knock-out y knock-in condicionales. La metodologa para obtener knock-out y knock-in totales o condicionales es diferente, pero se da siempre mediante mutaciones dirigidas. Knock-out/ -in total Primero se modifica el gen en el genoma de las clulas madre embrionarias. Despus se utiliza estas clulas para generar un animal en el que todas sus clulas presenten la mutacin. Se hace mediante un vector llamado targeting vector. Hay dos tipos de targeting vector: los vectores de insercin y los de sustitucin. Los vectores de insercin tienen las siguientes caractersticas:

En nuestro gen de inters, pues, se introduce todo el vector. De esta manera, el gen queda roto. Tambin se puede dar el caso de duplicaciones del gen de inters y perderse el knockout. Normalmente esto no pasa y da como resultado protenas no funcionales (lo que queramos al truncar el gen). De todos modos se ha dejado de usar por la posibilidad de reversin del knock-out. El vector de sustitucin se caracteriza por tener la siguiente estructura:

En este caso, el targeting vector se usa para sustituir una parte esencial del gen o el gen de inters entero por secuencias del vector. El vector de sustitucin ahora se utiliza ms. Consiste en: Dos brazos homlogos (es decir, con dos secuencias homlogas al gen que queremos introducir. Las secuencias de vector y DNA han de ser, pues, isognicas) La longitud de los brazos de homologa es crtica para el mayor grado de recombinacin homloga. Deben ser de como mnimo 2kb. Si son ms cortos se producir menos recombinacin homloga. Un casete de seleccin positiva (normalmente resistencia a neomicina, neo). El gen de resistencia a neomicina est situado entre los brazos de homologa, de manera que si se sustituye el gen por el vector, se pueda detectar mediante este antibitico. Un casete de seleccin negativa (TK). El gen de seleccin negativa normalmente se aade en un extremo del vector, fuera de las secuencias de homologa. Se suele utilizar el gen de la Timidina Kinasa. Se debe tener en cuenta que el fragmento a delecionar es mejor que sea pequeo para obtener una frecuencia de xito mayor pero siempre asegurndonos que se pierde totalmente la funcin de la protena que codifica ni se toca ninguna secuencia reguladora. As pues, el fragmento a delecionar mejor que sean unos cuantos exones en lugar del gen entero. Para conseguir que las stem cells en las que se quiere introducir el gen recombinante estn receptivas se utiliza la electroporacin. La electroporacin consiste en inducir la formacin de poros en la membrana de las clulas mediante choques que se dan por la aplicacin de un campo magntico externo. As se consigue introducir el gen recombinante de forma lineal y, en algunos casos, se producir la recombinacin homloga en el ncleo. Entonces se sembrar en placas de Petri. Ahora interesa seleccionar los casos en los que el targeting vector reconozca el gen de la clula madre y se d la recombinacin homloga entre el vector y el gen de inters. El resultado de la recombinacin ser la sustitucin de exones por

secuencias de nuestro vector (normalmente un gen de resistencia). En el genoma de la clula madre el gen queda roto ya que se han introducido secuencias externas. En el momento de seleccionar las stem cells de inters, se debe tener en cuenta que al introducir el vector de recombinacin pueden pasar varias cosas: Degradacin del vector (no hay modificacin) Insercin en cualquier punto del genoma no homlogo. Si esto ocurre, se suele introducir todo el vector. Integracin del vector en el gen de inters (lo que interesa) En la placa de cultivo hay, pues, estos tres tipos de clulas. Para seleccionar las que han integrado el vector en el gen de inters se debe aadir neomicina y danciclovir al cultivo. As, las clulas con resistencia a neomicina vivirn en presencia de este antibitico y las clulas con actividad timidina-quinasa (TK) morirn en presencia de danciclovir. Solo quedaran las clulas con resistencia a neomicina pero sin actividad TK:

Cuando no hay insercin las clulas no resistirn la neomicina y si esta ha sido al azar tendrn actividad TK. Las nicas que sobrevivirn sern las que hayan hecho recombinacin homloga ya que resisten a los dos antibiticos. Esta prueba se debe realizar siempre para obtener los clones recombinantes. Despus de la seleccin se usan estas clulas para microinyectar. Las colonias interesantes se pescan de las placas de Petri. La microinyeccin es en blastocisto (en KO condicionales). Las clulas de la masa celular interna son clulas madre embrionarias o embrionic stem cells. Las clulas madre se introducen en la cavidad. Aqu se encontraran con otras

clulas madre no recombinantes. Despus de fomar la cavidad el blastocisto eclosiona. Al desarrollarse el ratn, los dos tipos de clulas participaran. Los embriones microinyectados se transferirn a una hembra receptora. Estos ratones son llamados quimera. Un animal quimera es aquel que est formado por dos tipos de clulas madre. Un ejemplo de animal quimera seria el obtenido a partir de unos blastocitos de una cepa de color blanco en los que se ha introducido el gen recombinante mediante blastocitos de una cepa negra. Podremos ver en funcin del color del pelaje si el animal es quimrico o no. Tal como se observa en la imagen inferior, para obtener animales quimera se puede utilizar la microinyeccin de stem cells a blastocisto, la agregacin o inyeccin a mrula, o la agregacin o microinyeccin a embriones tetraploides.

La mrula es una fase embrionaria compacta y sin cavidad en el interior. Tambin se puede utilizar para obtener animales quimera. En la microinyeccin en mrula se dejan entre 5 y 6 stem cells. La zona pelcida protege el embrin durante periodos preimplantacionales. Se tendr que tratar para poder microinyectar en estos estadios. Podemos trabajar con una agregacin, esto se realiza cultivando embriones sin ZP con cmulos de stem cells durante un over-night. Al da siguiente el cmulo se habr convertido en blastocisto con una masa molecular interna que contendr las stem cells inyectadas. Con la agregacin algunas veces no se obtienen quimeras sino un animal que proviene totalmente de la inyeccin de stem cells. Otra manera de obtener animales que derivan nicamente de las stem cells es partiendo de dos clulas 2n. Se induce la fusin de las dos membranas plasmticas y, as, se obtiene un embrin de una clula tetraploide. Se pueden mantener en cultivo hasta es estadio de mrula o blastocisto.

De esta manera se pueden obtener mrulas tetraploides y agregar stem cells diploides. Entonces el trofoectodermo ser tetraploide pero la massa molecular interna ser diplode. El animal deriva completamente de las clulas 2n recombinantes. Las clulas tetraploides darn lugar a tejidos extracelulares como la placenta. Con esta tcnica se pueden llegar a obtener knock-out totales. Mrula Localizacin de los embriones Blastocisto tero oviducto

Al inyectar DNA en blastocisto se produce un colapso (colapso en blastocisto). Este colapso es imprescindible para que haya contacto ntimo para que se forme el animal quimera. Despus el blastocisto comenzar a cavitar. Interesar que un animal quimrico haya incorporado la mutacin sobretodo en clulas germinales ya que se conseguira que pasaran a la descendencia. El blastocito que se utiliza es de macho. Entonces se coge el macho quimera y se cruza con una hembra control. Para ello, se utiliza una hembra de color blanco (recesivo). Si obtenemos en la primera generacin ratones negros es que han heredado la mutacin. Es decir, pueden llevar el knock-out. En cambio, si fueran blancos provendran del genoma no mutado. Se debe tener en cuenta que los knock-out obtenidos sern heterocigticos ya que la hembra es blanca (recessiva). As pues, siempre se procura que domine el gen que nos interesa. Estos knock-out no sern totales. Para obtener knock-out totales, se debe cruzar 2 heterocigticos para el knock-out: De esta manera se obtendran los animales en la siguiente proporcin: 25% homocigticos (knock-out totales) 50% heterocigticos. 25% wild type (control)

Un knock-out total es un animal knockeado en todos los sentidos desde que se genera y en todas sus clulas. Las clulas madre embrionarias provienen de la masa celular interna de

un blastocito. Son clulas pluripotentes ya que pueden dar lugar a cualquier tipo celular. Es importante mantener la pluripotencialidad in vitro. As que se deben cultivar, modificar, hacerles inserciones sin que hayan perdido esta caracterstica. Para este fin se utilizan cepas: 129Sv Agut (Ag) C57B16 Blanco (Bl) Las madres receptoras pacficas son de las cepas CD-1 y ICR. Las quimeras que se obtienen con la cepa Agut (cepa negra), tendrn manchas marrones sobre un fondo negro. Las stem cells marrones tendrn la recombinacin homloga en heterozigosi (el otro alelo no est recombinado). Podemos encontrar muchos fenotipos: negros, marrn con modificacin gentica, marrn sin modificacin gentica De la F1 se tendrn que fenotipar los marrones para saber cules son knock-outs heterozigticos. Despus se cruzan dos heterocigticos para el knock-out y as se obtendrn, aproximadamente, el 25% de knock-out totales. El cdigo de color solo se utiliza para la F1. Otra cosa a tener en cuenta es que cuando se trata de fibroblastos embrionarios murinos la mayora de stem cells tienen que ser cultivadas encima de una monocapa de MEF. Las capas de MEF confieren un contacto entre clulas. Adems, los MEF secretan factores que impiden la diferenciacin (p.ej. LIF, leukemia inhibitory factor). Es importante que los clones no lleguen a tocarse. Demasiada confluencia puede hacer que se diferencien. La nica prueba para saber si la stem cell se ha diferenciado o no es mirando la morfologa. Las stem cells se ven muy delimitadas. En cambio, si la diferenciacin se ha dado el clon pierde la delimitacin y se aplana. Si no nos damos cuenta de que se han empezado a diferenciar, al introducirlas en un blastocisto no darn lugar a todos los tipos celulares. Muchas veces en los animales quimera falla la lnea germinal. Esto supone una prdida tanto de tiempo como de dinero. Las stem cells que se utilizan para microinyectar son normalmente de macho, pero al inyectar no se sabe si el blastocisto ser macho o hembra. As pues se pueden dar varias opciones: Machos quimera frtiles: si se inyectan a un blastocisto macho. Conversin de sexo Hermafroditismo si se inyectan a un bastocisto hembra. Hembra quimera

Conversin de sexo: se da cuando las clulas XY colonizan muchas porciones de tejido. Siempre puede quedar algunas clulas XX. Estos machos tienen la gran ventaja que solo darn espermatognesi sus clulas XY. As solo se transmitir a la descendencia el genotipo XY (clulas recombinantes). Conversin de sexo incompleta: obtenemos animales hermafroditas infrtiles, no sirven.

Hembra quimera: estas hembras no transmitirn a la descendencia el genotipo XY. Hay clulas XY inestables que pierden el cromosoma Y. Sern XO. Estas clulas pueden dar ovognesis. Induced Pluripotencial Stem Cells (iPS) Antes no se saba el camino para obtener clulas embrionarias de una clula normal. Las iPS son parecidas a las clulas madre y provienen de clulas ya diferenciadas. Por ejemplo, a partir de fibroblastos y aadiendo diversos factores se pudo obtener clulas madre iPS. Los factores utilizados en este caso fueron: Oct4, Sox2, Mye, Klf4. Las clulas iPS se parecen mucho a las clulas madre embrionarias pero haca falta ver si eran pluripotentes. Para ello se microinyectaron en embriones y se obtuvieron animales quimera. Se vio que las iPS se pueden diferenciar en cualquier clula as que, efectivamente, son pluripotentes. Ahora se pueden aplicar las iPS en terapia gnica o en transplantes para evitar el rechazo. Limitaciones de los animales KO Al sustituir la secuencia de inters por el gen neo podemos afectar a locus cercanos. Lo que se quiere es estudiar la funcin del gen que falta, no las alteraciones que se producen en genes cercanos por su ausencia. Si se elimina un gen endgeno puede que el animal no llegue a superar la fase embrionaria. En este caso, no se puede estudiar ni sus acciones ni su funcin. Tambin puede haber problemas de adaptacin y compensacin. Por ejemplo, se muta un gen y el resto de genes (background gentico) compensan su ausencia. Por tanto, al no notarse su ausencia no se puede estudiar la funcin. Si la compensacin se da en fase embrionaria, adems, no se puede realizar un seguimiento. Si se knockean todas las clulas y la expresin se da en varios tejidos, puede que tengamos un efecto global difcil de estudiar. Por ejemplo, el gen se expresa en hgado, rin y tejido adiposo. En hgado y rin tiene la misma funcin pero en tejido adiposo esta es distinta. De esta manera, al observar el fenotipo global no se puede discernir que tejido expresa cada funcin. Ventajas de los animales KO totales

Animales KO/KI condicionales o inducibles En este caso se modifica un gen concreto del genoma en un tejido concreto y/o en un momento concreto. Hablaremos de KO y KI condicionales o inducibles. Se utilizaran tecnologas como el sistema de recombinasa especfico de secuencia y tcnicas de gene targeting para hacer KO/KI. Sistema de la CRE-loxP Se parte de una secuencia de DNA especfica que reconoce la CRE y otra que reconoce el loxP. La CRE cataliza la recombinasa conservativa (sin prdida de nt) entre dos loxP. LoxP: son dos fragmentos de 13 pb invertidos, en su centro hay un core que define su orientacin. La orientacin de los loxP vendr definida por un tringulo:

Dependiendo de la orientacin de los loxP, CRE har una funcin u otra. Las dos secuencias loxP junto con las dos molculas de CRE que se unen a loxP forman un tetrmero. Cuando los dos loxP estn en la misma orientacin se da una delecin del ADN que se lleva los dos loxP. Esta reaccin de recombinacin suele ser unidireccional, es decir no se puede recuperar. Normalmente se utiliza este sistema. Si los loxP se encuentran en la direccin opuesta, las secuencias que se encontraban entre los loxP se invertirn producindose una inversin. DELECIN

INVERSIN

Hay otro mecanismo de recombinacin llamado Flp-FRT que procede del plsmido 2m de Saccharomyces Cerevisiae. Es similar al sistema Cre-LoxP, pero presenta una baja eficiencia en

clulas animales (37C). Por ello, se utiliza preferentemente el sistema Cre-LoxP. Se debe tener en cuenta que recientemente se han obtenido otras variantes (Flpe, FlpL) que aumentan su actividad in vitro e in vivo. Propiedades que hacen tiles estos sistemas para la transgnesis animal
No se encuentran normalmente en el genoma

Se puede transmitir a la descendencia

Aplicaciones de las recombinasas - La CRE se puede utilizar para eliminar el gen neo del genoma. - En transgnesi por adicin se puede hacer que el gen de inters no se exprese hasta que se quiera. Se ponen secuencias STOP que despus se delecionan con CRE (gene repair). - Poner un gen marcador que solo se expresar cuando se delecione un STOP (indicator mice). - En alteraciones cromosmicas los dos loxP pueden estar muy separados, incluso estar en cromosomas diferentes. Por ello se pueden dar translocaciones. - Knock out especfico de tejido.

Knock out especfico de tejido Si se quiere hacer un KO con mutacin especfica de tejido (por ejemplo solo en hgado), se hacen dos tipos de transgnicos para, despus, cruzarlos: Un ratn floxado que por recombinacin homloga en stem cells tiene introducido dos loxP en zonas intrnicas rodeando secuencias importantes del gen del que se quiere producir el KO. Ser pues un KI ya que el gen seguir siendo activo porque los loxP estn en intrones. Un transgnico convencional generado por adicin. Expresar la recombinasa CRE junto a un promotor especfico de hgado. As, aunque el gen est en todas las clulas se expresar solo en hgado.

Al cruzar los dos animales se obtiene un doble transgnico con el gen que se quiere integrar floxado en todo el organismo, pero la recombinasa CRE solo se expresar en hgado. De esta forma el gen floxado se expresar en el resto de tejidos. Se deben hacer suficientes cruces para obtener el gen floxado en homocigosis y la recombinasa CRE, al menos, en heterocigosi. Una vez se tiene el gen floxado, se cruza el transgnico con animales que expresan la CRE en diferentes tejidos. As se obtienen KO especficos del tejido donde se expresa CRE.

El targeting vector que se utiliza para obtener un animal floxado (conditional gene targeting) es:

Se ha diseado para que despus de la recombinacin homloga se introduzcan los loxP en intrones. Tiene dos brazos de homologa con la secuencia que se quiere floxar. A menudo se aade un tercer loxP (tambin en una regin intrnica), con un gen de resistencia a neomicina rodeado de dos loxP. En uno de los extremos se introduce un gen de seleccin negativa (por ejemplo TK). Cuando se da la recombinacin se sustituye el intrn por el vector. Como se ha mencionado anteriormente, la mutacin se ha introducido en secuencias intrnicas. Se pueden inyectar estas clulas directamente a un animal o hacer una transfeccin transitoria con CRE en las clulas in vitro. Hay tres tipos de delecin: Recombinasa 1 y 3: se obtiene el KO total sin neo (gen de resistencia a neomicina). Recombinasa 2 y 3: se obtiene el KO equivalente al de antes, no sirve.

Recombinasa 1 y 2: se obtiene el gen de inters floxado en las stem cells. Se deben seleccionar estas. La seleccin se puede hacer mediante PCR y por Southern-blot (biologa molecular).

KO/KI inducible El sistema inducible sirve para determinar el lugar y el momento de la activacin de la recombinasa CRE. Como ya se ha mencionado se debe producir un animal transgnico floxado rodeando los genes que se quieren floxar. El gen debe ser activo en todas las clulas. Tambin hace falta generar un animal transgnico con un constructo que exprese la recombinasa CRE en un sistema inducible. As, CRE se expresar en presencia de la droga.

Al cruzar ambos transgnicos se obtiene un doble transgnico que solo expresar CRE con la droga. Si el KO se expresa solo en un tejido ser especfico de tejido. Si no, se expresar en todas las clulas.

Control de la actividad de CRE A. Nivel transcripcional: bajo promotores inducibles (por ejemplo, metalotioneina con metales pesados; ecdisoma que es una hormona de Drosophila). El que ms se utiliza es la tetraciclina: Clsico o Tet-Off Reverso o Tet-On

Sistema Tetraciclina Clsico o Tet-Off:

En ausencia de tetraciclina, el transactivador queda libre y se une al operador que est junto al promotor que dirigir la expresin de CRE. Se puede usar el mismo sistema con doxiciclina (Dox) dando el mismo resultado. En estos casos, el inductor inhibe la transcripcin de CRE y se debe administrar el antibitico durante las fases embrionarias si no se quiere que se exprese CRE. Esto tiene efectos secundarios. Por estos inconvenientes se desarroll el sistema reverso o Tet-On. Sistema Tetraciclina reverso o Tet-On: En este sistema al administrar tetraciclina se activa la recombinasa CRE.

Aqu, el transactivador est modificado (reverso) de manera que es incapaz de unirse al operador si no hay antibitico. Si se quiere expresar el KO, tan solo debe administrarse el antibitico. El sistema Tet-On tambin se puede utilizar con doxiciclina. B. Nivel post-transcripcional: Se utiliza una CRE como protena quimrica (CRE ER-LBD). El resultado es una protena quimrica que en ausencia de promotor se une a HS protein.

As, cuando se administra el inductor este compite con las hit-shot proteins por la protena quimrica. El complejo con el inductor es capaz de activar el KO llegando al ncleo. Limitaciones de los KO condicionales

Adems, se generan dos tipos de transgnicos y se debe obtener un elevado nmero de transgnicos que expresan la recombinasa CRE de tejidos especficos y con promotor inducible. Aun as se tienen que hacer muchos cruces. Otro inconveniente es que el producto gnico de la protena que se quiere knockear, a veces, tiene una vida media muy larga. Entonces se tarda mucho en ver los efectos. Cuando se knockea un gen an se puede encontrar actividad suya al cabo de un tiempo de expresin. Se han hecho variantes de la protena quimrica que con poco inductor funcionan. En los animales con mosaicismo, CRE no siempre se expresa o se expresa de la misma manera. Esto implica que no en todas las clulas se da la recombinacin y, por tanto, el knock-out. Si es el caso se podra enmascarar el fenotipo ya que se debe tener en cuenta que, a veces, con poco tanto por ciento de protena de inters el fenotipo original se puede mantener. Se pueden hacer dos cosas: Hibridacin in situ: para ver qu tanto por ciento de clulas tienen el mensajero mutado. Para ello es mejor hacer deleciones grandes. Poner un gen marcador que se active cuando CRE recombine. Se activa cuando el gen se escinde. El inconveniente es que estos estudios se realizan bsicamente en ratn. Las stem cells de ratn son las nicas que superan las gene targeting. Hay un estudio con stem cells de rata pero no es muy eficiente. Actualmente se estudia la manera de cultivar stem cells para que sean ms estables en cultivo. Hay inhibidores como el fibroblast grouth factor (FGF), ERK, GSK3 Tecnologa KO/KI. Aplicaciones en estudio de la funcin gnica, estudio de enfermedades y xenotransplantes. Bsicamente los KO se utilizan para analizar la funcin gnica. Una vez se sabe qu gen est relacionado con una enfermedad, se puede crear animales modelos en los que probar terapias que inhiben la enfermedad. Por ejemplo, las enfermedades de base monognica serian ms fciles de estudiar. En xenotransplantes bsicamente se utilizan transgnicos con un gen concreto inyectado. Tambin se intenta alterar genticamente un animal modificando sus antgenos de superficie. Los estudios ms avanzados son del corazn, riones

 Transgnesis en stem cells dirigida Se conoce a priori el gen que se quiere modificar. Transgnesis en stem cells al azar. Se producen animales Gene-Trap.

Cuando se habla de gen endgeno se hace referencia al gen mutado.

La primera parte del vector no tiene promotor, la segunda s. As, el primer gen no lleva promotor y el segundo gen (gen de resistencia) s. Esto da lugar a dos posibilidades: Condiciones normales (1): el gen endgeno se expresa y da una protena funcional. Gene-Trap (2): se inserta en el gen. El gen deja de producir el mensajero y se hace el KO. LacZ se producir solo en los tejidos en los que se produce el gen de inters, tejidos en los que lacZ estar activo.

Para introducir el Gene-Trap se utiliza la electroporacin en clulas madre embrionarias. Las clulas con el Gene-Trap sern resistentes a neomicina y expresarn lacZ. Se puede hacer clonacin y secuenciacin y as saber el gen que se ha mutado (a priori no se sabe). De esta manera se puede obtener un animal quimera y saber en qu tejido expresar el gen.

Consorcios Todas las tecnologas de KO que se estn haciendo aqu siguen consorcios europeos (por ejemplo EUCOM). EUCOM utiliza un vector para hacer el KO que es un hbrido entre el KO y el Gene-Trap. El vector tiene dos brazos de homologa con el gen de inters, que queda floxado. El vector tiene el gen marcador con el de resistencia a neomicina.

Cuando se da la recombinacin homloga se obtiene un KI. El gen est knockeado porque se ha activado el aceptor de splicing y el gen -gal. Si adems lleva CRE, se puede lograr una expresin especfica de tejido. En un solo casete se tiene todo.

Tema 3: Mtodos de transferencia gentica en animales grandes

La obtencin de animales grandes es, inicialmente, como en ratn. Es decir, por microinyeccin de DNA. Este sistema no es muy eficaz, es complicado y caro. Se intent mejorar el sistema usando esperma como vector, pero ninguno de los dos sistemas era perfecto. Ms tarde se realiz la transferencia de ncleos para crear animales clnicos. Antes era lo que se utilizaba. Por ltimo, tambin est la introduccin de vectores virales (retrovirus RV o lentirus LV). Esto nos permite formar cualquier animal. Hay por tanto cuatro mtodos que seguidamente se explicaran. Microinyeccin de DNA

El ratn tiene madurez sexual muy pronto (a las seis semanas ya se puede trabajar). Al superovular, se puede obtener de 20 a 30 embriones. Adems el periodo de gestacin de los embriones es corto. Solan nacer entre 15-10 ratones de los embriones transferidos. Esto

disminuye en animales grandes. Por ejemplo, con cerdo es bastante complicado aunque al superovular se puede obtener de 15 a 20 embriones (nmeros similares a ratones). El inconveniente, en parte, viene dado porque se necesita mucho ms tiempo para gestar (15 semanas). Se puede saber si los cerdos recin nacidos son transgnicos cogiendo una muestra y haciendo un transfer. En las ovejas, la madurez sexual es alrededor de las 35 semanas y al superovular se puede obtener de 4 a 10 embriones. Al transferir no se pueden transferir los 10 embriones, tendr que ser uno o dos. Por ello, el rendimiento baja mucho (1%). Para obtener un animal transgnico ser necesario transferir a alrededor de 100 ovejas. La obtencin de animales grandes transgnicos requiere pues de grandes granjas, mantener los animales Es un proceso muy caro. En Australia y Nueva Zelanda se hacen ovejas transgnicas para optimizar el comercio de la lana. En las vacas la madurez sexual es de 52 a 65 semanas. Las vacas se fecundaran in vitro. El periodo de gestacin son 39 semanas y solo se puede gestar un animal. La obtencin de vacas transgnicas se haca en Alemania y Canad, pero ahora la produccin est bastante parada. El rendimiento es tambin del 1%. El proceso de microinyeccin es el mismo:

Los embriones de ratn son muy transparentes. Los de conejo, por ejemplo, son muy elsticos. Los embriones de animales ms grandes son opacos debido a que tienen una capa de mucina a un lado. Esto baja mucho el rendimiento. La microinyeccin, en s, es relativamente simple. Ahora se fecunda in vitro o se inseminan las hembras. Se necesita un equipo de gente muy grande y la transferencia a hembras receptoras se debe realizar en hospital (esto es mucho ms complicado en cuanto a equipamiento).

El nmero de transgnicos que nacern ser muy bajo. Para obtener una cabra transgnica tendran que nacer 100 animales y, de ellos, uno ser transgnico (rendimiento del 1%). Para microinyectar, adems, se necesita mucha prctica.

Se introduce en el embrin un gen quimrico que lleva un vector con un promotor. Los animales ya nacen con este gen. En terapia gnica, el gen debe ser de la misma especie (el animal ya tiene SI). As, en transgnicos el gen ya se detecta como propio. El constructo se prueba en ratn o en animales pequeos, para estar seguros de que funcionarn in vivo. Si el transgnico sale mal, dado al bajo rendimiento de la tcnica, an se pierde ms dinero. Por ejemplo, se hicieron cerdos con menos grasa que dieran mejores hamburguesas (aos 90) o mejores costillas. La empresa quebr porque los cerdos tuvieron muchos problemas de salud (ms hormona del crecimiento, acromegalia). Ahora la gente no quiere comer animales transgnicos.

Tambin se hacan animales resistentes a plagas. En una granja cuando el animal tiene una enfermedad lo puede pasar a toda la granja y morir todos. Aplicaciones de la ingeniera gentica Para la ciencia biomdica

Actualmente se hacen animales transgnicos como modelos de enfermedades humanas. Los ensayos se hacen en animales grandes (por ejemplo, la diabetes se puede inducir en perro). Aun as, no hay modelos animales de todas las enfermedades humanas. Faltan modelos animales que se tienen que crear. Los animales grandes de granja tambin se han utilizado para la produccin de biofrmacos. Hay protenas que para ser activadas necesitan determinadas glicosilaciones. Han de producirlas clulas eucariotas.

Los animales transgnicos tambin se utilizan para desarrollar nuevas terapias y xenotransplantes. Los transgnicos para xenotransplantes trabajan mucho con el sistema immunolgico. La FDA no aprobaba muchos protocolos ya que transferir un rgano de cerdo a humano puede ser un vehculo de zoonosis (transfeccin de enfermedades de animal a humanos). Ahora las las investigaciones se estn desplazando al mundo de las stem cells. Para diabticos se estn transfiriendo islotes de cerdo. Los transplantes duran un ao y se tienen que renovar. Los restos provocan fibrosis en el estmago. Cada vez se hacen menos xenotransplantes.

Para mejorar la lana se modifican las protenas de esta. Otra cosa es aumentar la eficiencia de las ligninas (productos ms baratos para alimentar). Tambin se puede augmentar la calidad de las carnes (con menos colesterol, mejor leche). Se hicieron conejos transgnicos que crecan ms rpido. Uno de ellos se convirti en un modelo de acromegalia (cabeza muy grande y patas largas). El problema es que los ovarios eran inmaduros y como consecuencia los animales eran estriles. El animal no sirvi como modelo de estudio. No hay modelos animales de acromegalia. Estos animales no se pueden reproducir.

Otros ejemplos:

Animales clnicos Los animales que provienen de una misma clula animal (por ejemplo, de vaca) provienen de un mismo embrin y, por tanto, son idnticos genticamente. Las manchas que tendrn s que sern diferentes. Obtencin a partir de la manipulacin del esperma Todo el mundo prob esta tcnica pero no funcion bien. En realidad el gen no entra en el espermatozoide sino que se engancha a l y el esperma acta como vehculo (al entrar dentro del vulo). El medio se ha de tratar para eliminar la membrana externa del espermatozoide (congelando o descongelando, con detergentes). Luego se ponen en un medio con la

solucin y se hace inseminacin artificial o FIV. No es la tcnica ms utilizada ya que se suelen obtener mosaicos.

Vectores lentivirales Es una tcnica sencilla que permite manipular cualquier especie animal. Se debe tener en cuenta que hay una capa que cubre el vulo (ZP). Resumen de vectores virales: Vectores retrovirales (infectan clulas murinas, no afectan a humanos). Solo infectan cuando el embrin se est dividiendo. Es muy fcil que se obtengan mosaicos. Los retrovirus son vectores integrativos que pueden entrar e incorporarse en el cromosoma. Cuando las clulas se dividen, las dos contendrn el transgen. Son virus de RNA pero al insertarse en el genoma lo hacen en DNA. Su cpside est envuelta de una capa lipdica, infecta muy bien las clulas en divisin.

 Vectores lentivirales. Derivan del virus del SIDA, se ha eliminado la parte patognica. Tienen la ventaja de que pueden infectar clulas que no se dividen. Antes que el ovocito sea fecundado, el lentivirus lo podr infectar (ya tenemos transgnico). En el vector podemos poner genes grandes, al haber eliminado la parte patognica.

MLV: murinos HIV-1: muchos ms genes, pero se eliminan todos y se introduce el gen de inters.

Ciclo normal del lentivirus

La cpside est envuelta de fosfolpidos con molculas que reconocen la membrana plasmtica. Al salir de la clula el virus se lleva parte de la membrana plasmtica.

El RNA entra dentro de la clula y la retrotranscriptasa inversa lo transforma en dsDNA y ya se puede insertar en el cromosoma. Luego el material del virus se replica en la clula y sale encapsidado (en un ciclo normal). En nuestro vector hay que mantener unas secuencias que son importantes para la transferencia del gen (secuencias en cys). Tambin se tiene que mantener el gen de la retrotranscriptasa inversa.

Replicacin:

Un ejemplo de animal transgnico es el que utiliza un vector FUGW:

Se caracteriza por tener: 5LTR-CMV Enhancer/Promotor. El elemento flap del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1) insertado entre la repeticin terminal larga (LTR, long terminal repeat) del extremo 5 y el promotor interno de la ubiquitina-C humana. Un promotor interno que lleva el gen reporter de la GFP (Green Fluorescent Protein). El promotor de la ubiquitina-C humana hace que la expresin sea en diferentes tipos celulares. Enhanced GFP (EGFP) Augmento de transcripcin ya que el elemento regulador post-transcripcional del virus woodchuck de la hepatitis (WRE) est en downstream a GFP.

As, el transgnico tendr en todas las clulas el gen, pero solo se expresar all donde indique el promotor. Tambin se pueden inyectar secuencias que estabilizan el mRNA.

Metodos de infeccin Normalmente se inyecta en el espacio perivitelino:

El problema es que este espacio tiene un volumen reducido y, adems, la zona pelcida protege el embrin. Despus de inyectar en el espacio perivitelino los embriones se dejan en cultivo 72 horas. La expresin de la GFP es evidente en blstula y mrula en los cigotos infectados. Despus, los embriones se implantan en el tero de hembras pseudogestantes. Tambin se puede destruir la ZP de manera que el vulo queda limpio. Entonces, los embriones desnudos se ponen en contacto con una suspensin de lentivirus. El problema es que los embriones son ms lbiles. Los embriones desnudos se dejan en cultivo 3 das hasta el estadio de mrula o blastocisto. Cuando se elimina la ZP los embriones se arrugan. Despus del cultivo los embriones se implantan en el tero de hembras pseudogestantes. Hay que decir que los embriones

desnudos tienen un desarrollo retrasado in vitro y una menor tasa de implantacin que los que mantienen la zona pelcida intacta. Se vio que el 82% de los animales incorporaba el transgen con almenos una copia (rendimiento muy alto).El 76% mostraba fluorescencia en patas, cola y cara. Los animales GFP positivos llevaban un provirus integrado. Los que tenan ms de dos copias expresaban el transgen en niveles detectables por la visualizacin directa de la fluorescencia emitida por la GFP. Los animales tenan tejido verde fluorescente en los tejidos donde se haba incorporado el transgen. El problema del mtodo es que no se sabe las copias que se insertan. En estas imagenes se puede ver la fluorescencia verde en un ratn, detectable con luz UVA:

Se ha comprobado que pes al alto rendimiento de la inyeccin de lentivirus en espacio perivitelino el nmero de copias integradas poda variar de 0 a 20. La fuente de esta variacin viene dada por la dificultad de controlar el volumen de los virus que se dejan en el espacio perivitelino durante la inyeccin. Esto es algo a tener en cuenta. Tambin se han realizado monos transgnicos que se obtuvieron por inyeccin en espacio perivitelino. El problema del mono verde que se obtuvo es que no se saba si era mosaico. Para averiguarlo se tuvo que cruzar.

Posibilidades de los lentivirus Resuelven muchas de las limitaciones de la inyeccin pronuclear: Mayor eficiencia Menos invasiva para los embriones Menor relacin coste-efectividad Requiere menos tcnica La incubacin de embriones desnudos facilita la manipulacin posterior Se puede extender a otras especies animales

 La protena VSVG media la entrada viral: encuentra receptores en clulas de todos los vertebrados incluyendo primates e incluso pjaros (animales sin mtodos satisfactorios para crear transgnicos).

Limitaciones Hay secuencias que pueden disminuir el ttulo viral. Por ejemplo, secuencias de splicing o de polyadenilacin en el transgen. Tambin disminuye el ttulo la insercin de transgenes de ms de 10 kilobases entre las LTRs. En los casos en que son necesarias inserciones virales mltiples para obtener un gran nivel de expresin puede ser complicado establecer lneas puras de transgnicos debido a la segregacin independiente de los provirus. La rutina utilizada debe pasar el Comit de Biotica. Utilizando lentivirus se pueden infectar stem cells pero no es un mtodo tan eficiente como la electroporacin.

Para hacer terapia gnica se necesita modelos animales. El hecho de pasar de ratn a hombre es un gran paso. La UE pide probar la terapia en un animal grande. En muchos casos sera interesante obtener animales grandes modelos de enfermedad. Por ejemplo, se consigui crear un mono con la enfermedad de Huntington pero el animal no era transgnico al no pasar el fenotipo a la descendencia. Transferencia de genes a stem cells de ratn utilizando vectores lentivirales

Tema 4: Transgnesis en pez

En los aos ochenta hubo resultados en diferentes familias. Las piscifactoras estaban muy interesadas en estos hallazgos. Se intentaron mejorar factores que aumentan la produccin (mejor crecimiento, mayor resistencia). Por ejemplo, se hicieron estudios con salmn y hormona del crecimiento.

En Canad, por ejemplo, las aguas de los mares son muy fras. Interesa que los salmones superen esta temperatura. Las mejoras obtenidas en la carne an no se aceptan para el consumo humano. Se hacen plantas transgnicas para cultivar en el tercer mundo. El problema es que se ha de comprar la semilla cada vez que se siembra ya que las plantas no son frtiles. Aqu aparece un gran negocio para las productoras de plantas transgnicas. Si se busca un mayor crecimiento se puede utilizar hormona de crecimiento o anticongelantes. Tambin se pueden modificar para que crezcan en agua con pocos niveles de oxgeno. Los peces transgnicos tambin se utilizan para ciencia (estudio de promotores, localizacin con protenas fluorescentes). Tiene una importancia econmica muy grande. Las protenas fluorescentes permiten hacer estudios de expresin in vivo (con la GFP). As se puede hacer un seguimiento sin la necesidad de sacrificar.

Liposomas Se utilizaron para intentar introducir DNA en huevos. Consista en el bombeo de las pequeas partculas de metal en el huevo. Microinyeccin

El DNA inyectado puede llegar a entrar en contacto con el DNA del embrin. Se ha de atravesar la cscara y el corion del huevo. Aqu se obtienen mucho ms mosaicos que en ratn. A menudo se integra en estadio de 2-4 clulas aunque el punto de integracin tambin es diferente. La aguja que microinyecta rompe las cscaras.

Se hacen servir placas de Petri con silicona donde se inyectan nanolitros de la concentracin de DNA. En ratones se inyecta entre 2-4 ng/l en peces entre 4-500ng/l. Para ello se utilizan pipetas de orden superior a las de ratn que son de 1m. En peces se puede inyectar DNA circular an con poca eficiencia. En ratones esto no se puede hacer. Se intenta que tanto el promotor como la secuencia codificante vengan del pez:

Electroporacin

La microinyeccin es muy lenta (1 por uno). Funciona bien con huevos fertilizados ya que sino el ovocito se podra activar con el pulso y no podran fecundarse. Lo que se hace es sumergir los huevos con el DNA y se aplica un campo elctrico que hace que se agujereen. Lo ms importante es que el DNA se integre. As, se detecta el DNA, se expresa y se transmite a la descendencia. Es una buena tcnica. Segn la especie se necesita ms o menos pulso. Normalmente se electroporan huevos de una clula para reducir el mosaicismo.

Se incubaba DNA y esperma y, despus, se electroporaba. El DNA se enganchaba al esperma y serva de vehculo para despus fecundar y obtener transgnicos. No se han conseguido buenos resultados.

Integracin

El DNA se integra en forma de tndem. En ratones se integra en tndem cabeza-cola (promotor + zona codificante):

En peces se integra al azar:

En Southern-blot se puede detectar estructuras secundrias. Se ha intentado la recombinacin homloga pero hasta ahora no se han obtenido resultados. Transmisin a la descendencia

Hasta la F2 no se puede tener las lneas bien establecidas debido al mosaicismo. El mosaico al tener descendencia puede dar F1 heterocigotos. Estos F1 de la descendencia normalmente son diferentes (no como pasaba en ratn). Se han de seleccionar animales de la F1 para tener un animal en F2 con un transgen determinado. Constructos y vectores: A lo largo de los estudios de transgnesis en peces es esencial la integracin. En los peces dependen mucho de los constructos utilizados.

Se puede utilizar promotor y cDNA de la especie, de otra especie de pez o de otro animal. Se han utilizado promotores vricos, de mamfero, de pez

Funciona mucho mejor utilizando secuencias de la propia especie ya que sino a menudo se inactiva el transgen. Administrando hormona del crecimiento al salmn se puede obtener animales ms grandes. Se hizo el experimento y los salmones que expresaban hormona del crecimiento de mamfero moran. El problema era que el gen de la GH era de humano.

 Constructo all fish Era el que funcionaba mejor. El resultado era un incremento normal del tamao. El problema fue que adems de obtener un incremento del tamao afectaba otras cosas como a la pigmentacin del salmn, acromegalias (crneo y mandbula ms grande). Esto daba problemas de viabilidad. Los salmones, adems, se adaptaban ms precozmente al agua del mar (abaratamiento del coste). En mamferos, el crecimiento para cuando el animal ha madurado. En salmones, en cambio, los animales van creciendo. Comparacin con otras especies Debido al mosaicismo la seleccin de lneas lleva mucha faena. Se deben controlar las piscifactoras para que no se expanda el animal. Si se hace en el mar, se debe asegurar la esterilizacin de los peces; por ello es mejor hacerlo en tierra.

Tema 5: Clonacin por transferencia de ncleos

En Marzo del 1997 se publica que es posible clonar un mamfero a partir de una clulasomtica diferenciada. No hay ninguna barrera biolgica que lo impida. Sera posible clonar una persona. Problemas a superar Bajos porcentajes de desarrollo y gestacin. Anormalidades fsicas en los animales que sobreviven. Alta mortalidad perinatal y prdida de embriones. Los problemas surgan sobretodo en pulmones y riones, y eran incompatibles con la vida. Estos problemas son debidos a una reprogramacin insuficiente. Manipulacin mecnica del embrin: Enucleacin del recipiente y transferencia del ncleo. Activacin del recipiente. El embrin es fijado con una pipeta de fijacin. Se microinyecta con una pipeta de microinyeccin. El orificio de contacto entre el ovocito y la pipeta de fijacin tiene unas 15-20 micras. Al aspirar se sujeta el ovocito y con la otra pipeta se manipula.

En el ao 1984 se descubri que era mejor usar ovocitos como recipientes. El defecto que esto tiene es la incapacidad de ver el ncleo ya que est en meiosis. La ovulacin se produce poco antes de la extrusin del primer corpsculo polar (excepto los perros, en los que la ovulacin es en vescula germinal).

Ms tarde se describi un mtodo para ver los cromosomas en metafase. Se tratan los ovocitos con host y se miran con luz UVA. As se aprecia dnde estn los cromosomas. Esto tiene dos inconvenientes: la luz UVA, en s, destruye el DNA y los cromosomas; adems, con este mtodo tambin se tie el DNA mitocondrial. Si se estropea el DNA nuclear no importa ya que lo que se quiere es enuclear el ovocito. El problema viene si se estropea el DNA mitocondrial, en cuyo caso el vocito ya no servira. Para evitar esto la exposicin con luz ultravioleta debe ser mnima (un minuto). Enucleacin La ZP es elstica pero ms rgida que la membrana nuclear. A parte tendramos el citoplasma rodeado de la membrana. Esta membrana en mamferos es muy frgil. La puncin aqu provoca en un 95% lisis. Entonces, se invent una tcnica para solucionar esto que consista en desestructurar el citoesqueleto. Se cultivan los ovocitos con inhibidores del huso mittico y los microtbulos. Entonces la membrana es ms elstica. Igualmente, no se penetra al citoplasma, se aspira antes. Una vez dentro se aspira una parte del citoplasma del ovocito llevndose los cromosomas. Hay que ir con cuidado porque siempre se aspira una parte de ovocito junto con los cromosomas.

Interacciones entre el citoplasma recipiente y el ncleo transferido. Reprogramacin del ncleo transferido. Se debe tener en cuenta que en una clula no manda el ncleo. El ncleo es tan solo una base de datos, informacin. Quien manda es el citoplasma, es el que decide qu informacin se necesita. Ahora que se ha sacado la base de datos se debe poner una nueva. Este trabajo lo har el citoplasma. Por ejemplo, estn los ncleos de clulas de ratn que se utilizaban para clonar. Tienen unos cuatro nuclolos. Al transferirse el ncleo, es muy difcil que con l no se transfiera una parte ms. De hecho, es tan difcil aislar ncleos viables, que en la mayora de casos hay que llevrselo junto con el retculo endoplasmtico (casi media clula). As, lo que se transfiere es el ncleo, una parte de citoplasma y la membrana de la clula. Si se trabaja con clulas somticas se transfiere la clula entera (15-20 micras de dimetro). Los ncleos se rebozan en una solucin viral. Al cabo de 10-15 minutos de contacto con solucin viral se produce la fusin de la membrana. Luego se aspiran todos los ncleos y se mantienen en la pipeta. Entonces se atraviesa la ZP (capa externa) y se deja el ncleo en el espacio perivitelino. Ahora se obtienen dos clulas cada una de ellas envuelta en su membrana citoplasmtica rodeada de la ZP.

Esta tcnica es buena en ratones pero no en otros animales. En estos animales (ovejas) se hace electroporacin. De modo que en una placa de Petri se pone el vulo entre dos barras que se pasan corriente (dos polos). Esto produce una desestabilizacin.

Se debe tener en cuenta que si el corriente es demasiado leve no se producir la fusin. Si por el contrario el corriente es muy elevado, tampoco funcionar. Lo ideal es aplicar el corriente suficiente para que se fusionen membrana celular y membrana del ncleo. Ahora falta activar el programa de desarrollo. Este papel lo realiza in vivo el espermatozoide que al fecundar deja carga 2n y activa el programa de desarrollo. Cuando se da esta activacin ya no se tiene un ovocito sino un nuevo individuo. Dicha activacin la produce, ms concretamente, una protena del esperma. Para reproducir la activacin si no hay fecundacin se puede poner alcohol al 7% y realizar electroporacin (campo elctrico en un medio con calcio y magnesio, o poner iones como el estroncio). Lo ms utilizado, sin embargo, es la electroactivacin, de este modo se incrementa la concentracin de calcio. En ratones (94-95) se utilizaba el medio rico en estroncio (Sn) ya que haca que el vulo liberase sus reservas internas de Ca 2+. Cuando se manipula el ovocito este est en metafase (se est dividiendo). Luego se mete en el ovocito (que est en mitosis) un ncleo en interfase. En el citoplasma, pues, hay factores promotores de la mitosis activos. Estos factores pasaran la membrana nuclear y activaran la condensacin de los cromosomas. El problema es que estos cromosomas no estn preparados para dividirse. Hay un ncleo, cromatinas y cromosomas que se han obligado a condensar. Prdida de genes Diferenciacin celular Modulacin de la expresin gnica Se han paralizado muchas investigaciones porque se tena una verdad como dogma. En 1938 an no se haba conectado las idease discuta como se produca la diferenciacin celular. Teoras que se barajaban: La clula va perdiendo genes y se diferencia Solo se expresan los genes necesarios en cada situacin (modulacin gnica)

Para descubrir la realidad Spemann realiz el experimento de transferencia de ncleos. El experimento permita evaluar la totipotencia del ncleo.

El hecho de que el embrin se desarrolle indica que todos los genes del zigoto estn en la clula del adulto. En 1952 se hacen experimentos con amfbios. Se consiguen individuos adultos frtiles a partir de renacuajos (1982). En 1992 con clulas sanguneas como eritrocitos y transfiriendo queratinocitos a anfibios se consigui el desarrollo hasta renacuajo.

Al no conseguir desarrollo de adulto a adulto se concluye que no es posible conseguir individuos frtiles a partir de clulas somticas de un individuo adulto. Sin embargo, se observa que utilizando ovocitos los resultados son mejores. Briggs y King en 1952 trabajaron con ratones. Los embriones de mamfero son ms frgiles y ms pequeos (unas mil veces ms pequeos que los anfibios). Al atravesar la membrana citoplasmtica se provocaba la lisis del ovocito. Con inhibidores del citoesqueleto y con un mtodo que no atraviesa la membrana plasmtica se consiguieron mejores resultados. Avances metodolgicos de los experimentos con amfbios:

En 1986 se descubri que aunque es mejor usar ovocitos como recipientes en lugar de cigotos, es ms difcil enuclearlos. Por suerte, ms tarde se describi el mtodo de visualizacin de cromosomas. El problema del Imprinting se descubri incubando dos proncleos que derivaban de espermatozoides y asimismo dos proncleos que derivaban de ovocitos. Ninguno de los dos llega a trmino, acaban muriendo. Se debe recibir la mitad de la carga por va materna y la otra por va paterna. Se recibe lo mismo pero en algunos casos se expresar el gen de la va materna y por otro el de la va paterna. Esto es una barrera biolgica de primer orden.

En realidad exista una barrera metodolgica. El ncleo es informacin debe contener toda la informacin. La informacin tiene que ser accesible. Reprogramacin del ncleo Al realizar la transferencia del ncleo, si debido a la manipulacin se lisa el ovocito no se podr obtener un embrin. Se deben evitar los daos por transferencia de ncleos. Al transferir se provoca la condensacin prematura de los cromosomas. La reprogramacin del ncleo consiste en colocarlo en el estadio de desarrollo que se necesita. Se deben silenciar los genes caractersticos de la clula de origen. Tambin hay que caracterizar los genes de la clula que se usa como recipiente. Por ltimo, es importante mantener la capacidad de progresar, silenciando y activando genes, en el desarrollo a un individuo adulto frtil.

Rebobinar el programa de diferenciacin

La barrera biolgica del Imprinting condicion mucho estos experimentos. Hay que saber que en el mundo de la clonacin entr un grupo de gente que estaba interesado en ella desde el punto de vista animal. Esta gente quera clonar los animales con mejores caractersticas. As, se podra incrementar la eficacia de obtener animales transgnicos (2-5% de rendimiento). La transferencia de ncleos era una posibilidad de reducir costes. La barrera biolgica quedaba invalidada utilizando ovocitos como recipientes, ya que se poda reprogramar el ncleo. Haba factores en el ovocito que permitan la reprogramacin del ncleo.

La fase del ciclo celular en que se haca la transferencia tena que ver con el futuro desarrollo del ncleo. Lo que se hace es coger un ncleo en plena fase de sntesis (condensado) y transferirlo a un citoplasma que se est dividiendo. Esto es un cambio muy brusco. Se ha visto que segn el estado del ciclo celular en el que se encuentra el ncleo, habr ms o menos xito: Clula en G1 Clula en sntesis o G2 desarrollo a blastocisto 45% desarrollo a blastocisto 0%

La durada en un embrin de cuatro clulas es de 10 minutos para G1, 4 horas la sntesis y menos de 1 hora G2. Se puede evitar la condensacin prematura de los cromosomas, activando el citoplasma y as transferir un ncleo en interfase a un citoplasma en interfase. Las estadsticas entonces son mejores: Clula en G1 Clula en sntesis o G2 desarrollo a blastocisto 60% desarrollo a blastocisto 15%

G1 se define como el tiempo que tarda desde la divisin celular hasta que se condensan los cromosomas (los ncleos an no estn del todo condensados). Abarca el tiempo desde que se forma la membrana nuclear y el ncleo crece (vuelven los factores de transcripcin que durante la mitosis saltan de la cromatina). As, el ncleo se divide, se vuelve a formar la membrana nuclear y entonces estos factores vuelven al ncleo y se pegan donde les toca. De una clula pasamos a dos, tambin pluripotentes. En G1 los factores de transcripcin an no se han pegado totalmente. El ovocito tiene los factores de reprogramacin. Se puede formar algo parecido a dos PN.

Es difcil sincronizar un cultivo celular en G1 ya que si se bloquea una parte del proceso el otro avanza (descompensaciones). Una alternativa mejor, es provocar la quiescencia. La quiescencia se consigue quitando el suero de los cultivos de las clulas. Las clulas entran en stand-by y se elimina todo aquello que no es necesario. De esta manera se consigui clonar la oveja Dolly.

Se vio entonces que la clonacin por transferencia de ncleos puede llegar a generar un nuevo individuo. Dolly era frtil. En este momento aumentaron los intereses para obtener animales clonados. Los investigadores que estudian el ciclo celular creen que se ha llegado a un callejn sin salida. Los que estn interesados en obtener animales clnicos, en cambio, no se rinden. Despus de Dolly se clonan ratas, conejos, cerdos

El embrin en el ratn se activa en el estadio de ocho clulas. Esto da ventaja a los rumiantes (2 o 3 ciclos de ms). Esto permita un tiempo muerto para reparar los daos obtenidos. El perro se consigue clonar en 2005 con problemas. El problema de los cnidos surgi porque los medios de cultivo eran subptimos. Se sacaban ovocitos de ovarios de perros de mataderos. La rata tambin da problemas (se clona sobre el 2004). Slo un laboratorio lo ha conseguido. El problema tambin est en los medios de cultivo de los ovocitos. Ms tarde un veterinario sudcoreano public un artculo sobre obtencin de stem cells de embriones humanos. Result ser falso. Aplicaciones de la clonacin.

La clonacin permite investigar los mecanismos moleculares profundos que rigen la transferencia celular que permiten la reprogramacin. Tambin permite incrementar la eficiencia de las tcnicas de clonacin en estas especies. La transferencia de ncleos permite la recombinacin homloga. Tambin permite una mejora en xenotransplantes y abre un camino hacia la clonacin humana. Investigacin Intentar saber el porqu de las cosas. Si se entiende la reprogramacin se pueden entender muchos mecanismos moleculares. Lo que provoca la muerte mayoritariamente es el cncer y la degeneracin neurolgica. Este grupo de enfermedades se rigen por la diferenciacin celular, si se entiende se pueden mejorar las terapias.

La longitud de los telmeros es algo a tener en cuenta. Cuando Dolly nace, sus telmeros corresponden a una oveja de seis aos (la edad que tena la oveja original). En ratones es a partir de la quinta generacin de animales sin telomerasa cuando se empieza a tener problemas, los ratones suelen ser infrtiles. En ratones con telomerasa no se han observado problemas de acortamiento de telmeros, incluso hasta la sexta generacin. Se cree que los ratones tienen ms actividad telomerasa.

Animales de granja transgnicos

Se cre una empresa que quebr al ao siguiente (1991- 1992) para obtener animales transgnicos en granjas. Haba una serie de personas que utilizaban los animales como bioreactores (obtencin de leche con protenas). El problema es que el mtodo de microinyeccin en embriones era muy poco eficiente. Por ejemplo, si se pinchan 200 embriones vacunos. Se transfieren 3 embriones por vaca y nacen al final 50 terneros de los cuales 1 o 2 son transgnicos. Los terneros no transgnicos se matan y se incineran. Es un coste econmico muy elevado. En el mismo ao que nace Dolly nace el primer cordero obtenido de clulas manipuladas genticamente in vitro por transferencia de ncleo. As, todos los terneros que nazcan sern transgnicos. Si se ha hecho caracterizacin previa ya se sabe que esa protena va a ser funcional. Una vez se tiene la protena funcional se puede tener un rebao con 200-300 animales en menos de un ao (utilizando transferencia de ncleos). As se consigue:

Recombinacin homloga En ratones se obtuvieron stem cells con una cepa que se seleccion por su capacidad de producir teratomas (cncer de ovarios). Esta cepa se genera para estudiar esta patologa humana. La recombinacin homloga se daba solo en ratones, pero con transferencia nuclear y fibroblastos se puede conseguir en otros animales. As, se pueden obtener clulas en cultivo con la recombinacin, all donde se quiere. A partir de aqu se puede obtener KO sin pasar por quimeras. Cupido y Diana fueron los dos primeros corderos.

Clonacin teraputica La clonacin es biolgicamente posible y puede ser un mtodo reproductivo (conseguir de una clula un individuo con la misma carga gentica). Aqu hay que mencionar una carga tica: la mayora de los animales clonados no llegan a nacer y los que nacen mueren a las 48 horas.

La clonacin tambin puede ser teraputica. Por ejemplo, cuando un paciente necesita un trasplante se puede realizar un embrin clnico al cual se le extraen stem cells que se diferencian hacia el tejido que interesa.

Problemas de la clonacin: Aspectos tcnicos y ticos Algunas de las preguntas que surgen al hablar de clonacin son: Es bueno clonar humanos? El embrin clnico es un nuevo individuo, se est matando?

La transferencia de ncleos utiliza herramientas parecidas al joystick.

Se desconoce gran parte de la reprogramacin nuclear. No se sabe gran cosa sobre las bases moleculares de la reprogramacin. Los factores de reprogramacin son las molculas responsables de la formacin de los PN masculino y femenino. Se investiga la relacin con el silenciamiento del DNA (metilaciones).

En la cepa 129 (estudio de queritocarcinomas) de 100 embriones entre un 10 y un 30 % darn stem cells. Otras cepas, solo el 5%. Las gnadas de los embriones se estn formando en blastocisto.

En el resto de especies no hay stem cells, sino stem-cells like. Se han conseguido quimeras en muchas especies pero no se han conseguido descendencia que d estas stem cells. Para conseguir stem cells se tienen que conseguir sobre 100 embriones. Cuando no se consigue descendencia directa desde quimera es porque no llegan a colonizar del todo la lnea germinal.

Se transformaron las clulas diferenciadas en stem cells like (iPS). As, se provoca una reprogramacin nuclear rpida. Con un solo gen era posible reactivar el sistema de desarrollo. La clula tiene mucha plasticidad. Lneas prioritarias de la investigacin

Para terminar: Dolly fue un hito cientfico, marc un antes y un despus. La investigacin de la reprogramacin ha dado lugar a las iPS. La clonacin facilita la manipulacin en animales de granjas y el avance en tcnicas de xenotransplantes.

 En la clonacin humana no hay barrera biolgica, esto abre las puertas.

Tema 6: Manipulacin gnica animal. Impacto social. Legislacin y patentes

Aspectos que tienen que ver con el impacto de los animales para experimentacin. Legislacin del tratamiento de la manipulacin gentica. La percepcin social de la experimentacin animal le da mala fama. Adems, la sociedad es contradictoria, quiere la ciencia pero no es una sociedad cientfica (va a astrlogos) Por ejemplo, un medicamento que cura una enfermedad pero que mata a uno de cada 10000 personas recibe muchas crticas de la gente. Los herbolarios, en cambio, no estn controlados pero la gente se fa ms.

La sociedad pide a los cientficos que cada vez sean ms eficientes pero la sociedad se opone cada vez ms a que se experimente con animales, cosa que es necesaria para el progreso.

En la actualidad, la vivencia con los animales se ha perdido, se ha dejado de matarlos personalmente. Existe un conflicto moral: rechazo al sufrimiento animal vs. ganas de saber ms. El estudio de los animales KO ha permitido avanzar mucho en la gentica.

 En Catalunya Es competencia del Parlament de Catalunya. Est la ley del 1995 y un decreto del 97. La legislacin cambiar pronto. El Real Decreto de Madrid cierra un agujero que haba en Catalunya.

 En Espaa Depende del Parlamento de Madrid. La ley del 2003 y el Real Decreto del 2004. La legislacin est muy enfocada a lo que es plantas transgnicas.

Ley 5/1995, de 21 de junio Ley de proteccin de los animales utilizados para la experimentacin y para otras finalidades cientficas. Define que se considera un animal de experimentacin. Prohbe la utilizacin de ciertos animales como los perros y gatos recogidos en la calle. Establece las condiciones generales de mantenimiento y transporte de los animales, as como las condiciones generales del centro. Obliga a realizar un registro de los centros y de control de los animales. Se deba indicar el procedimiento de la experimentacin: porque, para que, como luego se tiene que enviar al comit de tica que decide que hacer. Hay tanto una Comisin de Experimentacin Animal como Comits ticos de experimentacin animal. Se debe eliminar el dolor. Se establece un rgimen disciplinario con penas de multa, crcel Decreto 214/1997, de 30 de julio Por el que se regula la utilizacin de animales para experimentacin y para otras finalidades cientficas.

Esto se realiza para minimizar el sufrimiento animal y que no se hagan experimentos que no sean absolutamente necesarios. Real decreto 178/2004, de 30 de enero Por el que se aprueba el Reglamento general para el desarrollo y ejecucin de la Ley 9/2003, de 25 de abril. Algunas cosas han cambiado a peor.

La evaluacin del riesgo se hace segn el dao que puede producir un organismo si este se escapa al medio. 1. 2. 3. 4. Leve Curable Grave (por ejemplo, genera una peste. Hay uno en la UAB, otro en Madrid) Muy grave (hay uno en Francia, otro en Estados Unidos)

Los animales de los que se habla son de tipo 1 o algn vector viral de tipo 2. Hay que trabajar bajo el Comit de tica, el apartado de Seguridad de la UAB. Valoracin del dolor El animal sufre. Se knockea un gen y en una determinada edad se eutanasian para ver los rganos. Hay modelos dolorosos, como el estudio del cncer que provoca el desplazamiento de tejidos y dolor. Tambin son dolorosos los estudios de analgesia, en los que se provoca dolor a los animales para ver si este se va al subministrar el frmaco. En el resto de procedimientos se debe minimizar o eliminar el dolor. Los animales sienten, la diferencia est en la manera de expresar el dolor. Los humanos al sentir dolor gritan, los perros tambin. La oveja en cambio no ya que si chillara un depredador se la podra comer. Se debe conocer la especie animal con que se trabaja. Lo que duele a los humanos, asumir (a priori) que tambin les doler al resto de animales. As, las presas normalmente disimulan el dolor. Los predadores se quejan ms. La expresin del dolor no es igual.

 Predecible: se puede evitar con analgesia o, como mnimo, aliviar. Despus de una gran operacin se puede dar un rgimen analgsico. Inesperado: se puede intentar detectar sobretodo conociendo la especie con que se trabaja (conociendo su normalidad). Entonces se puede evitar o aliviar.

Limpieza: cuando se ve a un animal sucio o se est criando en un sitio sucio, algo no va bien (estrs). Lo primero que afecta es a la reproduccin. Fijarse en la interaccin del animal con nosotros. Si es agresivo normalmente y luego es dcil, o viceversa.

En los procedimientos quirrgicos se puede eliminar el dolor. En una enfermedad inducida se puede intentar aliviar. Tipos de dolor:

El dolor agudo es bueno. Por ejemplo, si apoyas la mano en un sitio caliente, te duele y te apartas.

El dolor crnico es patolgico y una fuente de estrs. Lo primero que se notan son problemas reproductivos, disminucin del apetito y letargia (disminucin de la actividad). Por ejemplo, en un estudio de supervivencia se puede considerar que un tratamiento ha fallado cuando el tumor tiene una cierta medida. Entonces el animal se retira (criterio de punto y final). Esto ya se contempla en el protocolo inicial.

Se debe presentar el procedimiento de experimentacin en el Comit de tica.

La justificacin averigua si la experimentacin es realmente necesaria. El Comit se asegura de lo que les va a pasar a los animales. Si no se saben todos estos trminos se hace un pequeo experimento para saberlo (con 2 o 3 animales). Cundo termina el proyecto? Quin es el responsable? Qu sntomas inesperados pueden surgir?

Patentes

Tema 7: Estabulacin y manipulacin de animales transgnicos

La utilizacin de animales en experimentacin debe cumplir unas condiciones. Primero, se ha de evitar que la experimentacin que se hace no sirva para nada. As, se minimizan los trastornos. Hay veces en las que los resultados se pueden ver alterados, por ejemplo, si se tiene estrs o una enfermedad subclnica. La legislacin se deriva de la directiva del 86. Est a punto de entrar en vigor una nueva ley en junio del 12/13. La legislacin sobre estabulacin nos indica varios parmetros como por ejemplo el espacio del que pueden disponer los animales que deben poder hacer todo lo que fisiolgicamente haran. Todo esto, en una jaula es complicado. Cuanto ms pequeos son los animales que se tienen, ms se pueden tener en un mismo espacio. En ratones y ratas, los animales se deben poder poner en pie. Adems hay que pensar que los ratones tienen una vida de experimentacin muy corta. Al subir de escala y tener animales en grupo su vida suele ser ms larga (por ejemplo en perros). Con estos animales se pueden hacer experimentos. Normalmente se les da un medicamento y se observa cmo se elimina. Interesa que los animales estn acostumbrados al manejo. Contra mejor estn los animales (hbitat sin estrs, condiciones similares a la naturaleza) ms reales sern los resultados obtenidos. Por ejemplo cuando se pincha en el brazo a monos si se les acostumbra a estirar el brazo justo en el momento previo a pinchar, vern minimizado su estrs. Otro ejemplo que reduce el estrs, sera acostumbrar a los ratones a ser cogidos. La legislacin pone las dimensiones mnimas para tener animales (en jaulas, recintos). La directiva, adems, regula la temperatura (en ratones 22C 2). En Barcelona, por ejemplo, el principal problema es el calor del verano. Esto implica instalaciones ms caras. En vacas el rango se ampla (y en animales grandes) siendo de entre 15 y 26 . Otra cosa que se regula es la humedad relativa. En ratn es del 54% 10. Si cae por debajo del 20% se pueden tener problemas en las cras (son ms sensibles a ambientes secos). La orina, al evaporarse produce vapores de amonaco que son irritantes. Se debe hacer 20 cambios de aire por hora. Tambin se regula la intensidad de la luz. Los roedores son animales nocturnos. Un exceso de luz es daino, no les gusta. As pues, se debe llegar a un compromiso entre la intensidad de luz que necesitan los trabajadores y los ratones.

Es interesante controlar los ciclos circadianos. Es ms fcil hacerlo con animales en un sitio cerrado. Los animales grandes lo tienen ms complicado al tener una poca de reproduccin. En ratones es ms fcil de controlar. Otras cosas que pueden interferir son las fuentes de alimentacin y las de agua. Las fuentes de alimentacin pueden contener residuos txicos, metales pesados, restos de insecticidas, citoesteroides La soja es una fuente muy barata de protena vegetal, tiene molculas parecidas a los citoesteroides que pueden reducir la fertilidad de los animales. El agua puede contener posibles contaminantes fsico-qumicos. Se debe controlar el estado sanitario de los animales. Es decir, si hay animales con alguna enfermedad contagiosa (por ejemplo gripe) se pueden ver alterados los resultados. Se ha encontrado el caso de una cepa de ratn en que las hembras al cabo de nueve semanas desarrollan diabetes tipo 1. Si esta cepa tiene el virus de la hepatitis murina (que en ratones normales se elimina a las dos semanas) el porcentaje de diabticos pasa del 90% al 10%. El virus hace que la diabetes en proceso se cure y desaparece el fenotipo de estudio. Otro ejemplo es la colitis ulcerosa en un modelo de ratn. Si se pona al animal en un estabulario se obtenan muchos idnticos y estos no desarrollaban la enfermedad. Esto era porque la flora bacteriana era diferente. Entonces, se volvi a sacar a los ratones al exterior (donde haban patgenos) y muchos de ellos desarrollaban la enfermedad. Federacin Europea de Asociaciones Cientficas de Animales de Laboratorio Se listan unos 15 virus (enfermedades peligrosas para el hombre y para los ratones). Se incluyen virus que pueden infectar al hombre, letales para ratones y que puedan interferir en los resultados (por ejemplo el virus de la hepatitis murina). Se obliga a hacer controles una vez al ao, normalmente se hacen una vez al mes. En un estabulario hay una barrera que lo mantiene alejado de todas las fuentes de patgeno. El aire externo que estar en contacto con el animal se tiene que filtrar. Adems se tiene que esterilizar el pienso, el agua, las jaulas, el serrn Esto implica barreras arquitectnicas potentes y medios de esterilizacin (autoclave, gases txicos para superficie e irradiacin). Es ms fcil la esterilizacin en sitios pequeos que es grandes, pero se realiza tambin en caso de animales grandes (cerdos, ovejas). Dependiendo de cmo sea esta barrera estaramos hablando de cuatro situaciones: Estabulacin convencional: no se tiene control sobre los microorganismos que estn en contacto con los animales ni sobre el estado sanitario de estos. Animales libres de patgenos especficos (SPF): existe una barrera sanitaria en funcionamiento y se puede garantizar que los animales no estn en contacto con una lista determinada de patgenos. Se conoce la microflora que est en contacto con nuestros animales. Es muy importante conocer la flora bacteriana (como se digiere, que nutrientes se absorben).

Animales sin microflora: carecen de cualquier microbio. Son muy delicados y la alimentacin es potente.

Hay que pensar que un estabulario con animales SFS ya tiene una barrera muy bien montada. Si se conoce la flora, adems, se deben introducir procedimientos que impidan la contaminacin de los animales. Cuando se trata de animales sin microflora, los procedimientos deben ser de aislamiento total (trabajar con guantes). Esto se puede aplicar en todas las especies pero se hace ms en ratn. Aun as, el proceso se est expandiendo. Se hacen estudios en los que se inocula un microorganismo y se ven los efectos. Se mira cmo reacciona un animal frente al ataque del patgeno. En cerdos, por ejemplo, se estudia la adsorcin de nutrientes. Adems de controlar las variables externas, la legislacin tiene por objetivo mantener al mnimo el sufrimiento animal. Se intenta mantener a los animales entretenidos. Se intenta imitar a la naturaleza con cosas como poner trozos de madera para roer (para ratones), balones de ftbol atados (para cerdos). Los estudios de neurologa se hacen en jaulas vacas. Se introduce una variable. Al hacer los estudios de fobia al exterior, por ejemplo, no se poda evaluar su validez. A parte de eso, se deben fenotipar todos los animales. Si se tienen 20000 ratones y se tienen que fenotipar se necesita mucho tiempo y paciencia. Por esto es importante armonizar todas estas cosas para no alterar los resultados y que los experimentos salgan bien. Esto vino de un estudio Europeo. Por ejemplo, el nmero de ratones por jaula afecta al nivel de glucosa. La estabulacin de los animales en experimentacin est regulada por la ley, tambin las condiciones ambientales (temperatura, humedad relativa, luz, niveles de ruido). Existe una barrera sanitaria, arquitectnica, de filtros y de control de lo que introducimos. Todo esto es muy costoso, por ello, es muy importante velar por el buen estado de los animales, controlar enfermedades, microorganismos

Tema 8: Utilizacin de animales transgnicos. Estudio de enfermedades. Cncer.

Un animal transgnico es una herramienta de investigacin. Este tema trata bsicamente de ratones en el estudio del cncer. El cncer es un conjunto de enfermedades de las cuales no se conocen todas las causas.

Asimismo, tiene un componente de enfermedad social ya que la tasa de cncer es ms elevada en la clase baja que en la alta. Los ambientes industrializados tambin aumentan la frecuencia comparados con los pases en vas de desarrollo. Esto es comprensible si se tiene en cuenta que en los ambientes industrializados hay ms carcingenos. La ingesta rica en grasas tambin favorece su aparicin.

En los animales transgnicos se intenta acortar el periodo de latencia.

Un ejemplo de afectacin de las radiaciones ionizantes sera las observaciones de los supervivientes de las radiaciones.

El carcinoma ms potente es la luz solar. Las personas blancas son ms dbiles frente a la radiacin solar. A pesar de estar en un ambiente carcinognico no se desarrollan tantos cnceres. Esto es porque la clula tiene sus mecanismos de defensa, adquiridos por seleccin natural. Se debe hacer nfasis en que los cnceres normalmente se desarrollan despus de tener descendencia.

La aparicin de tumores implica que algo ha fallado en el crecimiento y reparacin celular. Estos fallos son mayoritariamente adquiridos a lo largo de la vida.

Si alguna de estas relaciones se altera aparecer un tumor. La protena p53, por ejemplo, est ausente en el 50% de los tumores humanos.

Si hay familiares afectados, algunos de estos cambios ya se habrn producido genticamente, harn falta menos para padecer la enfermedad.

En los ratones transgnicos se puede hacer cualquier manipulacin gentica ya que tienen una vida muy corta.

Casi la mitad

Un ejemplo de estudio de la patogenia es descubrir las causas de que el virus de la hepatitis B de cncer. Ahora ya se sabe la transformacin que hace el virus en las clulas. Una prueba de conceptos podra ser realizar una seleccin de manera que las clulas sanas sean ms resistentes a quimioterapia o radioterapia. As, se puede incrementar la dosis del tratamiento.

Pruebas de agentes carcinognicos

Los animales a los que se ha introducido una mutacin implicada en el proceso de carcinognesis desarrollaran la enfermedad antes. En menos tiempo sabemos si un producto es carcinognico o no. Ahorramos tiempo.

Hay un virus murino que provoca tumor mamario en ratn y no se saba por qu. Ahora ya se ha podido descubrir qu causa la transformacin maligna.

P53 es una de las protenas de control celular ms importante que tenemos. Es un paso de control que est ausente (o mutado) en el 50% de los cnceres. En el proceso de sntesis de DNA hay una serie de molculas que detectan errores y reparan o activan la apoptosis de la clula. Un knock-out de la p53n permite estudiar qu pasa sin ella. Los ratones nacen, as que la protena no tiene un papel importante en la embriognesis. Han aparecido muchos mutantes. Se observaban diversas situaciones en los knock-out: Homocigotos: a los 4-5 meses desarrollaban tumores. Heterocigotos: a los 18 meses desarrollaban tumores (equivaldra en los humanos a 80 aos).

Un animal tan sensible tambin es sensible a los anticancergenos. Se pueden utilizar productos para ver si tienen efecto teraputico. Se debe tener cuidado con las manipulaciones genticas. Los bilogos moleculares piensan que la molcula que estudian es la clave de todo. Esta afirmacin es falsa ya que el cuerpo se regula.

La falta de p53 predispone a la aparicin del tumor. Apareci un KO de la p53 con la protena mutada, pero funcional. La mutacin disminua la produccin de cncer frente a las no mutadas, pero los animales tenan envejecimiento prematuro. Otro KO que se consigui sobreexpresaba la forma normal de la p53 sin acelerar el proceso de envejecimiento.

El resultado final es similar (ms p53). En el primer caso produce una aceleracin del proceso de envejecimiento y en el segundo no. La causa de esto podra ser que la forma mutada hubiera perdido alguna zona de control de actividad. No afectara a su regulacin en la forma sobreexpresada ya que esta tiene una buena regulacin. Se ha de tener en cuenta las diferencias entre humanos y ratones (diferentes tumores). Los ratones tienen los telmeros ms largos y disponen de cierta actividad telomerasa. Los humanos, en cambio, tienen actividad telomerasa solo en la lnea germinal. La vida del ratn es ms corta.

La actividad metablica es mucho ms grande en el ratn. Se dan menos divisiones celulares en ratones (1011) que en humanos (1016).

Hay que tener en cuenta que las cepas que se utilizan tienen poca variabilidad, son cepas con consanguinidad. Sndrome Peutz-Jeghers

En homocigosis produce plipos benignos, en heterocigosis produce carcinomas. La pregunta es si los plipos benignos son precursores de los carcinomas. Parece ser que la respuesta es s. Para estudiar este sndrome no se puede trabajar con homocigotos ya que mueren. Lo que se hace es realizar un ratn heterocigtico para LKb1 que lleve el otro alelo floxado condicionalmente (que se pueda quitar cuando se quiera). Una vez en cultivo se hace saltar la copia floxada. As se tienen cepas con las que se puede estudiar. Sin embargo, los resultados no cuadran actualmente con pacientes humanos. Las preguntas que se deben resolver son: Qu pasa si la actividad del LKd1 se produce despus de que se active el oncogen? LKd1 est protegiendo otros genes?

Tema 9: Modelos animales de enfermedades metablicas hereditarias

Se vern ejemplos del uso de la transgnesis para obtener modelos de enfermedades animales. Glucogenlisis

La idea era encontrar una terapia para la glicogenosis de tipo 7 (es una gran familia de enfermedades). Implica el mal metabolismo del glicgeno. Hay una enfermedad para cada enzima que participa en la sntesis del glicgeno. PFK-1 (6 fosfofructoquinasa 1): enzima clave para metabolizar la glucosa por la va citoslica. Humanos PFKM PFKM Glucogenosis tipo VII Modelo Animal PFKM-KO Pfkm PFKM Fenotipo mutante (enfermedad?)

Si se toca el gen de la PFKM se esperara un fenotipo mutado. Normalmente no es tan fcil. PFK-1 Fructosa-6P ATP ADP Fructosa-1,6P2

PFK est codificada por tres genes (muscular, heptico y plaquetario).

El gen de la isoforma muscular (PFK-1M) se expresa en msculo esqueltico, diafragma, corazn, cerebro, eritrocito, testculo y clula La isoforma heptica (PFK-1L) se expresa en hgado, eritrocitos, riones, adipocitos, cerebro, corazn, testculo, pulmn, bazo, musculatura uterina y clula . La plaquetaria (PFK-1P) en cerebro, plaquetas, fibroblastos, linfocitos, bazo, testculo y clulas .

La forma activa es un tetrmero que depende del tejido donde se encuentre. Si se expresa en hgado, por ejemplo, tiene cuatro formas (formas hepticas). En msculo tambin hay cuatro formas. En el resto de tejidos suele haber combinaciones (hbridos). Por ejemplo en los eritrocitos una de las formas est compuesta por dos formas musculares y dos hepticas. Regulacin de la PFK-1

La PFK-1 est en el inicio de la gluclisis. Necesitar energa en niveles bajos (es decir, altos niveles de AMPc y de ADP). Al tener mucho ATP se inhibe. As, pequeos cambios en la [ATP] pueden causar cambios rpidos y notorios en la va.

Glucogenosis tipo VII Es una enfermedad gentica de carcter autosmico recesivo causada por un dficit en la actividad PFK-1 muscular (PFK-1M). Para realizar un modelo animal de la enfermedad se ha de tener en cuenta que en un mismo gen hay muchas mutaciones. Por tanto, existe una heterogeneidad en la enfermedad. Adems de que la mayora de estas enfermedades son heterogneas, estas presentan variantes.

Si se eliminan los exones en ratn puede que no se obtenga las diferencias que en humanos se obtendran (por ejemplo, generar un codn stop). Lo que se hizo es intentar cargarse la funcin del gen. Existen tres formas de la glucogenosis de tipo VII: Forma clsica Forma hemoltica Forma tarda: se manifiesta a partir de los 60 aos. Forma infantil letal: los nios no sobrepasan el segundo ao de vida.

Forma clsica Ausencia de actividad PFK-1 en el msculo esqueltico, que implica: Acmulo de glicgeno en el msculo esqueltico. Las hexosas se encuentran incrementadas (azcares de seis). Hiperuricemia miognica: aumenta el cido ctrico circulante. Alteraciones es la bioenergtica muscular.

Dficit parcial de eritrocitos: hemlisis y reduccin del 2,3DPG. Cuadro clnico: intolerancia al ejercicio. Al empezar a correr dan rampas musculares. Terapia: limitacin del ejercicio fsico. Dieta pobre en carbohidratos. Se hizo un modelo con la esperanza de realizar terapia gnica pero el modelo no daba mucho de s. Igualmente, sera una buena opcin a investigar.

Creacin de un ratn deficiente en PFK-1M Se necesita mucha informacin. Ahora hay consorcios de mutagnesis que mutan todos los genes del genoma humano. Se pueden ir a buscar aqu. Hace unos aos, cuando el genoma no se haba secuenciado era mucho ms complicado. Con la secuenciacin se puede clonar el gen por PCR. Lo primero que se debe hacer es buscar toda la informacin disponible, vale la pena perder un mes. Si hay un error aqu, al disear el vector, nos daramos cuenta al cabo de tres aos. Hace unos aos cuando no se tenan secuenciadores. Se tena que ir plaqueando fagos y ver los que tenan el gen que interesaba. Despus se tena que mapear. Se realizaban muchas digestiones. As se consigui identificar el exn 3, que es donde est el ATG (inicio de la protena). Se pens que si se eliminaba este ATG la protena no sera funcional. Tambin se quiso cambiar el frame (marco de lectura), pero no se poda.

Uno de los promotores estaba muy cercano al exn 3. As que se intent eliminar la regin promotora y el exn 3. Para ello, se hizo un vector con una regin homloga al promotor y otra al final del exn 3 con resistencia a neomicina.

Se ha de tener en cuenta que un pequeo grado de cambio en la seleccin puede dar que la lnea germinal no quede afectada y no se transmita la mutacin. Se han de hacer muchos cambios de medio. Ahora se pueden mirar clones y clones de clulas (de las clulas que han pasado la seleccin + y -. MEF

Se hace un Southern (con 200-400 clones) y se va mirando cual tiene la mutacin correcta. La seleccin negativa te ayuda a enriquecer. Al realizar el Southern se controla que un lado del exn est correctamente en 5. Despus se hace un segundo Southern con las que tienen en 5 correcto para mirar cuales tienen tambin el 3 correcto. Por ltimo, se realiza un tercer Southern para ver cuantas tienen el gen neo, para comprobar que la mutacin est donde le toca y en todas las clulas.

Ahora es el momento de inyectar en blastocisto. Las stem cells son de color agut para poder identificar rpido los quimera.

Los quimera tienen manchas agutes y negras, al seleccionarlos por color se ahorra la mitad del trabajo. Estos animales han de transmitir a la descendencia el carcter. Si al cruzar el animal con otro animal se obtienen agutes, estos agutes sern 100% homocigotos para la mutacin. Las madres que se utilizan son hembras blancas para que no se coman las cras. Adems, las blancas adoptan cras de otras madres.

La clula muscular necesita la gliclisis para hacer ejercicio. Se hizo un anlisis de la PFK-1M al animal homocigoto para la mutacin

Homocigoto: no presentaba la mutacin en clulas musculares. Heterocigoto: 50% respecto al normal.

Como en Humanos

Bloqueo de la gluclisis en el msculo esqueltico Las hexosas en el mutante tambin estaban elevadas. El lactato era bajo.

En msculo se vio incrementado el nivel de glicgeno y las fibras tambin estaban muy elevadas. Entonces, se detect una mutacin en la ultraestructura.

Contenido de glicgeno en el msculo esqueltico:

Ultraestructura del msculo esqueltico:

En los animales se reprodujo la intolerancia al ejercicio. Para comprobarlo se puso una cinta y el ratn mutado tan solo aguantaba un par de minutos y acababa con las extremidades enrampadas. Un ratn normal aguanta mucho y al hacer ejercicio incrementa sus niveles de lactato. Niveles de lactato srico:

Metabolismo en ejercicio:

El fenotipo real de este animal es una letalidad muy elevada (duraban de 1 a 3 meses). Si se generaban 50 homocigotos, nacan 25, moran 15, al empezar el experimento eran 7 y quedaban 3 o 4. Esto es un problema. Los animales en reposo tienen ya el 50% de niveles de ATP (de promedio, en las clulas del msculo esqueltico). El nivel de ATP caracteriza la viabilidad de las clulas. Nucletidos de adenina:

Adems, presentan un incremento de glucosa en el diafragma:

La musculatura intercostal tambin resulta alterada:

De igual manera la musculatura cardaca, donde se apreciaba una hipertrofia con el tiempo:

La PFKM tambin se expresa en eritrocitos. El eritrocito vive exclusivamente de glucosa. Si se quita la PFK-1, la gliclisis no funciona y cae el metabolito que regula la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno. Por esto las clulas son hemolticas y hay tanta letalidad. Para compensar esto se producen ms eritrocitos. Cae pues el 2-3-BFG y el oxgeno se queda retenido en los pocos eritrocitos viables cosa que da hipoxia.

Hemlisis:

Fragilidad eritrocitaria:

Para quemar cidos grasos se necesita oxgeno. Si los eritrocitos no ceden oxgeno el msculo en s es poco viable.

La enfermedad no es solo severa, sino que el dficit eritrocitario la agrava. Se puede intentar acceder a las clulas de la medula sea. Por esta va, quiz en un futuro se logre una mejora.

Tema 10: Anlisis de los mecanismos epigenticos implicados en el silenciamiento y activacin de transgenes in vivo

Cada vez est ms de moda la epigentica. Ejemplo de transgen:

Despus de microinyectar en ovocitos el transgen se puede integrar (una o ms copias) en ms de una zona y que no se exprese. Utilizando un marcador se puede ver la expresin. Curiosamente contra ms copias se observaba ms expresin. Las copias no deben implicar cambios en el marco de lectura. Epigenetic reprograming La epigentica no son cambios en la secuencia de DNA. Son modificaciones de las bases, de la cromatina o de las histonas. No alteran la secuencia, son reversibles y muchos de estos cambios son regulables por factores ambientales.

Mecanismos epigenticos

Ejemplos de estos mecanismos son microRNA, RNA de cadena larga no codificante, metilaciones, modificacin de histonas Metilacin del DNA Aadir grupos metilo a citosinas. La metilacin del DNA es la nica modificacin del genoma que siempre pasa en la parte de la citosina por donde se une la guanina.

La metilacin es imprescindible para la vida del organismo. Se da por la metiltransferasa. En las islas CpG la hipermetilacin de C est asociada al silenciamiento. Las protenas antitumorales presentan una hipermetilacin y los oncogenes hipometilacin.

La metilacin del DNA impide la unin del factor de transcripcin. Tambin atrae otras protenas implicadas en otros complejos, estas protenas silencian la expresin del gen.

 Cromatina Hay dos metros de DNA/clula. La cromatina est compuesta por protenas, aparte de por DNA. Estas protenas son muy pequeas y su masa iguala a la del DNA.

El DNA se organiza en el collar de perlas, el solenoide, los loops Esto lleva a la formacin de heterocromatina.

El DNA envuelve las histonas. En el extremo C-terminal hay residuos de lisina o de otros aminocidos. Modificaciones en estos residuos dan lugar a alteraciones en la expresin gentica. Las modificaciones son acetilaciones, metilaciones, ribosilaciones).

Existen una serie de modificaciones de histonas. Hay un cdigo de histonas que actan de manera combinatorial. Esto lleva a un estado de activacin o de represin. Es un concepto nuevo.

Ejemplos: histona 3 y 4.

Un metil en la histona 3 genera un STOP. Si est acetilada da activacin. Hay una serie de combinaciones que marcan que un transgen se exprese o no.

Puede haber residuos mono, di o trimetilados. Esto implica diferentes grados de acivacin o silenciamiento. Heterocromatina: inactiva, compactada. Eucromatina: activa, tiene cierta plasticidad (para pasar de una a la otra).

Al tener heterocromatina abierta se puede realizar modificaciones en residuos especficos que pueden hacer que esta pase a eucromatina. La acetilacin permite el paso de heterocromatina a eucromatina.

A continuacin se muestra una tabla con protenas que modifican las histonas. Hay metilantes, desmetilantes (histonas metilasas y demetilasas)

La funcin de las enzimas se intenta descubrir mediante la invencin de transgnicos, KO Se encuentran con que la mayora de transgnicos son letales y no se puede ver su funcin. Alguno se ha hecho no letal pero no viven mucho tiempo.

HAT, HDAC, HMT determinan el paisaje epigentico del genoma. Las protenas de unin al DNA pueden atraer metilasas, acetilasas pueden tener una activi dad metiltransferasa.

Se une la demetilasa y demetila la histona 3 o 4, una vez demetilada atrae otras protenas que demetilan el DNA adyacente. Despus se produce deacetilacin y se impide la unin de factores de transcripcin. Se silencia el gen.

Se han encontrado metilaciones en protenas antitumorales e hipometilaciones en oncogenes (MIC).

Hay estudios de cncer, asma Existen muchas enfermedades donde hay evidencia de que los fenmenos de metilacin afectan.

Por ejemplo, SIRT1 puede llevar al desarrollo de cncer. Por un lado deacetila, realiza cambios en la funcin de la protena que provocan senescencia o apoptosis. Tambin deacetila las histonas. Esto da lugar a la proliferacin celular y al bloqueo de la senescencia y la apoptosis. Del mismo modo, atrae la DNA metil transferasa a los promotores, cosa que provoca ms proliferacin. Con el paso del tiempo esto implica cncer. Para evitarlo se estn inventando frmacos que alteren estas funciones. Se han encontrado inhibidores de histonas acetilasas. Los frmacos se aplican en casos extremos y no se suelen observar mejoras.

El problema de los frmacos es que no se puede dirigir su accin solo a las clulas que interesa. Su efecto se encuentra en todas las clulas. Inhibir la acetilacin de histonas en una clula sana tambin comporta problemas.

Para introducir genes se tienen varias maneras: microinyeccin, con vectores de DNA Inactivacin de transgenes Qu pasa cuando se administra un gen a un vector? Tiene lgica que el transgen se active y se inactive de forma endgena (ya que el vector se integra. Cuando se utilizan vectores que no se integran (vectores no virales), san niveles bajos de expresin y la expresin es transitoria. Los plsmidos perduran al cabo de un ao de estar en un organismo. Aun as, no se encontraba expresin. Esto hizo pensar que el plsmido se encontraba silenciado (como si fuera endgeno).

Se utilizaron dos vectores. Uno era el plsmido que aunque se tuviera en mucha cantidad su expresin era cero. Hay otra manera de obtener plsmidos modificados. En el plsmido haba una parte no eucariota, bacteriana que pareca la responsable de la silenciacin. Del plsmido se elimin la parte bacteriana y solo qued el transgen (parte eucariota). Despus se pueden aislar estos minicrculos con nuestro transgen. La parte bacteriana tiene muchas CpGs, ms que la eucariota.

Se pens que los plsmidos se metilaban y por esto se silenciaban. Se meti el minicrculo (con solo el transgen), el plsmido normal y un plsmido normal pero sin CpGs.

El resultado fue que los plsmidos sin CpGs mejoraban pero no tenan nada que ver con los minicrculos. Como las islas CpGs son inmunognicas se pens que quizs desencadenaban una respuesta inmune. Se hicieron pruebas y no se encontr evidencia de ello.

Entonces se pens que quizs eran las metilaciones de histonas. Para analizarlo se hicieron inmunoprecipitaciones de cromatinas (ChIP). Se hace la inmunoprecipitacin contra el anticuerpo que sospechamos que tiene que ver con el silenciamiento. Una vez aislado se puede mirar de secuenciar el DNA, encontraramos el DNA causante de la silenciacin. Ejemplo de inmunoprecipitacin en ratones. El minicrculo tena altos niveles de expresin, en cambio el plsmido poco nivel. Al hacer un ChIP se esperara en los minicrculos un incremento de eucromatina (activa). En los plsmidos se esperara un incremento de heterocromatina. Esto indicara que las histonas tienen un papel en la silenciacin.

 Anlisis de las modificaciones de histonas por ChIP:

En un experimento se observ un incremento en marcadores de heterocromatina en el plsmido y de eucromatina en el minicrculo.

En otro, haba diferencia aunque no tan evidente.

Se probaron 19 plsmidos. En uno el promotor de la ubiquitina no se vio silenciado ni en el plsmido ni en el minicrculo al cabo del tiempo.

La explicacin es que a lo largo del tiempo la expresin del plsmido activo se va perdiendo. Las seales que inactivan el plsmido se desconocen del todo, pueden ser: una seal de localizacin nuclear (no se integra en el ncleo, queda episomal), la modificacin de histonas, anticuerpos intracelulares que detectan el DNA exgeno Esto lleva a la deacetilacin de las histonas, la histona metiltransferasa va metilando las histonas. Al llegar al da 35 todo el plsmido est prcticamente silenciado.

Conclusiones: Vectores plasmdicos: incrementan los marcadores de heterocromatina. Minicrculos: incrementan los marcadores de eucromatina.

Tema 11: Mouse clinics

En el genoma hay unos 20000 genes. En Europa y en Estados Unidos se han iniciado proyectos de hacer el genoma a escala. En el mundo se va rpido, ahora todo es high-throughput. Hoy en da se saben todos los genes. Los proyectos de high-throughput solo mutan el gen. Se debe hacer todas las mutaciones de cada gen del genoma. Despus hay que generar un animal y por ltimo fenotiparlos. El fenotipaje no es algo trivial, debe haber centros especializados en fenotipaje de highthroughput. Para solucionar esto, mouse-genetics tuvo una iniciativa. Se financi un proyecto en Europa (EUCOMM). EUCOMM ha generado muchos genes knockeados, adems, dispone de una pgina web donde por 1500 o 2000 facilitar algo que costara 40000 si se hiciera en una empresa particular. Proyectos similares se hicieron en EEUU (NorCOM) y Canad (KOMP). Al final decidieron unirse (IMMC).

Si da la casualidad que el gen que se necesita no lo tiene el consorcio, se puede encargar.

EUCOMM se encarga de realizar mutagnesis a gran escala. Interesa elegir la cepa del ratn, todos trabajan con la misma: C57BL/6N (una cepa negra). Esta cepa lleva un constructo que puede dar a la vez un KO total y un transgnico especfico de tejido. Los consorcios solo te proporcionan la stem cell. Esta se debe inyectar en blastocisto para obtener quimeras y seguir con los cruces habituales para obtener KO. Hay proyectos ms pequeos agrupados en IMMC (por ejemplo el espaol). Puede que al implantar el quimera haya muerte embrionaria. Hay centros que estudian esta posibilidad. Para fenotipar bien se deben saber todas las caractersticas del organismo (cardacas, pulmonares). Por esto, los centros de fenotipado a gran escala tienen que fenotipar con unos estndares. Hay un proyecto para estandarizar la manera de fenotipar un ratn en Europa, llamado EUMORPHIA.

Aqu se estableci como fenotipar la funcin cardaca, respiratoria, immune todo. De esta manera se puede comparar resultados entre centros. Se establecieron las mismas pruebas (EMPReSSslim). Se hacen dos pipelines en las que se utilizan 10 machos y 10 hembras (mnimo nmero de ratones). Se empieza cuando el ratn est en 9 semanas. El proyecto busca el mnimo trabajo de fenotipaje que permita establecer la caracterizacin de los ratones por tal de ahorrar tiempo y dinero. En el pipeline se pasa por diferentes pruebas (tensin, immunolgica). No responde igual un macho que una hembra. Las hormonas cambian en fenotipar actividades.

Esto va unido a un equipo de bioinformticos. En Europa hay cuatro grandes centros que hacen fenotipado a gran escala:

EUMODIC surgi para fenotipar animales que provenan del proyecto EUCOMM. Lo coordina Steve Brown, la idea es fenotipar 650 ratones.

EUCOMM (genera las stem cells) Ratones (mouse clinics) EMMA (aqu se guardan los ratones) Mouse clinics EMPReSSslim (anlisis bsico) Centro especializado de fenotipaje (si interesa un fenotipado ms concreto).

Si se quiere fenotipar todos los genes se debe hacer ms rpido. Se ampli el proyecto con ms pases, entre ellos Espaa. Infrafrontier Para crear estructuras legales, todo est muy interaccionado (como deben ser los estabularios). El objetivo del proyecto es relizar una empresa de la vida.

Se cre el IMPC, un mouse clinic a nivel mundial. Cuesta varios billones de euros. En estados unidos se hacen tres mouse clinics. Tambin se decide hacer mouse clinics en Australia, en Taiwn, en China

Se tienen que organizar. En octubre de 2008 se ponen en marcha. Las determinaciones son dar la mxima informacin con el menor coste. Fase 1: fenotipar 5000 ratones (5 aos) Fase 2: analizar 10000 ratones (a partir del 2016) Genoma de ratn stem cells fenotipado (EUMODIC, ARRA) IMPC (ya estn fenotipados a gran escala, para ver algo ms concreto hacer un fenotipado ms especfico en otro centro).

Para curar enfermedades genticas si no hay modelos animales nunca llegar a la clnica. Los consorcios son muy importantes para trabajar a gran escala, sobre todo para tratar enfermedades raras. En cinco aos se pretende tener todo el genoma mutado.

CBATEG, Spanish Mouse clinic Es un mouse clinic. Se present a final de ao del 2005. ICTS: infraestructuras singulares. Catalunya present cuatro proyectos y se escogieron dos. Uno de ellos fue el mouse clinic (febrero de 2007). Se tuvo que hacer otra gran memoria. Desde 2007 se han ido modificando planes Se evalu el proyecto muchas veces. A parte de ICTS, tambin era parte de un proyecto europeo. El proyecto se defini como very high priority in Spain. El problema es que el proyecto se debe firmar por Espaa, Europa y Catalunya. Con la crisis Espaa no lo firma. En los consorcios europeos siempre se est al da de la tecnologa.

Las empresas que hacen mouse clinics necesitan que otras empresas las prueben (aplicacin de frmacos). Hay empresas que estn interesadas en utilizar mouse clinics para probar sus productos.

Se estn desarrollando ms los mtodos de fenotipado. Estan surgiendo tecnologas que lo permiten hacer ms rpido. Se debe tener en cuenta que mantener animales transgnicos es caro, pero que mantener colonias lo es ms. Basndose en el diseo, se necesita que alguien haga el fenotipado. Se debe externalizar, buscar una empresa que haga el fenotipado (por ejemplo, universidades, centros de investigacin). El mundo se ha globalizado. Al lado de una mouse clinic ha de haber investigadores. Se ponen a punto tecnologas que se pueden ofrecer cmo plataformas tecnolgicas. Se va innovando. El personal tcnico de las plataformas tambin ha de ser investigadores, normalmente doctores. Esto es una fuente de sitios de trabajo. Los patlogos estn muy buscados (en patologa del ratn). Los morflogos tambin. Una mouse clinic puede hacer todo. Hay tres grandes plataformas. Modificacin gentica en animales Capacidad de analizar los animales Evaluacin preclnica (de frmacos, drogas) Muchas no prevn evaluacin preclnica pero cada vez se hace ms. Una plataforma se divide en varias subunidades. Una vez se tienen los ratones habr que fenotiparlos. La primera unidad nutre toda una unidad de animales transgnicos, hace fertilizacin in vitro, criopreservacin Habr tambin una segunda unidad que se dedicar a vectores virales. Se puede manipular un rgano inyectando un vector. La tercera unidad es de vectores no virales. Con estas tres unidades se consigue animales modificados genticamente. Hay subplataformas divididas en subunidades (plataformas de fenotipado). Despus de pasar al animal por las diferentes plataformas se consigue el fenotipado (por ejemplo, plataforma que se encarga del metabolismo: unidad de endocrinologa, anlisis metablico, hematologa, estudios de expresin gnica, inmunologa (que podra convertirse en s en una plataforma)). Con los diferentes anlisis se pueden hacer muchas cosas. Se tiende a utilizar el mnimo nmero de animales. Las plataformas de imagen dicen como es el animal. El mismo grupo de animales se va incluyendo en estos equipos (in vivo, morfologa, patologa, anlisis microscpico). Hay tambin un rea de medicina interna (parte cardiovascular, neurologa, sensorial (pruebas acsticas), pneumologa, gastroenterologa, nefrologa, reproduccin).

Por ltimo, tambin hay un rea de comportamiento. Pasar a los animales por todas las bateras es muy caro. Cada vez hay ms pruebas. Imagen: tags para ratones, equipos de resonancia magntica, ultrasonido Todo esto no se puede tener a punto en un centro. Las tcnicas necesitan muchos especialistas de diferentes reas. Behaviour: actividad locomotora (cintas donde corren), circuitos, pruebas de atencin Si se tiene una mouse clinic interesa que el animal sea fenotipado a diferentes tiempos. Al mismo lote de animales se le hace un seguimiento. Se utilizan estabularios libres de patgenos. Esto interfiere en las investigaciones En el estabulario han de caber todas las mquinas, sino no puede ser una mouse clinic (hace seguimiento), sino que ha de ser de punto y final (como el de la UAB). Hay diferentes zonas en el estabulario. La complejidad no es hacer el animal sino fenotiparlo. Las plataformas han de estar muy internamente organizadas. A veces un animal tiene un fenotipo primario esperado pero al pasar por las bateras se encuentran diferentes fenotipos no esperados que pueden ayudar a entender una enfermedad. Medicina translacional En el proceso de Drug Discovery entra en pie una mouse clinic o centro de fenotipado. Se empieza a nivel de ratn y va evolucionando. Se ensaya en los pequeos animales, cuando funciona se ha de ir a animales ms grandes. Adems, no debe olvidarse que se requiere de una regulacin para que se acepten los medicamentos Para ello son necesarias las empresas de regulacin que se encargan de preparar la documentacin. Evaluacin preclnica Se ha de tener en cuenta muchas cosas: efectos secundarios del medicamento (por ejemplo aparicin de tumores, toxicologa) Generacin del KO Fenotipado Modelos animales de enfermedades humanas Nuevo tratamiento de cura El fenotipado es muy importante para el establecimiento de modelos animales y as poder encontrar nuevos tratamientos. Terapia gnica (medicinas innovadoras) Terapia de Drug Discovery

Las empresas farmacuticas piden ratones humanizados (con el gen humano que provoca una enfermedad). Los centros pueden participar en muchos tipos de proyectos (pequeos, medianos y grandes). Se disea el estudio. Como el mundo es global, tambin se pueden hacer proyectos online. Actividades de training Se hacen cursos de entrenamiento, estancias cortas de estudiantes Siempre va la investigacin ayudada por las plataformas y las actividades de training.