INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZNIA INPA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS UFAM PROGRAMA INTEGRADO DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA TROPICAL E RECURSOS

OS NATURAIS

ESTUDO DA VARIABILIDADE GENTICA DO CARDINAL (OSTARIOPHYSI: CHARACIFORMES: Paracheirodon axelrodi) NA BACIA DO RIO NEGRO

Audrey Alencar Arruda d Assuno

Dissertao de mestrado apresentada ao Programa de Ps-graduao em Biologia Tropical e Recursos Naturais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia INPA para a obteno do ttulo de Mestre em Gentica, Conservao e Biologia Evolutiva.

MANAUS AMAZONAS 2006

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZNIA INPA UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS UFAM PROGRAMA INTEGRADO DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA TROPICAL E RECURSOS NATURAIS

ESTUDO DA VARIABILIDADE GENTICA DO CARDINAL (OSTARIOPHYSI: CHARACIFORMES: Paracheirodon axelrodi) NA BACIA DO RIO NEGRO

Audrey Alencar Arruda d Assuno

Orientador: Jorge Ivan Rebelo Porto, Dr. Co-orientador: Tomas Hrbek, Dr.

MANAUS AMAZONAS 2006

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Ficha Catalogrfica D231e D'Assuno, Audrey Alencar Arruda Estudo da variabilidade gentica do cardinal (Ostariophysi: Characiformes: Paracheirodon Axelrodi) na bacia do Rio Negro / Audrey Alencar Arruda D' Assuno. -- Manaus : INPA/UFAM, 2007. xiv, 67f. : il. Dissertao(mestrado)-- INPA/UFAM, Manaus, 2007. Orientador (a): Dr. Jorge Ivan Rebelo Porto Co-Orientador: Dr. Tomas Hrbek rea de concentrao : Gentica 1. Peixe ornamental. 2. Variabilidade gentica. 3. Microssatlites. I. Ttulo.

Sinopse: Foi analisada a variabilidade gentica do peixe ornamental cardinal (Paracheirodon axelrodi). Estudou-se 6 amostras populacionais, provenientes dos tributrios do mdio Rio Negro prximos aos municpios de Barcelos (Igarap Cajarizinho, Igarap Zamula e Lago Rainha) e Santa Izabel do Rio Negro (Rio Tea, Rio Urubaxi e Igarap Iaha). Foi desenvolvido e caracterizado 12 marcadores microssatlites para Paracheirodon axelrodi, e adicionamente utilizado 5 outros microssatlites descritos na literatura. Foi observado uma alta diversidade gentica e no estudo populacional foi verificado indcios de estruturao populacional. Foi sugerido que o rio Negro no uma barreira disperso do cardinal e que, no momento, esta espcie no est sendo afetada pela explorao comercial intensa na regio considerando seus nveis de diversidade gentica.

A meus pais Ednelza e Wagner, Ao meu amor & Ao meu orientador

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 At o Sol para enxergar com clareza necessita que o cu se abra... Shakespeare

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AGRADECIMENTOS

Neste momento, revendo minha trajetria at aqui, como num filme passando rapidamente pela cabea me vem na memria vrios momentos especiais de pura alegria e porque no, tambm, de puro desespero. Nessa viso enlouquecida de final de trabalho, sei que devo agradecer a muitos pela pacincia, pelo ouvido, pelo tempo, pelos pedidos e pelas palavras. De todas as formas, a experincia adquirida aqui ficar para sempre por isso agradeo a todos que contriburam para que finalmente esse momento chegasse. Agradeo profundamente: Ao CNPq PRONEX / PNOPG, Projeto Piaba, INPA-PPI 2-3750, curso GCBEV e FAPEAM pelo suporte financeiro. Especialmente a FAPEAM pela cesso da bolsa de estudo. Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia INPA especificamente ao Laboratrio Temtico de Biologia Molecular LTBM, por disponibilizarem a estrutura fsica e os equipamentos para o desenvolvimento desse mestrado. Ao laboratrio da UFAM e ao Projeto PIRADA por disponibilizarem os programas de genotipagens e anlise de microssatlites. Universidade Federal do Amazonas - UFAM, especificamente aos laboratrios de Gentica (Bloco G) e LEGAL (Bloco E) pelo socorro nos momentos difceis ocorridos nesse tempo. Aos que abasteceram-me com amostras de cardinal particularmente aos pesquisadores Dr. Paulo Petry e Dr. Jansen Zuanon; ao Sr. Ribeiro, distribuidor de peixes ornamentais em Barcelos, que mesmo sem conhec-lo pessoalmente conseguiu-me amostras e contribuiu no esclarecimento de minhas dvidas sobre coleta e exportao de cardinal; e ao Sr. Cleuder, tcnico do projeto Piaba. A Dra. Vera Scarpassa, que mostrou-me por meio de seus conhecimentos um caminho tico de trabalho, auxiliando-me no esclarecimento de minhas dvidas. Dra. Izeni Pires Farias e ao Dr. Tomas Hrbek pelos incentivos e disponibilidade em ensinar. Ambos foram de fundamental importncia durante o desenvolvimento dos marcadores microssatlites e anlise dos resultados.

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A Dra. Eliana Feldberg pelo direcionamento, carinho, apoio, incentivo e pela coco-co-orientao. Foi fundamental para essa realizao. Pois, no me vejo profissionalmente sem enxerg-la por perto em todos os momentos!!! Aos filhos do mesmo pai no LTBM: Carlos, Rebecca, Fabola e Alexandra pela pacincia, pelo auxlio e pelo companheirismo. Especialmente, a Faf e Xandra pela cesso de seus braos e seu tempo na execuo do trabalho. Aos colegas de laboratrio: Raquel, Jacqueline, Kyara, Tatiana e aos demais PIRADOS pelos momentos de aprendizado e de divertimentos. Em especial, agradeo a Tati pela sua disponibilidade em injetar placas interminveis no Mega. Aos colegas de curso: Renata, Carla, Taciana, William, aos Danieis Raid, Dutra, Barros e Toffoli pelos momentos no GCBEV. Aos colegas da UFAM: Doriane, Dina, Larissa, Neves, Themis, pelo auxlio. Aos meus colegas do Ensinando Gentica Brincando: Daniel Raid, Taciana Amorim, Manuella Villar e Cleyton Fantini pelos momentos de coragem e deciso ao se fazer um curso voltado educao, apesar de todas as atribulaes individuais. Aos amigos do Chico: Waldete Salem, Helio Saraiva e Ins Cardoso pelo apoio e encorajamento. s minhas amigas de corao: Eleilza, Flaviane, Paula e Luciane por tudo e por sempre! minha famlia (me, pai e irmos) pela preocupao, compreenso e confiana. A minha famlia ps-matrimnio pela torcida. Descobri a duras penas que minha famlia o meu amor, meu porto seguro!! Ao Dr. Jorge Porto por ter me proporcionado um crescimento profissional e pessoal imensurvel aps longos anos de trabalho juntos. Mostrou-me que o caminho rduo e de constantes batalhas. Agradecerei sempre pelo apoio incondicional, pela pacincia, pelas crticas e discusses, pelo tempo e especialmente pelo carinho e preocupao. Ao Alexandre Cavalcanti, que nos melhores e piores momentos estava sempre ao meu lado, crendo em mim quando eu mesma no o fazia.

Obrigada!!!

RESUMO O peixe ornamental cardinal (Paracheirodon axelrodi) um dos caracdeos amaznicos mais exportados. Desde 1950, os cardinais vem sendo coletados para fins comerciais ao longo de sua distribuio natural nos tributrios dos rios Negro e Orinoco (Brasil, Colmbia e Venezuela). Somente o cardinal responsvel por 80% do total de peixes ornamentais exportados da regio amaznica. Apesar dessa importncia atualmente no existe nenhum plano de gesto da pesca ornamental. Como parte de um esforo para desenvolver marcadores moleculares hipervariveis para os peixes amaznicos e contribuir com informao gentica para futuros planos de manejo e conservao, foram desenvolvidos marcadores microssatlites para o cardinal (P. axelrodi) e adicionalmente microssatlites previamente publicados foram utilizados. A partir de protocolo de enriquecimento para microssatlites e hibridizao seletiva com sondas oligonucleotdicas 12 microssatlites foram desenvolvidos e caracterizados sendo que cinco mostraram-se polimrficos e apenas dois mostraram-se aptos para as anlises populacionais. Usando 6 locos de microssatlites previamente publicados a estrutura gentica de seis populaes selvagens de P. axelrodi coletados em anos distintos e provenientes dos municpios de Barcelos (Igarap Cajarizinho, Igarap Zamula e Lago Rainha) e Santa Izabel do rio Negro (rio Tea, rio Urubaxi e Igarap Iaha) foi investigada. O polimorfismo dos locos de microssatlites foi avaliado, tendo sido encontrado um total de 17 alelos. Estes marcadores microssatlites detectaram quantidades substanciais de variao gentica, com a heterozigosidade observada (Ho) variando de 0.1 a 0.967 e a heterozigosidade esperada (He) variando de 0.059 a 0.938. A maioria dos locos nas populaes analisadas estavam em equilbrio de HardyWeinberg (H-WE), mas em alguns casos desvios neste equilbrio foram observados. VI

Alm disso, houve evidncias de desequilbrio de ligao em alguns locos. De uma maneira geral, as populaes do cardinal foram caracterizadas por uma alta diversidade gentica (d = 0,744) com evidncia de uma pequena estruturao gentica (Fst = 0,14309), a qual pode ser revertida ou minimizada pelo fluxo gnico estimado (Nm= 1 9). Foi sugerido que o rio Negro no uma barreira disperso do cardinal e que as populaes amostradas ainda podem ser consideradas como parte de uma nica unidade de manejo. O teste de Mantel no mostrou nenhuma correlao entre a distncia gentica e a distncia geogrfica para as amostragens de 1999, o mesmo no podendo ser dito para as de 2005. Diferentes resultados foram obtidos com os testes Bottleneck e Mvalues para detectar afunilamento populacional (bottleneck), sendo observado afunilamento apenas no segundo teste e em algumas populaes. Concluiuse que o cardinal do mdio rio Negro no est imediatamente ameaado pela perda de potencial evolutivo por eventos de longo prazo, como a pesca extrativista, ou por eventos cclicos de curto prazo, como o El Nio.

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ABSTRACT The cardinal tetra Paracheirodon axelrodi is the most exported Amazonian characin. Since the mid-1950s, cardinal tetras have been harvested along their natural distribution in the Negro, and the upper Orinoco River drainages and their tributaries in Brazil, Colombia and Venezuela. Just the cardinal tetra constitutes over 80% of total catch all ornamental fish exported from the Amazon region. Despite its economic importance, no fisheries management or conservation plans are available for the ornamental fishes in the Amazon. As part of an effort to develop hypervariable molecular markers for Amazonian fishes and to contribute genetic information for future management and conservation plans, microsatellite loci were developed for the cardinal tetra (Paracheirodon axelrodi) and additional previously published microsatellites were assayed. Starting from a protocol of enrichment for microsatellite repeat regions and selective hybridization by using oligonucleotides as a probe, a total of 12 microsatellites loci were developed and characterized. Although five out of 12 loci were polymorphic, only two were adequate for population analyses purposes. By using six previously published microsatellite loci, the genetic structure of P. axelrodi from six wild populations collected in distinct years in the municipalities of Barcelos (Igarap Cajarizinho, Igarap Zamula and Lago Rainha) and Santa Izabel do Rio Negro (Rio Tea, Rio Urubaxi and Igarap Iaha) was investigated. Polymorphism at all loci was assessed, with a total of 17 different alleles found. These microsatellites markers detected substantial amounts of genetic variation, with observed heterozygosity (Ho) ranging from 0,1 to 0,967 and the expected heterozygosity (He) ranging from 0.059 to 0.938. The most loci were at Hardy Weinberg equilibrium (HWE) but in some cases deviations were observed. Also, partial evidences for linkage disequilibrium was detected. Overall, the populations were VIII

characterized by high microsatellite genetic diversity (d= 0,744) and a low genetic structure (FST = 0,14309) which may be reversed or minimized by the estimated gene flow (Nm =1-9). It was suggested that the Negro River did not hinder dispersal of the cardinal tetra and that sampled populations are a single unit of management. Mantels test showed no correlation between genetic distance and geographical distance for the populations sampled in 1999 but did show a weak but significant correlation for the 2005 samples. The detection of bottlenecks gave different results for the tests implemented in the programs Bottleneck and Mvalues; genetic bottleneck was observed only in the second test and only in some populations. In conclusion, it was found that the cardinal tetra in the middle Negro River is not immediately threatened by loss of evolutionary potential either due to long term events, i.e. extrativism fisheries, or by short term events, i.e. the cyclic El Nio.

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NDICE FICHA CATALOGRFICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DEDICATRIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . EPGRAFE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AGRADECIMENTOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . RESUMO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ABSTRACT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . LISTA DE TABELAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . LISTA DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. INTRODUO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1. O Cardinal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. A importncia de estudos genticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3. Os microssatlites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4. Teste de hipteses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5. Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5.1. Objetivos especficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. MATERIAL E MTODOS 2.1. Material biolgico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. Extrao de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3. Eletroforese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4. Tcnica de microssatlite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1. Desenvolvimento dos marcadores microssatlites de Paracheirodon axelrodi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 I II III IV VI VIII XII XIV 1 1 3 4 6 8 8 9 9 11 11 12

2.4.2. Caracterizao dos primers de microssatlite . . . . . . . . . . 2.5. Anlise genotpica e populacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. Desenvolvimento dos microssatlites . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Anlises Populacionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4. DISCUSSO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1. Caracterizao dos locos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2. Variabilidade espacial e temporal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5. CONCLUSES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7. ANEXOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1. Anexos I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

20 22 25 25 32 42 42 44 50 51 61 61

XI

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Tabela 2 -

Classificao dos microssatlites. Sinopse da amostragem do cardinal efetuada para o trabalho.

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Tabela 3 -

Primers de microssatlites desenvolvidos para a estimar a variabilidade gentica de Paracheirodon axelrodi. Caracterizao dos microssatlites do cardinal do rio Uneiuxi observando o tamanho, temperatura de anelamento, heterozigosidade observada e esperada dos locos polimrficos. Novo conjunto de primers de microssatlites de Paracheirodon axelrodi. Caracterizao dos microssatlites do rio Uneiuxi observando o tamanho, temperatura de anelamento, heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He) dos locos polimrficos. Resultado dos testes cruzados realizados com 4 espcies diferentes de peixes ornamentais amaznicos. Legenda: ++ boa amplificao, + amplificao fraca ou bandas mltiplas e no amplificou. Listagem dos primers desenvolvidos para o Cardinal por Behereharay et al.(2004). Em destaque os primers selecionados para esse trabalho. Dados populacionais: No de alelos, Heterozigosidade observada (Ho) e Heterozigosidade esperada (HE). Nveis de significncia de P< 0,004 (aps a correo de Bonferroni) correspondem a desvio de H-WE.

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Tabela 4 -

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Tabela 5 -

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Tabela 6 -

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Tabela 7 -

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Tabela 8 -

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Tabela 9 -

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Tabela 10 - Estimativas do ndice de fixao (FST - abaixo da linha diagonal) e do nmero de migrantes por gerao (Nm - e acima da linha diagonal) para as populaes analisadas. Tabela 11 - Resultados da anlise de varincia molecular (AMOVA) no conjunto de populaes de cardinal. Tabela 12 - Resultados da anlise de varincia molecular (AMOVA) entre grupos de populaes de cardinal coletados em tributrios de margens opostas (margem esquerda X margem direita). Tabela 13 - Resultados da anlise de varincia molecular (AMOVA) entre

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XII

grupos de populaes de cardinal coletados em anos distintos (1999 X 2005). Tabela 14 - ndices de diversidade entre as populaes analisadas Tabela 15 - Comparaes dos testes para reduo do tamanho populacional. Nvel de significncia antes (*P=0,05) e aps a correo de Bonferroni (**P=0,004).

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XIII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Foto do cardinal (Paracheirodon axelrodi) e mapa de localizao das reas de coleta nos municpios de Santa Izabel Rio Negro (? ) e Barcelos (? ). 1 = rio Urubaxi, 2 = rio Iah, 3 = rio Tea, 4 = igarap Zamula, 5 = igarap Cajarizinho e 6 = lago Rainha. Etapas do desenvolvimento dos marcadores microssatlites. Esquema do protocolo econmico de marcao de fragmentos de PCR com fluorescncia. Adaptado de Schuelke (2000).

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Figura 2 Figura 3

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Figura 4 - DNA genmico de P. axelrodi digerido pela endonuclease de restrio Sau3AI. O destaque em amarelo corresponde rea dos fragmentos excisados. M= marcador de peso molecular. Figura 5 Figura 6 Sequncia e identificao dos microssatlites selecionados. Teste de amplificao em microssatlites de cardinal. 11 pares de primers de

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Figura 7

Eletroferograma do loco Mic03 evidenciando trs indivduos homozigotos (A) e trs heterozigotos (B). Extrao de DNA genmico de amostras populacionais do igarap Cajarizinho.

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Figura 8 -

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XIV

1. INTRODUO

1.1. O cardinal A pesca de peixes ornamentais uma das atividades mais rentveis para os municpios de Barcelos e Santa Izabel do Rio Negro (Amazonas) gerando mais de 2 milhes de dlares anuais pela exportao. Porm, esta atividade continua sendo uma prtica de subsistncia para 80% das famlias ribeirinhas, as quais de algum modo esto envolvidas na captura e comercializao de peixes ornamentais (Prang, 2001a; Prang, 2001b). Os pescadores de peixes ornamentais, denominados de piabeiros, so contratados pelos grandes exportadores e saem para capturar os peixes entre o perodo da vazante e da enchente (outubro a fevereiro). Os espcimes so capturados com apetrechos regionais de pesca (cacuri e o rapich) e colocadas em caapas plsticas (54 x 36 x 20 cm) com 12 a 15 litros de gua. Como medida de preveno a doenas, contaminao e a morte dos animais, so aplicados na gua fungicidas e bactericidas, e tambm so realizadas trocas regulares da gua dos recipientes evitando a morte por hipxia e por alta concentrao de amnia (Prang, 2001a; Prang, 2001b; Waichman et al., 2001). Ainda que seja permitida a exportao de aproximadamente 200 espcies de peixes ornamentais (MMA, 2005), a demanda comercial recai sobre um pequeno nmero de espcies. Somente o cardinal (Paracheirodon axelrodi) responde por mais de 80% do total de peixes ornamentais exportados da regio Amaznica. Estima-se que cerca de 15 a 20 milhes de cardinais sejam retirados dos rios amaznicos todos os anos, embora se acredite que esses valores possam atingir os 40 milhes. Sendo assim, o cardinal a mais importante espcie de peixe ornamental da Bacia do Rio 1

Negro e uma das mais populares no mercado internacional (Chao, 2001; Harris & Petry, 2001). Embora a importncia scio-econmica dessa espcie seja notria para a regio infelizmente o cardinal carece de um plano de manejo e conservao. O cardinal uma espcie de pequeno porte (2 - 3 cm), que apresenta um ciclo de vida curto de aproximadamente dois anos possui uma elevada capacidade de repovoamento em ambientes intactos. encontrada em reas rasas, sombreadas e com pouca correnteza nos tributrios de gua preta do alto e mdio Rio Negro, no Brasil, e nos tributrios do Rio Orinoco, na Colmbia e na Venezuela (Geisler & Annibal, 1987; Prada-Pedreros, 2002; Harris & Petry, 2001). Paracheirodon axelrodi juntamente com outras duas espcies P. simulans e P. innesi so consideradas como incertae sedis dentro da famlia Characidae (Lima et al., 2003). De acordo com Geisler & Annibal (1987), o perodo de reproduo dessa espcie geralmente tem seu incio no final do ms de maro ou comeo de abril indo at o final do ms de junho, dependendo do nvel das guas. Estes autores apresentaram vrios fatores limnolgicos que esto relacionados com a sua reproduo em tributrios do rio Negro e demonstraram que esta espcie depende de reas alagadas como os igaps e chavascais para sua reproduo e alimentao. Walker (2004) estudou a estratgia alimentar do cardinal e observou que em sua dieta alimentar so encontradas larvas da ordem Diptera (Chironomidae) e microcrustceos (Cladocera), tendo sido notado que os itens alimentares podem diferir entre indivduos coletados em tributrios distintos. Recentemente, Anjos & Anjos (2006) apresentaram informaes fundamentais sobre a reproduo e o desenvolvimento embrionrio e larval do cardinal tetra, Paracheirodon axelrodi, em condies laboratoriais. 2

1.2 A importncia de estudos genticos Para entender melhor a dinmica das populaes de espcies exploradas e tentar levantar dados que colaborem com planos de manejo e conservao, os estudos genticos tm se mostrado de grande importncia na caracterizao e identificao de espcies e seus hbridos, na identificao de linhagens, na determinao da variabilidade gentica em populaes selvagens e cultivadas, na avaliao de impactos genticos com a introduo de peixes cultivados em populaes naturais, na determinao de estratgias para fins de criao e repovoamento e na localizao de marcadores ligados a genes de interesse econmico (Carvalho & Hauser, 1998). Alm disso, so cruciais na formao de estratgias de manejo e identificao de unidades de conservao. O emprego de marcadores moleculares do genoma nuclear (nDNA) e mitocondrial (mtDNA) vem sendo considerados ferramentas importantes em estudos relacionados com a estrutura de populaes de peixes, uma vez que esses marcadores so teis na deteco de polimorfismos e fornecem informaes seguras sobre os nveis de variabilidade e similaridade entre distintas populaes ou estoques. Por meio da deteco de diversidade gentica e caracterizao gnica de populaes e espcies possvel uma manuteno, em longo prazo, de estoques explotveis e da variabilidade necessria para o melhoramento gentico de espcies em cativeiro (Hilsdorf & Krieger, 1998). A manuteno da variabilidade gentica um fator fundamental para qualquer espcie manter a vitalidade reprodutiva, a resistncia a doenas e a habilidade para se adaptar a mudanas ambientais (Primack et al., 2001). H dcadas a identificao de padres genticos tem servido de base para a definio de estoques, na seleo de reas de preservao e na definio de polticas 3

de manejo e conservao de peixes. Contudo, os estudos genticos publicados sobre o cardinal ainda so incipientes estando restritos a descrio do nmero cromossmico (Scheel & Christensen, 1970; Scheel, 1973), um trabalho preliminar de cunho molecular (Harris & Petry, 2001) e um trabalho sobre o desenvolvimento de marcadores microssatlites (Beheregaray et al., 2004a).

1.3. Os microssatlites No genoma dos organismos ocorrem seqncias repetitivas organizadas em tandem de tamanhos variados. Essas seqncias podem ser usadas como marcadores moleculares possibilitando o estudo da diversidade gentica, de investigao das relaes de parentesco, mapeamento gnico e anlise de paternidade. Reconhecem-se trs tipos de marcadores moleculares com seqncias repetitivas: o DNA satlite com seqncias longas acima de 100pb (Britten & Kohne, 1968), minissatlites com seqncias mdias variando de 10 a 64pb (Jeffreys et al., 1985) e microssatlites com seqncias curtas variando de 1 a 6pb (Litt & Luty, 1989). Apesar de haver problemas em relao ao desenvolvimento e caracterizao de marcadores microssatlites, o elevado nvel de variabilidade que pode ser detectado por esses marcadores e a rapidez no processamento da tcnica tem feito com que os microssatlites tenham se difundido amplamente na literatura mundial, quando comparado a outros tipos de marcadores moleculares j conhecidos (OConnel & Wright, 1997). Os microssatlites podem ser encontrados em qualquer lugar do genoma, em regies codificantes ou no codificantes, sendo menos freqentes nos xons do que nos ntrons (Hancock, 1995). So encontrados em elevada freqncia e em ampla 4

distribuio nos genomas eucariotos (Weber & May, 1989; Weber & Wong, 1993), sendo mais comum em vertebrados que invertebrados. Segundo Chambers & MacAvoy (2000), os microssatlites podem ser classificados de acordo com suas repeties em: puro ou perfeito, imperfeito, composto, composto imperfeito e complexo (Tabela 1).

Tabela 1- Classificao dos microssatlites Classes Puro ou Perfeito Seqncias A A A A A Aou (A)5 (mononucleotdeo) AT AT AT AT AT AT ou (AT)6 (dinucleotdeo) ATGATGATG ATG ATG ou (ATG)6 (trinucleotdeo) ATGCATGCATGCATGCATGC ou (ATGC)6 (Tetranucleotdeo) AT (CA)4 TA (CA)6 (CT)22 (CA)6 (AC)14 AG AA (AG)12 (TC)4 (T)6 (CT)4 (TTCC)2-4

Imperfeitos Composto Composto imperfeito Complexo

A natureza da variabilidade existente nesse marcador se deve ao nmero de repeties que existem nas unidades repetidas (Tautz, 1989; Weber & May, 1989). Essas variaes podem ser explicadas por dois modelos: a slippage (deslize ou escorrego) da DNA polimerase durante a replicao (Strand et al., 1993; Tautz & Schltterer, 1994) e a recombinao desigual (Majewski & Ott, 2000). Desde a ltima reviso sobre os microssatlites em peixes (OConnel & Wright, 1997), vrios trabalhos foram publicados. No Brasil, o desenvolvimento de marcadores microssatlites um fenmeno recente podendo ser encontrados trabalhos em algumas espcies de peixes tais como o de Calcagnotto et al. (2001) que descreveram primers (oligonucleotdeos iniciadores) de microssatlites para o pacu (Piaractus mesopotamicus); Farias et al. (2003) que descreveram primers de microssatlites para 5

o pirarucu (Arapaima gigas); Barroso et al. (2003; 2005) que descreveram primers de microssatlites para a pirapitinga do sul (Brycon opalinus); Beheregaray et al. (2004a; 2004b; 2005; 2006) que descreveram primers de microssatlites para os peixes ornamentais cardinal (Paracheirodon axelrodi), nanstomo-lpis (Nannostomus

unifasciatus), rodstomo (Hemigrammus bleheri) e borboleta (Carnegiella strigata); Revaldaves et al. (2005) que descreveram primers de microssatlites para o pintado (Pseudoplatystoma corruscans).

1.4. Teste de hipteses Com a descrio de marcadores microssatlites para o cardinal (Beheregaray et al., 2004a) j possvel tentar aferir a magnitude e a distribuio da variabilidade gentica existente nas populaes da espcie. Espera-se que a utilizao desses marcadores moleculares responda questionamentos relevantes sobre a gentica populacional do cardinal, ou seja: estariam as populaes de cardinal geneticamente estruturadas? Haveria relao entre distncia geogrfica ou barreiras geogrficas com a estruturao populacional? A variabilidade gentica das populaes explotadas de cardinal tem diminuido ao longo dos anos? A resposta a tais perguntas o cerne do que se tem convencionado de chamar Gentica da Conservao e um dos objetivos desta rea tentar explicar, de maneira integrada, os papis relativos dos mecanismos microevolutivos como seleo, fluxo gnico, deriva gentica, na diferenciao de populaes, relacionando-os distribuio dos indivduos tanto no tempo como no espao. A anlise e interpretao de aspectos genticos podem ser de fundamental importncia para o estabelecimento de polticas de conservao de recursos genticos. Esta abordagem de particular interesse para 6

espcies como o cardinal que h pelo menos 50 anos alvo de extrativismo intensivo na Amaznia. H de se considerar que, at o momento, nenhum dos estudos genticos realizados no cardinal conseguiu demonstrar se a espcie vem conseguindo ou no manter sua integridade gentica aps mais de meio sculo de explorao comercial intensa. Nesse estudo, trs hipteses relacionadas estrutura de populaes do cardinal sero testadas: Ho = As populaes de cardinal no esto geneticamente estruturadas. H1 = As populaes de cardinal esto geneticamente estruturadas. Se a hiptese alternativa for verdadeira, ento: Ho = A distncia geogrfica no explica a estruturao populacional H2 = A distncia geogrfica explica a estruturao populacional Se a hiptese nula for verdadeira, ento: Ho = Barreiras geogrficas no explicam a estruturao populacional. H3 = Barreiras geogrficas explicam a estruturao populacional. Se a hiptese nula for verdadeira, ento: Ho = As populaes explotadas de cardinal nas regies do Rio Negro no apresentam reduo nos nveis de variabilidade gentica ao longo dos anos. H4 = As populaes explotadas de cardinal apresentam diminuio nos nveis de variabilidade gentica ao longo dos anos provavelmente causados pela sobrepesca deste recurso.

1.5. OBJETIVOS

1.5.1. Objetivo Geral Estudar a variabilidade gentica do cardinal (Paracheirodon axelrodi) em populaes do mdio Rio Negro das proximidades dos municpios de Barcelos e Santa Izabel do Rio Negro coletadas em anos distintos.

1.5.2. Objetivos Especficos 1) Desenvolver marcadores microssatlites adicionais para a espcie

Paracheirodon axelrodi. 2) Caracterizar os locos de microssatlites do cardinal nas populaes selecionadas. 3) Identificar se existem populaes geneticamente diferenciadas. 4) Verificar se o cardinal vem conseguindo manter sua variabilidade gentica ao longo dos anos analisando os nveis de variabilidade gentica das populaes sob uma escala temporal.

2. MATERIAL E MTODOS 2.1. Material biolgico Amostras populacionais de cardinal foram coletadas em diferentes localidades da Bacia do mdio Rio Negro, nos municpios de Barcelos e Santa Izabel do Rio Negro. As coletas do cardinal foram realizadas utilizando-se apetrechos de pesca, como cacuri e rapich, no perodo de seca dos rios. Algumas amostras foram obtidas diretamente de piabeiros e de exportadores de peixes ornamentais. As amostras populacionais coletadas foram colocadas em tubos Falcon de 50mL contendo lcool 70% e levadas ao Laboratrio Temtico de Biologia Molecular do INPA. Nesse trabalho, foram estudadas seis populaes, sendo trs delas localizadas em Barcelos: igaraps Cajarizinho e Zamula e Lago Rainha e as outras trs em Santa Izabel do Rio Negro: rios Iah, Urubaxi e Tea (Figura 1). O Lago Rainha foi

considerado como rea controle em relao explorao do cardinal, uma vez que esta localidade de difcil acesso. Por outro lado, o Rio Tea foi considerado como o mais impactado devido ao histrico de intensa explorao nessa rea. O estudo da variabilidade gentica temporal dessa espcie foi realizado a partir da obteno das amostras populacionais em pelo menos dois anos distintos. Amostras anteriores a 2005 foram adquiridas a partir do banco de tecidos/espcimens do Laboratrio Temtico de Biologia Molecular do INPA ou da coleo ictiolgica do INPA (Tabela 2). Alm de amostras de cardinal, foram obtidas amostras de outras espcies de peixes ornamentais Paracheirodon innesi e P. simulans, Hyphessobrycon pyrrhonotus e Carnegiella strigata.

Figura 1 Foto do cardinal (Paracheirodon axelrodi) e mapa de localizao das reas de coleta nos municpios de Santa Izabel Rio Negro ( ) e Barcelos ( ). 1 = rio

Urubaxi, 2 = rio Iah, 3 = rio Tea, 4 = igarap Zamula, 5 = igarap Cajarizinho e 6 = lago Rainha.

Tabela 2 Sinopse da amostragem do cardinal efetuada para o trabalho.

Espcie P. axelrodi P. axelrodi P. axelrodi P. axelrodi P. axelrodi P. axelrodi P. innesi P. simulans H.pyrhronotus C.strigata Local Ig. Urubaxi Ig. Iaha Rio Tea Ig. Zamula Ig. Cajarizinho Lago Rainha Rio Japur Rio Japur Rio Mariu Rio Mariu Populao UR 1999 UR 2005 IH 2002 IH 2005 TE 1999 TE 2005 Z 1999 Z 2002 CJ 1999 CJ 2005 RA 1999 ----------------No. Indivduos 30 30 20 30 30 30 30 20 30 30 14 02 02 01 02 Ano 1999 2005 2002 2005 1999 2005 1999 2002 1999 2005 1999 ---------------------

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2.2. Extrao do DNA As amostras de DNA foram extradas de acordo com o protocolo de Sambrook et al. (1989). Utilizou-se o tampo de lise (Tris-HCl pH 8,0 em 10mM, NaCl 0,3M, EDTA 10mM, Urea 4M, SDS 1%) descrito por Estoup et al. (1993) e Ashida et al. (1996). Foram descartadas as vsceras e as escamas de cada espcime, utilizando-se somente o tecido muscular e esqueltico para realizar a extrao do DNA. O tecido foi transferido para tubos de 1,5mL contendo 500 L de TNEs-Urea, 15 L de proteinase K (10mg/mL) e 10 L de RNAse (10mg/mL) incubando-se overnight. As amostras, em seguida, foram submetidas a trs lavagens sucessivas usando 1V de fenol, 1V de clorofane (1:1) e por ltimo, 1V de clorofrmio-lcool isoamlico (24:1). Levando-se a centrfuga a 13.000 rpm por 10 minutos, coletando-se o sobrenadante. Para a precipitao do DNA foi adicionado ao sobrenadante 2V de etanol 100% e 2 L de NaCl 3M deixando no freezer por 12h. Em seguida, foram adicionados 800mL de lcool 70%, centrifugando-se a 13.000 rpm por 15 minutos, desprezando-se o sobrenadante. Ao final, o DNA foi hidratado com aproximadamente 100 L de gua milliQ.

2.3. Eletroforese Aps a extrao de DNA foram feitos gis de agarose 0,8%, sendo aplicado 3 L da amostra e 3 L de azul de bromofenol. O gel foi submetido a uma corrida eletrofortica de 70V. Posteriormente, o gel foi corado em brometo de etdio (10mg/mL). A visualizao do DNA no gel foi feita no fotodocumentador Eagle Eye II (Stratagene).

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2.4. Tcnica de microssatlite 2.4.1. Desenvolvimento dos marcadores microssatlites de Paracheirodon axelrodi Inicialmente, o DNA de um nico indivduo foi extrado usando-se o protocolo de Sambrook et al. (1989). O desenvolvimento da tcnica para obteno de microssatlites seguiu o protocolo de Tenzer et al. (1999) com modificaes de Farias et al. (2003), que incluem as seguintes etapas visualizadas na figura 2 e descritas a seguir.

Digesto do DNA por endonucleases

Construo de uma biblioteca genmica - Recuperao do DNA

Anelamento a adaptadores

Enriquecimento da biblioteca e hibridizao dos fragmentos

Lavagem dos fragmentos usando os DynaBeads

PCR dos fragmentos hibridizados

Clonagem dos fragmentos em plasmdios

Identificao dos clones e repiquete das colnias

Sequenciamento dos clones Triagem e desenho dos primers Caracterizao dos microssatlites

Figura 2 - Etapas do desenvolvimento dos marcadores microssatlites

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a) Digesto do DNA genmico O DNA extrado foi submetido digesto enzimtica pela endonuclease de restrio - Sau3AI (2U/ug), com stio de corte 5-/GATC-3 e 3-CTGA/-5, por 2 horas.. Em seguida a amostra digerida foi precipitada de acordo com o procedimento abaixo: 1. Foi adicionado 1/10V de NaAc 3M e 2V de etanol 100%, misturou-se bem, deixando descansar por 30 minutos no gelo. Em seguida, foi centrifugada a 14.000rpm por 15 minutos a 4oC, desprezando-se o sobrenadante. 2. Foi feita uma lavagem com 1mL de etanol 70%, misturando-se bem. Em seguida, o DNA foi centrifugado a 14.000g por 5 minutos a 4oC, descartando-se o sobrenandante. 3. Essa amostra ento foi seca em estufa e ressuspendo-a em 50uL de TE. b) Construo da biblioteca genmica Para a construo da biblioteca genmica foram selecionados fragmentos entre 300 a 900pb fazendo-se um gel de agarose 1%, no qual foi aplicado 50uL do DNA da amostra e um marcador de peso molecular de tamanho conhecido (1kb). Este gel foi submetido a uma eletroforese horizontal por 2h a 60V. Aps a corrida, foi cortado um pedao do gel correspondente ao tamanho dos fragmentos desejados, em seguida os mesmos foram purificados. Os fragmentos selecionados foram, ento, ligados a adaptadores (Er1Bh1Blunt 5 CGG AAT TCA GTG GAT CCT GCC 3 e Er1Bh1GATCSticky 3 GCC TTA AGT CAC CTA GGA CGG CTA G 5) por meio das pontas coesivas deixadas pelo corte da endonuclease de restrio. Para que isso ocorresse foi feita uma soluo dos adaptadores usando 10uL de cada adaptador (500uM), 0,8uL de NaCl 5M e 79,2 uL de TE pH 8,0. Essa soluo foi submetida a um ciclo de 95oC por 3 minutos, 65oC por 2 minutos, 45oC por 2 minutos e 25oC por 1 minuto no termociclador (Eppendorf - Mastercycler Gradient), onde os 13

adaptadores se anelaram formando os linkers. Em seguida, foi feita uma reao para efetuar a ligao dos linkers aos fragmentos de DNA da amostra e para isso foi preparada uma reao com 50uL de gua milli-Q, 25uL de DNA, 10uL da linkers, 10uL do tampo da enzima ligase (5X) e 5uL de T4 ligase, esse mix foi colocado no termociclador a 16oC por 12h e 65oC por 20 minutos. Com o intuito de enriquecer o produto de ligao e evitar a seleo e excluso casual de fragmentos, o produto da reao da ligao foi reamplificado apenas com o primer Blunt usando-se 11,7uL de gua milli-Q, 2,5 uL dNTP (25mM), 3,0uL de MgCl2, 2,5 uL de Tampo 10X, 4ul de primer Blunt (2uM), 0,3 Taq DNA polimerase e 1,0uL do produto de ligao. O perfil da reao foi de um ciclo de 72 C por 5 minutos e em seguida 30 ciclos de 94 C por 35s, 53 C por 35s, 72 C por 1minuto e 30s, 72 C por 7 minutos e mantido a 4 C at a retirada do material do termociclador. O produto dessa amplificao foi purificado usando kit de purificao GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification (GE - Amersham Bioscience). Nesse procedimento, em cada coluna de purificao havia 5 reaes da PCR. c) Hibridizao dos microssatlites O primeiro passo para o enriquecimento da biblioteca genmica foi a hibridizao de fragmentos com sondas contendo repeties dinucleotdicas CA e CT marcadas com biotina, que sero catalisadas pela enzima terminal transferase. Para a biotinilizao das sondas, inicialmente as sondas foram preparadas com as repeties de CA e CT numa concentrao de 40uM, e ento num tubo de 1,5mL adiciona-se uma soluo contendo: 21uL de gua, 8uL de tampo 5X da terminal transferase, 8uL de sonda 100uM, 2,5uL de d-UTP biotina (Boehringer Mannheim) e 0,5uL de terminal transferase. Esse mix foi colocado em banho-maria a 37oC por 25 14

minutos. Aps esse tempo, foi adicionado 100uL de etanol 100% e 4uL de acetato de sdio 3M, colocando-se no freezer por uma noite (-20oC). No dia seguinte, o mix foi submetido a uma centrifugao de 13.000 rpm por 30 minutos, desprezando-se sobrenadante. Foi, ento adicionado 100uL de etanol 70% e novamente foi centrifugado a 13.000rpm por 30 minutos. O lcool foi descartado, o tubo foi seco em temperatura ambiente e depois foi ressuspendido em 100uL de gua milli-Q. Em seguida foram preparados os dynabeads (contas magnticas), fazendo-se inicialmente uma lavagem prvia com soluo tampo de ligao e lavagem para a retirada da soluo de 0,02% de NaN3 na qual vm imersos os dynabeads. Somente, ento, foi seguido o procedimento abaixo: 1. Foi encostado um im pela parte de fora do tudo de 1,5mL de forma que os dynabeads ficassem aderidos a parede do tubo possibilitando a remoo do lquido com uma pipeta. 2. Foi adicionado 200uL de soluo PBS/BSA homogeneizando-se bem. 3. Encostou-se o im novamente por fora do tubo para a retirada do lquido. Repetindose esse procedimento por mais duas vezes. 4. Foi adicionado 200uL da soluo tampo de ligao e lavagem e homogeneizandose manualmente. 5. Alquotas de 100uL foram feitas, guardando-as na geladeira. As sondas biotinizadas e os dynabeads foram ligados adicionando-se 100uL da soda biotinizada em 100uL de dynabeads e em seguida, essa mistura ficou em temperatura ambiente por 1 hora e depois foi colocada na geladeira. Previamente o hibridizador foi colocado a temperatura de 60oC e em seguida preparou-se solues TE 1M com NaCl 5M; e solues de SSC SDS em diferentes 15

concentraes: 5X SSC (0,1% SDS), 10X SSC (0,2%SDS) e 2X SSC (0,1% SDS); sendo que as solues 5X SSC (0,1% SDS) e 2X SSC (0,1% SDS). Em um tubo de 0,2mL colocou-se 150ul do produto da PCR purificado e o submeteu a um ciclo de 95oC por 5 minutos para desnaturar o DNA e imediatamente foi mantido em gelo. Somente agora a hibridizao dos fragmentos com microssatlites potenciais foi realizada seguindo-se as etapas abaixo: 1. O volume de 200uL de sondas biotinizadas e os dynabeads foram lavados duas vezes com 200uL de tampo ligao e lavagem. 1. Encostou-se um im por fora do tubo para descartar o sobrenandante com a pipeta. 2. Foi feita uma lavagem com 200uL de 5X SSC (0,1% SDS) no aquecido. 3. Novamente foi encostado o im na parede externa do tubo e foi descartado o sobrenadante com a pipeta. 4. Foi adicionado 150uL da soluo 10X SSC (0,2% SDS) aquecida. E esse mix foi colocado no hibridizador. 5. Foi adicionado o produto de PCR da ligao desnaturado 6. Esse complexo permaneceu no hibridizador em rotao por 4h a 60oC, invertendose o tubo manualmente algumas vezes. 7. Depois desse perodo, o complexo foi lavado invertendo-se vagarosamente o tubo por 5 minutos, em temperatura ambiente, usando 200uL da soluo 2X SSC (0,1%SDS). Repetiu-se esse procedimento por mais 2 vezes. 8. O im foi usado mais uma vez por fora do tubo e o sobrenadante foi descartado 9. Foi adicionado 200uL da soluo 2X SSC aquecida recolocando-se o tubo no hibridizador em rotao por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado usando-se novamente o im. 16

10. Foi adicionado 200uL da soluo TE/NaCl. Foi usado novamente o im por fora do tubo para descartar o sobrenadante. 11. Esse produto foi ressuspendido em 200uL TE. Ao final desse processo faz-se uma PCR teste com o objetivo de verificar o produto hibridizado usando para isso: 9,2uL de gua, 5,0uL de dNTP, 3,0uL de MgCl2, 2,5uL de Tampo da Taq, 4,0uL de Er1Bh1Blunt 10uM, 0,3 Taq. A PCR foi colocada num termociclador por 30 ciclos de 94oC por 1 minuto, 55oC por 1 minuto, 72oC por 1 minuto e 72oC por 2 minutos. Em seguida foi feito um gel de agarose 1% para verificar a amplificao numa corrida eletrofortica a 70V. d) Amplificao por PCR dos microssatlites hibridizados Esta amplificao foi feita com 16 tubos de 0,2mL para cada repetio (CA e CT) usando 11,2 uL de gua, 3,0uL de dNTP (2,5uL) , 3,0uL de MgCl2 (25mM) , 2,5ul de Tampo, 4,0uL de primer Blunt (10uM), 0,3uL de taq e 1,0uL de produto hibridizado, colocou-se em um termociclador para 15 ciclos a 94oC por 1 minuto, 55oC por 1 minuto, 72oC por 1 minuto, 72oC por 30 segundos. Grupos de 4 PCRs foram misturados e purificados numa nica coluna eluindo-se o DNA purificado em 30uL de tampo TE. Ao final, obteve-se 120uL do produto hibridizado para ser ligado ao vetor pela transformao gentica. e) Ligao O produto da PCR foi ligado ento ao vetor usando o Original TOPO TA cloning Vector Kit (Invitrogen), usando 4,5 uL de DNA, 0.5 uL de Topo vector e 1uL de Salt (ATP, MgCl2), sendo homogeneizado a temperatura ambiente por 25 minutos. Em seguida deu-se prosseguimento de acordo com os passos abaixo:

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1. O material para a ligao foi colocado em tubos com clulas competentes e deixando agir por 30 minutos sobre o gelo. Em seguida o material foi colocado a 42oC por 50 segundos e depois em gelo por 3 minutos. 3. Foi adicionado 600uL de SOC ou meio LB (pr-aquecido a 37oC) mantendo em baixa agitao por 1 hora. Aps esse procedimento o material foi inoculado em placas de cultura. Deixando as bactrias crescerem overnight 37oC. Para fazer a transformao gentica fez-se as seguintes etapas: 1. Foi coletada uma colnia isolada de DH5a, para que fosse inoculada num tubo contendo 3 mL de meio L (lquido) e deixando-se overnight a 37oC. Posteriormente, foi inoculado 300uL de meio de cultura e deixou-se overnight em 30mL de meio L. 2. Deixou-se crescer a 37oC (estufa) agitando-se (100-150rpm) por 4h at atingir 0,3 a 0,4OD, para que as clulas fossem coletadas e colocadas em 50mL de cultura. 3. As clulas foram centrifugadas a 200g por 15 minutos. E em seguida, descartou-se o sobrenadante, ressuspendendo delicadamente o sedimento em 1mL de tris-clcio. Deixou-se no gelo por no mnimo 15 minutos. 4. Foi transferido 50uL de clulas competentes para um tubo pr-resfriado. E adicionou-se 5uL de DNA plasmidial sendo mantido em gelo por 1 hora e depois se executou um choque trmico de 42oC por 2 minutos. E deixando-se descansar temperatura ambiente. 5. Foi adicionado 800uL do meio lquido incubando o sistema por 1 hora a 37oC (para restaurar as paredes das bactrias). Em seguida, fez-se o plaqueamento das clulas transformadas em meio a-gar slido contendo marcador (ampicilina 10ug/mL) e foi incubado a 37oC overnight.

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f) Repique das colnias positivas 1. Aps o crescimento bacteriano, fez-se o repiquete das bactrias crescidas em placas de 96 poos contendo 150uL de LB-lquido com ampicilina (100ug/mL). 2. Com palitos de dentes esterilizados foram realizadas transferncias das colnias para cada poo. E em seguida, foram ser incubadas a 37oC overnight. g) Amplificao dos SSR usando o primer universal M13 Foi feito uma PCR de alquotas das clulas a partir do crescimento overnight com 11,7uL de gua, 3uL de MgCl2, 2,5uL de tampo (10X), 2,5uL de dDNTP (2.5mM), 2uL de cada primer (M13F e M13R 2pmol/uL), 0,3uL de Taq (5U/uL) e 1uL de DNA (clones). A PCR baseou-se no programa de 35 ciclos de 94oC por 5 minutos, 92oC por 1 minuto para a desnaturao, 50oC por 40 segundos para o anelamento dos primers, 72oC por 1minuto e 30 segundos extenso, 72oC por mais 5 minutos. O produto da PCR em seguida foi purificado. h) Sequenciamento dos fragmentos para o desenho dos primers. Para os sequenciamento nucleotdico foram usados os primers internos T3: 5ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3 e T7: TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 numa reao que foi utilizado 2uL de ET, 2uL de tampo, 2uL de primer e 4uL de DNA. O termociclador foi programado para um total de 35 ciclos de 95oC de 20 segundos, 55oC para 15 segundos e 60o por 1 minuto. As amostras foram lidas no seqenciador automtico MegaBace 1000 DNA Analysis system (Amersham Biosciences). Em seguida as seqncias obtidas foram salvas em formato abd e analisadas no programa BioEdit (Hall, 1999) verificando-se a existncia, a qualidade, o polimorfismo e a classificao dos microssatlites. Os marcadores microssatlites foram classificados de acordo com Chambers & MacAvoy (2000). Os primers foram desenhados com auxlio 19

do programa Primer 3 (Rozen & Skaletsky, 2000) e posteriormente encomendados sua sntese em firmas comerciais especializadas. Cada um dos primers forward foi sintetizado com uma cauda do primer M13(-18pb) com vistas a posterior incorporao de fluorescncia, como sugerido pela metodologia econmica descrita por Schuelke (2000). O primer universal M13: 5- TGT AAA ACG ACG GCC AGT 3 marcado com fluorescncia FAM foi encomendado de firmas comerciais especializadas.

2.4.2. Caracterizao dos marcadores de microssatlites Uma vez sintetizados os primers, foram realizados testes de amplificao e de genotipagens em 24 amostras de Paracheirodon axelrodi provenientes de uma mesma localidade. No processo de genotipagem, as reaes da PCR foram feitas utilizando quantidade especficas das seguintes substncias: 4,3 uL de gua, 1,5uL de Tampo (10x), 0,8uL de dNTP (2,5mM), 0,7uL de MgCl2(25mM), 0,5uL de Primer M13 Foward (2mM), 1uL de Primer Reverse, (2mM), 0,3uL de Taq (5U/uL) e 1,5 uL de DNA. As condies de termociclagem foram programadas de modo a ocorrer nos ciclos iniciais a incorporao do primer M13 forward fluorescente ao produto da PCR. Assim, utilizou-se o mtodo touchdown. Desta forma quando o primer forward fosse totalmente usado ao final dos 21 ciclos iniciais, a temperatura de anelamento nos 09 ciclos finais seria reduzida para 53oC facilitando o anelamento do primer universal M13 a regio complementar no primers forward. Dessa maneira, o primer universal marcado com a fluorescncia M13(-18) agiria como o primer forward incorporando a fluorescncia FAM ao produto de PCR (Figura 3).

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Figura 3 - Esquema do protocolo econmico de marcao de fragmentos de PCR com fluorescncia. Adaptado de Schuelke (2000).

Aps a PCR foram selecionadas aleatoriamente algumas amostras para que fossem verificadas as amplificaes em gel de agarose 3,5%, dependendo da intensidade de amplificao dos fragmentos as amostras foram diludas 10 ou 20 vezes. Foi feita uma reao de genotipagem em placa de 96 poos, usando-se 7,75uL de Tween 0,1%, 0,25uL de ET size standard 400R e 2uL do DNA diludo. As amostras foram lidas no analisador automtico de DNA MegaBace 1000 DNA Analysis System (Amersham Biosciences). Os procedimentos de amplificaes por PCR das regies de microssatlites e das reaes de genotipagens foram usados tambm para os primers desenvolvidos para essa espcie por Beheregaray et al. (2004a) nesse estudo.

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2.5. Anlise genotpica e populacional A anlise genotpica foi realizada no programa MegaBACE Fragment Profiler v. 2.0 (Amersham Biosciences) onde puderam ser verificados o tamanho e nmero de repeties de cada alelo por indivduo e por populao. De posse desses dados, foi construida uma matriz com as informaes dos gentipos dos indivduos de P. axelrodi para serem feitas s anlises estatsticas das populaes amostradas. Para as anlises populacionais foi utilizado o programa Arlequin V. 3.0 (Excoffier et al., 2005) verificando o nvel de variabilidade gentica e os parmetros populacionais da espcie. Desta forma, variaes no tamanho dos locos microssatlites foram determinadas atravs das heterozigosidades observada e esperada, testadas para o equilbrio de Hardy-Weinberg, para o desequilbrio de ligao e para a divergncia na freqncia allica e genotpica entre as populaes, como descrito a seguir. O polimorfismo gentico foi estimado atravs do nmero de alelos (A) por loco observado-se a heterozigosidade observada e heterozigosidade esperada. Foram realizados testes para verificar se houve desequilbrio de ligao para todos os pares de locos dentro de cada populao e para verificar se estavam em equilbrio de HardyWeinberg. Foi realizado o teste exato para H-WE atravs do clculo da Cadeia de Markov, para fornecer uma estimativa imparcial da probabilidade do H-WE dos alelos microssatlites em cada populao. Foi realizado o clculo da Cadeia de Markov, para fornecer uma estimativa imparcial dos desvios do H-WE dos alelos microssatlites em cada populao. A diferenciao entre as populaes foi estimada pelos valores FST par-a-par proposto por Wright (1969) enquanto as estimativas de fluxo gnico foram obtidas nmero de migrantes entre as populaes (Nm). Considerando que menos de 20 locos 22

de microssatlites foram utilizados no presente trabalho, optou-se em analisar os dados usando-se o FST de Wright ao invs do RST de Slatkin (Slatkin, 1995), seguindo a proposio de Gaggiotti et al. (1999) para situaes desse tipo. A anlise da varincia molecular foi efetuada com o auxlio do AMOVA (Excoffier et al., 1992) com intuito de verificar a estrutura gentica encontrada dentro e entre as populaes analisadas, levando-se em conta o nmero de mutaes entre os alelos e a variao total em diferentes componentes. Ainda no Arlequin, foi realizado o teste de Mantel (Mantel, 1967) para testar a significncia das relaes entre distncia geogrfica e os valores de FST para todos os pares de populao analisadas. A significncia de todos os resultados das anlises foi avaliada por testes de permutao (3000 replicaes) e todos os nveis de significncia para os testes envolvendo comparaes mltiplas foram ajustados seguindo a correo de Bonferroni (Rice, 1989). Para verificar se as populaes experimentaram algum evento relacionado a reduo no tamanho populacional foram aplicados dois programas: Bottleneck (Piry et al., 1999) e MValues (Garza & Williamson, 2001). O primeiro avaliou os casos de excessos heterozigosidade observada (He), situao tpica de populaes que sofreram afunilamentos (bottleneck). As probabilidades obtidas por este programa foram derivadas do Teste de Wilcoxon que permite um bom poder de anlise utilizando-se um nmero pequeno de locos (Luikart et al.,1997). O segundo programa, avaliou a razo (M) entre o nmero de alelos (k) e os seus tamanhos (r), visto que populaes que sofrem afunilamentos tendem a extinguir alelos em baixa frequncia. Assim, a perda de qualquer alelo contribuir para a reduo em k, enquanto que a perda do maior ou 23

menor alelo contribuir para a reduo de r. De acordo com Garza & Williamson (2001) valores de M abaixo de 0.68 so uma forte indicao de reduo no tamanho populacional. Os testes de reduo populacional tiveram como base os seguintes modelos: o modelo dos alelos infinitos (IAM - Kimura & Crow, 1964) em que cada nova mutao produz um novo alelo e a similaridade de alelos entre as amostras inferida como resultado tanto de fluxo gnico como de tempo recente de coalescncia; o modelo de mutao aos passos (SMM - Ohta & Kimura, 1973; Kimmel et al., 1996) em que cada mutao causada por uma mudana simples no tamanho do alelos, indicando que a mutao age aumentando ou diminuindo o tamanhos das unidades repetidas e que por isso alelos com tamanhos prximos tendem a ser mais similares que aqueles com tamanhos distantes e o modelo de duas fases mutacionais (TPM) que incorpora o SMM permitindo, porm, uma variao maior na magnitude das mutaes, assumindo que as mutaes ocorre atravs de mltiplas unidades de repetio (Di Rienzo et al., 1994).

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3. RESULTADOS 3.1. Desenvolvimento dos microssatlites A partir de um exemplar de Paracheirodon axelrodi foi estabelecida com sucesso uma biblioteca genmica com vistas obteno de marcadores microssatlites. O DNA foi clivado com a endonuclease de restrio Sau3AI para em seguida ter fragmentos entre 300 a 900pb excisados, como mostra a Figura 4. No processo de varredura de 182 clones de bactrias transformantes, 384 seqncias de DNA foram geradas e verificou-se que somente os clones enriquecidos com sondas CT proporcionaram bons resultados.
Marcador SAU 3A I

Figura 4 - DNA genmico de P. axelrodi digerido pela endonuclease de restrio Sau3AI. O destaque em amarelo corresponde rea dos fragmentos excisados. M= marcador de peso molecular.

No processo de seleo das seqncias de DNA com microssatlites dois critrios bsicos foram observados: o tipo de repetio desse marcador (perfeitos, imperfeitos ou compostos) e a proximidade dessa repetio em relao ao vetor de clonagem. Dentro desses parmetros foi possvel selecionar 12 marcadores microssatlites e desenhar primers para amplific-los (Figura 5; Tabela 3).

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Figura 5 Sequncia e identificao dos microssatlites selecionados.

Tabela 3 Primers de microssatlites desenvolvidos para estimar a variabilidade gentica de Paracheirodon axelrodi.
Nome Primer Mic01 Mic02 Mic03 Mic04 Mic05 Mic06 Mic07 Mic08 Mic09 Mic10 Mic11 Mic12 Primer F: CCCGGTGGGAATTAACTGCTC R:GGCCCTCTCTGGTGAGAATAGG F: TGGCCACATCACCACCACAT R: TGTTGGTCTCCCTACACTCTCTCC F: TGGGCCTAATATCCAACCCACA R:ACTCACAAATGGGTCAAAGTCCAC F: CAAGGGAATGTGATGAGAATGAAGG R: TCCTCATCCATACACAGTTCAATGAC F: GCGAGCCTGGGAGTCCACTA R: GCAGCGGATCCTGCTACAAAGC F:TCGCAAGTTCTGCTGCCAAG R: GACACGCACTTGAGACGGACA F: AGGGCCGCGTTTCTAAAAGC R:GGTGGTTGAGCGAGCTTTTCA F: CTGGTTGAGCGCTTCTGTACG R: TAATGCATGCTGATGGGGAGAAA F: CCTGTCCTCCTGTCCCTGCT R: CTGCCACAGAACCCGGAATG F: TGCCTGATAAACACCCGCTCT R: GTGCTGCTTTAAATGCATGGTTGA F: GGTCGCGGTGAGAGCAAACT R:TGCCATCAAATTCTACTCGTAAGAACG F: CCAAGCACAGTCGCTCTCCA R:TGCCAGGACTGTTTGTCCACAT pb 210 208 160 120 224 269 106 212 120 152 251 156 Repetio (CT)3CACTCG(CT)10 (CT)20 (CA)15 (CT)13 (CT)14(CA)20 (TC)17 (CT)12CACT (TC)4ACCAC(TC)2(TT C)2(TC)6(AC)3(TC)5 (CA)10 (TC)3TT(TC)4TT(TC)3T T(TC)10 (TC)4TA(TC)9 (CT)3TT(CT)7 Classificao Composto Perfeito Perfeito Perfeito Composto Perfeito Imperfeito Imperfeito Perfeito Composto Composto Composto

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Na fase de caracterizao dos microssatlites, logo aps a sntese dos primers, vrias reaes de PCR foram executadas para averiguar a amplificao ou no do DNA amostral. Inicialmente, foram utilizados 8 indivduos provenientes de uma nica populao (Rio Uneiuxi), variando-se a temperatura de anelamento (53oC a 62o) para cada primer. Objetivou-se com isso, verificar a qualidade e o tamanho dos produtos amplificados. No gel de agarose, j foram detectadas diferenas no tamanho dos produtos amplificados. Observou-se ainda, que a maioria dos primers teve uma amplificao positiva, muito embora tenha sido identificada a amplificao de bandas inespecficas em alguns primers (Mic01, Mic 07 e Mic09) e a no amplificao do primer Mic02 (Figura 6).

Figura 6 Teste de amplificao em 11 pares de primers de microssatlites de cardinal.

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Aps os testes de amplificao que definiram as temperaturas timas de anelamento de cada primer, foi realizada uma bateria de genotipagens com o objetivo de caracterizar os alelos detectados por esses primers. O processo inicial de genotipagem envolveu as seguintes etapas: 1) identificao dos primers monomrficos e polimrficos; 2) identificao dos indivduos homozigotos e heterozigotos; 3) identificao do nmero e tamanho dos alelos; 4) identificao de problemas de picos inespecficos (rudo). Na Figura 7 e na Tabela 4 so mostradas algumas destas etapas. A caracterizao inicial dos microssatlites permitiu a separao desses marcadores moleculares em trs grupos genricos: polimrficos (Mic03, Mic04N, Mic05N, Mic06, Mic08, Mic09 e Mic11), monomrficos (Mic10) e nulos ou sem amplificao (Mic01, Mic02, Mic07 e Mic12). O tamanho mximo allico encontrado entre todos os locos analisados foi de 278pb no Mic06 enquanto que o tamanho mnimo encontrado foi de 145pb no Mic03. A variao allica mxima encontrada dentre os diferentes locos analisados foi de 12 alelos por loco (Tabela 4).

Figura 7 Eletroferograma do loco Mic03 evidenciando trs indivduos homozigotos (A) e trs heterozigotos (B).

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Tabela 4 Caracterizao dos microssatlites do cardinal do rio Uneiuxi observando o tamanho, temperatura de anelamento, heterozigosidade observada e esperada dos locos polimrficos.
Primer Monomrfico
Mic08 Mic09 154 154 154 154 154 154 154 154 154 154 154 154 1 Mic10 154 154 154 154 154 154 154 154 154 154 154 154 -

Primers polimrficos
AMOSTRAS UN 02 UN 05 UN 06 UN 07 UN 10 UN 11 UN 13 UN 14 UN 15 UN 16 UN 17 UN 18 UN 19 UN 20 UN 21 UN 22 UN 23 UN 24 UN 25 UN 26 UN 27 UN 28 UN 29 UN 30 No.alelos Mic03 Mic04_N Mic05_N 231 266 196 198 198 200 Mic 06 263 265 Mic 11 259 265 230 232 102 108 263 265 230 232 102 108 263 265 230 232 102 108 230 232 102 108 263 265 230 232 102 108 -

157 157 225 235 198 200 225 225

231 237 198 200 -

155 171 223 231 198 200 149 153 149 157

198 200 262 278 263 265 230 232 102 108 198 198 266 274 230 232 102 108 230 232 102 108 230 232 102 108

151 165 231 233 198 200 264 278 263 265 230 232 102 108 153 173 233 239 145 165 258 266 263 265 230 232 102 108

149 149 219 231 198 200 252 266 198 200 252 266

165 165 219 223 198 200 264 266 263 265 230 232 102 108 235 237 198 200 252 266 265 271 230 232 102 108 151 157 219 225 198 200 252 266 263 265 230 232 102 108 149 177 227 231 198 200 262 266 277 267 230 232 102 108 149 165 227 227 153 153 221 235 149 175 221 235 149 151 241 243 155 153 231 239 155 153 225 233 155 163 231 237 12 12 3 266 268 102 108 262 264 263 265 230 232 102 108 266 266 263 261 252 266 261 263 252 266 8 8 102 108 -

151 165 225 233 198 200 268 274 247 263 230 232 102 108 264 266 263 265 230 232 102 108 230 232 102 108 2 2

252 274 265 263 230 232 102 108

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Alguns problemas foram detectados durante as genotipagens: 1) os primers Mic01, Mic04, Mic05 e Mic08 apresentaram alelos com muitos rudos. Para solucionar este problema a temperatura de anelamento dos primers foi aumentada mas o problema permaneceu, o que levou a sntese de novos primers com novas sequncias (Tabela 5). Mesmo assim, os problemas com o Mic01 no foram resolvidos; 2) No primer Mic02, no foi possvel detectar alelos; 3) os primers Mic4N, Mic5N, Mic06 e Mic10 apresentaram problemas no clculo do nmero de repeties dos microssatlites e por esse motivo no foram selecionados para as anlises populacionais; 4) os primers Mic08 e Mic09 s apresentaram indivduos heterozigotos nas genotipagens (alelos 230/232 e 102/108, respectivamente). Esses marcadores foram novamente

genotipados e o padro se manteve. Por essa razo, esses primers tambm no foram selecionados para as anlises populacionais.

Tabela 5 Novo conjunto de primers de microssatlites de Paracheirodon axelrodi.

Nome Primer Mic01N Mic04N Mic05N Mic08N Primer F2: GAAATCAACCCGGTGGGAAT R2: GATGCGGCCTCCTTTCAGAG F2: TGCCCCTCGCACAACAGATA R2: CTCCTCATCCATACACAGTTCAATG F2: TCATGAGTGCTCTGGCTGAATACC R2: CTGCTACAAAGCGTGTAATAGCACT F2: CAGACAGGGTGGGGTCTAAAGAA R2: ATTGTAATGCATGCTGATGGGGAG pb 149 210 280 250 Repetio (CT)3CACT CG(CT)10 (CT)20 (CA)15 (CT)13 Classificao Composto Perfeito Perfeito Perfeito

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Para o clculo da heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada (HE) dos locos polimrficos inicialmente foram selecionados os primers Mic03, Mic04N, Mic05, Mic06 e Mic11. Observou-se uma variao da He de 0,544 e 0,939, enquanto que a variao na HO foi de 0,818 a 1.0. Foi observado nos locos mic05 e mic11 que a heterozigosidade observada foi superior a heterozigosidade esperada (Tabela 6) isso provavelmente deveu-se a desequilbrio de ligao.

Tabela 6 Caracterizao dos microssatlites do rio Uneiuxi observando o tamanho, temperatura de anelamento, heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He) dos locos polimrficos. Tamanho Locos (bp) Mic03 163-195 Mic04N 237-265 Mic05N 190-220 Mic06 265-300 Mic11 245-280 No. de Alelos 12 11 3 7 8

T( C) 59 58 62 60 61

Ho 0.818 0.916 0.933 0.950 1.000

He 0.919 0.939 0.544 0.837 0.764

Como parte da etapa de caracterizao dos primers foram realizados testes de amplificao cruzada (interespecfica) em 2 espcies do gnero Paracheirodon (P. innesi e P. simulans) e duas outras espcies de peixes ornamentais (Hyphessobrycon pyrrhonotus e Carnegiella strigata), utilizando-se 11 dos 12 primers sintetizados. Com exceo de C. strigata, que no teve nenhum produto amplificado, foi observado uma variao na qualidade do produto amplificado (Mic03, Mic04, Mic05, Mic06, Mic08, Mic11) ou ausncia de amplificao (Mic01, Mic07, Mic09, Mic10, Mic12) (Tabela 7).

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Tabela 7 - Resultado dos testes cruzados realizados com 4 espcies diferentes de peixes ornamentais amaznicos. Legenda: ++ boa amplificao, + amplificao fraca ou bandas mltiplas e no amplificou.
Espcies P. innesi P. simulans H. pyrrhonotus C. strigata Mic01 Mic03 Mic04 Mic05 Mic06 Mic07 Mic08 Mic09 Mic10 Mic11 Mic12 + + + ++ ++ ++ + ++ + ++ + + + -

+ ++ ++ -

3.2. Anlises populacionais As amostras populacionais analisadas totalizaram 294 espcimes de seis populaes coletadas. As populaes do Tea, Urubaxi e Cajarizinho foram amostradas nos anos de 1999 e 2005. A populao do Iah foi amostrada nos anos de 2002 e 2005. A populao do Zamula foi amostrada nos anos de 1999 e 2002. J a populao do Rainha foi amostrada apenas em 1999. O DNA de amostras representativas dessas populaes pode ser visto na Figura 8.

Figura 8 Extrao de DNA genmico de amostras populacionais do igarap Cajarizinho. 32

Aps a etapa inicial de caracterizao dos primers (item 3.1) apenas 2 primers desenvolvidos nesse trabalho foram considerados ideais para anlises populacionais: Mic03 e Mic11. Os locos detectados por esses primers foram polimrficos em todas as populaes, tendo uma variao allica de 06 a 20 alelos. No foi observado nenhum problema quanto ao nmero de repeties em todas as 11 populaes amostradas nesse estudo. Entretanto, prximo do final do trabalho esses primers pararam de funcionar, no em relao a qualidade das amplificaes mas sim em relao ao padro de genotipagem. Postulou-se que a fluorescncia FAM adicionada aos primers tenha perdido o seu poder de excitao e impossibilitado a deteco de alelos desses microssatlites ao passar pelo feixe de laser do analisador de DNA. Para no comprometer os objetivos propostos para o trabalho foram utilizados os primers desenvolvidos por Beheregaray et al. (2004a) (Tabela 8). Todos os primers desenvolvidos por estes autores foram testados e analisados conforme o item 3.1 atentando-se para as etapas: 1) identificao dos primers monomrficos e polimrficos; 2) identificao dos indivduos homozigotos e heterozigotos; 3) identificao do nmero e tamanho dos alelos; 4) identificao de problemas de picos inespecficos (rudo). Dos 14 primers desenvolvidos pelos autores foram selecionados seis primers para serem utilizados nas anlises populacionais (Tabela 9). Assim, a partir dos marcadores Pa07, Pa13, Pa19, Pa26, Pa32 e Pa 37 foi construda uma matriz de dados com o tamanho dos alelos por locos (anexo 1) verificando-se, ainda, a variao allica de cada microssatlite nas 11 amostragens populacionais e analisando-se o grau de polimorfismo apresentado.

33

Foram realizadas algumas anlises no programa computacional Arlequin (Excoffier et al., 2005) de forma que pudesse ser detectado os ndices de variabilidade gentica da espcie e que respondessem as hipteses propostas no trabalho. Conforme observado na Tabela 9, o maior nmero de alelos foi encontrado nas amostras populacionais coletadas em 2005 nos rios Urubaxi e Tea (Pa32 com 17 alelos), enquanto que o menor nmero de alelos foi encontrado em amostras populacionais do Iaha (Pa26), Rainha (Pa13 e Pa19), Zamula (Pa26) e Cajarizinho (Pa32) todas com apenas trs alelos. As heterozigosidades observada (Ho) e esperada (He) foram calculadas para todos os locos analisados, sendo que o menor valor de heterozigosidade observada encontrado foi de Ho = 0.1 (Pa32 - CJ1999) e o maior valor encontrado foi de Ho = 0.967 (Pa19 - UR1999), enquanto que o menor valor de heterozigosidade esperada foi de He = 0.059 (Pa37 - TE1999) e o maior valor encontrado foi He = 0.938 (Pa32 UR2005). Observou-se que a maioria dos locos (87,5%) apresentou nveis de heterozigosidade observada acima de 0.5 e que em alguns locos houve um desvio no H-WE (P< 0.004) (Tabela 9). O equilbrio de HardyWeinberg (H-WE) pressupe uma condio gentica ideal caracterizada pela unio aleatria de alelos de uma populao infinitamente grande, em que no h seleo ou mutao como foras atuantes na populao. A comparao entre os FST e nmero de migrantes (Nm) por gerao pode ser visualizada na Tabela 10 onde pde se observar que o Nm varia de 1 a 9 indivduos na populao e que o padro de FST entre as populaes praticamente o mesmo.

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Tabela 8 Listagem dos primers desenvolvidos para o Cardinal por Behereharay et al.(2004). Em destaque os primers selecionados para esse trabalho.

Primer Pa1

Seqncia do primer F: TGAAGACGAGGCAAGCTACA R: GTGGAGCACATGATCACAGC F: CAGTCCCTGCTGGAGTCCTA R:TGGAACATATTGTGTCAGCAG F: CTGAGGTTTACCGACACTGC R:CCGCCTTCAGATCTTTCTCA F: ACATGACCCAGAGCCAAGTC R: TAGCCTCAAACGGTCAGAGA F: GCGAATGGTCTCTGATTGG R: TGTGAAAAATGAAGCGAGG F: ACGAATGTGGGGACACAAAG R: AACACATCAGGCTGGTCCTC F: GAGGTGTGAGATGGTTG R: CACGGTAAGCTGATAGTTTG

Primer Pa26

Seqncia do primer F: TCAGGCTTGCTGTTCTCTG R: CATTAAACCCAGCGTTAGC F: CATATCGCCCACACATGAAG R: GAAACGGAGCCTGTATTGGA F: TGGTTTTGACTTACCGCTG R: CAACGATATTGTGTTCAACTC F: ACAAGGAGACTAAACAAGGATG R: CTGAGCCATGTAAGGCATAAGG F: TAAGCAGGGACTGACCGAG R: ATGCTGCAACACAAAAGATAC F: GGAGAAGGGGCGTTATTAGC R: GTATACAGGCATATGGGGCG F: GCTAGACAGACCACAGTC R: ACATCTGGCATCTTGCGTTA

Pa4

Pa27

Pa7

Pa32

Pa8

Pa33

Pa11

Pa34

Pa13

Pa37

Pa19

Pa39

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Tabela 9 Dados populacionais: N de alelos, Heterozigosidade observada (Ho) e Heterozigosidade esperada (HE). Nveis de significncia de P< 0,004 (aps a correo de Bonferroni) correspondem a desvio de H-WE.. Populaes/Locos Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 TE1999 A 8 7 6 10 7 5 HO 0,533 0,655 0,731 0,667 0,8 0,571 HE TE2005 P A HO HE UR1999 P A HO HE UR2005 P A HO HE IH2002 P A HO HE IH2005 P A HO HE RA1999 P A HO HE Z1999 P A HO HE Z2002 P A HO HE CJ 1999 P A HO HE CJ2005 P A HO HE P Mdia A Mdia Ho Mdia He 0,688 0,023 7 0,654 0,69 0,836 9 0.767 0.807 0.080 8 0,654 0,794 0,006 5 0,85 0,693 <0.004 9 0,8 0,823 0,013 7 0,846 0,809 <0.004 11 0,812 0,796 <0.004 10 0,75 0,892 <0.004 5 0.815 0.611 <0.004 5 0.700 0.700 0.340 7,42 0,7437 0,7548 0,778 0,007 6 0,769 0,703 0,536 6 0.833 0.712 <0.004 5 0,538 0,715 0,346 5 0,75 0,746 0,299 5 0,7 0,718 <0.004 3 0,643 0,611 0,023 6 0,516 0,756 <0.004 6 0,65 0,768 0,07 10 0.586 0.863 <0.004 6 0.800 0.767 <0.004 5,91 0,6764 0,7397 0,708 0,047 5 0,615 0,737 0,005 4 0.967 0.679 <0.004 7 0,692 0,861 0,102 5 0,765 0,745 0,042 10 0,893 0,805 0,285 3 0,643 0,553 0,753 8 0,677 0,854 <0.004 9 0,45 0,863 <0.004 8 0.931 0.761 <0.004 6 0.733 0.749 0.121 6,45 0,7361 0,7559 0,873 <0.004 8 0,654 0,824 <0.004 5 0.600 0.665 0,015 4 0,541 0,631 0,139 3 0,5 0,529 0,046 9 0,8 0,785 0,017 4 0,5 0,624 0,129 4 0,406 0,477 0,57 3 0,444 0,613 0,439 5 0.500 0.558 0.088 5 0.333 0.583 <0.004 5,45 0,5404 0,6511 0,547 0,059 17 0,461 0,934 <0.004 12 0.900 0.811 0,012 17 0,923 0,938 0,074 8 0,55 0,859 <0.004 13 0,6 0,878 <0.004 6 0,071 0,873 <0.004 16 0,75 0,894 <0.004 14 0,85 0,902 0,414 3 0.100 0.159 0.100 15 0.633 0.923 <0.004 11,64 0,6035 0,7925 0,059 <0.004 9 0,615 0,880 <0.004 7 0.655 0.712 0,42 9 0,615 0,074 <0.004 5 0,6 0,844 0,359 13 0,767 0,897 0,129 7 0,714 0,817 0,098 14 0,906 0,86 0,195 13 0,65 0,946 <0.004 9 0.700 0.862 0.014 11 0.733 0.885 <0.004 9,27 0,6842 0,7124

36

Tabela 10 Estimativas do ndice de fixao (FST - abaixo da linha diagonal) e do nmero de migrantes por gerao (Nm acima da linha diagonal) para as populaes analisadas.

Populaes

10

11

CJ 1999 CJ 2005 UR 1999 UR 2005 TE 1999 TE 2005 RA 1999 Z Z 1999 2002

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

* 0.204 0.214 0.249 0.208 0.233 0.248 0.240 0.265 0.155 0.230

1.945 * 0.072 0.113 0.166 0.148 0.139 0.116 0.104 0.087 0.074

1.837 6.492 * 0.110 0.163 0.126 0.161 0.139 0.089 0.095 0.094

1.506 3.904 4.033 * 0.135 0.104 0.171 0.065 0.070 0.136 0.083

1.897 2.506 2.567 3.205 * 0.139 0.214 0.158 0.170 0.160 0.153

1.643 2.877 3.459 4.277 3.087 * 0.174 0.159 0.145 0.106 0.106

1.516 3.104 2.604 2.423 1.835 2.362 * 0.198 0.182 0.102 0.110

1.582 3.788 3.099 7.191 2.663 2.639 2.030 * 0.048 0.163 0.107

1.389 4.281 5.062 6.572 2.432 2.929 2.241 9.929 * 0.147 0.097

2.729 5.245 4.776 3.161 2.614 4.191 4.394 2.568 2.895 * 0.083

1.671 6.263 4.790 5.507 2.759 4.194 4.019 4.161 4.662 5.511 *

IH 2002 IH 2005

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Foi feita uma anlise agrupando todas as populaes como uma nica unidade comparativa (Tabela 11). Pde-se observar que uma pequena estruturao populacional poderia estar ocorrendo (FST = 0,143), contudo a maior diferena gentica encontrada foi interindividual (79,31%) e no interpopulacional (14,31%) ou mesmo intrapopulacional (6,38%). Posteriormente foi feita uma anlise agrupando-se as populaes de acordo com seu posicionamento em relao s margens do rio Negro (Tabela 12). No grupo 1 foram colocadas as populaes localizadas na margem direita (oeste): Rio Tea, Rio Urubaxi e Igarap Cajarizinho. No grupo 2 foram colocadas as populaes da margem esquerda (leste): Rio Iah, Igarap Zamula e Lago Rainha. Nessa anlise, verificou-se que quase no h diferenas entre os grupos (0,25%) e que a maior diferena a interindividual (79, 22%) quando comparada a interpopulacional (14,16%) e intrapopulacional (6,37%).

Tabela 11 Resultados da anlise de varincia molecular (AMOVA) no conjunto de populaes de cardinal. Fonte de Variao Interpopulacional Intrapopulacional Interindividual Componentes Percentagem variantes de variao (%) 0,29567Va 0,13181Vb 1,63889Vc 14,31 6,38 79,31 Fst 0.14309 P P<0,004

Obs.: Vb = varincia inter-populacional, Vc = varincia intra-populacional, Vt = varincia total, P estimado entre 10.000 permutaes aleatrias.

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Tabela 12 - Resultados da anlise de varincia molecular (AMOVA) entre grupos de populaes de cardinal coletados em tributrios de margens opostas (margem esquerda X margem direita). Fonte de Variao Entre grupos Interpopulacional Intrapopulacional Interindividual Componentes Percentagem variantes de variao (%) 0,005 Va 0,293 Vb 0,132 Vc 1,639 Vd 0,25 14,16 6,37 79,22 Fct 0.00249 P P=0,336

Tambm foi realizada uma anlise para verificar se estaria havendo perda de variabilidade gentica entre os anos amostrados (Tabela 13). Desta forma, trs populaes foram separadas em dois grupos de acordo com o ano de coleta (1999 e 2005). No se observou diferena significativa entre os grupos analisados (0%) e verificou-se que a diferena intrapopulacional (79, 24%) maior que a interpopulacional (15,52%). Resumidamente, os valores de AMOVA permaneceram praticamente os mesmos em todas as trs anlises executadas. Uma anlise individual de cada uma das populaes indicou que o cardinal apresenta uma diversidade gentica considervel, variando entre 0,621 (CA1999) e 0,858 (ZA2005). A diferena entre os pares variou entre 2.483 +/- 1.359 (CJ1999) e 4.667 +/- 2.324 (TE2005). Novamente, no se verificou perda de diversidade gentica na comparao das amostras coletadas em anos distintos, ao contrrio, observou-se que a diversidade gentica nas populaes aumentou no segundo ano de amostragem (Tabela 14).

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No teste de desequilbrio de ligao, aps 15 comparaes feitas por meio da cadeia de Markov, detectou-se desequilbrio nos locos das populaes do rios Tea (TE2005 - Pa26), Urubaxi (UR1999 - Pa13 e Pa26) e Iaha (IH2002 - Pa13) e do Igarap Zamula (ZA1999 - Pa7). Pelo teste de Mantel, no foi detectado co-relao entre distncia gentica e distncia geogrfica nas amostras populacionais de 1999 (P = 0.313) mas o mesmo no pode ser dito para as coletas de 2005 (P= 0.051).

Tabela 13 Resultados da anlise de varincia molecular (AMOVA) entre grupos de populaes de cardinal coletados em anos distintos (1999 x 2005). Fonte de Variao Entre grupos Interpopulacional Intrapopulacional Componentes Percentagem variantes de variao (%) 0,0001 Va 0,38846 Vb 2,11378 Vc 0,0 15,52 84,47 Fct 0.00198 P P=0,367

Tabela 14 - ndices de diversidade entre as populaes analisadas Populao/ano TE 1999 TE 2005 UR 1999 UR 2005 IH 2002 IH 2005 RA 1999 ZA 1999 ZA 2005 CJ 1999 CJ 2005 Divers. Gnica 0.703 +/- 0.417 0.778 +/- 0.429 0.718 +/- 0.399 0.818 +/- 0.459 0.701 +/- 0.420 0.812+/- 0.455 0.678 +/- 0.398 0.753 +/- 0.416 0.858 +/- 0.482 0.621 +/- 0.377 0.765 +/- 0.423 Diferenas entre os pares 2.8124 +/- 1.505 4.6667 +/- 2.324 4.3096 +/- 2.163 4.0889 +/- 2.071 2.8051 +/- 1.513 4.0593 +/- 2.054 3.3915 +/- 1.789 4.5169 +/- 2.253 4.2923 +/- 2.171 2.483 +/- 1.359 4.5938+/- 2.287

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Foram executados testes nos programas Bottleneck e MValues para verificar se em alguma populao houve uma recente reduo populacional. A anlise no Bottleneck no indicou a ocorrncia de reduo populacional recente no modelo evolutivo de microssatlite mais aceito (modelo de mutao aos passos - SMM); entretanto no outros modelos (modelo dos alelos infinitos - IAM, modelo de duas fases mutacionais - TPM) foram observados valores de heterozigosidade um pouco abaixo que os demais nas populaes do Urubaxi e Iaha amostradas em 1999. Por outro lado, a anlise no MValues detectou uma sutil reduo populacional pois verificou-se que em amostras populacionais dos rios Iaha (IH1999) e Tea (TE1999 e TE2005) houve um decrscimo no acentuado no nmero de alelos (Tabela 15).

Tabela 15 - Comparaes dos testes para reduo do tamanho populacional. Nvel de significncia antes (*P=0,05) e aps a correo de Bonferroni (**P=0,004). Populao IAM SMM TPM
M value (Valor de P)

(Wilcoxon) (Wilcoxon) (Wilcoxon)

TE 1999 TE 2005 UR 1999 UR 2005 IH 1999 IH 2005 RA 1999 ZA 1999 ZA 2002 CJ 1999 CJ 2005 Todas .

0,9609 0,9844 0,3437 10,000 0,5781 0,7812 0,9766 10,000 10,000 0,7812 0,9219 0,8480

0,9844 1,0000 0,7812 10,000 0,7812 0,9844 0,9766 10,000 10,000 0,9766 0,9844 0,9517

10,000 0,9922 0,5781 10,000 0,5781 0,9766 0,9766 10,000 10,000 0,9609 0,9219 0,74

0,6875 (0,02)* 0,6323 (0,03)* 0,7811 (0,16)

0,8354 (0,42)

0,6193 (0,05)* 0,7391 (0,06) 0,7812 (0,29)

0,8245 (0,39) 0,8182 (0,38)

0,8057(0,26) 0,7961 (0,21) 0,8340 (0,17)

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4. Discusso 4.1. Caracterizao dos locos No Brasil, h mais de 30 anos vm-se usando marcadores citolgicos e moleculares para acessar a variabilidade gentica de peixes. Alguns trabalhos de cunho revisional destacam que os estudos genticos conduzidos em peixes de gua doce do Brasil abordam aspectos da caracterizao cromossmica, conservao gentica, sistemtica molecular, aquacultura, biotecnologia e processos de hibridizao (Toledo-Filho et al., 1992a; Toledo-Filho et al., 1992b; Toledo-Filho et al., 1996; Hilsdorf & Krieger, 1998; Artoni et al., 2000; Marques et al., 2002; Martins et al., 2002; Torres et al., 2004; Hilsdorf et al., 2006). De uma maneira geral, observa-se que medida que novas metodologias surgem a tendncia de que elas substituam as mais antigas. Nos ltimos tempos os marcadores microssatlites talvez sejam a classe de marcadores moleculares que mais despontou na literatura mundial, tendo como principais aplicaes estudos de gentica populacional, anlises de parentesco, mapeamento genmico, dentre outras (OConnel & Wright, 1997). Vrios protocolos de isolamento de microssatlites esto disponveis na literatura (Zane et al., 2002). A metodologia aplicada para o isolamento de marcadores microssatlites para o cardinal foi a mesma que vem sendo utilizada em outras espcies amaznicas (Farias et al., 2003; Rodrigues et al., 2004; Farias et al., 2006) e que se baseia no protocolo de enriquecimento para microssatlites e hibridizao seletiva com sondas oligonucleotdicas. Mesmo assim, a obteno de microssatlites est sujeita a vrios contratempos como a no amplicao de bandas e as bandas de gaguejo (stutter bands). No caso 42

especfico desse trabalho, os seguintes problemas foram detectados: no amplificao, diferena para menos no nmero de repeties esperadas e no deteco de alelos. Diferenas no nmero de repeties podem ter ocorrido por duas razes: deslizes na polimerase e calibragem nos analisadores de DNA. No processo de anlise das seqncias nucleotdicas dos clones hibridizados e seleo de primers, no se atentou a existncia de pequenas repeties em tandem dentro da regio a ser amplificada. Sabe-se que durante a PCR podem ocorrer deslizes no processo de polimerizao pela Taq polimerase, o que poderia acarretar diferenas nos tamanhos das repeties a cada nova PCR e assim aumentar ou diminuir a quantidade de pares de bases adicionadas durante o processo de amplificao do DNA in vitro. A utilizao de dois aparelhos de anlises de DNA durante o estudo, no caso um do INPA e um da UFAM, tambm poderia ter causado as diferenas no tamanho das repeties observadas, caso a calibragem dos aparelhos fossem diferentes, o que justificaria o resultado negativo no clculo das repeties dos microssatlites. Dos 12 marcadores microssatlites desenvolvidos na dissertao apenas dois foram considerados ideais para a continuidade das anlises populacionais (Mic03 e Mic11). Ainda assim os mesmos apresentaram problemas na segunda metade do projeto. A no deteco dos alelos pelos primers Mic03 e Mic11 ao final do trabalho pode ter sido pela perda da atividade da fluorescncia (FAM), visto que no protocolo utilizado (Shuelke, 2000) foi adicionada uma cauda fluorescente na poro 5 do primer forward. A falta de fluorescncia impossibilitaria a deteco de alelos pelo aparelho MegaBace pois o mesmo necessita identificar a atividade fluorescente do FAM durante o processo de genotipagem, quando os fragmentos de DNA so sugados por capilaridade e detectados pelo leitor tico (feixe de laser) presente nesse equipamento. 43

Contudo, convm destacar que sempre foi observado excelentes produtos de amplificao nesses primers pois a falta de atividade da fluorescncia no impede a amplificao do DNA. No processo de desenvolvimento de marcadores microssatlites, a busca por solues tcnicas uma etapa crtica. Devido aos problemas expostos, certamente ser necessrio uma retomada das atividades laboratoriais para verificar se parte dos problemas abordados acima tem soluo.

4.2. Variabilidade espacial e temporal A importncia histrica no aspecto scio-econmico do cardinal para a regio amaznica notria sendo a mesma relatada por diferentes autores na literatura (Geisler & Anbal, 1987; Prada-Pedreros, 1998; Prang, 2001a; Prang, 2001b; Chao, 2001). Prang (2001a; 2001b) mostrou que a explorao extrativista do cardinal por meio da pesca do peixe ornamental na regio de Barcelos e Santa Izabel do Rio Negro vem se desenvolvendo desde a dcada de 50. Em todo esse perodo no houve nenhum plano de manejo e conservao para essa espcie. De uma maneira geral, esperava-se que os nveis de variabilidade gentica do cardinal fossem baixos. Entretanto, o que se observou foi que os 6 locos analisados indicaram nveis considerveis de diversidade gentica (0.621 a 0.858) e de heterozigosidade observada (0.1 a 0.967) e heterozigosidade esperada (0.059 a 0.938). Dada a situao observada acima, os ndices detectados nas amostras populacionais de cardinal so muito similares aos descritos na literatura para outras espcies de peixes. 44

Vrijenhoek (1996) analisando populaes naturais de duas espcies de truta Oncorhynchus clarki lewisi e Oncorhynchus mykiss, encontrou uma heterozigosidade observada de Ho = 0.676 e Ho = 0.850, respectivamente. Kohlman et al. (2003) analisando amostras populacionais de carpa (Cyprinus carpio) detectou uma heterozigosidade esperada de HE = 0.851. Barroso et al. (2005) estudou a estrutura gentica de Brycon opalinus, uma espcie endmica da Bacia da Paraba do Sul (SP) altamente ameaada, detectaram uma Ho = 0,23 a 1,00 e uma HE = 0.756 0.892. Spruell et al. (2003), encontrou baixos nveis de heterozigosidade nas populaes de Truta (Salvelinus confluentus) Ho = 0.000 - 0.404 e HE = 0.010 em todas as 4 populaes analisadas no estudo ao compar-las a outros salmondeos. Desvios no equilbrio de H-WE tambm foram observados mesmo aps a correo de Bonferroni (Tabela 9). Pode-se observar que em alguns locos houve deficincia e em outros excesso de heterozigotos. Acredita-se que esses desvios tenham sido causados pela presena de alelos nulos, por desequilbrio de ligao ou mesmo por migrao. Embora na literatura, haja outras explicaes para a deficincia de heterozigotos como endocruzamento, cruzamentos preferenciais, deriva gentica e estruturao de populao (Crouau-Roy, 1988). O ndice de diferenciao populacional obtido para a espcie foi de FST = 0,143 com uma variao entre populaes de 14,31%, isto indica que est havendo uma pequena estrutura de populaes, porm, as diferenas existentes esto sendo minimizadas pela a presena de fluxo gnico entre elas (nmero de migrantes - Nm entre 1 e 9). Loveless & Hamrick, (1984) vem demonstrando que uma pequena quantidade de fluxo gnico a longas distncias suficiente para retardar a diferenciao das populaes para alelos neutros. Wright (1969) afirma que basta um 45

nico migrante por gerao para se contrapor aos efeitos da deriva gentica impedindo uma diferenciao populacional. Observando-se o mapa hidrogrfico da regio do mdio rio Negro bem como imagens orbitais, percebe-se que algumas reas alagadas nos interflvios (chavascais) podem perfeitamente facilitar o fluxo de migrantes entre os igaraps de uma mesma margem, particularmente no perodo da enchente. Alm dessa possvel migrao via os interflvios, pode-se pensar que o cardinal tambm poderia utilizar as margens do rio Negro, migrando de um igarap para outro, visto que algumas amostras populacionais desse trabalho (particularmente as do Iah) foram obtidas na boca dos tributrios que desguam no rio principal. Porm, h de se considerar que a caracterstica migratria do cardinal aparentemente se restringe as migraes laterais (entrada nos igaps para forrageio e proteo) e as reprodutivas (durante a enchente dos rios quando sobem para as cabeceiras e chavascais). Contudo, no podemos descartar a hiptese de que a ao antrpica esteja influenciando na homogeneizao das populaes ao longo do Rio Negro, visto que h mais de 50 anos a pesca de cardinais feita na regio, o que potencialmente promoveria a mistura de amostras ao longo do tempo. Para um melhor entendimento sobre a estrutura populacional da espcie e sua variabilidade gentica foram realizadas diferentes anlises de variancia molecular. Primeiramente, as amostras analisadas foram separadas em grupos distintos de acordo com o posicionamento de suas localidades s margens do rio Negro (margem direita X margem esquerda). Por no haver relatos da presena do cardinal na calha principal do rio Negro, esperava-se encontrar diferenas significativas entre os grupos populacionais 46

de margens opostas, o que no aconteceu. Isto sugere que o rio Negro no estaria funcionando como barreira fsica a disperso dessa espcie. Alm das comparaes genticas espaciais buscou-se entender se houve variaes temporais. Vrios trabalhos com microssatlites demonstram a efetividade desse tipo de abordagem em espcies comercialmente explotadas (Heath et al., 2002; Meldgaard et al., 2003; Saisa et al., 2003; Hansen et al., 2006). Desse modo, somente as amostras dos rios Tea, Urubaxi e Cajarizinho participaram dessa anlise. Observouse que no houve diferenas genticas entre os anos analisados e verificou-se que a diferena intrapopulacional (79,24%) maior que a interpopulacional (15,52%). Individualmente, as amostras populacionais no perderam variabilidade gentica de 1999 para 2005, ao contrrio, de uma maneira geral a diversidade gentica nas populaes aumentou. Alm disso, pode-se observar ainda que as diferenas interindividuais foram bastantes significativas e mais expressivas que as diferenas inter/intrapopulacionais. Essas diferenas podem ter sido ocasionadas por eventos ambientais histricos como o El Nio, ocorrido em 1997 e 1998 (Prang, 2001a; Prang, 2001b; Chao, 2001). Esse fenmeno pode ter atuado de maneira diferenciada em cada tributrio ao longo do rio Negro. Prang (2001a; 2001b) relata que esse fenmeno afetou a reproduo do cardinal devido ao perodo extensivo de seca, prejudicando as geraes seguintes devido ao pouco alimento disponvel. Esse fato pode ter ocasionado a mortalidade de alguns indivduos reduzindo o tamanho populacional da espcie podendo ter alterado o seu nmero de alelos. Chao (2001, pg 171) demonstrou que realmente houve um decrscimo no nmero de indivduos coletados.

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Mesmos sendo explorado continuamente h mais de 50 anos os nveis de diversidade gentica no cardinal so elevados (0.621 a 0.858) e a explicao provvel para isso talvez esteja na biologia da espcie. O cardinal apresenta um ciclo de vida curto e uma reproduo anual associado ao regime sazonal de cheia e vazante do rio Negro (Geisler & Annbal, 1987). Na poca de cheia do rio, os cardinais migram para dentro dos igaps onde se reproduzem, havendo uma maior dificuldade na captura dessa espcie e assim permitindo uma recuperao das populaes. A reproduo dessa espcie to vinculada ao pulso das guas, que no momento em que h repiquete em determinada rea, uma desova parcelada pode ocorrer (Prang, 2001a; Prang, 2001b), o que acarretaria no aparecimento de indivduos mais novos no meio de uma populao anual adicionando variabilidade a populao existente. Alguns estudos vm assumindo que eventuais diferenas populacionais observadas sejam devido a mudanas recentes na diversidade gentica como resultado aos processos ambientais ou medidas humanas ou os dois casos associados, como por exemplo o observado em coelhos domsticos (Queney et al., 2002). Caractersticas populacionais importantes como migrao e tamanho

populacional podem variar no tempo e no espao (Whitlock, 1992). A anlise de variabilidade gentica de uma espcie numa perspectiva temporal pode fornecer dados sobre a ocorrncia de crises demogrficas e redues no tamanho populacional. Os testes nos programas Bottleneck e M values foram executados para verificar se em alguma populao houve uma recente reduo populacional. O resultado utilizando o programa Bottleneck, no indicou a ocorrncia de reduo populacional recente em nenhum dos modelos evolutivos para microssatlites. Observou-se,

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entrentanto, que em algumas populaes houve uma reduo no excesso de heterozigotos que provavelmente seja devido a presena de alelos nulos. J o programa MValues foi mais sensvel a deteco de reduo populacional recente, o que esperado uma vez que o nmero de alelos reduzido mais rapidamente do que a heterozigosidade. Garza & Williamson (2001) sugerem que populaes cujos valores de P sejam menores que 0,70 j estariam sofrendo uma reduo populacional. Isto foi observado nos rios Tea e Iah. Entretanto, a populao do rio Iah conseguiu se recuperar no segundo ano analisado, o mesmo no ocorrendo no rio Tea (Tabela 11). Prang (2001a; 2001b) relata que o rio Tea tem um histrico de explorao intensa de peixes ornamentais, sendo, portando, possvel que esta localidade ainda no tenha se recuperado desse perodo intenso de explorao. Segundo Ryman (1991), a habilidade de uma populao para se adaptar a um determinado ambiente inteiramente dependente de suas caractersticas genticas - os alelos que carrega, suas combinaes e suas freqncias. Em alguns exemplos de peixes notria a capacidade dos mesmos se recuperarem demografica e geneticamente em curto, mdio ou longos perodos (Ruzzante et al., 2001; Larsen et al., 2005). Se observarmos a explorao continua de cardinal no mdio rio Negro com estimativas de captura na faixa de 40 milhes de espcimes/ano; pode-se assumir que as populaes de cardinal podem estar sofrendo bruscas perdas no tamanho populacional e se recuperando logo em seguida. Isso indica um potencial inerente da espcie em responder a essas modificaes ambientais e presses antrpicas.

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5. CONCLUSES Os resultados obtidos por meio do uso de marcadores moleculares

microssatlites permitiu chegar as seguintes concluses: 1) O cardinal apresenta nveis considerveis de variabilidade gentica tendo se como base os parmetros de diversidade gnica, ndice de fixao, heterozigosidades observada e esperada. 2) Detectou-se uma sutil estruturao populacional que pode ter sido ocasionada por eventos histricos como El Nio ou pela intensa explorao. Porm, seus efeitos esto sendo minimizados pela ocorrncia de fluxo gnico entre as populaes. 3) O isolamento por distncia detectado nas amostragens de 2005 pode ser um reflexo das mudanas de atitude em relao ao descarte de cardinais na calha principal do rio, pela no comercializao. Diminuindo, assim, a mistura de amostras de cardinal pertencentes a tributrios geograficamente distantes. 4) O rio Negro parece no estar funcionando como barreira fsica a disperso do cardinal, uma vez que no foi encontrado diferenciao entre as populaes da margem direita e esquerda do rio Negro. Porm, no pode se descartar a possibilidade de influncia antrpica na homogeniezao de estoques. 5) A anlise da variabilidade temporal nas amostras populacionais dos rios Tea, Urubaxi e Cajarizinho nos anos de 1999 e 2005 mostraram que no h perdas de diversidade gentica e de heterozigosidade, ao contrrio, houve um aumento siginificativo em todas as amostragens populacionais de 1999 e 2005. Embora, tenha sido detectado um afunilamento populacional nas amostras do rio Tea.

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6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS Anjos, H. D. B.; Anjos, C.R. 2006. Biologia reprodutiva e desenvolvimento embrionrio e larval do cardinal tetra, Paracheirodon axelrodi Schultz, 1956 (Characiformes: Characidae), em laboratrio. B. Inst. Pesca, 32(2): 151-160. Artoni, R.F.; Vicari, M.R.; Bertollo, L.A.C. 2000. Citogentica de peixes netropicais: mtodos, resultados e perspectivas. Publ. UEPG Ci. Biol. Sade, 6 (1): 43-60. Ashida, T.; Kobayashi, K.; Nakayama, I. 1996. Tissue preservation and total DNA extration from fish stored at ambient temperature using buffers containing high concentration of urea. Fish. Sci., 62 (5): 727-730. Barroso, R.M.; Hilsdorf, A.W.S.; Moreira, H.L.M; Mello, A.M.; Guimares, S.E.F.; Cabello, P.H.; Traub-Cseko, Y.M. 2003. Identification and characterization of microsatellites loci in Brycon opalinus (Cuvier, 1819) (Characiformes, Characidae, Bryconinae). Mol. Ecol. Notes, 3: 297-298. Barroso, R. M.; Hilsdorf, A. W. S.; Moreira, H. L. M.; Cabello, P. H.; Traub-Cseko, Y. M. 2005. Genetic diversity of wild and cultured populations of Brycon opalinus (Cuvier, 1819) (Characiformes, Characidae, Bryconinae) using microsatellites. Aquaculture, 247: 51 65 Beheregaray, L.B; Mller, L.M.; Schwartz, T.S.; Chao, N. L.; Caccone, A. 2004a. Microsatellite markers for the cardinal tetra Paracheirodon axelrodi, a commercially important fish from central Amaznia. Mol. Ecol. Notes, 4 (3): 330-332. Beheregaray, L.B.; Schwartz, T.S.; Mller, L.M.; Call, D.; Chao, N.L.; Caccone, A. 2004b. A set of microsatellite DNA markers for the onelined pencilfish Nannostomus unifasciatus, an Amazonian flooded forest fish. Mol. Ecol. Notes, 4 (3): 333-335.

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ANEXOS
Anexo 1 Matriz de dados dos microssatlites utilizados contendo o nmero de repeties por locos e por indivduo. POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 TE1 12 13 9 24 18 34 13 13 9 24 20 34 TE2 10 13 8 24 18 32 13 13 8 24 20 35 TE3 10 13 8 24 18 33 13 14 8 26 20 34 TE4 10 13 8 25 20 33 20 15 8 25 20 34 TE5 10 13 8 24 20 33 10 13 8 25 27 34 TE6 13 ? ? 21 20 34 13 ? ? 24 22 34 TE7 10 10 6 21 20 34 13 13 11 24 32 34 TE8 13 12 11 21 20 34 13 13 11 25 20 34 TE9 9 12 11 24 20 34 13 13 14 27 38 34 TE10 13 12 11 26 20 34 13 13 13 24 20 34 TE11 13 12 11 24 18 34 13 12 13 24 20 34 TE12 12 12 11 21 18 34 13 13 13 31 20 35 TE13 10 10 8 21 18 33 10 14 11 29 20 37 TE14 10 12 8 21 18 34 10 14 11 21 20 34 TE15 13 10 8 19 18 33 13 14 11 19 20 35 TE16 12 12 ? 19 18 33 14 12 ? 19 20 34 TE17 10 12 11 25 18 33 13 12 14 25 20 34 TE18 9 12 8 26 18 34 13 12 11 27 20 34 TE19 15 11 11 26 18 33 20 12 14 31 20 37 POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 TE20 13 14 8 26 18 34 13 14 11 27 20 34 TE21 12 9 11 21 18 33 13 12 14 29 20 35 TE22 10 10 8 21 18 33 10 13 11 29 20 34 TE23 13 10 11 21 18 ? 17 13 11 32 20 ? TE24 10 10 8 24 18 ? 13 13 11 29 20 ? TE25 10 10 9 19 18 33 10 13 11 32 20 37 TE26 13 10 8 21 18 34 13 13 11 32 20 34 TE27 13 10 8 25 20 33 17 13 11 25 20 35 TE28 13 14 ? 21 20 33 17 14 ? 32 29 34 TE29 10 14 11 21 20 33 10 14 14 21 20 34 TE30 10 10 ? 21 20 34 10 13 ? 34 20 34 TE31 13 13 12 22 22 17 13 14 12 35 22 17 TE32 13 13 12 22 31 16 16 14 13 35 31 21 TE33 11 11 11 35 14 16 11 12 11 35 26 21 TE34 11 12 11 38 26 18 13 13 11 41 40 28 TE35 11 9 13 27 24 14 13 13 14 27 24 14 TE36 11 9 11 25 33 17 13 12 12 45 33 17 TE37 11 12 11 38 19 18 12 13 11 41 27 20 TE38 11 12 11 38 29 18 11 13 11 41 29 21

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POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 TE39 12 13 11 27 20 17 13 14 11 27 22 17 TE40 11 12 8 38 14 16 18 13 12 41 26 21 TE41 13 11 12 25 26 18 13 14 12 45 42 20 TE42 11 13 8 25 24 18 13 13 12 27 24 20 TE43 11 9 11 38 20 19 13 11 12 41 36 19 TE44 12 13 11 25 19 16 13 14 12 45 34 18 TE45 11 13 8 25 29 19 13 13 12 27 29 22 TE46 11 13 14 36 18 19 11 13 14 36 33 19 TE47 11 13 12 25 22 16 18 13 12 27 32 18 TE48 13 11 12 27 32 16 13 14 13 27 32 18 TE49 11 9 11 38 34 16 13 13 11 41 34 18 TE50 11 14 11 27 29 16 13 15 12 27 29 16 TE51 10 13 11 38 29 19 13 13 12 41 29 19 TE52 13 11 11 27 24 20 20 13 12 27 31 21 TE53 13 9 8 25 17 18 13 13 12 27 17 18 TE54 10 13 8 27 24 20 13 13 12 27 32 21 TE55 11 13 12 25 29 19 11 14 13 27 29 19 TE56 13 9 12 27 29 20 13 13 13 27 29 25 UR1 15 10 12 8 20 18 17 10 12 12 33 20 UR2 11 10 12 8 18 20 12 14 13 12 19 20 UR3 11 10 12 8 19 17 11 14 13 12 19 20 UR4 11 10 8 8 18 20 13 14 13 12 19 22 UR5 11 10 12 12 18 20 17 14 13 12 19 22

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POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 IH52 11 13 8 12 22 18 17 14 9 12 27 20 IH53 9 11 8 8 22 18 10 13 11 11 22 21 IH54 11 11 8 10 22 18 13 13 9 11 22 19 IH55 11 11 6 8 18 14 17 13 9 10 18 20 IH56 11 13 9 8 27 20 11 14 9 10 27 25 IH57 11 11 8 12 22 17 13 13 9 12 31 21 IH58 11 13 8 8 22 21 13 14 10 11 29 29 IH59 11 13 8 8 24 17 11 14 10 11 25 20 IH60 9 13 8 12 18 16 10 13 10 12 22 20 RA1 11 13 6 10 11 19 12 14 6 14 20 23 RA2 11 14 6 10 19 19 12 15 11 10 19 23 RA3 10 14 6 10 19 20 14 15 11 10 19 23 RA4 10 14 6 10 20 19 14 15 12 12 20 19 RA5 11 13 6 12 19 19 12 13 12 14 19 20 RA6 10 13 6 10 20 17 14 13 6 11 20 22 RA7 10 14 6 10 22 19 14 15 12 11 22 22 RA8 10 13 6 10 16 19 15 13 12 10 16 22 RA09 11 13 6 10 17 18 12 13 11 10 17 24 RA10 11 13 6 10 21 20 12 14 6 10 21 20 RA11 11 13 6 12 19 19 11 14 11 12 19 19 RA12 11 13 6 10 20 17 11 13 11 11 20 19 RA13 ? 13 6 10 22 18 ? 14 6 11 22 24 RA14 13 13 6 12 21 20 16 14 6 12 21 20 64

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POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 Z15 11 12 14 11 18 17 13 14 20 12 22 19 Z16 9 12 13 11 18 15 11 12 12 12 22 22 Z17 10 12 13 9 18 16 10 14 14 12 24 21 Z18 9 12 19 9 19 14 11 14 19 11 20 19 Z19 17 12 19 12 18 17 17 14 19 12 32 22 Z20 10 10 14 12 22 20 10 10 14 12 22 20 CJ01 10 21 9 12 20 19 13 28 10 12 20 19 CJ02 11 26 9 8 20 20 13 26 9 12 20 24 CJ03 11 23 9 10 20 19 13 23 11 10 20 20 CJ04 11 ? 11 10 20 16 13 ? 12 10 20 20 CJ05 ? 21 12 10 20 17 ? 28 12 10 20 20 CJ06 11 26 12 6 18 17 13 26 13 10 20 22 CJ07 11 23 12 ? 20 15 13 23 13 ? 20 15 CJ08 13 26 ? 10 20 22 13 26 ? 12 20 22 CJ09 11 23 8 6 20 17 12 23 12 10 20 19 CJ10 11 21 12 10 20 15 13 26 13 10 20 15 CJ11 11 26 12 10 20 17 13 26 13 10 20 20 CJ12 11 23 11 10 19 19 13 23 12 10 20 19 CJ13 11 21 11 6 20 19 13 28 12 10 20 19 CJ14 11 26 13 6 20 18 13 31 14 10 20 22 CJ15 11 23 11 10 20 20 11 23 12 12 20 22 CJ16 13 23 12 10 20 18 13 25 14 10 20 20 CJ17 ? 23 12 10 20 16 ? 25 14 10 20 20

POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 CJ18 11 21 11 10 20 17 13 25 12 14 20 19 CJ19 11 30 12 6 20 17 13 30 13 10 20 19 CJ20 11 26 11 12 20 20 13 31 12 12 20 20 CJ21 11 21 12 ? 20 18 13 23 13 ? 20 19 CJ22 13 21 9 10 20 17 13 31 10 10 20 24 CJ23 ? 20 12 10 20 17 ? 21 13 14 20 22 CJ24 13 22 11 6 20 19 19 23 12 10 20 24 CJ25 11 21 12 6 20 20 13 23 13 10 20 20 CJ26 11 28 12 10 20 16 13 28 13 12 20 21 CJ27 11 22 9 6 20 19 13 23 11 10 20 19 CJ28 11 27 11 10 20 18 13 27 12 10 20 22 CJ29 11 22 11 10 20 20 12 31 12 10 20 22 CJ30 9 22 12 10 18 18 9 23 15 10 19 20 CJ51 12 11 9 10 37 19 12 14 11 12 40 22 CJ52 12 12 9 10 27 19 13 13 9 10 27 24 CJ53 11 12 8 10 20 18 12 12 10 12 29 20 CJ54 11 10 10 12 19 16 12 13 13 12 29 21 CJ55 12 10 10 10 18 22 13 14 13 14 29 22 CJ56 12 11 11 10 18 22 13 12 10 12 19 22 CJ57 11 13 10 10 22 18 13 14 10 12 22 22 CJ58 12 10 10 10 21 20 12 14 10 12 32 20 CJ59 12 12 10 10 20 12 16 12 13 12 20 18 CJ60 10 10 10 10 28 17 13 14 13 12 28 20 66

POP Pa07 Pa13 Pa19 Pa26 Pa32 Pa37 CJ61 12 10 11 10 28 17 13 14 11 12 28 17 CJ62 12 10 10 10 21 17 12 14 13 10 33 17 CJ63 11 13 10 12 37 17 13 15 10 12 40 19 CJ64 13 14 10 12 27 18 13 14 10 12 27 24 CJ65 13 10 9 12 20 16 13 14 11 12 29 19 CJ66 13 14 10 10 19 18 13 14 11 10 29 23 CJ67 11 12 9 11 18 19 12 13 10 13 29 20 CJ68 11 13 10 12 18 19 13 14 10 12 19 24 CJ69 13 10 11 12 22 17 13 14 13 12 22 17 CJ70 10 14 9 12 21 17 13 15 13 12 32 17 CJ71 10 14 13 12 19 19 13 14 15 12 19 27 CJ72 12 12 10 10 19 17 13 13 13 10 19 19 CJ73 11 13 10 10 19 17 12 15 11 10 25 19 CJ74 11 13 13 10 17 19 12 13 15 10 32 24 CJ75 13 10 13 10 22 18 13 14 15 10 33 20 CJ76 13 10 10 10 20 16 13 14 11 10 20 21 CJ77 11 10 11 12 20 22 13 14 13 12 30 22 CJ78 11 10 13 12 19 18 13 14 15 12 19 20 CJ79 11 10 11 12 19 16 12 14 13 12 25 21 CJ80 11 14 10 11 22 16 13 15 10 11 33 21

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