MICROSCOPA LSER CONFOCAL

ngel Martnez Nistal Servicio de Proceso de Imgenes. Universidad de Oviedo

1.- INTRODUCCIN La microscopa lser confocal es una nueva tcnica de observacin microscpica que est logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biologa, materiales, geologa, etc.) Su xito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a la microscopa ptica tradicional (imgenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolucin vertical y horizontal, etc.) y, sobre todo, a la posibilidad de obtener "secciones pticas" de la muestra, lo que permite su estudio tridimensional. Aunque el principio de la microscopa confocal fue patentado hace varios aos (Minsk, 1957) y los primeros microscopios basados en esta tcnica que demostraron su validez fueron descritos por Petran et al. en 1968, su gran aceptacin y espectacular desarrollo no ha tenido lugar hasta hace unos pocos aos con el desarrollo del lser y de los ordenadores personales. La mayor parte de las muestras observadas con microscopa ptica son traslcidas o, en el caso de ser opacas, su superficie de reflexin no se encuentra perfectamente pulida. En ambos casos la luz interacciona con la muestra a varias profundidades por lo que la imagen que llega al observador presenta reas borrosas debidas a la luz procedente de zonas fuera del plano de enfoque, lo que produce una degradacin en el contraste y resolucin de la imagen (figura 1 A).

Fig. 1. (A). Imagen de microscopa ptica de fluorescencia de un alga (Spyrogira). (B) Imagen del mismo tipo de muestra (Spyrogyra) obtenida con el microscopio confocal.

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El principio de la microscopa confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco (figura 1 B). Para ello se ilumina una pequea zona de la muestra y se toma el haz luminoso que proviene del plano focal, eliminndose los haces procedentes de los planos inferiores y superiores (Boyde, 1988).

Detector

Diafragma (pinhole)

Fuente de iluminacin

Espejo dicroico

Luz en foco Luz fuera de foco Objetivo

Plano focal Especimen

Fig. 2. Esquema del principio de la microscopa confocal. La luz procedente de los puntos fuera del plano focal es eliminada por el diafragma o pinhole.

2.- BASES INSTRUMENTALES Parte de la luz procedente de la fuente de iluminacin atraviesa un primer diafragma, es reflejada mediante un espejo dicroico y se enfoca en un punto del espcimen mediante la lente de un objetivo. La seal emitida por el punto iluminado (fluorescencia o luz reflejada) vuelve por el mismo camino ptico, pasa a travs del espejo dicroico y es enfocada en un detector, un segundo diafragma o pinhole es colocado delante del detector para eliminar las seales procedentes de la zona fuera de foco (Figura 2). El principio del funcionamiento del Microscopio Confocal se basa en la existencia de dos diafragmas (pinhole), uno entre la fuente de luz y el objetivo y el otro entre el objetivo y el detector. Ambos pinhole deben de estar perfectamente alineados de forma que el segundo de ellos nicamente deje llegar al detector la luz procedente del plano focal. La utilizacin de un lser como fuente de luz permite focalizar la iluminacin en una regin muy pequea de la muestra y con una gran intensidad.

Microscopa lser confocal

Dado que slo se ilumina una pequea zona de la muestra (punto), para poder visualizarla se necesita un sistema de barrido que permita muestrear todos los puntos y un sistema de formacin de la imagen donde se recoja la informacin de cada uno de estos puntos. El sistema de barrido puede ser de dos tipos: que el haz del lser se desplace por la muestra (beam scanning) o que sea sta la que se desplace, mientras el haz permanece inmvil (stage scanning) (Wright, et al, 1993). El primer tipo es el ms comnmente empleado, tiene la ventaja de una mayor velocidad de barrido y por tanto de formacin de la imagen, adems el espcimen no necesita ser movido durante el muestreo por lo que no necesita ser fijado, lo que lo hace especialmente interesante para el estudio de clulas en vivo. El campo de barrido coincide con el campo de observacin del objetivo permitiendo que la zona de estudio pueda ser localizada utilizando microscopa de fluorescencia convencional. La tcnica de desplazamiento de la muestra (stage scanning) presenta como principal ventaja el permitir la observacin de una zona tan grande como se desee sin tener que ceirse al campo visual del objetivo, adems debido a que el haz permanece estacionario se tiene una iluminacin axial constante. La luz reflejada o fluorescencia emitida por la muestra es recogida en un fotomultiplicador donde se transforma en una seal de vdeo que se digitaliza y almacena en un ordenador, visualizndose a travs de un monitor. La mayora de los sistemas cuentan con varios fotomultiplicadores y un sistema ptico que permite recoger en cada uno de ellos diferentes longitudes de onda. Este tipo de microscopio confocal en el que el haz del lser barre la muestra es denominado Confocal Lser Scanning Microscopy (CLSM). Debido a que el lser necesita un tiempo para barrer la imagen, sta no pueda ser visualizada de manera instantnea en el monitor. El mtodo de trabajo del microscopio confocal es por epiluminacin, es decir con muestras que al incidir la luz sobre ellas reflejan toda o parte de la luz incidente (microscopa de reflexin), o emiten luz en una longitud de onda superior (microscopa de fluorescencia). El primer caso se suele utilizar con muestras opacas, principalmente en estudios de materiales, mientras que la fluorescencia se utiliza principalmente con muestras biolgicas.

3.- LA FLUORESCENCIA. Se denomina fluorescencia a la propiedad que tienen ciertas molculas de, al absorber luz de una determinada longitud de onda, emitir luz en una longitud de onda superior. La fluorescencia puede darse de forma natural en determinadas sustancias (clorofila, algunos tejidos frescos, etc.), denominndose fluorescencia primaria o autofluorescencia. En otros casos para que la muestra que queremos observar tenga fluorescencia es preciso teirla con un marcador fluorescente, denominado fluorocromo. En este caso hablaramos de fluorescencia secundaria.

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Existen una gran cantidad de fluorocromos que permiten marcar de forma selectiva la mayora de los componentes celulares y tisulares, adems podemos asociarlos a protenas o anticuerpos para estudiar funciones celulares.

Fig. 3. Espectro de excitacin y de emisin de un fluorocromo. El pico de excitacin estara en 488nm y el de emisin en 525nm. Todos los fluorocromos vienen caracterizados por su espectro de excitacin y su espectro de emisin (figura 3). El espectro de excitacin es el rango de longitudes de onda en las que un fluorocromo absorbe luz, o lo que es el mismo es excitado. El espectro de emisin es el rango de longitudes de onda en las que un fluorocromo emite luz. Ambos espectros presentan dos picos que se corresponden con la mxima absorcin y la mxima emisin.

4.- FUNCIONAMIENTO DEL EQUIPO En la Figura 4 se muestra el esquema de un microscopio lser confocal Leica TCS SP2 AOBS (Leica Microsistemas). Su funcionamiento es como sigue: De las distintas lneas de lser que tiene el equipo el selector de excitacin AOTF nos permite seleccionar la que deseamos utilizar, el haz de lser atraviesa un filtro ptico acstico AOBS y atravesando el objetivo, ilumina un punto de la muestra. Un conjunto de espejos galvanomtricos permite desplazar el lser por toda la zona de muestra. La seal luminosa emitida vuelve por el mismo camino ptico, atraviesa el filtro AOBS siguiendo un camino distinto al del haz incidente y llega a un sistema de deteccin espectral donde es dividida en funcin de sus longitudes de onda. Un diafragma delante del detector espectral permite seleccionar la luz procedente del plano focal. Esta luz incide en un fotomultiplicador donde es transformada en una seal elctrica que se digitaliza mediante un convertidor analgico digital y se almacena en un ordenador. La imagen del espcimen es visualizada en la pantalla del ordenador a medida que el lser barre toda la zona de muestra. Una

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platina con enfoque motorizado permite variar de forma automtica la posicin del plano focal.

Fig. 4. Imagen del Microscopio Lser Confocal Leica TCS SP2 AOBS y esquema bsico de su funcionamiento

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A la hora de adquirir imgenes con el microscopio confocal deberemos de ajustar los siguientes parmetros: - Lnea de excitacin e intensidad del lser. Normalmente un microscopio confocal viene con varios lser que tienen una o varias lneas de emisin: Argon (458, 476, 488, 496 y 514nm), Helio-Nen (543nm), Helio-Nen (633nm), Diodo azul (405 nm), etc. Un filtro ptico acstico (AOTF) permite seleccionar la lnea o lneas de emisin que mejor se ajusten al espectro de excitacin de los fluorocromos que tenemos en la muestra. Este filtro permite tambin regular la intensidad del lser. A mayor intensidad del lser tendremos mayor emisin de fluorescencia, pero tambin se nos producir un mayor photobleaching (disminucin de la fluorescencia con el tiempo). - Apertura del pinhole (diafragma) de deteccin. Para cada objetivo existe una apertura ptima del diafragma de deteccin conocida como Airy 1 en la que el espesor de la seccin que se obtiene es el mnimo lo que garantiza la mxima resolucin en el eje Z. Cuando la intensidad de la fluorescencia es baja es posible que necesitemos aumentar la apertura de este diafragma para recoger ms seal. En este caso estaremos aumentando el espesor de la seccin y perdiendo resolucin en Z. - Ganancia del fotomultiplicador. Ajusta la amplificacin de la seal elctrica generada a partir de los fotones emitidos por la muestra. Si la intensidad de luz emitida por la muestra es dbil deberemos de aumentar la ganancia para poder obtener la imagen. Un aumento excesivo de la ganancia se traduce en una prdida de calidad de la imagen debido al ruido electrnico que se genera. - Velocidad de barrido del lser. Se define como el nmero de lneas por segundo que barre el lser. A menor velocidad de barrido mejor relacin seal/ruido y por tanto ms calidad de imagen. - Tamao de la imagen. Define el nmero de pxeles que tendr la imagen. Cuanto mayor sea el tamao de la imagen para un campo determinado mejor ser la resolucin de la imagen.

5.- VENTAJAS DE LA MICROSCOPA CONFOCAL. Las principales ventajas de la microscopa confocal frente a la microscopa ptica tradicional son las siguientes: - Mayor resolucin. Para un objetivo de inmersin en aceite con una apertura numrica de 1.4 y una longitud de onda de 442 nm es posible alcanzar resoluciones de 0.14 m en horizontal y 0.23 m en vertical (Wilson, 1990). - Mayor contraste. Debido a que se elimina la luz procedente de las zonas

Microscopa lser confocal fuera de foco.

- Posibilidad de realizar secciones pticas. Variando el plano de enfoque el sistema es capaz de tomar imgenes a diferente profundidad. Lo que permite obtener informacin tridimensional de la muestra. - Anlisis de imgenes. Al obtenerse la imagen de modo electrnico es posible digitalizarla y aplicar sobre ella toda una serie de tcnicas de anlisis de imgenes como: realce de imgenes, para mejorar su calidad, combinacin de imgenes para comparar cambios en el tiempo, medida de intensidades, medidas morfomtricas, etc. - Reconstruccin 3D. A partir de las secciones pticas es posible aplicar tcnicas de reconstruccin 3D que nos permitan visualizar las estructuras. - Imgenes multidimensionales. El microscopio confocal nos permite estudiar imgenes en 2 y 3 dimensiones a lo largo del tiempo. Es posible programar el equipo para obtener imgenes durante un periodo de tiempo determinado. - Imgenes Lambda. Si el equipo cuenta con un detector espectral podremos tomar imgenes a diferentes longitudes de onda (lambda scan) y a partir de ellas deducir el espectro de emisin de un fluorocromo determinado. El sistema de barrido punto a punto (scan) utilizado en los microscopios confocales de tipo CLSM comporta una serie de ventajas adicionales como son: - Posibilidad de obtener imgenes perpendiculares al plano XY tomando la misma lnea a diferentes profundidades. - Fijar el lser sobre un punto o una pequea zona de la muestra y tomar imgenes a diferentes tiempos para observar los efectos del lser sobre esa zona. - Aumentar la resolucin mediante zoom del rea a barrer tomando mayor nmero de puntos en reas ms pequeas. La velocidad de formacin de la imagen depende tambin del nmero de puntos que tomemos por imagen, as es mayor en imgenes de 512 x 512 pxeles que en imgenes de 1024 x 1024 pxeles. Se denomina pixel (del ingls picture element) a cada uno de los puntos que forman la imagen

6.- PRESTACIONES DEL SISTEMA

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Para una pequea apertura del diafragma o pinhole el sistema trabaja como un verdadero microscopio confocal, limitando la informacin de la imagen a la proveniente de un nico plano focal y posibilitando la obtencin de secciones pticas. Para una apertura grande del pinhole las prestaciones del microscopio son similares a las de un microscopio convencional de fluorescencia. En la prctica las grandes aperturas se utilizan cuando se tiene una seal dbil de fluorescencia, sacrificndose en este caso la confocalidad por una mayor intensidad de la fluorescencia en la imagen. La resolucin de la imagen es otro de los factores, como se ha visto anteriormente, que afectan a las prestaciones del sistema. Una mayor resolucin de la imagen implica una menor velocidad en la formacin de la misma, por lo que en aquellos casos en que sea necesaria una rpida adquisicin de la imagen (por ejemplo, visualizacin de procesos dinmicos que cambian rpidamente con el tiempo) ser necesario tomar imgenes de menor resolucin, pero con un tiempo de formacin mucho ms rpido. La resolucin de la imagen esta condicionada tambin por las capacidades de proceso y almacenamiento del sistema informtico del microscopio. Una imagen de 1024 x 1024 pxeles ocupa 1 Mbytes de informacin, esto significa que una serie compuesta de 36 secciones, con esta resolucin, ocupar 36 Mbytes de informacin, necesitndose alta capacidad de almacenamiento en disco y alta velocidad de proceso para poder trabajar con estas imgenes.

7.- PROCESO DE IMGENES Y MICROSCOPA CONFOCAL El hecho de que la mayora de los microscopios lser confocal utilicen un sistema informtico para digitalizar las imgenes facilita la aplicacin de tcnicas de proceso y anlisis de imgenes. La visualizacin de muestras con fluorescencia dbil puede ser mejorada mediante la acumulacin de un determinado nmero de imgenes. Un fondo con ruido debido a una alta amplificacin de la seal puede ser corregido mediante promedio de varias imgenes. Otras tcnicas, como realce de contornos, filtros, etc., pueden ser aplicadas a las imgenes de microscopa confocal para realzarlas. En estudios de cintica celular los cambios experimentados en un determinado componente (Ca++, por ejemplo) pueden visualizarse mediante sustraccin de imgenes tomadas a diferentes tiempos. Tcnicas de anlisis de imgenes como clasificacin, operaciones morfolgicas y cuantificacin de componentes, pueden ser utilizadas para la realizacin de mediciones morfomtricas y densitomtricas de determinados parmetros presentes en la imagen; por ejemplo, contenido en DNA de ncleos teidos con un determinado fluorocromo (Rigaut et al., 1991).

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8.- APLICACIONES DE LA MICROSCOPA CONFOCAL La microscopa confocal es muy til para el estudio de muchos problemas en biologa, permitiendo un nuevo conocimiento de la estructura celular y sus procesos. Entre otras aplicaciones la microscopa confocal se utiliza en: estudios de estructura celular y citoesqueleto, medida de actividad intracelular (pH e iones), produccin de reconstrucciones tridimensionales, etc. Para trabajar con microscopa de fluorescencia, ya sea convencional o confocal, se ha de tener en cuenta que la longitud de onda de la fuente de iluminacin (el lser en el caso del confocal) se corresponda con la longitud de onda de excitacin del fluorocromo utilizado. La eficiencia es mxima cuando la longitud de onda del lser coincide con el pico del espectro de excitacin del fluorocromo (figura 5).

Fig. 5. Espectros de excitacin y emisin del fluorocromo Alexa 594 y diferencias en la intensidad del fluorocromo al ser excitado con un lser verde HeNe de 543 nm (imagen a) y HeNe de 594 nm (imagen b). (Imagen cortesa de Leica Microsystems). Por lo tanto antes de decidirnos a utilizar un fluorocromo determinado debemos de estar seguros de que alguna de las lneas de lser de nuestro microscopio confocal coincide con su espectro de excitacin. La intensidad de la seal fluorescente ser mayor cuanto ms prxima est la lnea del lser al pico de excitacin del fluorocromo. 8.1.- Imgenes teidas con un marcador fluorescente (single labeling). Imgenes de una muestra con autofluorescencia o que estn teidas con un nico marcador fluorescente, visualizadas con microscopa confocal presentan una considerable mejora en relacin a la misma imagen visualizada con microscopa de fluorescencia convencional. Esta mejora es ms evidente cuanto mayor es el espesor de la muestra a estudiar. En muestras con espesores inferiores a 10 micras apenas hay diferencia entre una imagen de fluorescencia y una imagen confocal, mientras que en una muestra de ms de 20 micras la calidad de la imagen confocal es muy superior a la de la imagen de

10 fluorescencia.

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En la figura 6 puede verse una imagen de unas fibras de pasta de celulosa observadas con microscopa de fluorescencia tradicional y con microscopa lser confocal. Las fibras se observan ms claras en la imagen confocal debido a su mayor resolucin y a que la fluorescencia de los planos fuera de foco ha sido eliminada.

Fig. 6. Fibras de pasta de celulosa observadas con microscopa de fluorescencia (izd) y la misma zona observada con microscopa lser confocal (dcha).

8.2.- Imgenes teidas con varios marcadores fluorescentes (multiple labeling). Mltiples estructuras de una clula o tejido pueden ser observadas simultneamente tiendo la muestra con dos o ms marcadores fluorescentes, donde cada fluorocromo marca una determinada estructura o sirve como indicador de determinados procesos celulares.

Fig. 7. Configuracin del Microscopio Confocal Leica TCS SP2 AOBS para observar una muestra con doble marcaje (SYTO13- Ioduro de Propidio

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El microscopio confocal suele venir equipado con uno o varios lser que emiten en diferentes longitudes de onda pudiendo utilizarse varias de ellas como fuente de iluminacin de la muestra. Si tenemos una muestra con dos o tres marcadores fluorescentes podremos recoger simultneamente su seal en diferentes fotomultiplicadores. La figura 7 muestra la configuracin del microscopio Leica TCS SP2 AOBS para observar una muestra de bacterias ( Streptomices Antibioticus) marcadas con SYTO13 y Ioduro de Propidio. Se han escogido como fuentes de iluminacin las lneas de lser de 488 nm y 543 nm. La seal del primer marcador se recoger en el fotomultiplicador 1 (PMT1) que se ha programado para recoger un rango de seal entre 490 y 535 nm. El fotomultiplicador 2 (PMT2) recoger la seal del segundo marcador en un rango entre 580 y 700 nm. Como puede observarse los rangos de deteccin de ambos fotomultiplicadores se han ajustado para que coincidan con los espectros de emisin de los fluorocromos. El marcador SYTO13 (verde) tie la pared celular de las bacterias mientras estn vivas. Cuando mueren este marcador es reemplazado por el Ioduro de Propidio y las bacterias aparecen en color rojo (figura 8) (Manteca et al, 2005).

Fig. 8. Imagen de bacterias (Streptomices Antibioticus) con doble marcaje. A) SYTO13. B) Ioduro de propidio). C) imagen mezcla de ambos fluorocromos. (Imgenes cortesa del profesor Jess Sanchez Martn del Dpto. de Biologa Funcional de la Universidad de Oviedo)

8.3.- Realizacin de secciones transversales (x-z). Con el microscopio ptico siempre observamos la muestra en el plano X-Y. Una caracterstica interesante del microscopio confocal es la posibilidad de realizar secciones transversales de la muestra que nos permiten observar como es su estructura interna sin necesidad de realizar complejas preparaciones. Para realizar secciones transversales de calidad necesitamos contar con una platina motorizada de alta precisin que nos permita realizar desplazamientos verticales en intervalos muy pequeos, del orden de 0,2 micras. Fijando el haz de barrido del lser en el punto en el que queremos realizar la seccin y desplazando la muestra verticalmente iremos obteniendo un corte transversal de esa zona.

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En la figura 9 se muestra un esquema de las diferentes secciones que podemos estudiar con el confocal (x,y ) (x-z) y un ejemplo de secciones longitudinales y transversales de una fibra de pasta de celulosa (Gnzalez-Ro et al 1997).

Fig. 9. Esquema de las diferentes secciones que podemos obtener con el microscopio confocal y ejemplo de una seccin longitudinal (A) y seis secciones transversales (B) de una fibra de pasta de celulosa.

8.4.- Informacin tridimensional de la muestra. Como se ha mencionado anteriormente una de las mayores ventajas de la microscopa confocal es la posibilidad de estudiar tridimensionalmente la muestra a partir de secciones pticas de la misma. Para ello se fija la posicin de barrido del microscopio en un extremo de la estructura a medir y se van tomando imgenes, correspondientes a diferentes secciones de la misma, hasta llegar al otro extremo. En la figura 10 puede observarse un conjunto de 30 secciones pticas de un grano de polen. La distancia entre secciones es de 5 m.

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Fig. 10. Conjunto de 30 secciones pticas de un grano de polen. La distancia entre secciones = 5 m Integrando las imgenes tomadas en los diferentes planos focales, es posible obtener una imagen de la informacin tridimensional en foco (Figura 11). Matemticamente esta imagen, denominada extended-focus, vendra dada por: I EF (x, y) = I(x, y, z)dz

Fig. 11. Imagen extended focus obtenida a partir de las secciones de la imagen anterior La construccin de una segunda imagen extended focus con un pequeo desplazamiento de las secciones permite obtener un par estereoscpico que visualizado adecuadamente proporciona una visin tridimensional de la muestra (figura 12).

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Fig. 12. Par estereoscpico visualizado en verde y rojo. Para obtener la sensacin de relieve necesitaremos unas gafas con un cristal de cada uno de estos colores

8.5.- Reconstruccin tridimensional. La imagen estereoscpica suministra informacin tridimensional de la muestra desde un punto de vista esttico y en una determinada direccin. Un mtodo mejor para analizar y estudiar las complejas relaciones espaciales es la realizacin de reconstrucciones tridimensionales donde el volumen de datos puede ser visualizado desde varios ngulos (figura 13).

Fig. 13. Reconstruccin tridimensional realizada a partir de las secciones de la figura 10 con diferentes ngulos de rotacin.

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8.6.- Estudios de actividad intracelular (ph e iones). El desarrollo, durante los ltimos 10 aos, de indicadores fluorescentes que responden selectivamente a iones biolgicos ha permitido a los investigadores medir el flujo de estos iones en clulas vivas. Indicadores fluorescentes han sido descritos para la mayora de los ms importantes iones biolgicos, aunque los usados ms ampliamente son los indicadores de PH y calcio intracelular (Haugland R.,1992). La mayor resolucin y contraste de la microscopa confocal permite obtener imgenes de actividad inica o PH mucho ms claras que las que se observan con microscopa de fluorescencia, adems la posibilidad de programar el barrido del lser permite tomar imgenes del mismo plano focal a distintos tiempos, pudiendo estudiarse la propagacin de un determinado Ion (por ejemplo la expansin de la ola de calcio despus de aplicar un estmulo sobre la clula). Debido al tiempo que se precisa para adquirir la imagen, en aquellos procesos en que los cambios en la actividad inica son muy rpidos es preciso tomar imgenes de menor resolucin o incluso captar nicamente unas pocas lneas por imagen para poder observar la evolucin en tiempos muy cortos.

8.7.- Determinacin de espectros de fluorescencia (lambda scan). Si el sistema cuenta con un detector espectral es posible utilizarlo para obtener el espectro real de emisin del fluorocromo con que hemos marcado nuestra muestra. Aunque existen mltiples tablas de los espectros de emisin de los fluorocromos, hay ligeras variaciones entre el espectro terico y el real debidas principalmente a variaciones en el PH al preparar la muestra o a variaciones de temperatura. Para obtener el espectro de emisin definiremos un rango de valores de longitudes de onda dentro del cual vamos a tomar imgenes, a continuacin definiremos el nmero de imgenes y finalmente el intervalo para cada imagen. Como resultado tendremos una serie de imgenes que nos muestran la intensidad de fluorescencia para cada intervalo. Si realizamos una grfica de las intensidades obtendremos el espectro real de emisin de ese fluorocromo (figura 14). Este mtodo es til tambin para deducir espectros de autofluorescencia.

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Fig. 14. Serie de imgenes de bolas de resina marcadas con un fluorocromo del que se desea obtener su espectro de emisin. Cada imagen muestra la seal detectada del fluorocromo en un intervalo de 10 nm entre 500 y 650nm. Midiendo la intensidad relativa de la fluorescencia en un punto de la bola de resina para las 15 imgenes podemos obtener la grfica del espectro de emisin del fluorocromo. En este caso la intensidad mxima de emisin estara en 540nm.

9.- NUEVOS DESARROLLOS. Uno de las principales limitaciones de los microscopios confocales de barrido punto a punto es el tiempo de obtencin de las imgenes (entre 2 y 3 imgenes por segundo). Esta lenta velocidad de adquisicin supone un problema cuando se trata de observar organismos en movimiento (por ejemplo bacterias) o procesos de dinmica celular que ocurren en un corto intervalo de tiempo. En la actualidad ya existen equipos en los que el lser incide simultneamente en toda una lnea de la imagen en lugar de en un nico punto obtenindose velocidades superiores a 200 imgenes por segundo. Estos microscopios denominados Confocal Live, precisan de equipos informticos con una gran capacidad de proceso y almacenamiento para poder manejar los cientos de imgenes que podemos obtener en unos pocos segundos.

Microscopa lser confocal BIBLIOGRAFA.

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INDICE ALFABTICO. 3D. Vase Reconstruccin tridimensional Airy, 6 AOBS, 4 AOTF, 4 apertura numrica, 6 autofluorescencia, 3 beam scanning, 3 Confocal Lser Scanning Microscopy, 3 Confocal Live, 16 deteccin espectral, 4 diafragma, 2 dicroico, 2 epiluminacin, 3 espectro de emisin, 4 de excitacin, 4 espejos galvanomtricos, 4 extended-focus, 13 fluorescencia, 3 fluorocromo, 3 fotomultiplicador, 2, 3, 4, 6 lambda scan, 7, 15 lser, 2, 3, 6 Leica TCS SP2 AOBS, 4 Lnea de excitacin, 6 mltiple labeling, 10 par estereoscpico, 13 photobleaching, 6 pinhole. Vase diafragma pixel, 7 plano focal, 2, 4, 8 platina motorizada, 11 Reconstruccin tridimensional, 14 resolucin, 6 secciones pticas, 7, 8, 12 transversales(x-z), 11 single labeling, 9 stage scanning, 3