Captulo 16

CARACTERIZACIN 16.1 LA NECESIDAD DE CARACTERIZACIN Hay seis principales requisitos para la caracterizacin de la lnea celular: (1) La demostracin de la ausencia de contaminacin cruzada (2) Confirmacin de la especie de origen (3) La correlacin con el tejido de origen, que comprende las siguientes caractersticas: a) Identificacin del linaje al que pertenece la clula b) Posicin de las clulas dentro de ese linaje (es decir, el tallo, precursor, o el estado diferenciado) (4) La determinacin de si la lnea celular se transforma o no: a) Es la lnea celular finita o lnea continua (vanse las secciones 18.2, 18.4)? b) Expresa propiedades asociadas con malignidad (ver seccin 18.6)? (5) Indicacin de si la lnea celular es propensa a la inestabilidad gentica y la variacin fenotpica (vanse las Secciones 17.1.1, 18.3) (6) Identificacin de lneas celulares especficos dentro de un grupo del mismo origen, seleccionados cepas de clulas o lneas celulares hbridas, todos los cuales requieren demostracin de las caractersticas nicas para esa lnea celular o cepa de clulas. 16.2 MANTENIMIENTO DE REGISTROS Y LA PROCEDENCIA Cuando una nueva lnea celular se deriva, ya sea a partir de un cultivo primario o de una lnea celular existente, es difcil evaluar su valor futuro. A menudo, es slo despus de un perodo de uso y difusin que la verdadera importancia de la lnea celular se hace evidente, y en que los detalles del punto de su origen se requieren. Sin embargo, para entonces ya es demasiado tarde para recoger informacin retrospectiva. Por tanto, es vital que se lleve un registro adecuado, desde el momento de su aislamiento del tejido, o de la recepcin de una nueva lnea celular, detallando el origen, caractersticas, y la manipulacin de la lnea celular. Estos registros forman la procedencia de la lnea celular, y cuanto ms detallada sea la procedencia, ms valiosa la lnea celular (ver secciones 13.7.8 y 12.3.11). Este aspecto del cultivo celular se ha vuelto particularmente importante con la amplia difusin de las lneas celulares a travs de bancos de clulas y los contactos personales a los laboratorios de investigacin y empresas comerciales muy alejadas de su origen. En particular, si una lnea celular se incorpora en un procedimiento que requiere validacin de sus componentes, la autenticacin de la lnea celular se convierte en crucial. La autenticacin se requiere que la lnea celular se caracterice en el recibo, y peridicamente durante el uso, y que estos datos sean compatibles con, y se aadan a, la procedencia existente. 16.3 AUTENTICACIN

La caracterizacin de una lnea celular es vital, no slo para determinar su funcionalidad, sino tambin para demostrar su autenticidad, hay que prestar especial atencin a la posibilidad de que la lnea celular ha recibido contaminacin cruzada con una lnea celular continua existente o mal identificadas por etiquetado incorrecto o confusin en el manejo. La demostracin de que la mayora de las lneas celulares continuas en uso en los Estados Unidos a finales de 1960 haban presentado contaminacin cruzada con clulas HeLa [Gartler, 1967; Nelson-Rees & Flandermeyer, 1977; Lavappa, 1978] primero trajo este grave problema a la luz, pero el uso continuo sigue siendo inconsciente, o no estn dispuestos a aceptar, que muchas lneas de uso comn (por ejemplo, Hep-2, KB, Girardi corazn, deseo, hgado Chang) no son autnticos (ver Secciones 16.6.2, 16.6. 3 y la Tabla 13.2). El uso de lneas de clulas contaminadas con HeLa, u otras lneas celulares continuas, sin el reconocimiento adecuado de la contaminacin, es todava un problema importante [Stacey et al, 2000;.. Drexler et al, 2003] y hace hincapi en que cualquier lnea clular que crece vigorosamente pueden recubrir otra lnea, que crece ms lentamente [Masters et al, 1988;. van Helden et al, 1988;. Christensen et al, 1993;. Gignac et al, 1993;. van Bokhoven et al, 2001a, b;. Rush et al., 2002]. Aunque algunos de los trabajos con estas lneas celulares pueden permanecer perfectamente vlidos por ejemplo, si se trata de un proceso molecular de inters, independientemente del origen de las clulas, cualquier intento de correlacionar el comportamiento de clulas con el tejido o tumor de origen est totalmente invalidado por contaminacin cruzada. Lamentablemente, este hecho es frecuentemente ignorado por los editores de revistas, las autoridades que conceden, rbitros, y los usuarios de las lneas celulares. Los estudios de caracterizacin, particularmente con lneas celulares continuas, se han convertido en un proceso de autenticacin que es vital para la validacin de los datos derivados de estas clulas. Independientemente de la capacidad intrnseca de la toma de huellas dactilares de ADN en laboratorio o anlisis de ADN y el anlisis de isoenzimas mltiple por geles de agarosa (vase el Protocolo 16.10) se han convertido en los principales procedimientos estndar para la identificacin de la lnea celular, y si usted no puede o no quiere llevar a cabo estos procedimientos de autenticacin usted mismo, entonces busque un servicio comercial (vase el Apndice II). Algunos de los mtodos de uso corriente para la caracterizacin de la lnea celular se enumeran en la Tabla 16,1 [vase tambin Hay et al., 2000]. 16.3.1 IDENTIFICACIN DE ESPECIES El anlisis cromosmico, tambin conocido como cariotipo (vase Protocolos 16,7, 27,5), es uno de los mejores mtodos para distinguir entre especies. Patrones de bandeo cromosmico puede ser utilizado para distinguir los cromosomas humanos y de ratn (vase la Seccin 16,5), y el pintado cromosmico, es decir, que utilizan combinaciones de sondas moleculares especficas para hibridar con los cromosomas individuales (vanse las Secciones 16.5.3 y 27.8.2), se suma adems la resolucin y la especificidad de esta tcnica. Estas sondas identifican pares de cromosomas individuales y son especficos de especie. La disponibilidad de sondas se limita a unas pocas especies en la actualidad, y la mayora son de ratn o humano, pero la pintura cromosoma es un buen mtodo para distinguir entre los cromosomas humanos y de ratn en el potencial de

contaminacin cruzada y de hbridos interespecficos. Electroforesis de isoenzimas (vase el Protocolo 16,10) es tambin una buena prueba diagnstica y es ms rpido que el anlisis cromosmico. Un simple kit est disponible que hace que esta tcnica fcilmente accesible (vase el Protocolo 16.10). Una combinacin de los dos mtodos y se utiliza a menudo da resultados inequvocos [Hay, 2000] 16.3.2 Linaje o marcadores tisulares rganos individuales se componen de tejidos, por ejemplo, la piel se compone de una epidermis externa y la dermis subyacente y los tejidos, a su vez, se componen de linajes individuales, por ejemplo, la dermis contiene fibrocitos del tejido conectivo, clulas endoteliales vasculares y clulas musculares lisas , y las clulas mesenquimales de las papilas drmicas, entre otros. Cada tipo de clula se puede rastrear, a travs de una serie de etapas de la proliferacin de clulas, a una clula madre de origen (vase la fig. 3,6), formando una estructura de rbol. Cada rama de aquel rbol puede considerarse como un linaje, como en una clula basal de la epidermis despus de una ruta de acceso a una diferenciacin de queratinocitos maduros confinada. Algunos linajes, por ejemplo, el linaje mieloide de la diferenciacin hematopoytica, puede ramificar en sublinajes (neutroflica, eosinoflica, y basfilos), la expresin de marcador de manera linaje tambin est influenciada por la diferenciacin, es decir, la posicin de la celda en la va de diferenciacin de linaje (vase la seccin 16,10). Marcadores de linaje son tiles en el establecimiento de la relacin de una lnea celular particular a su tejido de origen (Tabla 16,1). Antgenos de superficie celular. Estos marcadores son particularmente tiles en la clasificacin de las clulas hematopoyticas [Visser y De Vries, 1990] y tambin han sido eficaces en la discriminacin de epitelio del estroma con anticuerpos tales como anti-EMA [Heyderman et al., 1979] y anti-HMFG 1 y 2 [Burchell y TaylorPapadimitriou, 1989] y las clulas derivadas neuroectodrmicamente (por ejemplo, anti-A2B5) [Dickson et al., 1983] a partir de clulas derivadas de las capas germinales. Protenas de filamentos intermedios. Estos son algunos de los marcadores tisulares o linajes ms utilizados [Lane, 1982; Ramaekers et al, 1982.]. Protena cida fibrilar glial (GFAP) para astrocitos [Bignami et al, 1980.] (Vase la lmina 11b) y desmina [Bochaton-Piallat et al, 1992;.. Brouty-Boye et al, '1992] para el msculo son los ms especficos , mientras que marcas de citoqueratina clulas epiteliales y mesotelio [Lane, 1982; Moll et al, 1982.] (vase la lmina 11a). Marcas de protena de los neurofilamentos en neuronas (Wu y de Vellis, 1987; Kondo & Raff, 2000) y algunas clulas neuroendocrinas (Bishop et al, 1988.). Vimentina (vase la lmina 11c), aunque generalmente se limita a las clulas del mesodermo derivados in vivo, pueden aparecer en otros tipos de clulas in vitro. Productos diferenciados y funciones. La hemoglobina de las clulas eritroides, la miosina o la tropomiosina para el msculo, la melanina por los melanocitos, y albmina de suero para los hepatocitos se encuentran entre los mejores ejemplos de marcadores especficos de clulas, pero, como todos los marcadores de diferenciacin, dependen de la expresin completa del fenotipo diferenciado. Transporte de iones inorgnicos, y la transferencia resultante de agua, es

caracterstica de absorcin y la secrecin epitelios [Abaza et al, 1974;. Lever, 1986]; cultivadas como monocapas, algunas clulas epiteliales se producen cpulas, que son hemi-quistes en el monocapa causada por la acumulacin de agua en la parte inferior de la monocapa [Rabito et al, 1980.] (Fig. 16,1; ver placa 12a, b). Otras funciones especficas que pueden ser expresados in vitro incluyen la contraccin muscular y la despolarizacin de la membrana de la clula nerviosa. Regulacin. El nivel de expresin de muchos productos diferenciados est bajo el control regulador de las influencias ambientales, tales como las hormonas, la matriz, y las clulas adyacentes (vase la Seccin 17,7). Por lo tanto, la medicin de marcadores de linaje especficos puede requerir la preincubacin de las clulas en, por ejemplo, una hormona tal como la hidrocortisona, factores de crecimiento especfico, o el crecimiento de las clulas en la matriz extracelular del tipo correcto. Expresin mxima de ambos, la sintetasa de la tirosina aminotransferasa en clulas del hgado y la glutamina en la gla requieren la induccin previa con dexametasona. Glutamina sintetasa es tambin reprimido por glutamina, glutamato as debe ser sustituido en el medio de 48 h antes del ensayo [DeMars, 1958]. Fidelidad del linaje. Aunque muchos de los marcadores descritos anteriormente han sido reivindicados como marcadores de linaje, que estn ms adecuadamente considerados como marcadores de clulas o tejido , a menudo son ms caractersticos de la funcin de la clula que de su origen embrionario. Las citoqueratinas se producen en mesotelio y epitelio renal, aunque ambos de estos tejidos se derivan del mesodermo. Enolasa especfica de neurona y la creatina cinasa BB se expresan en las clulas neuroendocrinas del pulmn, aunque estas clulas son ahora se reconoce que derivan del endodermo y no del neuroectodermo, como uno podra esperar de las clulas de tipo neuroendocrino. 16.3.3 Marcadores nicos Marcadores nicos incluyen aberraciones cromosmicas especficas (por ejemplo, deleciones, translocaciones, polisoma); complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de antgenos de grupo (por ejemplo, HLA en seres humanos), que son altamente polimrficas, y huellas de ADN (vase el Protocolo 16,8) o de perfiles (vase el Protocolo 16,9). Deficiencias enzimticas [por ejemplo, deficiencia de timidina quinasa (TK-)] y de resistencia a frmacos (por ejemplo, resistencia a la vinblastina, normalmente acoplada a la expresin de la P-glicoprotena por uno de los genes MDR, que codifican para la protena de eflujo) no son verdaderamente nico, pero pueden ser utilizados para distinguir entre las lneas celulares de los mismos tejidos pero los donantes diferentes. 16.3.4 Transformacin El estado de transformacin constituye un elemento importante en la caracterizacin de la lnea celular y se tratan por separado (vase el captulo 17). 16.4 MORFOLOGA CELULAR Observacin de la morfologa es la tcnica ms sencilla y directa para identificar clulas. Tiene, sin embargo, algunas deficiencias que deben ser reconocidas. La mayora de estos estn relacionados

con la plasticidad de la morfologa celular en respuesta a diferentes condiciones de cultivo, por ejemplo, las clulas epiteliales que crecen en el centro de una lmina confluente son generalmente regulares, poligonales, y con un borde claramente definido, mientras que las mismas clulas creciendo en el borde de un parche puede ser ms irregulares y distendidas y, si se transforma, se pueden desprender el parche y se convierten en forma de fibroblastos. Fibroblastos subconfluentes de rin de hmster o de pulmn humano o de la piel asumen formas multipolar o bipolar (vase la fig. 16.2a, g y 8a Plate) y estn bien distribuidos sobre la superficie de cultivo, pero en confluencia son bipolares y menos extendidas (vase la fig. 16.2b, h y 8b placas, 10d, e). Tambin forma caracterstica matrices paralelas y espirales que son visibles a simple vista (figura 10c). Clulas 3T3 de ratn (Fig. 16.2s, t) crecen como fibroblastos multipolares en baja densidad celular pero se convierten como epitelio en la confluencia (Fig. 16.2v, w; vase la lmina 10b). Las alteraciones en el sustrato [Gospodarowicz et al, 1978b;. Freshney, 1980], y la constitucin del medio (vase el apartado 17.7.2), tambin pueden afectar la morfologa celular. Por lo tanto, las observaciones comparativas de clulas se debe hacer siempre en la misma fase de crecimiento y la densidad celular en el mismo medio, y creciendo en el mismo sustrato. Los trminos'' fibroblstica'' y'' epitelial'' se utilizan ms bien libremente en el cultivo de tejidos y a menudo describen la apariencia ms que el origen de las clulas. As, una clula bipolar o multipolar migratoria, cuya longitud es por lo general ms del doble de su anchura, se llamara fibroblstica, mientras que una monocapa de clulas que es poligonal, con dimensiones ms regulares, y que crece en un parche discreto junto con otras clulas se generalmente como epitelial (Fig. 16.2e, f, i, j, m, n, q). Sin embargo, cuando la identidad de las clulas no ha sido confirmado, los trminos similar a fibroblastos (o fibroblastoide) y epitheliumlike (o epitelioide) se debe utilizar. Clulas derivadas de carcinoma son a menudo epitelio similar a pero ms variable en la morfologa (Fig. 16,2 M, n, k, l), y algunas clulas mesenquimales como CHO-K1 y endotelio tambin puede asumir una morfologa del epitelio como en la confluencia (Fig. 16,2 d, r). Frecuentes observaciones breves de cultivos vivos, preferiblemente con ptica de contraste de fase, son ms valiosos que las infrecuentes preparaciones teidas que se estudian en profundidad. Los primeros dan una impresin ms general de la morfologa de la clula y su plasticidad y tambin revelan diferencias en granularidad y vacuolizacin que influyen en la salud del cultivo. Las clulas enfermas a menudo se convierten en granulares y luego mostrarn vacuolizacin alrededor del ncleo (ver fig. 13.1). 16.4.1 Microscopa El microscopio invertido es una de las herramientas ms importantes en el laboratorio de cultivo de tejidos, pero a menudo se utiliza incorrectamente. Como el espesor del recipiente de cultivo cerrado hace difcil la observacin desde arriba, debido a la larga distancia de trabajo, el recipiente de cultivo se colocan en el escenario, iluminado desde arriba, y observado desde abajo. Como el espesor de la pared del recipiente de cultivo todava limita la distancia de trabajo, el aumento del objetivo mximo se limita generalmente a 40 . El uso de contraste de fase ptica, donde se

enmascara una trayectoria de la luz anular correspondiente a un anillo oscuro en el objetivo y visible slo a la luz difractada, permite que las clulas no teidas sean vistas con mayor contraste que la que est disponible por la iluminacin normal. Debido a que esto significa que la intensidad de la luz se aumenta, un filtro de infrarrojos debe ser incorporado para la observacin prolongada de las clulas. PROTOCOLO 16.1. UTILIZANDO UN MICROSCOPIO INVERTIDO Esquema Coloque el cultivo en la platina del microscopio, encienda y seleccione la ptica correcta. Enfoque la muestra y centre el anillo de fase y de condensador, si es necesario. Materiales No estriles: - Microscopio invertido (vase la Seccin 5.2.5) con contraste de fase en 10 20 y o 40 objetivos y condensador con anillos de fase apropiados - Lente de tejido Protocolo 1. Asegrese de que el microscopio est limpio. (Limpie el escenario con alcohol al 70%, y limpiar los objetivos con papel para lentes, si es necesario.) 2. Encienda la unidad, colocando la intensidad de la lmpara encima de su nivel ms bajo a la intensidad correcta, con el restato, en lugar de cambiar la lmpara directamente a la iluminacin brillante. 3. Compruebe la alineacin del condensador y la fuente de luz: (a) Coloque un portaobjetos teido, frasco, o un plato en el escenario. (b) Cierre la abertura de campo. (c) Enfoque la imagen del diafragma iris. (d) Centro de la imagen del iris en el campo de visin. 4. Centre el anillo de fase: (a) Si un telescopio fase se proporciona, se inserta en lugar del ocular estndar. A continuacin, se centran en el anillo de fase, y comprobar que el anillo de condensador (blanco sobre negro) es concntrico con el anillo de objetivo (negro sobre blanco). (b) Si no se proporciona telescopio fase y vuelva a colocar el espcimen manchado con una cultura sin teir (vivo o fijo), el enfoque, y mover el anillo de ajuste de fase hasta que se obtiene un contraste ptimo. 5. Se examinan las clulas. A 10 contraste de fase objetivo ser suficiente detalle como para examen de rutina. A 4 contraste de fase objetivo no se dan suficientes detalles y ampliaciones superiores a 10 restringir el rea de escaneado. (a) Tomar nota de la fase de crecimiento (por ejemplo, escasa, subconfluent, confluente, denso). (b) Tenga en cuenta el estado de las clulas (por ejemplo, clara y hialino o granular, vacuolado).

6. Comprobar la claridad del medio (por ejemplo, ausencia de residuos, grnulos flotantes, signos de contaminacin), la seleccin de un objetivo de mayor magnificacin requerida. (Vase la Seccin 19.3.1, fig. 19.1a, c, e, y placa 16a, b, c.) 7. Anota tus observaciones. 8. Gire el restato hacia abajo y desconectar la alimentacin del microscopio. 9. Volver a la cultura de la incubadora, o llevarlo a una campana para manipulaciones estriles. Recipientes de cultivo tomadas directamente de la incubadora desarrollarn condensacin en el interior de la parte superior o tapa. Esta condensacin se puede borrar en un matraz invirtiendo el frasco, corriendo medio sobre el interior de la parte superior del matraz (sin permitir que se corra en el cuello), y se coloca el matraz verticalmente durante 10-20 s para permitir que el lquido se drene hacia abajo. Eliminacin de la condensacin es ms difcil para placas de Petri y puede requerir la sustitucin de la tapa. Si el plato est correctamente etiquetado, es decir, en un lado de la base, esto no debe afectar la identificacin del cultivo. Los cultivos en placas de microtitulacin son particularmente difciles de examinar debido a la difraccin causada por el menisco. Es til mantener un conjunto de fotografas a densidades celulares diferentes (vase la fig. 16,2) para cada lnea celular (vase el Protocolo de 16,6), preparado poco despus de la adquisicin y posteriormente a intervalos, como un registro en caso de que posteriormente se sospeche un cambio morfolgico. Fotografas de lneas celulares en uso regular debe aparecer por encima del microscopio invertido. Registros fotogrficos se pueden complementar con fotografas de preparaciones teidas y un escaneado auto-radiografa de una huella de ADN o salida digital de anlisis de ADN y se almacena con el registro de la lnea celular digital o en papel. 16.4.2 Tincin Una tincin de sangre policromtica, como Giemsa, proporciona un mtodo conveniente de preparar un cultivo manchado. Giemsa se suele combinar con de May-Grunwald tincin cuando se tie sangre, pero no cuando se tie clulas cultivadas. Solo, se tie el ncleo de color rosa o magenta, los nucleolos de azul oscuro, y citoplasma de gris-azul plido. Se tie las clulas fijadas en formol o alcohol, pero no funcionar correctamente a menos que el preparado sea completamente anhidro. PROTOCOLO 16,2. La tincin con GIEMSA Esquema Fijar la cultura en metanol, se tien directamente con Giemsa diluido, y despus diluir la tincin 1:10. Lave el cultivo, y examinar la humedad. Materiales No estriles: - D-PBSA - D-PBSA: metanol, 1:1

- Giemsa diluido - Metanol - Agua desionizada Protocolo Este protocolo asume que una monocapa celular se est utilizando, pero las suspensiones de clulas fijadas (vase la Seccin 16.4.4) tambin se puede utilizar, a partir del paso 6. 1. Retire y deseche el medio. 2. Lavar la monocapa con D-PBSA y deseche el enjuague. 3. Aadir 5 ml de D-PBSA/methanol por 25 cm2. Dejarlo durante 2 minutos y luego deseche el DPBSA / metanol. 4. Aadir 5 ml de metanol fresco, y se deja durante 10 minutos. 5. Desechar el metanol, y reemplazarlo con metanol anhidro fresco. Enjuague la monocapa, y luego descartar el metanol. 6. En este punto, el frasco puede ser secado y almacenado o tieron directamente. Es importante que la tincin se realice directamente a partir de metanol anhidro fresco, incluso con un recipiente seco. Si el metanol es vaciado y el matraz se deja durante algn tiempo, el agua ser absorbida por el metanol residual y se inhiben posterior tincin. Incluso monocapas secos pueden absorber la humedad del aire. 7. Aadir ordenada tincin de Giemsa, 2 ml por cada 25 cm2, asegurndose de que la monocapa est cubierto y permanece cubierta. 8. Despus de 2 min, se diluye la mancha con 8 ml de agua, y agitar suavemente durante 2 min. 9. Plegar la mancha con agua de manera que la escoria que se forma se flotaron a la izquierda y no hacia atrs para recubrir las clulas. Lavar las clulas suavemente con agua corriente del grifo hasta cualquier fondo nublado mancha rosada (precipitado) se elimina, pero la tincin no se lixivia fuera de las clulas (por lo general alrededor de 10-20 s). 10. Verter el agua, lavar la monocapa en agua desionizada, y examinar las clulas en el microscopio, mientras que la monocapa est todava hmedo. Guarde las clulas secas y mojar a volver a examinar. Nota. Tincin de Giemsa es un procedimiento simple que da una buena tincin con alto contraste policromtico, pero una tincin precipitada puede dar una apariencia manchada a las clulas. Este precipitado se forma como una escoria en la superficie de la solucin de tincin, debido a la oxidacin, y toda la solucin, particularmente en la superficie de la corredera, cuando se aade agua. Lavando la tincin por el desplazamiento hacia arriba, en vez de verterla o quitando las diapositivas, est diseado para prevenir que las clulas entren en contacto con la escoria. Lavado exhaustivo al final del procedimiento est diseado para eliminar cualquier precipitado dejado en la preparacin. Preparaciones de clulas fijadas tambin se pueden teir con violeta cristal. Cristal violeta es una toncin monocromtica y tie el ncleo azul oscuro y el citoplasma azul claro. No es tan bueno como Giemsa para observaciones morfolgicas, pero es ms fcil de usar y puede ser reutilizado.

Es una tincin cmodo de usar para la tincin de los clones para el recuento, ya que no tiene los problemas de precipitacin de Giemsa y es ms fcil de lavar, dando un fondo ms claro y haciendo ms fcil contar colonia automatizado. PROTOCOLO 16,3. La tincin con violeta cristal Materiales No estriles: - D-PBSA - D-PBSA/MeOH: metanol al 50% en D-PBSA - Metanol - Crystal Violet - Embudo de filtro y filtro de papel de un tamao apropiado para tomar 5 ml de tintura de cada plato - Botella de reciclado de tincin Protocolo 1. Retire y deseche el medio. 2. Lavar la monocapa con D-PBSA y deseche el enjuague. 3. Aadir 5 ml de D-PBSA/MeOH por 25 cm2. Dejarlo durante 2 minutos y luego deseche el DPBSA/MeOH. 4. Aadir 5 ml de metanol fresco, y se deja durante 10 minutos. 5. Deseche el metanol. Escurrir los platos y dejar que se sequen. 6. Aadir 5 ml de cristal violeta por 25 cm2, y se deja durante 10 min. 7. Colocar el embudo de filtro en la botella de reciclaje. 8. Descartar la mancha en el embudo de filtro. 9. Enjuagar la cpsula en agua corriente y luego en agua desionizada, y permitir que el plato de secar 16.4.3 Recipientes de cultivo para Citologa: Los cultivos monocapa La siguiente es una lista de los recipientes de cultivo que se han encontrado adecuados para la citologa: (1) Regular 25-cm2 o 5 cm placas de Petri. (2) Los cubreobjetos (vidrio o plstico; vase el Apndice II) en placas de pocillos mltiples, cajas de Petri o tubos Leighton (Fig. 16.3 bis; ver tambin las figuras 8.2 y 8.3.). (3) Portaobjetos en 9-cm placas de Petri o adjunto con cmaras mltiples (cmara de diapositivas, ver el Apndice II;. Fig. 16.3b). (4) El OptiCell doble membrana cmara de cultivo (Fig. 16.3c). (5) Platos Petriperm (Heraeus), acetato de celulosa o los filtros de policarbonato, Thermanox y PTFE recubierto cubreobjetos, todos los cuales han sido utilizados para estudios citolgicos (EM

algn tratamiento previo de filtros o PTFE puede ser necesario-por ejemplo, gelatina, colgeno, fibronectina , Matrigel, o suero de revestimiento vase la Seccin 8.4.1). 16.4.4 Preparacin de cultivo en suspensin de Citologa Las clulas no adherentes deben ser depositados en una superficie de vidrio o plstico para observaciones citolgicas. La tcnica convencional para clulas de la sangre, la preparacin de un frotis de sangre, no funciona bien porque las clulas cultivadas tienden a romperse durante el frotamiento, aunque esto se puede reducir mediante el recubrimiento del portaobjetos con suero y luego se extiende a las clulas en el suero. Centrifugacin. Centrfugas Citolgicas se han convertido en la opcin preferida para la creacin de monocapas de clulas en suspensin. Centrfugas (generalmente llamada cytocentrifuges) estn disponibles con soportes deslizantes especiales para la hilatura clulas en un portaobjetos (vase el Apndice II y el 16,4 fig.). Los portadores tienen compartimentos de muestra que conducen a un orificio que se coloca contra un portaobjetos de microscopio y se encuentra dentro de un diseo especial, rotor cerrado. El recubrimiento de los portaobjetos con suero ayuda a evitar que las clulas se rompan cuando golpean la corredera PROTOCOLO 16,4. PREPARACIN DE LAS CLULAS DE SUSPENSION PARA CITOLOGA DE CITOCENTRFUGA Esquema Dispensar un pequeo volumen de clulas concentradas en el compartimento de la muestra in situ y se coloca contra una diapositiva. Centrifugar las clulas en el portaobjetos. Materiales No estriles: - Suspensin celular, 5 10 5 clulas / ml, en 50-100% de suero - Suero - Metanol - Citocentrfuga (vase el Apndice II) - Portaobjetos - Portadores de deslizamiento para centrfuga - Ventilador Protocolo 1. Cubra las diapositivas en el suero y escurrir. 2. Secar los portaobjetos con un ventilador. 3. Etiquetar los portaobjetos. 4. Colocar los portaobjetos en soportes de corredera e insertar los soportes en el rotor. 5. Colocar aproximadamente 1-2 x 10 5 clulas en 200-400 l de medio en al menos dos bloques de muestras (vase el protocolo del fabricante). 6. Encender la centrfuga, y girar las clulas hacia abajo sobre los portaobjetos a 100 g durante 5

min. 7. Seque las diapositivas rpidamente, y fijarlos en MeOH durante 10 min. Nota. Algunos cytocentrifuges requerir que la fijacin se realiza in situ. Nota de seguridad. El rotor debe ser sellado durante la hilatura si clulas de primates humanos o de otro tipo se estn utilizando Tcnica de la gota. Este procedimiento es el mismo que el utilizado para la preparacin de cromosomas (vase el Protocolo de 16,7), pero sin los tratamientos colcemid y hipotnica. Se debe tener cuidado para evitar la formacin de grumos y la concentracin celular se debe ajustar para asegurar que las clulas no se amontonan. Las clulas en el borde de la mancha se pueden romper. Filtracin. Esta tcnica se utiliza a veces en citologa exfoliativa (ver las instrucciones de los fabricantes siguientes para obtener ms informacin: Pall Gelman, Millipore, Sartorius). Esta tcnica es adecuada para el muestreo de grandes volmenes con una concentracin celular baja. PROTOCOLO 16.5. FILTRACIN CITOLOGA Esquema Suavemente sacar una suspensin de clulas de baja concentracin a travs de un filtro de vaco. Se lavan las clulas y fijarlo en el lugar. Materiales No estriles: - D-PBSA, 20 ml - Metanol, 50 ml - Giemsa - Medio de montaje (DPX o Permount) - Filtros transparentes (por ejemplo, 25-TPX mm o policarbonato, 0.5-micras de porosidad, Millipore, Pall Gelman, Sartorius) - Soporte para filtro (por ejemplo, Millipore, Pall Gelman, Sartorius) - Vaco frasco (Millipore) - Suspensin celular (~ 10 6 clulas en medio de 5-10 ml con 20% de suero) - Bomba de vaco Protocolo 1. Instale el conjunto del filtro (Fig. 16,5) con un 25 - filtro mm de dimetro, 0,5-micras de porosidad transparente. 2. Dibujar la suspensin celular en el filtro con una bomba de vaco. No deje que todo el mediano plazo a travs. 3. Suavemente aadir 10 ml de D-PBSA cuando la suspensin de clulas se ha reducido a 2 ml. 4. Repita el paso 3 cuando el D-PBSA mnimo es de 2 ml. 5. Aadir 10 ml de metanol a la D-PBSA, y mantener la adicin de metanol hasta metanol puro

est siendo arrastrado a travs del filtro. 6. Apagar el vaco antes de que todo el metanol se ejecuta a travs. 7. Extraer el filtro, y el aire que se seque. 8. Teir el filtro de Giemsa, enjuagar con agua y secar. 9. Monte el filtro en una diapositiva en DPX o Permount pulsando el cubreobjetos hacia abajo con un peso pesado para aplanar el filtro. 16.4.5 Microfotografa La forma ms sencilla de grabacin de imgenes de microscopio es digital a travs de una cmara CCD. Elegir al menos una cmara de 5 megapxeles ofrece resolucin que es ms que suficiente para su publicacin. Almacenamiento electrnico de imgenes aumenta la facilidad de bsqueda, transmisin electrnica a otros sitios, el formato y edicin. La imagen se visualiza en la pantalla en el momento en que se toma y se puede imprimir al instante si se requiere, en blanco y negro o en color. PROTOCOLO 16.6. FOTOGRAFA DIGITAL EN UN MICROSCOPIO Esquema Configure el microscopio, compruebe la alineacin de la ptica, y se centran en el rea relevante de la muestra. Compruebe las conexiones de la cmara al ordenador, desviar el haz de luz a la cmara, enfocar y guardar la imagen. Materiales Estril o preparados aspticamente: - Cultivo para el examen (asegrese que el cultivo est libre de residuos-por ejemplo., cambiar el medio en un cultivo primario antes de la fotografa) No estriles: - Microscopio invertido (vase la Seccin 5.2.5) con los siguientes atributos: Contraste de fase en 10 y 20 o 40 objetivos Fase condensador con anillos de fase de 10 y 20 o 40 objetivos Cabezal triocular u otro puerto con adaptador para cmara CCD Filtros de densidad neutra, 2 y 4 - Lente de tejido - Registro de almohadilla para imgenes - Micrmetro de diapositivas Protocolo 1. Preparar la cultura para la fotografa: (a) Para los cultivos en frascos: i) Llevar a una campana de flujo laminar, afloje el tapn en el matraz, y permitir que el cultivo se enfre. ii) apriete la tapa en el frasco cuando el contenido del matraz estn a temperatura ambiente, con el fin de evitar cualquier distorsin del matraz mientras se enfra.

iii) Se lava el medio en el interior de la parte superior del matraz para eliminar cualquier condensacin que pueda haberse formado. iv) Permitir la pelcula de medio para drenar colocndose el frasco en posicin vertical. (b) Para las fuentes y platos: i) Permitir la cultura enfriar a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar. ii) Colocar la tapa del plato o placa (asegrese de que la muestra est marcado en la base del plato o placa). 2. Seleccione el campo y magnificacin (4 x es mejor para los clones o patrn de una monocapa, 10 para un tiro representante, y 20 para el detalle celular), evitando imperfecciones o marcas en el matraz. (Siempre marcar el lateral del recipiente o plato, y no la parte superior o inferior.) 3. Revise el enfoque: (a) Centrar los oculares binoculares a sus propios ojos, con la trama o retcula en el ocular. (b) Enfoque del microscopio. 4. Cambiar al monitor, y comprobar la densidad y el contraste de la imagen en pantalla, el ajuste de la intensidad de la luz con el restato en el microscopio en busca de un registro negro y blanco y con filtros de densidad neutra para color (aunque la imagen ms adelante puede ser reprocesado electrnicamente si la temperatura de color es incorrecto). 5. Reorientar el microscopio si es necesario. 6. Guarde la imagen con una resolucin adecuada para el uso final de la imagen y el almacenamiento electrnico disponible (por ejemplo, 940 740 se requieren 2 Mb espacio de almacenamiento y proporcionar una calidad razonable si se reprodujeran en el 5 7 cm, 12 x 18 cm.) 7. Baje la luz para evitar el sobrecalentamiento de la cultura. Nota. Un filtro de infrarrojos se pueden incorporar para minimizar el sobrecalentamiento. 8. Repetir los pasos 3-6 con un tobogn de micrmetro con el mismo aumento para dar la escala de ampliacin. Si esta imagen se procesa de la misma manera como las otras inyecciones, sta se puede utilizar para generar una barra de escala. 9. Volver a la cultura a la incubadora. 10. Completar un registro manual o en una hoja de clculo contra el nombre de archivo, de lo contrario, las imgenes sern difciles de identificar. 11. Imgenes guardadas se pueden ver, editar y formatear con programas como Adobe PhotoShop e impreso por inyeccin de tinta de alta calidad, la impresora lser color, o una impresora Kodak ColorEase. Con la cada en el costo de las cmaras digitales, es difcil de justificar el uso continuo de pelcula. Sin embargo, si se utiliza pelcula convencional, hay dos tamaos grandes que usted puede desear para considerar: 35 mm, lo que es mejor para transparencias en color de rutina y de alto volumen fotografas de negro andwhite, y 3 1 2 4 1 2 9 pulgadas ( 12 cm) con polaroid positivo / negativo pelcula (tipo 665), lo cual es bueno para las fotografas lowvolume negro y blanco. Pelcula instantnea, fabricado por Fuji, tambin se pueden usar. Con la pelcula instantnea, obtener un resultado inmediato y saber que tiene el registro sin tener que desarrollar e imprimir una pelcula.

El coste unitario es alto, pero hay un considerable ahorro de tiempo. Sin embargo, algunas pelculas instantneas con un contraste relativamente bajo, y su saturacin de color no siempre es tan buena como la de pelcula convencional. Pelculas instantneas tambin tienden a tener una vida til ms corta. 16.5 CONTENIDO DE CROMOSOMAS Contenido cromosmico o cariotipo es uno de los criterios ms caractersticos y mejor definidos para la identificacin de las lneas celulares y relacionarlos con la especie y el sexo de la que se derivaron. Ejemplos de cariotipos humanos y de ratn estn disponibles en www.pathology.washington.edu/galleries/Cytogallery/, y el ideograma rata est disponible en Idiogram.html http://ratmap.gen.gu.se/. Ver tambin Mitelman [1995] para humanos y Hsu y Benirschke [1967] para otros mamferos, aunque este ltimo es anterior bandeo cromosmico (vase la Seccin 16.5.1). El anlisis cromosmico tambin puede distinguir entre clulas normales y transformadas (vase la Seccin 18.3.1), debido a que el nmero de cromosomas es ms estable en las clulas normales (excepto en ratones, donde el complemento cromosmico de las clulas normales pueden cambiar muy rpidamente despus de la explantacin en cultivo). PROTOCOLO 16,7. PREPARACIONES DE CROMOSOMAS Esquema Fijar las clulas detenidas en metafase y se hincha en un medio hipotnico. Suelta las clulas en un portaobjetos, mancha, y examinar (Fig. 16,6) [Rothfels y Siminovitch, 1958; Rooney y Czepulkowski, 1986]. Materiales Preparado estril o asptica: - Cultivo de clulas en fase logartmica - Colcemid, 1 10-5 M en D-PBSA - D-PBSA - Tripsina, 0,25% de crudo No estriles: - Solucin hipotnica: 0,04 M KCl, 0,025 M citrato de sodio - Fijador metanol actico: 1 parte de cido actico glacial ms 3 partes de metanol anhidro o etanol, compuesto fresco y se mantuvieron en hielo - Giemsa - DPX o medio de montaje Permount - Hielo - Tubos de centrfuga - Pipetas Pasteur - Correderas - Cubreobjetos, # 00 - Platos de diapositivas

- Baja velocidad de centrfuga - Vortex mezclador Protocolo 1. Establecer un cultivo de 75 cm2 frasco entre 2 10 4 y 5 10 4 clulas / ml (4 x 10 3 y 1 10 4 clulas/cm2) en 20 ml. 2. Aproximadamente 3-5 das despus, cuando las clulas estn en la fase logartmica de crecimiento, aadir 0,2 ml de 1 10-5 M colcemid al medio ya en el matraz para dar una concentracin final de 1 10-7 M. 3. Despus de 4-6 h, se elimina el medio suavemente, aadir 5 ml de tripsina al 0,25%, y se incuba el cultivo durante 10 min. 4. Centrifugar las clulas en tripsina, y descartar el sobrenadante tripsina. 5. Resuspender las clulas en 5 ml de solucin hipotnica, y se dejan durante 20 min a 37 C. 6. Aadir un volumen igual de recin preparada, metanol actico enfriado con hielo, mezclando constantemente, y luego centrifugar las clulas a 100 g durante 2 min. 7. Desechar el sobrenadante mezcla, zumbido'''' el pellet en un vrtex (por ejemplo, sujetar la parte inferior del tubo contra el borde de la taza giratoria), y se aade lentamente metanol fresco actico con mezcla constante. 8. Agregar las clulas durante 10 min en hielo. 9. Centrifugar las clulas durante 2 minutos a 100 g. 10. Desechar el sobrenadante metanol actico, y resuspender el precipitado por buzzing en 0,2 ml de metanol actico, para dar una suspensin de clulas finamente dispersas. 11. Dibujar una gota de la suspensin en la punta de una pipeta Pasteur, y soltar desde alrededor de 12 pulgadas (30 cm) en un portaobjetos fro. Incline la diapositiva y dej caer el correr por el tobogn ya que se propaga. 12. Seque el portaobjetos rpidamente en un recipiente con agua hirviendo, y examinarlo en el microscopio de contraste de fase. Si las clulas estn repartidas por igual y no tocar, a continuacin, preparar ms diapositivas en la concentracin de la misma clula. Si las clulas se apilan y se superponen, a continuacin, se diluye la suspensin twoto cuatro veces y hacer una preparacin de cada adicional. Si las clulas de la suspensin diluida son satisfactorias, entonces preparar ms diapositivas. Si no, entonces se diluye la suspensin adicional y repetir ste paso. 13. Teir las clulas con Giemsa: (a) Colocar los portaobjetos en una rejilla colocada sobre el fregadero. (b) Cubrir completamente las clulas con unas pocas gotas de Giemsa ordenada, y teir durante 2 min. (c) Baar el frotis con aproximadamente 10 volmenes de agua. (d) Dejar los portaobjetos durante 2 min. (e) Plegar la mancha diluida con agua corriente. Nota. No vierta la mancha de las diapositivas, ya que dejar una mancha de escoria oxidada detrs, siempre desplazar la mancha con agua. Incluso cuando la tincin en un plato, la tincin nunca se vierte fuera pero debe ser desplazado desde el fondo con agua. (f) Acabado mediante la ejecucin de las diapositivas individualmente bajo el agua del grifo para

eliminar cualquier precipitado teido. (g) Verificar la tincin al microscopio. Si es satisfactorio, a continuacin, secar a fondo la diapositiva y montar con un cubreobjetos de # 00 en DPX o Permount. Variaciones Metafase bloque. (1) La vinblastina, 1 10-6 M, se puede utilizar en lugar de colcemid. (2) Duracin del bloque de la metafase se puede aumentar para proporcionar ms metafases para el recuento de cromosomas, o reducirse para reducir la condensacin de los cromosomas y mejorar bandas (vase la Seccin 16.5.1). Coleccin de la mitosis. Algunas clulas, por ejemplo, CHO y HeLa, desmontan fcilmente cuando est en metafase si se agita el matraz ('' tcnica shake-off''), eliminando tripsinizacin. El procedimiento es como sigue: (1) aadir colcemid, (2) eliminar el colcemid cuidadosamente y reemplazarlo con citrato hipotnica / KCl, (3) agitar el matraz para desprender las clulas en metafase ya sea antes o despus de la incubacin en medio hipotnico, y (4) fijar las clulas como se ha descrito previamente. Tratamiento hipotnico. Sustituir 0,075 M KCl solo o HBSS diluido al 50% con agua destilada para que el citrato hipotnico usado en el Protocolo 16,9. La duracin del tratamiento hipotnico se puede variar de 5 min a 30 min para reducir o aumentar la difusin de lisis. Difusin. Hay variaciones tal vez ms en esta etapa que cualquier otra, todas ellas diseadas para mejorar el grado y la planitud de la propagacin. Ellos incluyen (1) dejar caer clulas en un portaobjetos de una altura mayor (sujetar la pipeta, y marque la posicin de la diapositiva, utilizando una prueba con fijador solo), (2) secado de llama (secar el portaobjetos tras cada de las clulas, por calentamiento de la corredera sobre una llama, o se queman en el fijador por encender la cada en la diapositiva ya que se propaga, sin embargo, sta podr hacer posteriormente las bandas ms difcil), (3) hacer que la ultrafros deslizante (slide en enfriar el slido CO2 antes de caer en las clulas a la misma), (4) la suspensin de refrigeracin fixedcell durante la noche antes de dejar caer las clulas en un portaobjetos, (5) las clulas que caen sobre un portaobjetos refrigerados (por ejemplo, el tobogn empinado en alcohol fro y squelo) y a continuacin, colocar la corredera sobre un vaso de precipitados de agua en ebullicin, y (6) la inclinacin del tobogn o soplado de la carga a travs del portaobjetos que se dispersa la gota (vase tambin Protocolos 27,5, 27,9). 16.5.1 bandeo cromosmico Este grupo de tcnicas [vase Rooney y Czepulkowski, 1986] fue concebido para permitir pares de cromosomas individuales a ser identificado cuando hay poca diferencia morfolgica entre ellos [Wang & Fedoroff, 1972, 1973]. Para Bandeo de Giemsa bandeo de, las protenas cromosmicas estn parcialmente digeridas por la tripsina cruda, produciendo un aspecto congregado en la tincin posterior. La tripsinizacin no se requiere para quinacrina. bandeo de El patrn de bandas es caracterstica para cada par de cromosomas (Fig. 16,7). Los mtodos para la banda incluyen los

siguientes: [. Caspersson et al, 1968] (1) Bandeo de Giemsa (. utiliza tripsina y EDTA en lugar de solo tripsina;; ver Fig. 16.7a); (2) Qbanding [teir las clulas en 5% (w / v) de dihidrocloruro de quinacrina. en el 45% de cido actico, enjuague portaobjetos, y montarlo en agua desionizada a pH 4,5 [Lin y Uchida, 1973; Uchida & Lin, 1974]], (3) bandeo C [esta tcnica hace hincapi en las regiones centromricas; las preparaciones fijas se pretrataron durante 15 minutos con 0,2 M de HCl y 2 min con 0,07 M de NaOH y luego se trat durante una noche con SSC (ya sea citrato de sodio 0,03 M, 0,3 M NaCl o citrato de sodio 0,09 M, 0,9 M NaCl ) antes de la tincin con Giemsa [Arrighi y Hsu, 1974]] (vase el Protocolo 27,5). Se han desarrollado tcnicas para discriminar entre los cromosomas humanos y de ratn, principalmente para ayudar al anlisis cariotpico de hbridos humanos y de ratn. Estos mtodos incluyen la tincin con Hoechst 33258, que hace que los centrmeros de ratn emitan fluorescencia ms brillante que centrmeros humanos [Hilwig y Gropp, 1972;. Lin et al, 1974], tincin con Giemsa alcalina (Giemsa-11'''') [Bobrow et al, 1972;. Friend et al., 1976] (vase la figura 16.7c.), y la hibridacin in situ con las pinturas de cromosomas (vase ms abajo y el Protocolo de 27,9). 16.5.2 Anlisis del cromosoma Los siguientes son mtodos por los cuales el complemento cromosmico puede ser analizado: (1) nmero de cromosomas. Cuente el nmero de cromosomas por extensin de entre 50 y 100 spreads. (Los cromosomas no necesitan ser anillados.) Circuito cerrado de televisin o un accesorio de cmara lucida puede ayudar. Usted debe tratar de contar todas las mitosis que se ve y clasificarlos (a) por el nmero de cromosomas o (b), si conteo es imposible, como'' casi diploide incontables'' o'' poliploide incontables.'' Parcela resultados como un histograma (vase la fig. 3,9). (2) cariotipo. Fotografiar digitalmente a unos 10 o 20 diferenciales de buenas bandas de los cromosomas. Usando AdobePhotoshop o un programa equivalente grficos, corte los cromosomas individuales y pegarlas en un nuevo archivo en el que se pueden rotar, recortar, alineadas y ordenadas (Fig. 16,8). El anlisis de imgenes se pueden utilizar para ordenar las imgenes cromosoma automticamente para generar cariotipos (por ejemplo, Leica CW4000). Con la ayuda de bandeo cromosmico, (vase el Protocolo de 27,5) y de la pintura cromosoma (vase el Protocolo 27,9) una imagen total del cariotipo tpico puede prepararse como una imagen estilizada conocida como un ideograma. Ideogramas de desarrollo humano, el ratn y el caballo estn disponibles en www.pathology.washington.edu/research/cytopages/ y rata en ratmap.gen.gu.se / Idiogram.html. Conteo de cromosomas y cariotipo permiten la identificacin de especies de las clulas y, cuando las bandas se utiliza, distinguen las variaciones de lneas celulares y cromosomas marcadores. Sin embargo, las bandas y cariotipo consumen mucho tiempo, y el recuento de cromosomas con una rpida bsqueda en la morfologa cromosmica en bruto puede ser suficiente para confirmar o descartar una sospecha de contaminacin cruzada. 16.5.3 Pintado de cromosoma

Con el advenimiento de sondas marcadas con fluorescencia que se unen a regiones especficas, y genes especficos, incluso, en los cromosomas, se ha hecho posible localizar genes, identificar translocaciones, y determinar la especie de origen de los cromosomas. Esta tcnica emplea en la tecnologa de hibridacin in situ, que tambin puede utilizarse para la localizacin extracromosmica y citoplsmica de secuencias especficas de cidos nucleicos, tales como podran ser utilizados para localizar especficos especies de ARN mensajero (vase Protocolos 27,8 y 27,9).