Manual de prcticas de Bioqumica vegetal Agronoma

Por: MsC. Marcela Uribe Lastra

Corporacin Universitaria Santa Rosa de cabal, UNISARC 2011

PRESENTACIN

La enseanza de las ciencias naturales pretende dar unas bases cientficas que le permitan a los estudiantes enlazar los conceptos tericos con el quehacer diario, para lograr esto se requiere de herramientas metodolgicas que permitan el acercamiento entre la teora y la prctica. El objetivo principal de este manual es describir los protocolos de las prcticas de laboratorio de Bioqumica vegetal, de una manera simple, para los estudiantes de Agronoma, con el fin de incentivarlos hacia el estudio de las ciencia bsicas de un modo prctico y sencillo y que incentive en estos el inters natural que permita enlazar tanto la biologa como la qumica, dos ciencias indispensables en el entendimiento de el funcionamiento de la vida.

Marcela Uribe Lastra Qumico MsC

REGLAS DE COMPORTAMIENTO Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO En esta introduccin se pretende que los estudiantes tomen contacto con el laboratorio, para lo cual se indican las normas generales de comportamiento en el mismo, reglas de seguridad y normas generales para la realizacin de las prcticas. Normas generales de comportamiento 1. El estudiante debe leer y estudiar con anticipacin las experiencias que se realizaran en el laboratorio, para lograr esto es importante la elaboracin del preinforme. 2. Se deber utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello recogido (bata preferentemente de algodn y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes). 3. El estudiante debe tener la gua de la prctica y un cuaderno donde hacer las anotaciones. 4. Durante el desarrollo de las prcticas no se podr salir del laboratorio sin consultarle al profesor. 5. No se debern realizar pruebas diferentes a las indicadas en la gua, deben ceirse a los procedimientos descritos en la misma Reglas de seguridad 1. En el laboratorio no est permitido comer, beber o fumar. 2. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. 3. No se permitir pipetear con la boca 4. Se tomaran especiales precauciones la trabajar con cidos, bases o sustancias peligrosas para evitar accidentes. 5. Si fuera necesario calentar el contenido de un tubo de ensayo a la llama, se har con el tubo algo inclinado y con la boca del mismo dirigida hacia un lugar donde no se encuentre ninguna persona. 6. Los residuos lquidos se vertern en las pilas del fregadero y los slidos se depositaran en los recipientes dispuestos para tal fin. 7. Si se produce algn accidente, avisar rpidamente al profesor.

ELABORACION DE UN INFORME DE LABORATORIO (TIPO ARTCULO CIENTIFICO) 1. Titulo: Debe ser el mismo de la gua de laboratorio. 2. Autores: Nombres y apellidos de los integrantes del grupo de laboratorio, especificar en pie de pgina datos como la carrera que estudia, el semestre que cursa y el correo electrnico. Introduccin: Consiste en una revisin sobre el tema tratado en el laboratorio y debe estar igualmente relacionada con los objetivos de la prctica. Debe ser breve, mximo de media pgina. No pude ser la misma que aparece en la gua. 4. Materiales y mtodos: Consiste en contar en forma organizada el procedimiento que usted realiz durante la prctica, por lo tanto deben estar escritos en pasado. Los materiales (reactivos, instrumentos, muestras, entre otros) se van nombrando a medida que el mtodo se describe, por lo tanto no se deben separar los materiales de los mtodos. Abstngase de hacer comentarios como: la profesora nos entreg la monitora dijo 5. Resultados y discusin: Corresponde al reporte y anlisis de las observaciones que usted hizo durante el laboratorio. Es la parte ms importante del informe. Para ello usted deba apoyarse en la bibliografa tratando de dar una explicacin lgica a lo observado en la prctica. La bibliografa utilizada debe ir reportada en el texto por ejemplo si usted extrae un prrafo del libro de Villee, al final de este usted debe poner entre parntesis el autor y el ao de la siguiente forma: (Villee, 2001). Solo deben ir aqu estos datos, el nombre de libro, la editorial, las pginas y la dems informacin van en la bibliografa. Cuando se trata de dos autores debe ir los dos por ejemplo (Jensen y Salisbury, 1994) cuando son ms de dos autores la referencia se hace as: (Alberts et al., 1996) Se debe analizar cada uno de los resultados. Sus figuras y tablas deben estar enumeradas, por lo que usted debe citarlas a la hora de hacer el anlisis. 6. Conclusiones: Son frases cortas que se refieren a sus resultados y discusin, por lo que deben ser redactadas con sus propias palabras. No se salga del contexto. 7. Bibliografa: Debe hacerse de la siguiente manera: Apellido de cada autor, seguido por las iniciales del nombre. Luego el ttulo del libro del artculo, luego el ao de publicacin, la edicin, la editorial, el lugar de publicacin y las pginas consultadas. Ejemplo: Villee C.A. 2004. Biologa, Octava edicin. NOTA: Es importante que el formato del documento siga las norma ICONTEC y sea en dos columnas

1. RECONOCIMIENTO DE LOS CARBOHIDRATOS

INTRODUCCION Los carbohidratos constituyen la mayor parte de la materia orgnica de la Tierra a causa de sus variadas funciones en todos los seres vivos. En primer lugar, los carbohidratos sirven como almacn o transferencia de energa, son combustibles e intermediarios metablicos, en general, son sustancias de reserva y estructurales. El almidn en las plantas y el glucgeno en los animales son dos polisacridos que rpidamente pueden movilizarse para liberar glucosa, el combustible primordial para generar energa. En segundo lugar, los azcares ribosa y desoxirribosa forman parte de la estructura del ARN y del ADN. En tercer lugar, los polisacridos son los elementos estructurales de las paredes celulares de bacterias y plantas, y del exoesqueleto de los artrpodos y de crustceos. De hecho, la celulosa, el principal componente de las paredes celulares de las plantas, es el compuesto orgnico ms abundante de la biosfera. En cuarto lugar, los carbohidratos estn unidos a muchas protenas, lpidos y metabolitos secundarios. Unidades de azcar se encuentran unidas a las anticianidinas para poder translocarse a travs del floema de los vegetales y proporcionar la coloracin a flores y algunos frutos. Clasificacin de los carbohidratos
Monosacridos Pentosas: xilosa, arabinosa, ribosa Hexosas: aldohexosas: Glucosa, galactosa Cetohexosas: fructosa Oligosacridos Disacridos: lactosa, sacarosa, maltosa Trisacridos: rafinosa Polisacridos Homopolisacridos: almidn, glucgeno, celulosa Heteropolisacridos: hemicelulosa, pectinas

Clasificacin en funcin de la distribucin de los carbohidratos en la naturaleza

En animales Reserva energtica: glucgeno En cidos nucleicos: D-ribosa Azcar de la sangre: D-glucosa Azcar de la leche: lactosa Azcares de los antgenos de los grupos sanguneos: A, B, O En plantas Reserva energtica: almidn, inulina y hemicelulosa Producto de la fotosntesis: D-glucosa Productos de degradacin: gomas y muclagos. Productos varios: glucsidos de metabolitos secundarios En cidos nucleicos: D-ribosa Elicitores procedentes de patgenos o clula husped: oligosacarinas

OBJETIVOS Caracterizar cualitativamente los carbohidratos de acuerdo con su reactividad en presencia de reactivos especficos

MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de ensayo Pinzas para tubo de ensayo Gradillas Vasos de precipitados Mechero, trpode y malla Pipetas graduadas Reactivo de Fehling Reactivo de Tollens Reactivo de Benedict Lugol Solucin de glucosa 0,1 M Solucin de fructosa 0,1 M Solucin de sacarosa 0,1 M Solucin de almidn 0,1 M

PROCEDIMIENTO Pruebas para azcares reductores: Prueba de Fehling Mezcle en un beaker 4 ml de reactivo de Fehling A con 4 ml de reactivo de Fehling B, agite, en 4 tubos de ensayo ponga 1 ml de las soluciones de carbohidratos a evaluar y aada a cada uno 2 ml de la mezcla de Fehling A y B, caliente los tubos de ensayo en bao mara durante cinco minutos y observe. Prueba de Tollens Ponga en diferentes tubos de ensayo 2 ml de las soluciones de los carbohidratos a evaluar, aada 1 ml de reactivo de Tollens, agite y caliente en bao mara durante 10 minutos, observe cambios de color. Prueba de Benedict Ponga en los tubos de ensayo 2 ml del reactivo de Benedict, luego agregue las soluciones de los carbohidratos a evaluar, agite y ponga en bao mara durante 5 minutos y observe cambios de color. Prueba para polisacridos Prueba de yodo Ponga en diferentes tubos de ensayo 2 ml de las soluciones de los carbohidratos a evaluar, aada a cada uno 5 gotas de solucin de lugol, agite y observe cambios de color.

CUESTIONARIO 1. Qu son los azcares reductores y no reductores mencione 3 de cada uno? 2. Defina y dibuje las estructuras qumicas de la glucosa, la fructosa, la sacarosa y la celulosa 3. Investigue los componentes de los reactivos a utilizar en la prctica: Fehling A , Fehling B, Tollens y Benedict 4. Investigue los mecanismos de reaccin de las pruebas de Fehling, Tollens, benedict y la prueba de yodo. 5. Qu aplicaciones prcticas tienen estas pruebas? 6. Cul es la importancia energtica del almidon? 7. Elabore una tabla resumen donde sern registrados los resultados obtenidos en cada una de las pruebas para su posterior anlisis.

BIBLIOGRAFIA Plummer, D. 1985. Bioqumica Prctica. 5 Edicin. Editorial McGraw Hill Latinoamericana S.A.. Bogot. 225. VARGAS, W.1985 Fundamento de Ciencia Alimentaria. 2 edicin. Universidad Nacional de Colombia. VERA J.A. 1990. Gua para el laboratorio de Qumica de Alimentos. Unidad universitaria del Sur de Bogot.

2. PROPIEDADES DE LOS LPIDOS INTRODUCCIN Los lpidos constituyen un grupo qumicamente diverso de compuestos cuya caracterstica comn y definitoria es su insolubilidad en agua. Las funciones biolgicas de los lpidos son igualmente diversas. En muchos organismos las grasas y los aceites son las formas principales de almacenamiento energtico, mientras que los fosfolpidos y los esteroles constituyen la masa de las membranas biolgicas. Otros lpidos, an estando presentes en cantidades relativamente pequeas, juegan papeles cruciales como agentes emulsionantes, mensajeros intracelulares y transportadores. Las grasas reaccionan en caliente con el hidrxido sdico o potsico descomponindose en los dos elementos que la forman: glicerina y los cidos grasos. Estos se combinan con los iones sodio o potasio del hidrxido para dar jabones, que son en definitiva las sales sdicas o potsicas de los cidos grasos. A este proceso se le conoce como saponificacin y puede representarse mediante la siguiente reaccin:

A parte de la saponificacin, otra caracterstica de las grasas es que son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequesimas gotitas formando una "emulsin" de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo, por reagrupacin de las gotitas de grasa en una capa que por su menor densidad se sita sobre la de agua. Por el contrario, las grasas son solubles en los llamados disolventes orgnicos como el ter, benceno, xilol, cloroformo, etc. Las molculas de agua se unen entre s gracias a las cargas positivas y negativas de oxgenos e hidrgenos respectivamente que se atraen formando grupos OH. En los lpidos no existen estos grupos, pues estn formados bsicamente por C y H, y por esto mismo no son miscibles en agua. Por otro lado, es pertinente definir una molcula tensoactiva. Esta se caracteriza por tener una cabeza hidroflica y una cola hidrofbica. En el caso de los jabones y detergentes, las

molculas tensoactivas son sus iones carboxilados RCCO. Por otro lado, las fuerzas de tensin superficial son aquellas que tienden a disminuir la superficie libre del lquido que se forma entre el agua y el aire. Durante el lavado de grasas, los jabones y detergentes disminuyen esta tensin superficial rodeando la grasa, orientando su extremo hidroflico hacia el agua. OBJETIVOS Determinar la solubilidad de los lpidos en diferentes en solventes polares y apolares. Analizar evaluar las diferentes variables correlacionadas con el proceso de saponificacin.

MATERIALES Y REACTIVOS Acetona Cloroformo Etanol ter de petrleo Hidrxido de sodio al 30% Metanol NaCl Vasos de precipitado de 250 ml Varilla de agitacin Plancha de calentamiento Pipetas graduadas de 5 y 10 ml Tubos de ensayo Gradilla Aceite vegetal

PROCEDIMIENTO Prueba de solubilidad de lpidos Enumere 5 tubos de ensayo y adicineles lo siguiente: Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo 1: 2: 3: 4: 5: 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml de de de de de agua destilada acetona etanol cloroformo ter

A continuacin agrguele a cada uno de ellos una gota de aceite vegetal agite vigorosamente y anote sus observaciones. Reaccin de saponificacin: Transfiera 12ml de aceite de origen vegetal (girasol, oliva, soya,) a un beaker de 150 ml y adicione 15 ml de una solucin de NaOH al 30% y 5 ml de metanol. Agite la mezcla y caliente con llama moderada. Contine el calentamiento de la mezcla, hasta cuando esta ebulla. Mantenga el volumen de la solucin constante mediante la adicin, cuando sea necesario, de una mezcla de agua metanol (1:1).

La muestra NO debe ebullir hasta la sequedad. Agite continuamente para evitar que el material se adhiera a las paredes del recipiente. Si el material se adhiere a las paredes del beaker, debe devolverse a la solucin con ayuda del agitador. Mientras la saponificacin continua, prepare una solucin salina concentrada (100gr de NaCl en 300 ml de agua, filtrar el exceso de NaCl). Una vez la saponificacin se ha completado (despus de 1 hora aproximadamente) transfiera la mezcla caliente, con agitacin, al beaker que contiene la solucin de NaCl concentrada. Agite la mezcla vigorosamente por unos minutos y deje reposar toda la noche. CUESTIONARIO 1. Disee una tabla para registrar los datos de la prueba de solubilidad, teniendo en cuenta que el aceite puede ser soluble, parcialmente soluble insoluble en los diferentes solventes probados. 2. Mediante un diagrama explique de que depende la solubilidad de los lpidos 3. Qu es el ndice de saponificacin, qu importancia tiene y como se determina? 4. Porque la temperatura de reaccin de la saponificacin debe ser baja? 5. Qu es el efecto de salado? Por qu se separa el jabn mediante ste proceso? 6. A que se debe la accin limpiadora de los jabones y detergentes BIBLIOGRAFA Hart H., Hart D.J, Craine L.E. Qumica Orgnica. Novena edicin. Editorial Mc Graw Hill. Mxico. 1995. Kent V. Jabones y detergentes Revista de divulgacin de I.E.S. N17, 2002, Madrid. Vargas, W.1985. Fundamento de Ciencia Alimentaria. 2 edicin. Universidad Nacional de Colombia. Bogot White A. Principios de Bioqumica. Segunda edicin. Editorial Mac Graw Hill. 1983. Espaa.

3. ACTIVIDAD ENZIMATICA

INTRODUCCION Las enzimas son catalizadores biolgicos que aceleran las reacciones metablicas de los seres vivos. Resulta, por lo menos en lo que concierne su parte proteica, de una sntesis proteica a nivel celular. Existe al menos una enzima diferente por reaccin catalizada, lo que representa miles de enzimas en un mismo organismo. Las hay extracelulares e intracelulares. En cuanto a la catlisis enzimtica, esta se da por la formacin de un sitio activo. Este sitio es una regin privilegiada que interacta con substratos que a su vez se transforman en productos. El sitio activo est constituido por aminocidos de 4 tipos: de contacto, auxiliares, colaboradores y no colaboradores. Son los grupos funcionales radicales de los aminocidos los que intervienen directamente en la catlisis. Su participacin se debe a su capacidad para transferir electrones (carcter nucleoflico) y protones (carcter cidobsico). La estructura terciaria es primordial para la catlisis. Permite la formacin del sitio activo ya que aproxima los aminocidos que lo constituyen. Esta conformacin juega a la vez un rol importante en la proteccin del sitio activo, y se adapta con exactitud al substrato. La mayora de las enzimas son de naturaleza proteica y estn sujetas a el fenmeno de la desnaturalizacin, si la forma de la enzima es alterada por algn factor externo (por ejemplo, aplicndole calor, cidos o lcalis), no es capaz de cumplir su funcin celular. La reaccin enzimtica in vivo o in Vitro puede inhibirse utilizando inhibidores que pueden ser o no ser anlogos estructurales de los verdaderos substratos de la enzima. De acuerdo a la complejidad de los complejos que forman en presencia de la enzima y/o del substrato, y de la modificacin cintica que generen, los inhibidores son calificados como competitivos, incompetitivos, no competitivos o mixtos. En presencia de una enzima (E) y su sustrato (S), un inhibidor (I) puede formar complejos binarios complejos EI o ternarios ESI. Solo el complejo ES es productivo. Cuando el inhibidor se fija a la enzima libre formando el complejo EI se habla de inhibicin competitiva. Cuando se fija sobre el complejo ES es incompetitivo. Cuando se fija con afinidades diferentes a E y a ES es mixto y cuando lo hace con la misma afinidad por ambos es no competitivo. OBJETIVOS Conocer la actividad de la catalasa en tejidos vegetales y animales Evidenciar la hidrlisis del almidn por accin de la amilasa presente en la saliva Evidenciar la hidrlisis de la sacarosa por accin de la glucosidasa de las levaduras Demostrar la presencia y definir el modo de accin de otros sistemas enzimticos tales como polifenoloxidasas.

MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de ensayo Vasos de precipitado de 250 ml Gradilla Plancha de calentamiento Pinzas para tubo de ensayo Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml Caja de petri Balanza Solucin de almidn Reactivos de Fehling A y B Lugol Metabisulfito de sodio 1% Zanahoria Hgado Manzana Rbano Levadura Acido clorhdrico

PROCEDIMIENTO Presencia de catalasa en tejidos animales y vegetales Corte dos trozos de zanahoria y dos trozos de hgado introduzca cada muestra en un tubo de ensayo, ponga 3 ml de agua destilada y ponga a hervir un tubo con zanahoria y otro tubo con hgado en un bao mara durante 15 minutos, pasado este tiempo deje enfriar el tubo, retire el agua y adicione 10 gotas de perxido de hidrgeno (H2O2) a cada tubo, observe y registre lo observado en la siguiente tabla: Tabla 1.Accin de la catalasa Hgado hervido Hgado sin hervir Zanahoria hervida Zanahoria sin hervir Reaccin con el H2O2

Hidrlisis del almidn por accin de la amilasa Marque 6 tubos de ensayo y realice las siguientes preparaciones: Tubos 1 y 2: 2 ml de solucin de almidn Tubos 3 y 4: 2 ml se solucin de almidn y 1 ml de saliva Tubos 5 y 6: 2 ml de solucin de almidn y 1,5 ml de HCl

Deje los tubos en reposo durante 30 minutos y adicione a los tubos 1,3 y 5 reactivo de Fehling A y B previamente mezclados y a los tubos 2,4 y 6 lugol. Reporte las observaciones en la siguiente tabla: Tabla 2. Hidrlisis del almidn Lugol Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Felhing

Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Hidrlisis de la sacarosa por la glucosidasa de las levaduras Disuelva 2 gr de levadura en 20 ml de agua destilada, deje reposar esta mezcla durante 15 minutos, filtre la mezcla y el liquido resultante es el extracto de lavadura. Prepare los siguientes tubos: Tubo A: 1 gr de sacarosa ms 5 ml de agua y agitar Tubo B: 1 r de sacarosa mas 5 ml de agua mas 3 ml de extracto de levadura y agitar Adicione a cada tubo una reaccin de Fehling y anote los resultados. Accin de las polifenol-oxidasas Corte 12 tiras delgadas de manzana y rbano de aproximadamente 5cm, raspando los bordes para destruir clulas del tejido. A continuacin, hierva en un bao mara la mitad de los trozos de manzana y rbano. Sobre una caja de Petri ponga 2 trozos de manzana y rbano sin hervir, y sobre otra ponga 2 trozos de cada uno pero hervidos. Enseguida, sumerja 2 trozos de manzana y rbano sin hervir en un tubo de ensayo con solucin de metabisulfito sdico. Haga lo mismo con 2 trozos de manzana y rbano hervidos. CUESTIONARIO 1. Investigue las enzimas encontradas normalmente en los vegetales y en los tejidos animales 2. Qu tiene que ver la desnaturalizacin de las protenas con esta prctica? En que pruebas se puede evidenciar la desnaturalizacin de las enzimas 3. Mediante un diagrama explique cmo acta la glucosidasa de las levaduras sobre la sacarosa 4. Investigue que es el pardeamiento enzimtico 5. Qumicamente qu es el metabisulfito de sodio y que efecto tiene sobre las polifenol oxidasas? Qu aplicaciones industriales tiene este compuesto? BIBLIOGRAFIA Fersht, A. 1998. Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. W. H. Freeman. ISBN 0-7167-3268-8 Athel C. 2004.Fundamentals of Enzyme Kinetics. (3rd edition), Portland Press (), ISBN 1-85578158-1.

4. FOTOSINTESIS INTRODUCCION La fotosntesis es un proceso metablico que realizan las plantas, las cianobacterias y algunos protistas. En los organismos eucariotes se realiza en los cloroplastos. La reaccin general de la fotosntesis es la siguiente: Energa solar + 6 H2O + 6 CO2 C6H12O6 + 6 O2 + Energa

La fotosntesis no es un proceso simple y consta de mltiples etapas. Las primeras etapas se conocen como reacciones lumnicas y se encargan de convertir la energa solar en energa qumica produciendo oxgeno como producto de desecho, se dan en las membranas de los tilacoides. Las segundas reacciones se conocen como Ciclo de Calvin (o reacciones de oscuridad) y producen molculas de azcar utilizando el CO2 y los productos de alto contenido energtico de las reacciones luminosas, estas se llevan a cabo en el estroma. Con esta prctica se pretende un acercamiento al complejo e importante proceso de la fotosntesis, para ello se realizaran diferentes procedimientos, empezando por la identificacin de los cloroplastos en clulas vegetales vivas mediante el uso del microscopio, seguida de una identificacin de los pigmentos fotosintticos mediante una tcnica de separacin llamada cromatografa y terminando con la medicin de la tasa fotosinttica mediante un ensayo de discos flotantes cuyo principio se explica a continuacin. Los discos de hoja normalmente flotan. Cuando los espacios de aire se infiltran con una solucin, la densidad de la hoja se incrementa y los discos se precipitan. La solucin de infiltracin incluye una pequea cantidad de bicarbonato de sodio. Los iones del bicarbonato sirven como fuente de carbono para la fotosntesis (Figura 1). Durante el proceso de la fotosntesis se libera oxgeno del interior de la hoja, cambiando as, que el disco flote. La respiracin celular por su parte consume oxgeno y se da al mismo tiempo que la fotosntesis, la velocidad que se demoran los discos precipitados en flotar es una medida indirecta de la tasa neta de fotosntesis.

Figura 1. Esquema general del experimento de discos flotantes

OBJETIVOS Identificar los cloroplastos en una clula vegetal Comprobar la presencia de clorofila mediante cromatografa en papel Reconocer y comprobar el fenmeno de la fotosntesis Medir la tasa fotosinttica

MATERIALES Y REACTIVOS Microscopio Porta objetos y cubre objetos Vasos de precipitados de 250 ml Mortero con pistilo Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml Gotero Papel filtro Plancha de calentamiento Tubo capilar Regla Elodea Solucin de bicarbonato de sodio 2% Etanol 95% Acetona Cloroformo Jeringa plstica nueva desechable de 10 ml (sin aguja) Jabn lquido Hojas de espinaca frescas Perforadora de un hoyo 3 vasos de precipitado de 250 ml Cronmetro Fuente de luz

PROCEDIMIENTO Identificacin de cloroplastos Corte una hoja de elodea pngala en el portaobjetos y agregue una gota de agua, luego cbrala con el cubre objetos y observe en el microscopio con los objetivos de 10 y 40X, dibuje lo observado, exponga la hoja a una fuente de luz artificial o natural y observe la ciclosis de los cloroplastos al interior de la clula. Identificacin de clorofila por cromatografa 1. En un vaso de precipitado de 250ml ponga etanol hasta alcanzar un centmetro de profundidad y cbralo con un vidrio reloj para crear una atmosfera alcohlica en el interior. 2. Corte hojas de espinaca y pngalas en el mortero adicione 5 ml de acetona y macere hasta tener una mezcla homognea. 3. Filtre la mezcla anterior usando una gasa o muselina para obtener el lquido. 4. Recorte un pedazo de papel filtro de 2 cm de ancho por 10 cm de largo, marque con un lpiz dos lneas paralelas a cada borde 5. Con un tubo capilar ponga la muestra en una de las lneas marcadas (Figura 2) 6. Introduzca el papel filtro con la muestra hacia abajo dentro del vaso de precipitado con alcohol, evitando tocar las paredes del vaso y procurando que la muestra no entre en contacto con el solvente. 7. Haga que el papel quede en forma vertical 8. Deje correr por absorcin el solvente sobre el papel filtro hasta que alcance la lnea superior 9. Retire el papel y deje secar a temperatura ambiente 10. Calcule el Rf para cada pigmento separado

Papel filtro Lneas de lpiz

Muestra

Solvente Figura 2. Montaje para cromatografa en papel

Ensayo del disco flotante para comprobar la fotosntesis 1. Disponga en un vaso de precipitado 20 ml de una solucin de bicarbonato de sodio al 0.2 %. En otro vaso de precipitado disponga 20 ml de agua destilada, este vaso ser utilizado como CONTROL del experimento. 2. Adicione 5 ml de jabn lquido al vaso con la solucin de bicarbonato. El jabn lquido humedecer la superficie hidrofbica de la hoja de espinaca, permitiendo que las soluciones penetren el interior de los tejidos. 3. Corte con un sacabocados 10 o ms discos uniformes de hoja de espinaca fresca para cada ensayo (10 para el vaso con bicarbonato) 10 o ms para el Vaso CONTROL (Evite discos con venas centrales) (Figura 3A). 4. Seleccione los discos de hojas remueva el pistn de la jeringa y coloque los discos de hoja dentro de la jeringa, deber incorporar nuevamente el pistn cuidando de no daar los discos de hoja. Empuje suavemente el pistn hasta dejar solo un pequeo volumen de aire para los discos de hoja (< 10%) entre el extremo de la jeringa y la barrera de goma del pistn (Figura 3B). 5. Succione un pequeo volumen de bicarbonato de sodio y resuspenda all los discos de hoja (Figura 3C). 6. Ponga su dedo ndice en la abertura de la jeringa y hale el pistn, de esta forma crear vaco el cual deber conservar por 10 segundos. As pues, el bicarbonato de sodio se infiltrar en los espacios de aire de la hoja. Repita este procedimiento unas 2 3 veces. (Figura 3D) 7. Coloque los discos y la solucin dentro de un vaso precipitado, y adicione 10 ml en el fondo del vaso de una solucin de bicarbonato de sodio. 8. Para el tratamiento control infiltre los discos solo con agua y jabn lquido. NO adicione bicarbonato. 9. Coloque ambos tratamientos, previamente marcados, con una fuente de luz y empiece a contabilizar el tiempo. Despus de cada minuto cuente el nmero de discos que flotan. Contine el conteo hasta que todos los discos floten. 10. Diligencie la tabla 1

A B

D E

Figura 3. Procedimiento discos flotantes de hojas Tabla 1. Coleccin de datos y anlisis Minutos Discos que han flotado Observaciones

Con estos datos es muy importante identificar, el punto donde el 50% de los discos flotan, este trmino se denomina ET50 (Steucek, et. al., 1985) realice una grfica, donde en el eje de X disponga tiempo en minutos y en el eje de la Y nmero de discos que flotan (Ver Figura 4).

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Dibuje un cloroplasto con sus partes Cul es el principio de la cromatografa? Qu es el Rf y como se calcula? Qu tipo de pigmentos fotosintticos se encuentran en los tejidos vegetales y que colores los representan en la cromatografa en papel? Qu relacin existe entre el ET50 y el tiempo? Qu factores podran influir en la tasa fotosinttica? Explique. Por qu es importante establecer un experimento control? Por qu es importante estudiar la tasa fotosinttica en vegetales?

BIBLIOGRAFIA Steucek, Guy L. Robert J. Hill and Class/Summer 1982. 1985. Photosynthesis I: An Assay Utilizing Leaf Disks. The American Biology Teacher, 47(2):96-99. Rukes, Kari L. and Timothy J.Mulkey. 1994. Measurement on the Effects of Light Quality and Other Factors on the Rate of Photosynthesis. Bioscene, 20(3): 7-11. http://www.acube.org/volume_20/v20-3p7-11.pdf. Greenler, John. 1990. Exploring Photosynthesis with Fast Plants. WisconsinFast Plant Notes, 4(1): 4-5. http://www.fastplants.org/pdf/activities/exploring_photosynthesis.pdf Richard, David S. Measure of Photosynthetic Rate http://www.susqu.edu/FacStaff/r/richard/photosynthlab.html In Spinach Leaf Disks

5. RESPIRACION CELULAR INTRODUCCIN La respiracin celular se asocia siempre a la toma de O2 y la degradacin de glucosa para formar CO2, H2O y energa, pero en realidad este proceso solo corresponde al tipo de respiracin aerobia que bien no poseen algunas bacterias y levaduras. Podramos dividir la respiracin aerobia en tres pasos principales: 1. La gluclisis, que degrada la glucosa en cido pirvico y que permite formar ATP. 2. El ciclo de Krebs, del cual se desprende CO2 y unas molculas altamente energticas como son el ATP, el NADH y el FADH2. 3. La cadena transportadora de electrones, en la cual el O2 se comporta como aceptor final y se asiste a la formacin de H2O y de ATP. Este tipo de respiracin es un proceso altamente energtico y mucho ms complejo que la respiracin anaerobia. Dentro de la diversa gama de seres vivos existentes, algunos tienen respiracin aerobia, otros son estrictamente anaerobios y otros tienen la facultad de realizar ambos tipos de respiracin, razn por la cual reciben el nombre de facultativos. Estos ltimos, ante la ausencia de oxgeno pasan de tener respiracin aerobia y anaerobia mediante el proceso de fermentacin. La fermentacin puede ser de dos tipos: lctica o alcohlica. En la primera el cido pirvico es transformado en cido lctico, mientras que en la segunda es transformado en etanol. Cabe anotar tambin que durante la fermentacin alcohlica se forma CO2 como producto de desecho. El etanol resultante de una fermentacin alcohlica se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, etc, Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar tambin etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible. Para separar el etanol del resto de la mezcla de fermentacin se emplea la destilacin, la cual es el proceso de separar, mediante evaporizacin y condensacin, los diferentes componentes lquidos slidos disueltos en lquidos o gases licuados de una mezcla, aprovechando los diferentes puntos de ebullicin de cada una de las sustancias ya que el punto de ebullicin es una propiedad intensiva de cada sustancia, es decir, no vara en funcin de la masa o el volumen. OBJETIVOS Verificar el desarrollo de la fermentacin en vino Aprender el manejo de equipo y las tcnicas de laboratorio empleadas para purificar compuestos orgnicos mediante la destilacin simple. Entender los aspectos tericos acerca de la destilacin simple y la obtencin de alcohol etlico por fermentacin.

MATERIALES Zumo de fruta 2 botellas de vidrio con tapa Estufa Erlenmeyer de 100 mL Frasco lavador Perlas de ebullicin Baln de destilacin Condensador recto Termmetro Plancha de calentamiento Balanza Soporte universal Pinza para condensador y baln de destilacin Pinza de madera Probeta de 250 mL Picnmetro

PROCEDIMIENTO Fabricacin del vino Extraiga el zumo de aproximadamente un kilo de uvas, puede ser en licuadora o manualmente, retire las cascaras y las semillas, filtrando con un colador, divida la cantidad de zumo obtenido en dos, una mitad hirvala durante 5 minutos y la otra djela cruda, embselas en dos recipientes de vidrio bien marcarlos y cirrelos bien. Djelos reposar una semana. Pasado este periodo completar la siguiente tabla: Zumo hervido Presencia de burbujas Grado de turbidez Olor Presencia de bacterias Destilacin simple: Transcurrido el t iempo recomendado para la fermentacin, decante cuidadosament e el lquido a un baln de destilacin de 1 L; de manera que no pase el residuo de levadura. Deje resbalar al fondo del baln 2 3 esferas pequeas de vidrio o trozos d e porcelana para evitar sobrecalentamientos y as regular la ebullicin. Monte el conjunto ilustrado en la figura No. 1, tomando las siguientes precauciones: El conjunto no debe quedar tensionado para evitar rupturas, la parte superior del bulbo del termmetro debe quedar a la altura del desprendimiento del tubo lateral del baln de destilacin (ver parte superior derecha de la figura 1); el agua debe circular en el refrigerante de manera que entre por la parte inferior y salga por la superior. Zumo no hervido

A continuacin caliente el baln de destilacin hasta que llegue al punto de ebullicin del agua (aprox. 94 C). Anote la temperatura a la cual ocurri la destilacin. Recoja una fraccin de destilado, con ayuda de una probeta y determine su densidad con ayuda de un picnmetro. Consulte los contenidos alcohlicos en peso y volumen segn la densidad en el AOAC Oficial Methods of Anlisis.

Figura 1. Montaje de destilacin simple Una vez realizado el montaje y cuando se hayan destilado aproximadamente 30 ml de etanol proceda a determinar el porcentaje de etanol de la siguiente manera: Primero halle la densidad del alcohol destilado usando un picnmetro Luego Hallar el % de etanol, segn la densidad en la tabla del Densidad del alcohol = peso del alcohol Volumen de alcohol

CUESTIONARIO 1. En cul de los dos zumos se presentara fermentacin y por qu?

2. Por qu razn los recipientes del experimento deben permanecer cerrados todo el tiempo? 3. Qu tipo de fermentacin se espera que ocurra en esta prctica? Sustente su respuesta 4. Escriba la reaccin de fermentacin de glucosa por levaduras 5. Cul es el propsito de destilar el producto de la fermentacin? 6. Qu tipo de levadura es utilizada para fabricar cerveza? BIBLIOGRAFIA DE LA TORRE, G., MORENO, P. 1.995.Qumica Orgnica. Vol 2. Unisur. Santa F de Bogot. GMEZ, M.J.1985. Qumica Orgnica. 1 Edicin. Universidad Nacional de Colombia. Bogot.