REVISTA BIOLOGA

Vol. 14, No. 1, 2000

TOXINAS ANIMALES: ACCIONES FACILITADORAS DE LA TRANSMISIN COLINRGICA

Olga Castaeda Pasarn
(*)

INTRODUCCIN GENERAL A lo largo de la evolucin diferentes grupos animales desarrollaron variadas estrategias tanto para asegurar su alimentacin como para defenderse de sus enemigos. Como parte de ellas surgieron los venenos: poderosas mezclas de sustancias qumicas de diversa naturaleza capaces de programar, en la presa o el predador, una cadena de eventos que trae como consecuencia la afectacin de procesos vitales tales como la trasmisin neuromuscular, la circulacin sangunea, la permeabilidad de las membranas, entre otros efectos, como forma de garantizar el dominio de la vctima. Las herramientas moleculares capaces de lograr dichas acciones y en el orden correcto, son las toxinas. La mayora son protenas y sustancias de bajo peso molecular, peptdicas o no, que tienen como sitio blanco de accin general las enzimas, los receptores, los canales inicos y las membranas. Los animales productores de veneno representan una amplia diversidad de grupos, entre ellos: peces, anfibios, reptiles, artrpodos, anlidos y moluscos. An los animales ms primitivos como los equinodermos, los celenterados, las gorgonias, los dinoflagelados e incluso los microorganismos, han desarrollado la capacidad de producir venenos. Algunos animales estn dotados de glndulas especializadas y utilizan estructuras y mecanismos en ocasiones sofisticados para la descarga del veneno, por ejemplo, las serpientes, los escorpiones y algunos insectos. Otros, producen el veneno en clulas urticantes especializadas como es el caso de los celenterados. Quizs por el hecho de que en mayor o menor medida el sistema nervioso est involucradoo en el control de todos los procesos fisiolgicos, es que la mayora de los venenos contienen neurotoxinas que actan sobre los diferentes mecanismos de la actividad nerviosa. A pesar del considerable nmero de toxinas caracterizadas, la naturaleza y en particular el mar tienen mucho que ofrecer. Los avances en la Toxinologa estn estrechamente relacionados con el desarrollo de las Neurociencias, donde la bsqueda de marcadores y reactivos especficos que permitan la caracterizacin de estructuras y funciones, constituye una estrategia de primera lnea. Otros aspectos tales como el origen de las sustancias, su funcin en el organismo que las produce y el papel que desempean en el ecosistema, aunque menos representativo del estado actual de las investigaciones, pueden constituir un tema muy importante si se tiene en cuenta su repercusin en el medio y su influencia en los recursos naturales. Las intoxicaciones con el alimento de orgen marino y el ganado afectado por toxinas de plantas y algas son algunos de los efectos devastadores de las toxinas en la naturaleza.

(*)

Departamento de Biologa Animal y Humana, Facultad de Biologa. Universidad de La Habana.

ACCIONES FACILITADORAS COLINRGICO

DE LAS

TOXINAS SOBRE EL SISTEMA DE TRANSMISIN

Las toxinas que actan sobre el sistema de transmisin colinrgico pueden ser antagonistas o sinergistas de la acetilcolina. Se consideran antagonistas, por ejemplo, aquellas que bloquean los receptores postsinpticos nicotnicos (curaremimticas), como las alfa-neurotoxinas de las serpientes, as como las toxinas que inhiben la liberacin de acetilcolina, por ejemplo, la toxina botulnica y las toxinas con actividad de fosfolipasa A2 de las serpientes. (Strong, 1987; Harris, 1991) Las toxinas sinergistas tienen, por el contrario, acciones facilitadoras mediadas por diferentes mecanismos que tienden a incrementar la concentracin de la acetilcolina en la sinapsis. Las acciones facilitadoras pueden lograrse por tres mecanismos bsicos: a) acciones sobre canales inicos, que prolongan la duracin del potencial de accin y conducen a un incremento en la liberacin de acetilcolina b) acciones que estimulan el mecanismo de exocitosis del neurotransmisor c) inhibicin de la hidrlisis de la acetilcolina. A continuacin analizaremos el primero y el ltimo de estos mecanismos. a) Acciones sobre los Canales Inicos El proceso de sealizacin de la clula nerviosa implica la accin coordinada de canales inicos selectivos en la membrana celular. Estos canales son protenas de membrana que funcionan como poros para iones particulares. En respuesta a un estmulo adecuado, por lo general un cambio en la diferencia de voltaje a travs de la membrana, estas protenas sufren un cambio conformacional que conduce a la apertura o cierre del poro. Existe, por tanto, una alteracin transitoria de la permeabilidad de la membrana a iones particulares. Los iones fluyen a travs de estos canales a su gradiente electroqumico y la corriente resultante dispara una variedad de respuestas fisiolgicas. En el proceso de sealizacin exitatoria en las neuronas, los iones implicados son Na+, K+ y Ca+2. Canales especficos para estos iones generalmente se abren o se cierran, en respuesta a las variaciones del potencial de membrana, y por tanto se refieren como canales dependientes del voltaje. Estos canales no estn uniformemente distribuidos en las neuronas. Acciones sobre los canales de Na+ Los canales de Na+ son responsables de la fase ascendente del potencial de accin. Estos canales se encuentran usualmente cerrados (no conducen) a valores de potencial de membrana en reposo y requieren un estmulo despolarizante para pasar al estado abierto (conducen). Una vez que han sido abiertos (activados) presentan el fenmeno conocido como inactivacin, lo cual significa que pasan a un estado no conductor aunque est presente el estmulo activador. Resulta interesante destacar que el primer hallazgo de neurotoxinas de accin especfica sobre canales inicos fue demostrar que la tetrodotoxina (TTX), un alcaloide obtenido a partir de un pez japons de la Familia Tetraodontidae (Tahara, 1909), era capaz de bloquear la permeabilidad al Na+ en axones gigantes de langosta. (Narahashi, 1974) De modo general, existen tres acciones bsicas de las toxinas sobre los canales de Na+: (a) toxinas que bloquean el canal, (b) toxinas que afectan la activacin del canal y (c) toxinas que afectan la activacin del canal. Nos limitaremos a analizar solamente las acciones facilitadoras de las toxinas sobre estos canales. En presencia de algunas toxinas, los canales de Na+ se abren ms rpidamente; en trminos electrofisiolgicos esto significa que la curva de dependencia del voltaje sobre la activacin, se desplaza 2

hacia valores de potencial de membrana ms negativos. Entre estas toxinas se destaca un grupo de alcaloides tanto de origen vegetal: veratridina, aconitina, germina (Detwiler, 1972; Caterall, 1980; Benn y Jacyno, 1983) como procedentes de la piel de los anfibios, la batracotoxina. (Daly et al., 1978) Todas provocan importantes efectos estimulantes tanto en el msculo esqueltico como en el cardaco. Otras toxinas de actividad similar proceden de dinoflagelados y se obtienen a travs de la cadena alimentaria, por ejemplo, la brevetoxina (Baden, 1983) y la ciguatoxina (Yasumoto, 1977). Estan han mostrado numerosas acciones excitatorias: despolarizaciones irreversibles, disparos repetitivos de potenciales de accin, incremento en la liberacin cuantal de acetilcolina, entre otros (Bidart et al., 1984; Benoit et al., 1986; Molg, 1990; Meunier et al., 1995). Tambin pertenecen a este grupo las denominadas -toxinas de escorpiones, que proceden de venenos de diferentes especies de Amrica. Son polipptidos o pequeas protenas que tienen efecto excitatorio sobre nervios y msculos, como consecuencia de las corrientes de Na+ provocadas por la apertura de canales a valores de potencial de membrana en que predomina el estado cerrado de stos. (Katz y Edwards, 1972; Watt y Simard, 1984; Jover et al., 1980; Arantes et al., 1992) Finalmente, existe un grupo muy importante de toxinas de naturaleza proteica cuyo efecto fundamental es retardar el proceso de inactivacin de los canales de Na+, por lo cual el canal permanece abierto durante ms tiempo. Esto provoca un incremento notable en la excitabilidad de nervios y msculos, como consecuencia del aumento en la liberacin de acetilcolina desde las terminaciones nerviosas. En este grupo se incluyen las -toxinas de escorpiones presentes en los venenos de especies procedentes de Africa y Amrica del Norte, tales como: Androctonus australis Hctor y Tityus serulatus, entre otras, (Jover et al., 1980; Wang y Strichartz, 1983; Kirsch et al.,, 1989), as como las toxinas de anmonas que referiremos a continuacin. Los trabajos pioneros de Bress et al., en 1975 permitieron aislar una serie de polipptidos anlogos a partir de la anmona Anemonia sulcata (ATXI, II, III y IV) de los cuales, el ms abundante y activo en membranas de vertebrados es ATXII. Toxinas con propiedades similares han sido aisladas a partir de otras especies: Anthopleura xantogrammica, Radianthus paumotensis, Condylactis gigantea, Heteractis macrodactylus, Phyllactis flosculfera, Stichodactyla giganteum y Stichodactyla helianthus. Todas provocan actividad espontnea y repetitiva en axones y en msculo esqueltico o cardaco. Las propiedades qumicas y las relaciones estructura-actividad de las toxinas de anmonas que actan a nivel de los canales de sodio han sido revisadas ampliamente por Norton en 1991. Recientemente se ha purificado y secuenciado una nueva toxina de 54 residuos de aminocidos a partir de Actinia equina y se le ha denominado Ae I(Lin et al., 1996), esta toxina presenta gran homologa estructural con otras bloqueadoras de canales de Na+ previamente descritas. Principales tipos de canales de K+ Antes de tratar los efectos de las toxinas sobre los canales de K , se hace necesario destacar los principales tipos de estos canales as como sus caractersticas ms generales. En contraste con la escasa diversidad de canales de Na+, existen muchos tipos de canales de K+. A pesar de que los canales de K+, Na+ y Ca2+ estn presentes tanto en clulas excitables como no excitables, los canales de K+ son los ms ubcuos y al parecer estn presentes en todas las clulas eucariotas. Esta amplia distribucin de los canales de K+ est en correspondencia con la amplia gama de procesos fisiolgicos sujetos a su actividad. Resulta difcil, por tanto, hacer generalizaciones sobre los diferentes tipos, lo que explica que existan diferentes clasificaciones. (Rudy, 1988; Adams, 1990; Halliwell, 1990; Latorre y Labarca, 1996) De forma general los canales de K+ pueden clasificarse de acuerdo a como se regula el paso de la configuracin abierta a la cerrada en: (a) canales dependientes del voltaje, (b) canales activados por Ca2+ (c) canales regulados por ATP y (d) canales regulados por agonistas y segundos mensajeros. An as, existe cierta superposicin, por ejemplo los canales activados por Ca2+ requieren un cambio en el potencial de membrana para su funcionamiento.
+

Los canales dependientes del voltaje y los activados por Ca han sido los ms estudiados en neuronas. Los canales dependientes de voltaje pueden subdividirse en: (a) de rectificacin tarda, (b) transientes y (c) rectificadores de entrada. Los canales de rectificacin tarda son los que clsicamente describieron Hodkin y Huxley (1952) en axn gigante de calamar, como responsables de la fase de despolarizacin del potencial de accin. La corriente de activacin tarda tiende a activarse lentamente con la despolarizacin y a permanecer activada hasta el cese del estmulo despolarizante. Los canales transientes se abren rpidamente con la despolarizacin pero se cierran espontneamente an si la despolarizacin es mantenida. Este tipo de corriente, a menudo conocida como corriente tipo-A (IA), fue descubierta en neuronas de invertebrados (Connor y Stevens, 1971) pero desde entonces ha sido registrada en muchas neuronas de mamferos. Su importancia radica en que regula la frecuencia de descarga repetitiva en respuesta a despolarizaciones tnicas. Los canales rectificadores de entrada se activan por hiperpolarizacin ms que por despolarizacin, y desarrollan corrientes de entrada ms que de salida. Debido a este comportamiento, el cual se opone a las clsicas corrientes rectificadoras, estos canales se conocen a menudo como de rectificacin anmala. Son responsables del mantenimiento de la meseta en algunos potenciales de accin, del mantenimiento de la actividad marcapaso y de la regulacin de la frecuencia de disparo en neuronas. Los canales de K+ dependientes de Ca2+, se abren en respuesta a concentraciones en el rango mol/L o menores de Ca2+ intracelular. Tienen una amplia distribucin y son particularmente importantes en clulas secretoras y excitables. Existen diferentes tipos de estos canales, por ejemplo, los de pequea conductancia(5-15 pS) y los de gran-conductancia(100-250 pS) y los de maxi-conductancia(>200 pS). Algunos canales de K+ son activados por diversos agentes intracelulares como el ATP, los segundos mensajeros y las protenas G, as como por neurotransmisores: serotonina, cido gamma-aminobutrico (GABA), acetilcolina, entre otros. Hasta el presente, estos canales no parecen ser afectados directamente por toxinas. Se han aislado varios tipos de DNA, que codifican protenas que conforman canales de K dependientes de voltaje, mediante la explotacin de mutantes de Drosophila; stos se dividen en 4 superfamilias: Shaker, Shab, Shaw y Shal. La utilizacin de pruebas de baja restringencia ha permitido el aislamiento de numerosos cDNA relacionados con estas superfamilias a partir de tejido cerebral de vertebrados: rata, ratn y humano (Strong, 1990). Estos tipos de canales de K+ funcionales, pueden ser expresados en oocitos de Xenopus o en clulas de mamferos en cultivo. La diversidad de nombres asignados a estos canales resulta, en ocasiones, confusa. En este sentido, resulta ltil la nomenclatura simplificada propuesta por Chandy en 1991 segn la cual, se identifica a las 4 familias antes mencionadas como: Kv1, Kv2, Kv3 y Kv4 respectivamente. Dentro de ellas se establecen subdivisiones que permiten homologar los diferentes subtipos con las denominaciones en Xenopus, ratn, rata y humano. Despus de la aplicacin de la biologa + molecular al campo de la electrofisiologa, los canales de K se han agrupado de acuerdo a su estructura primaria en tres grandes superfamilias, segn el nmero de segmentos de cadena polipeptdica que atraviesan la matriz lipdica de la membrana. (Latorre y Labarca, 1996) Acciones de las toxinas sobre los canales de K
+ +

2+

En las neuronas, las corrientes de K+ son bsicamente inhibitorias, ya que equivalen a corrientes de salida + 2+ que contrarrestan las seales despolarizantes provocadas por las corrientes de Na y Ca . De manera + general, la apertura de canales de K conduce a que el potencial de membrana tienda al potencial de Nernst para el K+ y con ello la clula se hiperpolariza. En contraposicin, el bloqueo de los canales de K+ dependientes de voltaje produce incremento en la duracin del potencial de accin y/o en la frecuencia de descarga. Como consecuencia, aumenta la duracin de la despolarizacin en la terminacin nerviosa, los canales de Ca2+ permanecen abiertos por ms tiempo, penetra Ca2+ y como consecuencia, aumenta la liberacin de acetilcolina. La farmacologa de los canales de K+ , en relacin a la de los canales de Na+ y Ca2+, constituye un rea prcticamente inexplorada sobre todo si se tiene en cuenta su amplia diversidad. En este sentido, no resulta 4

posible establecer hasta el presente una clasificacin de las acciones especficas de las toxinas que actan a nivel de estos canales. El tetraetilamonio (TEA) fue la primera droga empleada como bloqueador de canales de K . A pesar de que no es muy potente ni muy especfica, ha sido utilizada como criterio de diferenciacin entre canales sensibles o no a sta (Cook y Quast, 1990). El descubrimiento de algunas toxinas naturales como potentes + agentes farmacolgicos con acciones especficas sobre canales de K , a pesar de ser llimitado, ha contribuido notablemente al conocimiento de las propiedades biofsicas y farmacolgicas de estos canales, as como a la vinculacin de stos a una gran diversidad de procesos fisiolgicos. (Moczydlowsky, 1988; Cook y Quast, 1990; Brewster y Strong, 1990; Harvey, 1993) La primera toxina caracterizada con accin especfica sobre canales de K+ dependientes de voltaje, fue la noxiustoxina (NTX), obtenida a partir del veneno del escorpin de Mxico Centruroides noxius, la cual es un polipptido de 36 residuos de aminocidos y tres disulfuros (Possani et al., 1982). Bloquea la corriente de rectificacin tarda en axones gigantes de calamar (Carbone et al., 1982; 1987) y, en concentraciones superiores, bloquea algunos canales de K+ dependientes de Ca2+. Se ha demostrado que facilita la liberacin de acetilcolina en terminaciones nerviosas motoras de mamferos (Harvey et al., 1992). Ha sido + utilizada en la preparacin de columnas de afinidad con el objetivo de aislar canales de K en membranas axnicas de calamar, lo cual ha permitido el estudio de parmetros biofsicos del canal de K+ (Prestipino et al., 1990). Tambin se han aislado y caracterizado dos toxinas polipeptdicas a partir del veneno de otra especie de este gnero, el escorpin Centruroides limpidus. Ambas toxinas desplazaron a la noxiustoxina radioyodada (125INTX) de membranas sinaptosomales de rata con alta afinidad e inhibieron las corrientes transientes de K+ (IA) en clulas cerebrales de rata en cultivo (Martin et al., 1994). Por otra parte, las dendrotoxinas (DTXs), un grupo de pequeas protenas aisladas a partir del veneno de varias serpientes mambas, constituyen poderosos bloqueadores de los canales de K+ dependientes del voltaje. Las especies incluyen la mambra verde oriental Dendroaspis angusticeps, la mamba verde occidental Dendroaspis viridis (Harvey y Karlsson, 1980; 1982). Las DTXs poseen carcter bsico y estn formadas por una cadena nica de 59-61 aminocidos estabilizada por tres uniones disulfuro. Muestran gran homologa estructural con inhibidores tipo Kunitz, tales como el inhibidor pancretico bovino de la tripsina + (Dufton, 1985). Sin embargo, este ltimo no presenta actividad bloqueadora de canales de K a pesar de que las DTXs inhiben algunas proteasas. (Marshall y Harvey, 1988) El primer efecto caracterizado como consecuencia del bloqueo de los canales de K dependientes de voltaje por las DTXs, fue incrementar la liberacin de neurotransmisor en uniones neuromusculares de vertebrados (Harvey y Karlsson, 1980; 1982; Harvey y Anderson, 1985). En los nodos de Ranvier del nervio citico de rana, la DTX bloquea especficamente un componente de la corriente rpida transiente (Benoit y Dubois, 1986). En neuronas sensoriales de ganglios dorsales de cobayo la DTX I reconoce un subtipo de canal de K+ que no se inactiva. (Penner et al., 1986) Con posterioridad, otros autores demostraron que estas toxinas lograban este efecto tanto en neuronas perifricas como centrales de diferentes regiones (Docherty et al.,1983; Dlly et al., 1984; Weller et al., 1985; {ennerr et. al., 1986; Awan y Dolly, 1991). Por ejemplo, cuando se inyect por va intracerebro-ventricular en rata, tanto la DTX como su homloga DTX I, produjeron convulsiones y muerte (Mehraban et al., 1985; Silveira et al., 1988). En estas condiciones se produce un incremento generalizado de la actividad neuronal que afecta la liberacin de neurotransmisores, tanto excitatorios como inhibitorios (Halliwell et al., 1986). Experimentos in vitro han demostrado que la dendrotoxina causa una ligera despolarizacin de los sinaptosomas de mamferos que conduce a la liberacin, dependiente de calcio, de GABA y de glutamato (Weller et al., 1985; Nicholls et al., 1985; Tibbs et al., 1989; Barbeito et al., 1990). Todos estos resultados son consistentes con el hecho de que la dendrotoxina bloquea ciertas corrientes de K+ en terminaciones nerviosas centrales y perifricas. Las dendrotoxinas constituyen importantes herramientas bioqumicas en el estudio de la + 125 neurofarmacologa de los canales de K dependientes de voltaje. As, la dendrotoxina radioyodada ( IDTX) ha permitido conocer la distribucin de los sitios de unin de esta toxina al cerebro, los cuales se 5
+ +

corresponden con reas muy ricas en sinapsis (Bidard et al., 1989; Pelchen-Mathews y Dolly, 1989). Esto ha contribuido a la determinacin del sitio de unin de la toxina al canal de K+, lo cual ha sido complementado con estudios en canales clonados y expresados en oocitos de Xenopus. (Scott et al., 1990; Hurst et al., 1991) Otra toxina que result ser un bloqueador de canales de K+ dependientes de voltaje, se obtuvo a partir del veneno de Apis mellfera: Breithaipt y Habermann en 1968 aislaron un pptido capaz de inducir la liberacin de histamina en mastocitos, que se denomin pptido desgranulador de mastocitos (MCDP). Posteriormente se demostr que posee fuerte efecto convulsivo cuando se administra directamente en el SNC (Habermann, 1977). Finalmente, se comprob que es capaz de competir con la DTX por sitios de unin + membranas neuronales (Stanfield et al., 1987; Bidard et al., 1987), adems de bloquear corrientes de K de activacin rpida sensibles a la DTX (Neuman et al., 1991). No est totalmente esclarecido si puede facilitar la liberacin de neurotransmisor en terminaciones nerviosas. Existe tambin un grupo de neurotoxinas con actividad de fosfolipasa-A2 aisladas a partir de venenos de serpientes que incluyen la beta-bungarotoxina, la crotoxina, la notexina y la taipoxina, las cuales se conocen por su capacidad de bloquear la liberacin de acetilcolina en terminaciones motoras (Chang, 1985; Harris, 1991). En adicin se comprob que, previo a este efecto, estas toxinas facilitan la liberacin de acetilcolina en terminaciones nerviosas motoras, lo cual est relacionado con su capacidad de bloquear corrientes de K+ dependientes de voltaje a este nivel. (Anderson et al., 1987; Rowan y Harvey et al., 1988) Adems, se han caracterizado algunas toxinas con acciones especficas sobre canales de K+ dependientes de Ca2+. La primera de estas toxinas fue la apamina, pequeo polipptido de slo 18 residuos aislado del veneno de Apis mellfera (Habermann, 1965). Esta toxina bloquea selectivamente, a 2+ concentraciones en el rango nmol/L, el subtipo de canal dependiente de Ca de baja conductancia. Tiene adems la caracterstica, poco usual en un polipptido, de ganar acceso al SNC; esto provoca hiperactividad, convulsiones y muerte. (Mourre et al., 1988; Messier et al., 1991) La charybdotoxina (CbTX) aislada a partir del veneno del escorpin de Israel Leiurus quinquestriatus (Miller et al., 1985) es un polipptido de 37 residuos de aminocidos y tres puentes disulfuro. A diferencia de la apamina, la CbTX bloquea el subtipo de alta conductancia en neuronas y en otros tipos celulares. (Moczydlowsky et al., 1988; Dreyer, 1990; Strong, 1990) Con posterioridad, a partir del veneno del escorpin Orthochirus scrobiculosus, se purificaron tres toxinas polipeptdicas (Os-K-1, OsK-2 y OsK-3). Osk-1 posee 38 aminocidos, 3 disulfuros y presenta gran homologa con la CbTX. Adems, OsK-1 y OsK-2, bloquean especficamente el subtipo de baja conductancia en neuronas de la serie NG108-15; a diferencia de OsK-3 que bloquea selectivamente los de alta conductancia en clulas de la hipfisis anterior. (Nosyreva et al., 1995) Hasta hace algunos aos se pensaba que las anmonas eran fuente casi exclusiva de toxinas con accin + sobre canales de Na (Norton, 1991), sin embargo recientemente las anmonas han atrado la atencin como la primera fuente de toxinas de origen marino con acciones sobre los canales de K+. Estas toxinas han sido aisladas y caracterizadas a partir de varias especies de anmonas: Bunodosoma granulfera (toxina denominada BgK, Aneiros et al., 1993; Cotton et al., 1997), Stichodactyla helianthus (toxina denominada ShK, Castaeda et al., 1995), Anemonia sulcata (toxinas denominadas AsKC1, AsKC2, AsKC3 y AsKS Schweitz et al., 1995), Heteractis magnifica (denominada HmK, Gendeh et al., 1997) y Actinia equina (toxina denominada AeK, Minagawa et al., 1998). Investigaciones preliminares sugieren que tambin se encuentran presentes en los extractos totales de Actinia bermudensis, Bunodosoma cangicum y Stichodactyla martensii (Harvey et al.,1995; Araque et al., 1995). Todas las molculas descritas hasta el presente con actividad de este tipo, en estas especies, son polipptidos de carcter altamente bsico que presentan seis residuos de Cys con los cuales forman tres puentes disulfuro (Pohl et al., 1995). Las ms pequeas: BgK, ShK, AsKS, HmK estn formados por 35-37 residuos de aminocidos, mientras que las mayores: AsKCs, estn formados por 58-59 residuos. Estas toxinas representan una nueva clase estructural + de pptidos bloqueadores de canales de K que presentan muy poca homologa estructural entre compuestos de actividad similar descritos a partir de otras especies e incluso entre las diferentes especies 6

de anmonas entre s. Por estas razones, la diversidad de estructuras que se suponen nos permite aseverar que el estudio de las toxinas de las anmonas contribuir de forma muy efectiva a una mejor comprensin de la farmacologa de los canales de K+. b) Inhibicin de la Hidrlisis de la Acetilcolina Otro mecanismo a travs del cual se logran acciones facilitadoras en el sistema colinrgico, consiste en inhibir la enzima que hidroliza la acetilcolina. Debido a esta accin, los agentes anticolinestersicos producen una acumulacin anormal de acetilcolina en la sinapsis que equivale a una estimulacin colinrgica. Como resultado de las investigaciones sobre la base bioqumica de algunos venenos animales, se han referido algunas toxinas con actividad anticolinestersica en especies poco relacionadas. La primera referencia de una toxina con actividad anticolinestersica result ser la melitina, un polipptido pequeo de 26 aminocidos, aislado a partir del veneno de Apis mellfera, inicialmente conocido por su actividad hemoltica (Habermann et al., 1965). Sin embargo, con posterioridad se demostr que era capaz de inhibir la acetilcolinesterasa del tejido cerebral de larvas de Drosophila. (Herschel et al., 1971) Por otra parte, al estudiar los efectos txicos del veneno en la mamba verde Dendroaspis angusticeps, se observ que la administracin intraperitoneal de ste provoc en ratones una serie de signos tales como: fasciculacin generalizada, secrecin de diversas glndulas y otros que son caractersticos del envenenamiento agudo con agentes anticolinestersicos (Rodrguez-Ithurralde et al., 1981). Ya se haba purificado y aislado la DTX a partir de esta misma especie (Harvey y Karlsson, 1980), pero la magnitud del efecto colinomimtico era tal, que poda ser explicada en base a la presencia de otros agentes presentes en el mismo veneno, que de alguna forma potenciaban las acciones colinrgicas. Posteriormente se demostr la presencia en dicho veneno de 2 polipptidos con potente actividad anticolinestersica: las fasciculinas I y II (Rodrguez-Ithurralde et al., 1983). La mayor parte de los estudios bioqumicos y neurobiolgicos se han realizado con la fasciculina II (FAS). Esta posee 61 residuos y 4 uniones disulfuro. La secuencia aminoacdica de esta toxina haba sido determinada por Viljoen y Botes en 1973, quienes la identificaron como F VII antes de que los aspectos bsicos de su actividad biolgica fuesen esclarecidos. Las FAS inhibe tanto la pseudo como la verdadera acetilcolinesterasa de diversas fuentes. Es un inhibidor de tipo no competitivo (Karlsson et al., 1985; Cerveansky et al., 1991). Adems, ha constituido una poderosa herramienta en estudios neurobiolgicos, puesto que ha permitido demostrar el papel clave de la acetilcolinesterasa estriatal en los mecanismos colinrgicos involucrados en el control de la conducta motora. (Dajas et al., 1991) Otras toxinas anticolinestersicas de naturaleza peptdica han sido aisladas a partir de otras especies de serpientes, por ejemplo la atramina, a partir del veneno de Naja naja atria, la cual inhibe la acetilcolinesterasa presente en el veneno de Bungarus multicinctus. (Takechi y Tanaka, 1980) Tambin se han aislado agentes anticolinestersicos a partir de organismos marinos. Por ejemplo, a partir de una cepa de la cianobacteria Anabaena flosaquae NRC-525-17 se aisl una neurotoxina, anatoxina-a (s), (Mahmood y Camichael, 1886). Las ratas tratadas con dosis letales de esta toxina mostraron reduccin o total inhibicin de la acetilcolinesterasa sangunea. Adems, desarroll una actividad de tipo no competitivo frente a la acetilcolinesterasa de anguila elctrica. El anlisis de su estructura indic que se trataba de un alcaloide de peso molecular menor de 400 Da. A partir de las secreciones del molusco marino Onchidella binneyi se identific el onchidal como el principal componente de la misma. El compuesto posee estructura anloga a la acetilcolina e inhibe irreversiblemente la acetilcolinesterasa, puesto que forma un enlace covalente con esta enzima (Abramson et al., 1989). De modo anlogo se analizaron los extractos y/o secreciones de 5 especies de gasterpodos marinos abundantes en costas cubanas: Aplysia dactylomela, aplysia juliana, Bursatela leachi, petalifera ramosa y Onchidella floridiana; todas inhibieron de forma significativa la acetilcolinesterasa de suero equino. Las evidencias anteriores sugieren la importancia defensiva de los agentes anticolinestersicos en los moluscos. (Garca et al., 1993) 7

En adicin, los extractos de tentculos de Physalia physalis y del cuerpo total de Bunodosoma granulfera (Castaeda et al., 1985) as como de la columna corporal de Condylactis gigantea (Rivera et al., 1987) inhibieron la colinesterasa sangunea de ratones. Estos resultados indicaron que la toxicidad de estos extractos se debe, al menos en parte, a la presencia de agentes anticolinestersicos en estos celenterados. Esos resultados motivaron a explorar la presencia de compuestos con actividad similar en el extracto del cuerpo total de la anmona del sol: Stichodactyla helianthus, caracterstica del mar Caribe. Como resultado de estos estudios el extracto de esta especie, cuando se administr a ratas previo al tratamiento con metilfenidato, produjo una reduccin significativa del clsico efecto excitatorio en reas extrapiramidales (Rivera y Castaeda, 1985). Este efecto puede ser suprimido, en gran medida, por el tratamiento previo con drogas que inhiben a la acetilcolinesterasa (Ross, 1978; Moss et al., 1985). Con posterioridad se demostr que en las ratas as tratadas se produjo una reduccin significativa de la acetilcolinesterasa cerebral. El aislamiento y purificacin de un principio anticolinestersico a partir del extracto acuoso del cuerpo total de esta especie, constituy la afirmacin de nuestras suposiciones sobre la presencia de agentes antilcolinestersicos en los celenterados. Se trata de un compuesto no proteico, de muy bajo peso molecular, que ejerce una inhibicin de tipo mixto frente a la acetilcolinesterasa eritroctica humana (Karlsson et al., 1991; Castaeda, 1996). De modo anlogo fue purificado un anticolinestersico a partir de la anmona Bunodosoma granulfera, tambin de naturaleza similar y cuyo peso es inferior a 2 000 Da (Aneiros et al., 1992). La presencia de agentes antilcolinestersicos en extractos o secreciones procedentes de animales venenosos constituye, hasta el presente, un hecho poco generallizado. Sin embargo, en las especies que los presentan, pueden considerarse que forman parte de la maquinaria defensiva de estos grupos. EL SINERGISMO: MODO DE ACCIN DE LAS TOXINAS PRESENTES EN LOS VENENOS Es un hecho comn que los animales que liberan secreciones neurotxicas producen varios tipos de toxinas que actan en sinergismo. Por ejemplo, el molusco marino Conus geographus produce tres conotoxinas: (, y ) que antagonizan las acciones de la acetilcolina por mecanismos diferentes (Olivera et al., 1984). La serpiente Dendroaspis angusticeps (mamba verde), produce dendrotoxinas, fasciculinas y toxinas con acciones sobre receptores muscarnicos y el efecto combinado de stas es incrementar el nivel de acetolcolina en la sinapsis. (Karlsson et al., 1985) La aparicin de toxinas excitatorias (exitotoxinas) a lo largo de la evolucin, pudo estar influenciada por la mayor o menor eficiencia del animal en inmovilizar la presa. Por ejemplo, algunas serpientes marinas que disponen de otros medios para someter a las presas, generalmente liberan toxinas de accin postsinptica que, por un mecanismo relativamente lento, logran una parlisis flcida. Las anmonas, por su parte, carentes de otros mecanismos de inmovilizacin, contactan inicialmente a sus presas con un solo tentculo. Consecuentemente, han desarrollado la capacidad de producir toxinas que, por diversos mecanismos conducen a incrementar el nivel de acetilcolina en la sinapsis: las que retardan la inactivacin de los canales de sodio, las que bloquean los de canales de K+ dependientes de voltaje, as como las anticolinestersicas. De esta forma provocan una rpida respuesta excitatoria en sus presas que puede conducir a una parlisis rgida inmediata. Adems, la existencia de toxinas anticolinrgicas descritas en algunas especies de celenterados (Menndez et al., 1990; Garateix et al., 1992), pudieran sugerir la coexistencia de dos tipos de estrategias ofensivas en los representantes de este phylum: una parlisis flcida, ms lenta, tpica del bloqueo neuromuscular postsinptico y una parlisis rpida, rgida, tpica del bloqueo neuromuscular presinptico. Recientemente se han referido estrategias similares para el molusco marino Conus purpurascens. (Terlau et al., 1996) La contribucin creciente de numerosos grupos de investigadores en el estudio de asilamiento, purificacin y caracterizacin bioqumico-farmacolgica de las ms diversas toxinas a partir de secreciones venenosas y cuerpo ntegros de especies txicas, permitir: definir en gran medida su significacin funcional en la ecofisiologa de las respectivas especies, esclarecer en gran parte los procesos fisiolgicos sujetos a la accin de receptores y canales sobre todo en los vertebrados y analizar su utilizacin potencial en el diagnstico y tratamiento de enfermedades en beneficio de la humanidad.

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