CROMATOGRAFIA Metodele cromatografice reprezint sisteme experimentale nrudite, utile n analizarea unei mari varieti de substane chimice.

Cromatografia reprezint o metod analitic important. Dintre domeniile de aplicare citm: controlul de calitate, purificarea produselor, cercetarea fundamental. Definiie Termenul de cromatografie a fost utilizat iniial de Tsvet (1872-1919), un botanist rus, ca rezultat al combinrii a doi termeni din limba greac (khromatos culoare i graphos scris). El a folosit termenul pentru a descrie studiile de migrare a unui pigment vegetal separat pe o coloan de cret. Tsvet a descris astfel cromatografia ca o metod prin care componentele unui amestec sunt separate pe o coloan de absorbie ntr-un mediu fluid. IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) definete cromatografia ca : o metod utilizat n principal pentru separarea componentelor unei probe, prob n care componentele sunt distribuite ntre dou faze din care una este staionar iar cealalt este mobil. Faza staionar poate fi solid sau un lichid dispus pe un suport solid sau un gel. Faza staionar poate fi compactat ntr-o coloan, pulverizat ntr-un strat sau dispus ca un film; n aceste definiii, patul cromatografic este un termen generic denominnd diferitele forme de utilizare a fazei staionare. Faza mobil poate fi gazoas sau lichid. Istoric 1941 Martin i Synge inventeaz cromatografia de partiie (lichid-lichid) pe coloan i planar (pe hrtie). Primesc Premiul Nobel n 1952. 1950 depunerea silicagelului n strat subire duce la apariia TLC (thin-layer cromatography) cromatografia n strat subire 1959 James i Martin introduc GLC (gas-liquid chromatography) cromatografia gazlichid 1959 Porah i Flodin cromatografia cu excludere dimensional permite separarea uoar a macromoleculelor dup dimensiuni 1970 HPLC high precision liquid chromatography metod de mare finee. Clasificare Exist 3 moduri de clasificare a metodelor cromatografice. Prima i cea mai folosit este bazat pe mecanismele de retenie modul n care substana de analizat interacioneaz cu faza staionar. n acest mod de clasificare, cromatografia poate fi de 5 tipuri: 1. Cromatografia de absorbie Aceast tehnic este bazat pe competiia pentru substane de analizat neutre dintre faza mobil (lichid sau gaz) i faza staionar. Substanele cu grupri polare sunt reinute mai mult de ctre un adsorbent polar n timp ce substanele cu grupri nepolare interacioneaz optim cu faza staionar nepolar. n acest tip de cromatografie, substanele de analizat sunt simultan n contact att cu faza staionar ct i cu faza mobil.

2. Cromatografia de partiie Tehnica este bazat pe competiia pentru substanele neutre ntre faza mobil (lichid sau gaz) i un lichid neutru sau o faz staionar de tip lichid (numit i faz legat deoarece este reprezentat de lanuri lungi alkilice cuplate la o matrice astfel nct s se comporte ca un fluid). n cromatografia de partiie, substana de analizat (analizatul) este transferat din masa unei faze n masa celeilalte faze astfel nct moleculele analizatului sunt nconjurate de moleculele unei faze. Separarea n cromatografia de partiie este obinut prin diferenele dintre coeficienii de partiie ai analizatului ntre faza mobil i staionar. 3. Cromatografia pe schimbtori de ioni Tehnica este bazat pe interaciunea electrostatic dintre un solvit ncrcat i o faz staionar ncrcat opus. Separarea n cromatografia pe schimbtori de ioni este obinut prin afinitatea diferit a ionilor din soluie pentru gruprile ionice de sens opus din faza staionar. Acest tip de cromatografie se aplic pentru orice solvit care capt ncrcare electric n soluie. Astfel, chiar i carbohidraii (glucidele) care sunt nepolare sub pH 12 pot fi separate prin aceast metod, n soluie la un pH peste 12. 4. Cromatografia de excludere dimensional Tehnica este bazat pe principiul sitei i mai este cunoscut sub denumirea de gelcromatografie, gel-filtrare sau cromatografie de gel-permeaie. n aceast tehnic, particulele fazei staionare posed pori de diferite dimensiuni astfel nct moleculele mari sunt excluse. Solviii sunt astfel separai pe baza greutii moleculare i a dimensiunilor; moleculele mari sunt primele eluate (extrase) din sistem. 5. Cromatografia de afinitate Tehnica este bazat pe specificitatea biologic unic a interaciunilor ligand-receptor (mecanismul cheie-yal). Ligandul este cuplat covalent cu matricea care formeaz materialul de tapetare a coloanei. Separarea are loc dup ce macromoleculele devin specific dar nu ireversibil cuplate ligandul. Eluarea are loc prin modificarea compoziiei sau pHului solventului de extracie (eluent) n scopul diminurii interaciunilor cu ligandul, facilitnd disocierea i facilitarea extraciei. Aa cum se observ n imaginea de mai jos, scopul cromatografiei de afinitate este de a separa moleculele cu o specificitate aparte dintr-un amestec molecular cum este serul sanguin. De exemplu, anticorpii serici specifici pentru un determinant antigenic pot fi izolai prin aceast metod (vezi i pricepe figura) Etapa 1 este cea de pregtire a imunosorbentului. Acesta const dintr-o matrice solid la care antigenul (marcat cu albastru n figur) a fost cuplat (de obicei covalent). Matricea const de obicei din agaroz, sefadex, derivai de celuloz sau alte tipuri de polimeri. Etapa 2. Serul este trecut peste imunosorbent. Att timp ct capacitatea de tranzitare a coloanei nu este depit, anticorpii din amestec (culoare roie) specifici pentru antigenul cuplat la matricea fix se vor cupla necovalent i vor fi reinui. Anticorpii nespecifici (verde) sau alte proteine serice (galben) vor trece nestingherite prin coloan. Etapa 3. Extracia. Un reactiv este trecut prin coloan pentru a elibera anticorpii de pe imunoadsorbent. Soluiile tampon care conin o concentraie crescut de sruri i/sau pH sczut sunt utilizate frecvent pentru a disloca interaciunile necovalente dintre anticorp i antigen. Un agent de denaturare cum ar fi ureea 8M va determina de asemenea desfacerea

legturii antigen-anticorp prin modificarea situsului de cuplare a antigenului cu molecula de anticorp. O metod de extracie mai delicat este splarea coloanei cu o soluie care conine antigen specific. Acesta va intra n competiie cu imunoadsorbentul pentru situsurile de cuplare pentru antigen ale anticorpului i va prelua anticorpii n faza fluid. Etapa 4. Soluia extras va fi dializat pe soluie tampon salin pentru a nltura reactivul utilizat la extracie.

DE REINUT Dializa reprezint procedeul de separare a solviilor cu molecul mic sau ionilor (ex. glucoz sau Na, Cl) de macromolecule (ex. amidon) datorit ratei diferite de difuziune printr-o membran cu permeabilitate diferenial. Exemplu: celofanul este o membran perforat de pori mici care permit ionilor i moleculelor mici s o traverseze dar care exclude moleculele cu greutate molecular peste 12.000 Da. Dac umplem un rezervor de celofan cu un amestec de amidon i glucoz i l imersm ntr-un rezervor cu ap pur, moleculele glucidice vor difuza n apa din mediul nconjurtor pn la stabilirea unui echilibru adic pn cnd concentraiile

sunt egale de ambele pri ale membranei. Datorit dimensiunilor mai mari, moleculele de amidon nu pot trece prin membrana de celofan. ! Greutatea molecular este suma greutilor atomilor din care este compus molecula. Unitatea de msur este Da daltonul 1/12 din greutatea unui atom de 12C. Astfel, greutatea molecular GM sau MW n englez - a apei este de 18 Da. De ce este att de important a cunoate greutatea molecular a unui compus ? S apreciem un exemplu simplu i americnesc de concret ! S spunem c suntem responsabili pentru un studiu care se ocup de rspunsul albinelor de miere la diferite tipuri de zahr. Una din modalitile de rezolvare a acestei probleme este crearea unor soluii cu diferite concentraii de zaharuri pentru a vedea care sunt preferate de albine. Ai putea oferi albinelor s aleag ntre o soluie de sucroz 35% (zahrul de mas) i o soluie 35% glucoz (component natural al mierii). Pentru a realiza aceste amestecuri ar trebui deci 350 pri pe greutate (ex. grame) de zahar n 650 pri (g) ap, producnd 1000 g din fiecare soluie. Este ns o problem! Modul de rspuns al albinelor la prezena zaharului dizolvat n ap este dependent de numrul de molecule dintr-un volum dat de soluie. Molecula de sucroz (GM=342) este de aproximativ 2 ori mai grea dect molecula de glucoz (GM=180). Astfel, o soluie de glucoz 35% va conine aproape de 2 ori mai multe molecule dect o soluie 35% de sucroz. Pentru a corecta aceast situaie trebuie compus o soluie cu greutile de sucroz i glucoz n raport de 342:180. n acest caz ar trebui s avem aceeai concentraie de molecule n fiecare soluie, astfel, pictur cu pictur, fiecare soluie trebuie s conin acelai numr de molecule. Dac vom cntri exact 342 g sucroz vom fi cntrit 1 mol de sucroz. Astfel, un mol reprezint cantitatea de substan a crei greutate n grame este egal cu greutatea molecular a substanei. Astfel, 1 mol de glucoz cntrete 180 g. dac se dizolv 1 mol de substan n suficient ap pentru a crea 1 litru de soluie, avem o soluie 1 M (1 molar). O soluie 1M ar fi prea concentrat pentru albine. O soluie mai potrivit ar fi cu 34,2g sucroz i 18 g glucoz. Astfel de soluii ar fi deci soluii 0,1M. Considerate pictur cu pictur, aceste dou soluii conin acelai numr de molecule avnd aceeai molaritate. Dar cte molecule sunt ntr-un mol? Aproximativ 6x1023. Acesta este numrul lui Avogadro. Numrul lui Avogadro se aplic pentru molii oricrei substane sau ion. 1 mol de H2 are 1g.