SELECCIN DE BACTERIAS DEL CIDO LCTICO SINTETIZAN PPTIDOS ANTIOXIDANTES DURANTE LA FERMENTACIN DE MASA FERMENTADA DE HARINAS DE CEREALES

Una piscina de seleccin de bacterias del cido lctico fue utilizado para la fermentacin de masa fermentada de harinas de cereales diferentes con el objetivo de sintetizar pptidos antioxidantes. La actividad de los radicales de captacin de agua / extractos sal soluble (WSE) de masas madre fue significativamente (P <0,05) mayor que la de las masas qumicamente acidificados. La actividad ms alta se encontr para trigo, espelta, centeno, y el kamut masas madre. Casi los mismos resultados se encontraron para la inhibicin de la auto-oxidacin de cido linoleico. WSE fueron sometidos a reversephase cromatografa lquida rpida de proteinas. Treinta y siete fracciones se recogieron y se ensayaron in vitro. Las fracciones ms activas fueron resistentes a la hidrlisis adicional por las enzimas digestivas. Veinticinco pptidos de 8 a 57 residuos de aminocidos fueron identificados por nano-cromatografa lquida de ionizacin por electrospray-espectrometra de masas en tndem. Casi la totalidad de las secuencias compartan caractersticas composicionales que son tpicas de los pptidos antioxidantes. Todas las fracciones purificadas mostraron actividad antioxidante ex vivo en fibroblastos de ratn artificialmente sometidos a estrs oxidativo. Este estudio demuestra la capacidad de las bacterias de cido lctico de masa fermentada para liberar los pptidos con actividad antioxidante a travs de la protelisis de las protenas de cereales nativas. El inters en la promocin de la salud los alimentos funcionales, suplementos dietticos,y preparaciones farmacuticas que contienen pptidos derivados de protenas de los alimentos est aumentando marcadamente (24). Bioactivos pptidos se definen como fragmentos de protenas especficas que tienen efectos positivos sobre las funciones del cuerpo o condiciones que influyen la salud humana (23). Por lo general, los pptidos bioactivos corresponden a secuencias crpticas de protenas nativas, que son liberados principalmente a travs de hidrlisis por digestivo, microbiano, y enzimas proteolticas de plantas, y sus niveles generalmente aumentan durante la comida de fermentacin (24). In vitro e in vivo estudios muestran un amplio espectro de las funciones biolgicas atribuidas a los pptidos bioactivos, tales como opioides como (19), mineral de unin (9), inmunomodulador (15), antimicrobiano (25), antioxidantes (27), antitrombtico (46),hipocolesterolmicos (53), y antihipertensivos (21) actividades.La liberacin de diversos pptidos bioactivos (por ejemplo, la angiotensinaI-enzima de conversin de [ACE]-pptidos inhibidores) de protenas de la leche a travs de la proteolisis por bacterias de cido lctico es el mejor documentado(24). Recientemente, el inters en pptidos antioxidantes derivados de las protenas de los alimentos ha aumentado, y la evidencia de que los pptidos bioactivos sirven para prevenir estrs oxidativo asociado con numerosos enfermedades degenerativa (por ejemplo, el envejecimiento, el cncer y arteriosclerosis) est acumulando. En general, los antioxidantes tienen muchas aplicaciones en la industria alimentaria.El retraso de la decoloracin y el deterioro de alimentos, la cual puede ocurrir como consecuencia de los procesos oxidativos, mejora notablemente la conservacin de alimentos. La oxidacin mediada

por radicales de grasas y aceites es una de las principales causas del deterioro de los alimentos que contienen lpidos durante el procesamiento y almacenamiento (36). Los antioxidantes son ampliamente la prueba de la ausencia de carcinogenicidad y otros efectos txicos en s mismos, en sus formas oxidadas, y en los productos de su reacciones con componentes de los alimentos, por su eficacia a bajas concentraciones; y por la ausencia de la capacidad para transmitir un sabor desagradable a la comida en la que se utilizan (28). El uso de antioxidantes en los productos alimentarios se rige por las leyes reguladoras de pases o por las normas internas (28). Aunque muchos compuestos sintticos tienen propiedades antioxidantes, solo algunos de ellos han sido aceptados como GRAS (como es generalmente reconocido) es segura para su uso en productos alimenticios por los organismos internacionales como la Comit Mixto FAO / OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios y elComit Cientfico de la Comunidad Europea para la alimentacin. Toxicolgica los estudios son cruciales para determinar la seguridad de un antioxidante y tambin en la determinacin de la ingesta diaria admisible (IDA) niveles (28). IDA para ampliamente utilizado antioxidantes, tales como butil hidroxianisol (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), y galatos, han cambiado con los aos, principalmente debido a su toxicidad efectos en especies distintas (20, 28, 33, 50), y los nuevos datos toxicolgicos para algunos de los antioxidantes sintticos advirti en contra de su uso (28). Antioxidantes naturales recientemente atrajo la atencin de muchos fabricantes de alimentos, como resultado del deseo de producir alimentos saludables (28). Pptidos biolgicamente activos con potencial antioxidante actividad se han derivado de muchos animales y protenas vegetales (35, 43, 49). Fueron aislados ya partir de granos de man, salvado de arroz, protena de girasol, protena de hoja de alfalfa, gluten de maz comida, piel de rana, ame, protena de huevo yema de huevo, leche kfir, leche de soya kfir, hongos medicinales, la caballa, las hojas de curry, el algodn gusano de la hoja, casena, protena de residuos de algas, gluten de trigo, protena de trigo sarraceno y (43). Se argument que los pptidos antioxidantes actan como inhibidores de la peroxidacin lipdica, como eliminadores de radicales libres directos, y / o como agentes para quelar iones de metales de transicin que catalizan la generacin de las especies de radicales (43). Pptidos antioxidantes por lo general estn constituidas de 2 a 20 residuos de amino cidos y tienen masas moleculares de menos de 6,0 kDa (26, 48). La actividad antioxidante parece ser fuertemente correlacionada con la composicin de aminocidos, la conformacin,y la hidrofobicidad (5). Los cereales son alimentos bsicos en la dieta humana. Ellos son considerados una de las fuentes ms importantes de carbohidratos, protenas, vitaminas, minerales y fibras para la gente de todo el mundo. Una gran proporcin de los cereales se procesan en los alimentos y bebidas por fermentacin (por ejemplo, masa madre) antes de su consumo. Aunque actividades biolgicas tales como la inhibicin de la ECA y los antimicrobianos y actividades contra el cncer se informaron para los pptidos de cereales (7,8, 38, 40, 41), a lo mejor de nuestro conocimiento slo unos pocos estudios (43) han investigado la posible liberacin de pptidos antioxidantes durante la fermentacin de cereales. Este estudio tuvo como objetivo investigar el antioxidante in vitro y ex vivo potencial de harinas de cereales diferentes, que fueron sometidos a la fermentacin de masa

fermentada por bacterias del cido lctico seleccionadas. Bioactivos pptidos se purificaron e identificaron para determinar relaciones estructurales con propiedades antioxidantes. MATERIALES Y MTODOS Microorganismos. Lactobacillus alimentarius 15 M, Lactobacillus brevis 14G, 7A Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii y 51B eran previamente seleccionados en base a su capacidad para hidrolizar gliadinas (14). L.sanfranciscensis LS3, LS10, LS19, LS23, LS38, LS47 y fueron seleccionados en base en sus sistemas de peptidasa, con particular referencia a las actividades hacia Pro-pptidos ricos (12). Las cepas fueron utilizados en la mezcla de masa madre de fermentacin. Los lactobacilos se propag durante 24 horas a 30 C en caldo MRS (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Inglaterra), con la adicin de fresco extracto de levadura (5%, vol / vol) y 28mMmaltose, a un pH final de 5,6 (modificadaMRS [TMM]). Cuando se utiliza para las fermentaciones de masa fermentada, cido lctico Las clulas bacterianas se cultivaron hasta la fase tarda de crecimiento exponencial se alcanz (ca. 10 h), se lavaron dos veces en tampn 50mMphosphate, pH 7,0, y se resuspendieron en agua del grifo (recuento total de bacterias,? 100 CFU / ml), el cual se utiliza para hacer la masa. La enumeracin de bacterias del cido lctico se llev a cabo en placas diluciones en serie de masas madre en agar mmrs medio (Oxoid) a 30 C durante 48 h. Fermentacin de masa fermentada. Segn lo determinado por AACC mtodos oficiales (1), las caractersticas de las harinas utilizadas en este estudio se presentan en la Tabla 1. Cada harina fue utilizado para preparar una masa madre que contiene 120 g de harina y 280 g de agua del grifo, con un rendimiento de masa (DY;? Peso de la masa 100/flour peso) de 330 (DY 330). Fermentacin con la piscina de cido lctico de bacterias seleccionadas (densidad celular inicial de 5? 107 CFU / g de masa) se llev a cabo en 37 C durante 24 h bajo condiciones de agitacin (aproximadamente 200 rpm). Control de masas (DY 330) sin inculo bacteriano se acidificaron a pH 3,5 qumicamente por una mezcla de cidos lctico y actico (relacin molar, 4:1) y se incubaron en las mismas condiciones. WSE. Agua / sal solubles en extractos (WSE) se prepararon a partir de cada uno masas de acuerdo con el procedimiento descrito originalmente por Osborne (32) y modificarse adicionalmente por Weiss et al. (51). Una alcuota de cada masa (que contiene 7,5 g de harina) se diluy con 30 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 8,8), se mantuvieron a 4 C durante 1 h, se agitaron a intervalos 15-min, y se centrifug a 20.000? g durante 20 min. Los sobrenadantes, que contienen el agua / saltsoluble fraccin de nitrgeno, se utilizaron para los ensayos in vitro de la actividad antioxidante . Las concentraciones de pptidos en la WSE y fracciones purificadas se determinaron por el o-phtaldialdehyde (OPA) mtodo (6). Una norma curva preparada usando triptona (0,25 a 1,5 mg / ml) se utiliz como referencia. El uso de peptona dio una curva estndar similar. DPPH radical de captacin de actividad. El efecto de barrido de WSE y las fracciones purificadas en 1,1-difenil-2-picrilhidracilo (DPPH) radicales libres se midi segn el mtodo de Shimada et al. (45), con algunas modificaciones (52). Muestras congeladas en seco se disolvieron en 0,1 M de fosfato tampn (pH 7,0) a una concentracin de pptido de 1 mg / ml, y 2 ml de cada solucin se aadi a 2 ml de DPPH 0,1 mM disuelto en 95% etanol. La mezcla se agit y se dej durante 30 min a temperatura ambiente, y la absorbancia de la solucin resultante se ley a 517 nm. La absorbancia medida despus de 10 min se utiliz para el clculo de los

Radicales DPPH eliminados por el WSE o fracciones purificadas de pptidos (39). La absorbancia inferior representa un radical DPPH mayor captacin de actividad. El efecto de barrido se expres como se muestra en la siguiente ecuacin:DPPH radical de captacin de actividad (%)? [(Absorbancia en blanco? Muestra absorbancia) /] absorbancia en blanco? 100. Hidroxitolueno butilado (BHT) y?-tocoferol (1 mg / ml) tambin se ensayaron como referencias antioxidantes. La inhibicin de la auto-oxidacin de cido linoleico. La actividad antioxidante de los Fracciones WSE y purificado tambin se midi segn el mtodo de Osawa y Namiki (31), con algunas modificaciones. Despus, el secado por congelacin 1,0 mg de cada muestra se suspendi en 1,0 ml de tampn de 0.1Mphosphate (pH 7,0) y se aadi a 1 ml de cido linoleico (50 mM), que anteriormente era disuelto en etanol (99,5%). La incubacin en un tubo de ensayo de vidrio, cerrado hermticamente con una tapa de caucho de silicona, se dej a 60 C en la oscuridad durante 8 das. El grado de oxidacin se determin midiendo los valores de frrico tiocianato de acuerdo con el mtodo descrito por Mitsuta et al. (30). Unos cien microlitros de la muestra se mezcl con 4,7 ml de 75% (vol / vol) etanol, ml 0,1 ml de 30% (peso / vol) de tiocianato de amonio, y 0,1 de 0,02 M de cloruro ferroso, que haba sido disuelta en 1 M HCl. Despus de 3 min, el grado de desarrollo de color, que representa la oxidacin de los cido linoleico, se midi espectrofotomtricamente a 500 nm. BHT y ?-Tocoferol (1 mg / ml) tambin se ensayaron como referencias antioxidantes. El control negativo (sin antioxidantes) tambin se consider. Purificacin de pptidos antioxidantes. WSE se fraccionaron por ultrafiltracin (Ultrafree-MC unidades de filtro centrfugo; Millipore) mediante el uso de tres tamaos diferentes de membrana con 50 -, 30 -, y los cortes 10-kDa (fracciones A, B, y C, respectivamente). Partes alcuotas de 400? L de WSE se centrifugaron a 10.000? g durante 60 min. Despus de la ultrafiltracin, las fracciones se utilizan para el ensayo de actividad radical DPPH de captacin. Los 10-kDa purificada parcialmente fracciones (C) eran ms fraccionado (37 fracciones) por reversephase rpido de cromatografa lquida (RP-FPLC), utilizando un recurso RPC columna y A KTA equipo FPLC con el detector de UV operando a 214 nm (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia). Alcuotas que contenan 1 mg / ml de los pptidos se aadieron a 0,05% (vol / vol) cido trifluoroactico (TFA) y se centrifug a 10.000? g durante 10 min. La sobrenadante se filtr con un 0,22?-m de tamao de poro del filtro y se carga en la columna. La elucin en gradiente se realiz a una velocidad de flujo de 1 ml / min usando una fase mvil compuesta de agua y acetonitrilo (CH3CN) que contiene 0,05% de TFA. La concentracin de CH3CN se aument linealmente 5 a 46% entre 16 y 62 min y de 46 100% entre 62 y 72 min. Los disolventes se separaron a partir de fracciones recogidas por liofilizacin. Las fracciones se volvieron a disolver en agua estril y se someti a en ensayos in vitro para la actividad antioxidante. La protelisis y la estabilidad trmica de las fracciones purificadas. Las fracciones purificadas de WSE, que mostraron las actividades ms antioxidantes, fueron sometidos a hidrlisis de las protenas secuencial por las enzimas digestivas de acuerdo con el mtodo descrito por Pasini et al. (34). En pocas palabras, alcuotas liofilizadas correspondientes a los pptidos 10mgof se suspendieron en 400? l de 0.2NHCl (PH 2,0) que contiene 0,05 mg / ml de pepsina (EC 3.4.23.1) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) y se homogeneizaron en un Sterilmixer Lab (PBI Internacional).

Despus de 30 min de incubacin a 37 C bajo condiciones de agitacin (150 rpm), 115? l de una solucin de cido 1Mboric y NaOH 0,5 N, se ajust a pH 6,8 con HCl 5 N y que contiene 0,25 mg / ml de pancreatina (Sigma) y 0,0087 mg / ml de tripsina (EC 3.4.21.4) (Sigma), se aadi. El resultante pH fue de 7,6. Digestin pancretica dur 150 min. Muestras digeridas se calentaron durante 5 min a 100 C y se centrifug a 12.000? g durante 20 min a recuperar los sobrenadantes. Despus de los tratamientos, las muestras se sometieron a en ensayos in vitro para la actividad antioxidante. Identificacin de pptidos antioxidantes. Las fracciones de WSE con la ms altos radical eliminadora de actividades fueron sometidos a una segunda etapa de purificacin mediante RP-HPLC en las condiciones descritas anteriormente y con Ana KTA aparato purificador (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ). Los centros de los picos se recogieron, liofilizado,y utilizado para la espectrometra de masas (MS). La identificacin de los pptidos se llev a cabo por nano-lquido cromatografa de ionizacin por electrospray en tndem MS (nanoLC-ESIMS /MS) utilizando un Finningan LCQ Deca XP Max trampa de iones espectrmetro de masas (ThermoElectron) a travs de la interfaz de nano-ESI. De acuerdo con los fabricante ajustes del instrumento para el anlisis de nano-LC-ESI-MS/MS, MS / MS espectros fueron tomados automticamente por el software Xcalibur (Thermo-Electron) en el modo de iones positivos. Los espectros se procesaron usando el software BioWorks 3,2 (ThermoElectron), generacin de listas de pico adecuados para bsquedas de bases de datos. Los pptidos se identificaron usando un MS / MS de iones de bsqueda con el motor de bsqueda MASCOT (Matrix Science, Londres, Inglaterra) y de la base de datos de protenas NCBInr (Centro Nacional de Informacin Biotecnolgica, Bethesda, MD). Para la identificacin de pptidos, los siguientes parmetros se consideraron: la enzima, ninguno; tipo de instrumento, ESI-trampa;tolerancia de la masa pptido,? 0,1%, y la tolerancia de masas de fragmentos,? 0,5 Da.Los resultados de la identificacin de pptidos se sometieron a una evaluacin manual como se describe por Chen et al. (5), y las secuencias de pptido validados explic todos los picos principales en el espectro MS / MS.Efecto de los pptidos purificados sobre la viabilidad de las clulas inducidas por la oxidacin.Fibroblastos de ratn (Balb 3T3; clon A31; ATCC CCL-163TM) se cultivaron bajo una atmsfera humidificada (5% de CO2, 37 C) usando Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% (peso / vol) fetal suero bovino (FBS), 1 mM de glutamina, y 100? g / ml penicillinstreptomycin.El medio de cultivo se renov cada 2 das, y despus de cuatro pasajes de los cultivos se utilizaron para determinar la viabilidad celular. Clula viabilidad se midi usando el MTT [3 - (4,5-dimetil-2-il) -2,5 -bromuro de difeniltetrazolio] mtodo (18), y la capacidad de succinato deshidrogenasa para convertir 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro visibles en cristales de formazn se evalu. Para el Ensayo de MTT, las clulas fueron sembradas en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5? 104 clulas / pocillo y se incubaron durante 16 h. Las clulas posteriormente se trataron con las antioxidantes fracciones purificadas y se incubaron durante 16 h. Las finales concentraciones de pptidos en la mezcla de reaccin eran 1,20, 0,81, 2,33,0,41, 1,79, 2,88, 1,69, y 1,67 mg / ml para WSE partir de la fraccin 3 de toda trigo, las fracciones 2 y 3 de espelta, fracciones 5 y 36 de centeno, y las fracciones 2, 3, y 37 de kamut, respectivamente. Un control negativo, sin la adicin de fracciones de pptidos, se utiliz. ?-Tocoferol (250 y 500? M) fue utilizadocomo control positivo. Despus de la eliminacin de FBS, las clulas fueron expuestas a 150? perxido Mhydroxide durante 2 h. Para cada pocillo, 250? L de MTT (0,5 mg / ml

concentracin final) disuelto en DMEM se aadi, y la incubacin (37 C) en la oscuridad se dej durante 1 h. Finalmente, dimetilsulfxido (DMSO) (250? L) se aadi para solubilizar el formazano que era formado. El nivel de formazan se determin midiendo el ptico densidad a 570 nm con un Biotek EL808 lector de microplacas (Winooski, VT). La viabilidad celular relativa se determin como el nivel de MTT convertido en sal de formazn. Los datos se expresaron como la media del porcentaje viable de clulas en comparacin con la del cultivo de control antes de que el estrs oxidativo. El anlisis estadstico. Los datos se sometieron a anlisis de una va de la varianza (ANOVA), la comparacin par de medios de tratamiento se logr Procedimiento de Tukey a P? 0,05 utilizando Statistica para Windows. RESULTADOS Fermentacin de masa fermentada. Despus de 24 h de fermentacin a 37 C, bacterias del cido lctico alcanzaron densidades celulares que van desde 1,2? 0,4 a 6.2? 0,5? 109 UFC / g. Los valores ms bajos se encontraron durante la fermentacin de masa fermentada de avena, arroz y harinas de maz. No significativo (P? 0,05) se encontraron diferencias entre las densidades de clulas de masas madre hechas con harina integral, trigo duro, centeno, espelta, kamut, y harinas de cebada. Antes de la fermentacin, los valores de pH fueron 5,20? 0,05, 5,27? 0,06, 5,82? 0,04, 5,45? 0,08, 4,56? 0,02, 5,15?0,02, 5,37? 0,03, 5,23? 0,03, y 4,45? 0,02 para el trigo integral, trigo duro, centeno, espelta, avena, arroz, kamut, cebada y maz masas, respectivamente. Despus de la fermentacin, los valores de pH oscilaron entre 3,40? 0,03 a 3,88? 0,05. Los valores de pH ms bajos se encontraron para el arroz (3,26? 0,02) y trigo (3,40? 0,03) masas madre. El valor ms alto fue encontrado de masa madre de avena (3,88? 0,05). En la actividad antioxidante in vitro de WSE. WSE de masas madre y masas de control tenan valores de pH que van desde 6,5? 0,2 a 7,0? 0,2 como una consecuencia de la extraccin con el tampn Tris-HCl. Como se determin por theOPAmethod, las concentraciones de pptidos ofWSE fueron 0,68? 0,04, 0,41? 0,02, 1,12? 0,05, 0,68? 0,05, 0,31?0,01, 0,18? 0,02, 0,61? 0,03, 0,71? 0,03, y 0,91? 0,04 mg / ml para trigo, trigo duro, centeno, espelta, avena, arroz, kamut, cebada,y masas madre de maz, respectivamente. Las concentraciones de pptidos de WSE de las masas acidificadas qumicamente fue ca. 2 a 3 veces ms bajos que los de las masas madre respectivas. Durante el ensayo de captacin de radicales, el DPPH estable de color radical se reduce a DPPH-H (forma no radical), en presencia de un antioxidante o un donante de hidrgeno. TheDPPHradical sin antioxidantes era estable en el tiempo. Bajo las condiciones de ensayo, 100% de actividad corresponde a la ofDPPH completa barrido radicales (50? M concentracin final) despus de 10 min de incubacin con los compuestos antioxidantes. De acuerdo con estudios previos (38, 50), la intensidad de color del radical DPPH mostr una logartmica disminuir en la presencia de BHT. El radical de captacin actividad hacia los radicalDPPHwas estables en el rango de 3,0%?0,2% a 5,5%? 0,2% para WSE masas qumicamente acidificados (Fig.1). No hay significativas (P 0,05) se encontraron diferencias entre las muestras. BHT (1 mg / ml) mostr una actividad de ca. 65% (10 min). Casi masas madre allWSEfrom mostr un marcado incremento de la radical de captacin de actividad en comparacin con la de la qumica masas acidificadas. Trigo duro, maz, cebada y masas madre no mostraron aumentos apreciables. La mayor actividad de barrido se encontr para

trigo integral (48,0%? 0,4%), kamut (39,0%?0,2%), la espelta (37,3%? 0,4%) y centeno (35,4%? 0,5%) masas madre. Basndose en estos resultados, WSE desde qumicamente acidific masas no se caracterizaron adicionalmente. La peroxidacin de lpidos se cree que proceder a travs de la radicalmediated abstraccin de tomos de hidrgeno de carbonos de metileno en cidos grasos poliinsaturados (35). La absorbancia de WSE en 500 masas madre nmfrom fue mayor que la de los controles positivos,lo que muestra una menor inhibicin de la autoxidacin cido linoleico (Fig.2). De acuerdo con los resultados anteriores de barrido radical-actividades, la oxidacin del cido linoleico fue marcadamente inhibida por la adicin de WSE de trigo, espelta, centeno, kamut y masas madre. WSE partir de trigo duro, arroz, avena, cebada y maz masas madre mostraron actividades dbiles. Con el objetivo de la identificacin posterior de pptidos antioxidantes, WSE de trigo, espelta, centeno, kamut y masas madre se someten a ultrafiltracin (puntos de corte de 10, 30 y 50 kDa) y adems ensay la actividad captadora de radicales. Todas las fracciones deultrafiltracin mostraron actividad hacia el radical DPPH, lo que sugiere que la masa molecular de los compuestos antioxidantes fue menos de 10 kDa (datos no mostrados). Purificacin y caracterizacin de pptido antioxidante fracciones. Treinta y siete fracciones se recogieron por la RP-FPLC separacin de cada WSE (alcuotas contena 10 mg de pptidos, como se determin por el mtodo OPA). Los perfiles peptdicos de la diferenteWSE fueron similares (Fig. 3). Las fracciones recogidas se liofilizaron, se disuelve en ca. 600? L de agua destilada, y se ensayaron para DPPH radical-actividad captadora y la inhibicin de la auto-oxidacin de cido linoleico. Basado en la DPPH radical de captacin de ensayo, ocho fracciones con mayor 2 y 3 tenan cargas netas positivas o neutro, mientras que las secuencias n.24 y n.25 partir de la fraccin 37 tenan cargas negativas netas. Efecto de los pptidos purificados sobre la viabilidad de la oxidacin inducida en las clulas. Para investigar la capacidad de los pptidos purificados para actuar como eliminadores de radicales, los cultivos de fibroblastos de ratn se cultivaron en la presencia de ocho fracciones purificadas de trigo, espelta, centeno,y masas madre kamut. Las clulas entonces se trataron con hidrxido perxido. En las condiciones experimentales, la viabilidad celular se evalu mediante el ensayo de la capacidad funcional de la mitocondria a catalizar la reduccin de MTT a formazn sal va mitocondrial deshidrogenasas. ?-Tocoferol y todas las fracciones purificadas ha aumentado la supervivencia de clulas en comparacin con la del control negativo (55,4%? 0,2% de la viabilidad celular despus de un estrs oxidativo) (Fig. 5). En particular, purificado fraccin 3 de masa madre de escanda mostraron una significativa (P? 0,05) la actividad mayor que la inducida por 500? M ?-Tocoferol (93,6%? 0,2% frente a 87,2%? 0,1%). Otros tres fracciones purificadas (2 de kamut y el 5 y 36 de masas madre de centeno) viabilidad celular inducida mayor que la inducida por 250? M?-Tocoferol (77,6%? 0,1%, el 73,9%? 0,4%, el 78,6%? 0,4%, y 70,8%? 0,3%, respectivamente).

DISCUSIN Fermentacin de masa fermentada tiene un papel bien conocido en la mejora de la propiedades nutricionales del trigo, el centeno, la avena y productos de panadera (22). Lo estabiliza o aumenta los niveles de varios compuestos bioactivos, retarda la biodisponibilidad de almidn (lo que disminuye el ndice glucmico), y aumenta la biodisponibilidad mineral (10, 13, 42). Para nuestro conocimiento,este es el primer estudio que hall la capacidad de masa fermentada de bacterias del cido lctico para liberar pptidos con actividad antioxidante a travs de la protelisis de las protenas de cereales nativas. En las reas de nutricin humana y la bioqumica, los antioxidantes naturales de fuentes de alimentos son estudiados en gran parte debido a su potencial para la salud beneficios con pocos efectos secundarios o no. Baja masa molecular, de bajo costo, actividad alta, y fcil absorcin son las principales caractersticas de antioxidante pptidos. Aunque los antioxidantes sintticos son ms eficaces, antioxidantes naturales tienen una estructura ms simple, mayor estabilidad, y no peligrosas reacciones inmunes (43). Se presume que pptidos bioactivos derivados de las protenas de cereales no son inmunognicas /alergnico hacia las personas sanas, pero son inmunognicas / alergnico para los sujetos que sufren de alergias especficas, la intolerancia, y / o sensibilidad a ellos. Trigo entero, trigo duro, centeno, espelta, avena, arroz, kamut, la cebada, y el maz son las harinas de cereales ms comunes que se utilizan para la fabricacin de fermentada productos horneados. Fermentacin lctica por Sourdough seleccionado bacterias de cido se dej durante mucho tiempo y bajo condiciones semilquido, que son indispensables para aprovechar al mximo la proteolisis microbiana (16, 38). Bajo estos parmetros de procesamiento, un moderado pero no demasiado extensa degradacin de las protenas de la harina producido (38). La piscina de bacterias de cido lctico utilizado para la fermentacin de masa fermentada incluy 10 cepas, las cuales fueron previamente seleccionados en base sobre las actividades de proteinasa y peptidasa hacia las protenas de trigo (37). Proteinasa actividad y, sobre todo, una gran cartera de peptidasas son los requisitos previos para liberar pptidos bioactivos durante sourdough de fermentacin (11, 17). Las actividades hidrolizantes responsables para la degradacin de las protenas de cereales no estn muy extendidos en masa fermentada bacterias de cido lctico, y, en general, es muy raro que una nica cepa microbiana posee todas las enzimas necesarias (13). Anteriormente, el mismo grupo de bacterias del cido lctico fue exitosamente utilizada para degradar los eptopos responsables de la enfermedad celiaca (37) y al sintetizar pptidos inhibidores de la ECA durante la fermentacin de masa fermentada de harinas de trigo y de centeno (38). A pesar de una activacin de las enzimas endgenas de cereales debido a la acidificacin (16), la actividad antioxidante de los qumicamente masas acidificadas (controles) fue muy baja. WSE de masas madre varios que tena casi el mismo nivel de acidez que el de los controles, mostraron una elevada in vitro radical de captacin de actividad y la inhibicin de la auto-oxidacin de cido linoleico. Masas madre de trigo, centeno, espelta, kamut y tuvo la mayor actividad, que, sin embargo, a la concentracin ensayada fueron inferiores los de BHT y?-tocoferol. Muchos cereales son especies estrechamente relacionadas, pero muchos factores, como el alto nivel de polimorfismo, la relacin entre los diferentes fracciones de protena (clases de

solubilidad), la composicin de aminocidos y la secuencia, y la masa molecular de los polipptidos individuales, diferenciar los aspectos tecnolgicos, estructurales, nutricionales y propiedades funcionales de las harinas (44). As, las diferencias de la funcional propiedades de los pptidos que se derivan de diferentes cereales fueron esperado. Con el objetivo de purificar pptidos antioxidantes, ocho fracciones (La concentracin de pptidos fue inferior a 3 mg / ml) de trigo integral, masas madre de espelta, centeno, kamut y se seleccionaron despus de RP-FPLC separacin. Seis fracciones eluidas en la zona inicial de el gradiente de acetonitrilo. Los otros dos se eluyeron en el extremo de el gradiente de acetonitrilo. El vitro de la actividad antioxidante de algunas de estas fracciones (3 y 36 de espelta y centeno, respectivamente) fue mayor que la de los antioxidantes sintticos utilizados como positivos controles. Como se inform anteriormente (29, 38), las fracciones purificadas pueden mostrar mayor bioactividad que el extracto crudo como la consecuencia de la concentracin ms alta del compuesto activo en comparacin con la de los otros constituyentes de la matriz. Para ser activo, pptidos antioxidantes deben tener la capacidad de superar hidrlisis y modificaciones a nivel intestinal y para alcanzar sus objetivos (43). En general, la actividad antioxidante de la fracciones purificadas pareci no verse afectada por secuencial in vitro tratamientos con enzimas digestivas. Una ligera disminucin de la actividad antioxidante se encontr slo para la fraccin 37 de la masa madre kamut y las fracciones 5 y 36 de masa madre de centeno, que contena pptidos que tienen el tamao ms grande. Despus de los ensayos in vitro, ex vivo actividad antioxidante de las fracciones purificadas se determin para fibroblastos de ratn, que fueron sometidos a oxidacin artificial estrs. Como byMTTassays mostrados, todas las fracciones purificadas mostraron un efecto protector marcado. En particular, las fracciones 3 de escanda de masa fermentada y 36 de masa madre de centeno, que tambin mostr la mayor inhibicin in vitro de la autooxidacin cido linoleico, tuvo un efecto sobre la supervivencia de fibroblastos de ratn comparable a la de los ?-Tocoferol. Sin embargo, un ensayo in vivo especfica debe llevarse para evaluar el efecto en la salud humana. Veinticinco pptidos se encontraron en las fracciones purificadas por nano-LC-ESI-MS/MS anlisis. Ninguno de estos pptidos fue previamente reportado como un antioxidante (43). Una mezcla de pptidos fue identificado en todas las fracciones activas. En general, se plante la hiptesis que la actividad antioxidante ms potente fue atribuido a el efecto sinrgico entre los pptidos en lugar de al individuo actividad de los pptidos individuales (5). Casi la totalidad de las secuencias mostr las caractersticas tpicas de los pptidos antioxidantes bien conocidos, tales como baja masa molecular (43). La presencia de aminocidos, tales como Tyr (Y), Trp (W), Met (M), Lys (K), Pro (P), Cys (C), His (H), Val (V), Leu (L), y Ala (A), se atribuye, por diferentes razones, a la actividad antioxidante de los pptidos (42). A excepcin de las secuencias DNIPIVIR y GTIFFSQEGDGPTSVTGSVSGLKPGLHGFHVH ALGDTTNGCMSTGPHFNPTGK, que se encuentra en las fracciones 3 de todo trigo fermentado y 36 de masa madre de centeno, respectivamente, todos los otras secuencias estn constituidos totalmente (por ejemplo, a partir de HPVPPKKK fraccin 3 de masa madre de escanda) o en su mayora por los aminocidos descritos anteriormente. Aminocidos hidrfobos mejorar la solubilidad de pptidos en los lpidos, facilitando as el acceso a radical hidrfobo especies y a PUFAs hidrfobos (cidos grasos poliinsaturados) (43). De hecho,

14 de las 25 secuencias tenan proporciones hidrfobos anteriores 50%. Los mayores niveles de hidrofobicidad se encontraron para la secuencias MAPAAVAAAEAGSK (64%), EALEAMFL (75%), LCPVHRAADL (60%), y PAEMVAAALDR (70%). El grupo SHde Cys (C) tiene una actividad antioxidante crucial debido a su interaccin directa con radicales (34). La secuencia NANGELCPNNMCCSQWGYCGLGSEFCGNGCQSGACCPEK, que se identific en la fraccin 5 de masa madre de centeno, contiene 8 residuos de cistena. Era La hiptesis de que la actividad antioxidante de His-pptidos que contienen est relacionado con el donador de hidrgeno radicaltrapping, lpidos peroxilo, y / o el quelante de iones metlicos capacidad del imidazol grupo (3, 36). Ocho secuencias contena sus restos. En particular, His en el extremo N terminal se encontr para el HPVP secuencias PKKK y HKEMQAIFDVYIMFIN a partir de fracciones de 3 escanda de masa fermentada y 23 de masa fermentada kamut, e His en el extremo C terminal se encontr para el KVALMSAGSMH secuencias y GVSNAAVV AGGH a partir de fracciones de masa madre de centeno 15 y 2 de la masa madre kamut.His en el extremo N terminal acta principalmente como un quelante de iones metlicos, mientras que en el extremo C Su es un eliminador eficaz contra diversos radicales (4). Cuatro secuencias tienen Ala o Leu en el extremo N o C terminal, que se muestra ya que una caracterstica tpica de pptidos antioxidantes (43, 47). Los aminocidos con residuos aromticos pueden donar protones a deficientes en electrones radicales. Este establecimiento de mejora de la actividad eliminadora de radicales de pptidos (43). Diecisis secuencias que figuran uno o ms aminocidos aromticos. Este estudio muestra que la seleccin de bacterias de cido lctico tienen la capacidad para sintetizar pptidos antioxidantes durante la masa madre fermentacin de harinas de cereales distintos. Las condiciones de fermentacin empleado aqu se aplican a nivel industrial para la fabricacin de sin aditivos productos de panificacin con alto valor nutritivo. Los pptidos purificados mostr propiedades bioactivas compatible con diferentes mecanismos antioxidantes, indicando as presuntivo proteccin contra los radicales libres. Estas caractersticas podran conducir a la produccin de alimentos funcionales innovadores y el diseo de nuevos pptidos sintticos para aplicaciones alimentarias / farmacutica