NTC5732

NORMA TCNICA COLOMBIANA
NTC 5732
2009-12-16
DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS QUMICOS. ENSAYO CUANTITATIVO DE SUSPENSIN PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD BACTERICIDA DE PRODUCTOS PARA EL TRATAMIENTO POR FROTACIN Y LAVADO HIGINICO Y QUIRRGICO DE LAS MANOS. MTODO DE ENSAYO. REQUISITOS (FASE 2/ETAPA 1)
E:
CHEMICAL DESINFECTANTS AND ANTISEPTICSQUANTITATIVE SUSPENSION TEST FOR THE EVALUATION OF BACTERICIDAL ACTIVITY OF PRODUCTS FOR HYGIENIC AND SURGICAL HANDRUB AND HANDWASH USED IN HUMAN MEDICINE TEST METHOD AND REQUIREMENTS (PHASE 2/STEP1).
CORRESPONDENCIA:
esta norma es una adopcin idntica (IDT) de la EN 12054:2001. investigacin; desarrollo; innovacin; proyectos; requisitos; planificacin; beneficios.
DESCRIPTORES:
I.C.S.: 11.080.20
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435
Prohibida su reproduccin
Editada 2009-12-24
PRLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 5732 fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-12-16. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 81 Desinfectantes y productos afines para uso hospitalario.
3M DE COLOMBIA S.A. ALKAMEDICA B BRAUN MDICAL BIOCONTROL LTDA. CENTRO DE MEDICINA NAVAL CLNICA SHAIO COMPENSAR ELECTROQUMICA WEST, ELECTROWEST GRUPO CENTRALES DE ESTERILIZACIN HOSPITAL DE LA VICTORIA HOSPITAL SANTA CLARA INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS -INVIMA JOHNSON & JOHNSON DE COLOMBIA
JOHNSON DIVERSEY COLOMBIA LTDA. JONSON DIVERSEY COLOMBIA LAB EUFAR LABORATORIO SFC LTDA. LAOREM INTERNACIONAL LABORATORIO NULAB LTDA PRODUCTOS PERFEX LTDA Y FULLER MANTENIMIENTO S.A. QUIRUMDICAS SOPSALUD-SOCIEDAD DE PROFESIONALES DE LA SALUD LTDA. SOPSALUD-SOCIEDAD DE PROFESIONALES DE LA SALUD LTDA. TEJADA TRADING
Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las siguientes empresas: ASOCIACIN COLOMBIANA ENFERMEROS EN CONTROL INFECCIONES-ACECI CLNICA DEL CAMPESTRE ELECTROWEST ELECTROQUMICA WEST S.A. DE DE INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS INVIMAJOHNSON & JOHNSON DE COLOMBIA S.A. JOHNSON DIVERSEY COLOMBIA LTDA.
LABORATORIO SFC LTDA. LABORATORIOS EUFAR S.A. LAOREM INTERNATIONAL LTDA.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA SECRETARA DISTRITAL DE SALUD UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIN DE NORMALIZACIN
NTC 5732
CONTENIDO
Pgina 1. ALCANCE ....................................................................................................................1
2.
REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1
3.
TRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2
4. 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6
REQUISITOS................................................................................................................2 GENERALIDADES.......................................................................................................2 FRICCIN HIGINICA DE MANOS.............................................................................3 LAVADO HIGINICO DE MANOS...............................................................................3 FRICCIN QUIRRGICA DE MANOS ........................................................................3 LAVADO QUIRRGICO DE MANOS ..........................................................................3 FRICCIN HIGINICA DE MANOS Y LAVDO HIGINICO DE MANOS......................
5. 5.1 5.2 5.3 5.4
MTODO DE ENSAYO PRINCIPIO....................................................................................................................3 MATERIALES Y REACTIVOS .....................................................................................4 EQUIPOS Y MATERIALES DE VIDRIO ......................................................................7 PREPARACIN DE LAS SUSPENSIONES Y LAS SOLUCIONES PARA ENSAYO............................................................................................................8 PROCEDIMIENTO......................................................................................................10 CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS .........................................................14 CONCLUSIN............................................................................................................17 INFORME DE ENSAYO .............................................................................................18
5.5 5.6 5.7 5.8
NTC 5732
Pgina
ANEXOS ANEXO A (Normativo) MTODO DE ENSAYO PARA LA VALIDACIN DE LOS MTODOS DE DILUCIN-NEUTRALIZACIN Y FILTRACIN PORM MEMBRANA .................................20 ANEXO B (Informativo) NEUTRALIZADORES ............................................................................................................26 ANEXO C (Informativo) LQUIDOS DE ENJUAGUE ...................................................................................................27 ANEXO D (Informativo) EJEMPLO DE UN INFORME DE ENSAYO TPICO..............................................................28 ANEXO E (Informativo) CEPAS DE REFERENCIA CORRESPONDIENTE EN OTRAS COLECCIONES DE CULTIVO ..........................................................................................................................30 ANEXO F (Informativo) INFORMACIN SOBRE LA APLICACIN Y LA INTERPRETACIN DE LAS NORMAS EUROPEAS SOBRE LOS DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS QUMICOS..................31 Tabla 1. Tiempo de contacto para diferentes categoras de producto
NTC 5732
DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS QUMICOS. ENSAYO CUANTITATIVO DE SUSPENSIN PARA LA EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD BACTERICIDA DE PRODUCTOS PARA EL TRATAMIENTO POR FRICCION Y LAVADO HIGINICO Y QUIRRGICO DE LAS MANOS. MTODO DE ENSAYO REQUISITOS (FASE 2/ETAPA 1)
1.
ALCANCE
Esta norma establece un mtodo de ensayo y los requisitos para determinar la actividad bactericida mnima de productos para friccin (sin agua) y lavado de las manos, para el tratamiento poscontaminacin de las manos, o para la desinfeccin quirrgica de las manos. Campo de aplicacin: se emplea en las reas y situaciones donde se indica mdicamente la desinfeccin de las manos. Tales indicaciones se presentan en el cuidado del paciente, por ejemplo: en hospitales, en instalaciones mdicas comunitarias y en instituciones odontolgicas en clnicas de escuelas, jardines infantiles y hogares geritricos.
Es aplicable en los sitios de trabajo y del hogar. Igualmente se pueden incluir servicios como lavanderas y cocinas que suministran productos directamente a los pacientes. No es posible determinar la actividad bactericida del producto para FRICCION de manos no diluido usando esta norma , dado que siempre se produce algn grado de dilucin al aadir el inculo. Por lo tanto, no es posible el ensayo confiable de productos que contienen 5% de agua o menos.
2.
REFERENCIAS NORMATIVAS
Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicacin de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica nicamente la edicin citada. Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin del documento normativo referenciado. (incluida cualquier correccin). NTC 5150, Antispticos y desinfectantes qumicos. Actividad bactericida bsica. Mtodo de ensayo y requisitos (fase 1). (EN 1040) NTC 5593, Antispticos y desinfectantes qumicos. Conservacin de las cepas microbianas utilizadas para la determinacin de la actividad bactericida y fungicida. (EN 12353)
1 de 33
NTC 5732
EN 1499, Chemical Disinfectants and Antiseptics - Hygienic Handwash - Test Method and Requirements (phase 2/step 2). EN 1500, Chemical Disinfectants and Antiseptics - Hygienic Handrub - Test Method and Requirements (phase 2/step 2).
prEN 12791, Chemical disinfectants and antiseptics- Surgical hand disinfectants - Test method and requirements (phase 2/step 2).
3.
TRMINOS Y DEFINICIONES
Para los propsitos de esta norma, se aplican los siguientes trminos y definiciones. 3.1 Producto (para desinfeccin y/o antisepsia qumica). Agente o formulacin qumica que se utiliza como desinfectante o antisptico qumico (NTC 5150 ). 3.2 Bactericida. Producto que destruye las bacterias vegetativas bajo condiciones definidas. 3.3 Actividad bactericida (en esta norma). Capacidad de un producto para reducir la cantidad de clulas bacterianas viables de los organismos pertinentes bajo las condiciones definidas por esta norma (en concordancia con la NTC 5150). 3.4 Friccin higinica de manos. Procedimiento poscontaminacin que implica la frotacin de las manos, sin adicin de agua, utilizando un producto bactericida dirigido contra microorganismos transitorios para evitar su transmisin, sin tener en cuenta la flora residente en la piel ( UNE EN 1500). 3.5 Lavado higinico de manos Procedimiento poscontaminacin que implica el lavado de las manos con agua, utilizando un producto bactericida dirigido contra microorganismos transitorios para evitar su transmisin, sin tener en cuenta la flora residente en la piel (EN 1499) 3.6 Friccin quirrgica de manos. Procedimiento prequirrgico que implica la frotacin de las manos sin la adicin de agua, utilizando un producto bactericida dirigido a la reduccin de la flora microbiana de las manos para evitar la transmisin de los microorganismos en procedimientos invasivos. 3.7 Lavado quirrgico de manos. Procedimiento prequirrgico que implica el lavado de las manos con agua, utilizando un producto bactericida dirigido a la reduccin de la flora microbiana de las manos con el fin de evitar la transmisin de los microorganismos durante procedimientos invasivos .
4. 4.1
REQUISITOS GENERALIDADES
El producto, cuando se somete a ensayo segn lo indicado en el numeral 5, debe demostrar una reduccin en los recuentos viables tal como se indica en los numerales 4.2, 4.3, 4.4 o 4.5 para cada uno de los siguientes organismos de ensayo: Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus.
NTC 5732
Este mtodo corresponde a un ensayo de fase 2/etapa 1, por lo cual es necesario un ensayo adicional de fase 2/etapa 2 (EN 1499: ao, UNE- EN 1500) antes de que se pueda cumplir la declaracin del rtulo que indica desinfectante quirrgico de manos de friccin higinica de manos, o de lavado higinico de manos. El producto debe cumplir con los requisitos que se indican en los numerales 4.2 a 4.6 de acuerdo con su aplicacin. 4.2 FRICCIN HIGINICA DE MANOS
El producto debe demostrar una reduccin de 105 en el recuento viable en 1 min 5 s. Adems, si el fabricante recomienda una exposicin inferior a 1 min, el producto debe demostrar una reduccin similar en el recuento viable en 30 s 5 s. 4.3 LAVADO HIGINICO DE MANOS
El producto debe demostrar una reduccin de 103 en el recuento viable en 1 min 5 s. Adems, si el fabricante recomienda una exposicin inferior a 1 min, el producto debe demostrar una reduccin similar en el recuento viable en 30 s 5 s. 4.4 FRICCIN QUIRRGICA DE MANOS
El producto debe demostrar una reduccin de 105 en el recuento viable en 5 min 10 s. Adems, si el fabricante recomienda una exposicin inferior a 5 min, el producto debe satisfacer el requisito de la Tabla 1 para uno de los siguientes tiempos de contacto opcional: 1 min 5 s, 2 min 10 s, 3 min 10 s, 4 min 10 s. El tiempo adecuado de contacto no debe ser superior al tiempo de exposicin recomendado por el fabricante. 4.5 LAVADO QUIRRGICO DE MANOS
El producto debe demostrar una reduccin de 103 en el recuento viable en 5 min 10 s. Adems, si el fabricante recomienda una exposicin inferior a 5 min, el producto debe satisfacer el requisito de la Tabla 1 para uno de los siguientes tiempos de contacto opcional: 1 min 5 s, 2 min 10 s, 3 min 10 s, 4 min 10 s. El tiempo adecuado de contacto no debe ser superior al tiempo de exposicin recomendado por el fabricante. 4.6 FRICCIN HIGINICA DE MANOS Y LAVADO HIGINICO DE MANOS
Los productos que cumplen con los requisitos segn lo indicado en los numerales 4.2 o 4.3 y se van a utilizar adicionalmente para la desinfeccin quirrgica de manos, no requieren de ensayo adicional en la fase 2/etapa 1 (para el ensayo de fase 2/etapa 1, vase Anexo F). Nota. Los requisitos de los numerales 4.4 y 4.5 se aplican a productos utilizados nicamente para desinfeccin quirrgica de manos y que no se han sometido a ensayo previamente segn lo indicado en los numerales 4.2 o 4.3.
5. 5.1
MTODO DE ENSAYO PRINCIPIO
Una suspensin de bacterias para el ensayo se adiciona a una muestra preparada del producto que se somete a prueba. nicamente para productos de lavado de manos, la muestra se prepara en agua dura (vase el numeral 5.2.2.7). La mezcla se conserva a una temperatura de 3
NTC 5732
20 C. A intervalos de tiempo especificados, incluyendo todos los perodos indicados en las instrucciones del fabricante, pero siempre en los intervalos establecidos en la Tabla 1, se toma una porcin alcuota; la accin bactericida de esta porcin se neutraliza o suprime inmediatamente mediante un mtodo validado. El mtodo de eleccin es el de dilucinneutralizacin. Sin embargo, si no se puede establecer un medio de neutralizacin adecuado, se utiliza la filtracin por membrana. Se determina la cantidad de bacterias sobrevivientes. La cantidad de bacterias en la suspensin de ensayo tambin se determina y se calcula la reduccin en el recuento viable.
Tabla 1. Tiempo de contacto para diferentes categoras de producto Tiempo de contacto recomendado por el fabricante 1 minuto < 1 minuto 1 minuto < 1 minuto 5 minuto < 5 minuto 5 minuto < 5 minuto
Procedimiento Friccin manos Lavado manos Friccin manos Lavado manos higinica higinico quirrgica de de de
Tiempo de contacto t usado en el ensayo 1 min 5 s 1 min 5 sy 30 s 5 s 1 min 5 s 1 min 5 s y 30 s 5 s 5 min 10 s 5 min 10 s y opcional: 1 min 5 s, 2 min 10 s, 3 min 10 s y/o 4 min 10 s 5 min 10 s 5 min 10 s y opcional: 1 min 5 s, 2 min 10 s, 3 min 10 s y/o 4 min 10 s
quirrgico
de
El ensayo se lleva a cabo utilizando Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus. 5.2 5.2.1 MATERIALES Y REACTIVOS Organismos de ensayo
La actividad bactericida se debe evaluar utilizando cuatro cepas. Se deben utilizar las siguientes cepas: Escherichia coli (K12) Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus hirae
1
NCTC1) 10538 ATCC1) 15442 ATCC1) 6538 ATCC1) 10541
5.2.2
Medios de cultivo y reactivos
5.2.2.1 Generalidades
1)
NCTC 10538, ATCC 15442, ATCC 6538 y ATCC 10541 son los nmeros de coleccin de la cepas suministradas por la coleccin nacional de cultivos tipo y la coleccin estadounidense de cultivos tipo. Esta informacin se suministra para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobacin por parte de ICONTEC del producto mencionado. Las cepas correspondientes suministradas por otras colecciones se pueden utilizar si se puede demostrar que producen los mismos resultados. NOTA Vase el Anexo E para el nmero de cepa correspondiente en algunas otras colecciones de cultivos.
NTC 5732
Los reactivos deben tener grado analtico y deben ser apropiados para los propsitos microbiolgicos.
NOTA Para mejorar la reproducibilidad, se recomienda la utilizacin de material deshidratado disponible en el comercio para la preparacin de los medios de cultivo. Se recomienda cumplir rigurosamente las instrucciones del fabricante relacionadas con la preparacin de estos productos.
5.2.2.2 Agua El agua debe estar libre de sustancias que sean txicas o inhibitorias para las bacterias. El agua debe estar destilada en vidrio recientemente y no desmineralizada. Esterilice en autoclave (vase el numeral 5.3.1).
NOTA 1 Si el agua se esteriliza durante la esterilizacin de los reactivos, este paso no es necesario.
NOTA 2 Si el agua destilada con calidad adecuada no est disponible, se puede utilizar agua para preparaciones inyectables (vase la Farmacopea Oficial).
5.2.2.3 Agar tripticasa de Soya (TSA) Para la conservacin de las cepas bacterianas y la realizacin de los recuentos viables. Triptona, digerido pancretico de casena Peptona de soya, digerido papanico de harina de soya NaCl Agar Agua (5.2.2.2) 15,0 g 5,0 g 5,0 g 15,0 g 1 000,0 ml
Esterilice en autoclave (vase el numeral 5.3.1). Despus de la esterilizacin, el pH del medio debe ser equivalente a 7,2 +/- 0,2 cuando se mide a 20 C. 5.2.2.4 Diluyente Solucin de cloruro de sodio y triptona: Triptona, digerido pancretico de casena NaCl Agua (vase el numeral 5.2.2.2) 1,0 g 8,5 g 1 000,0 ml
Esterilice en autoclave (vase el numeral 5.3.1). Despus de la esterilizacin, el pH del medio debe ser equivalente a 7,0 +/- 0,2 cuando se mide a 20 C. 5.2.2.5 Neutralizador El neutralizador se debe validar para el producto que se somete a ensayo, de acuerdo con lo indicado en el Anexo A. El neutralizador debe estar estril.
NOTA En el Anexo B se presenta informacin sobre los neutralizadores adecuados para algunas categoras de productos.
NTC 5732
5.2.2.6 Solucin de enjuague (para filtracin por membrana) La solucin debe ser estril, compatible con la membrana filtrante y con capacidad para la filtracin a travs de la membrana, bajo las condiciones de ensayo que se describen en el Anexo A.
NOTA En el Anexo C se presenta informacin sobre las soluciones de enjuague adecuadas para algunas categoras de productos.
5.2.2.7 Agua dura para la dilucin del producto de lavado de manos El agua dura para la dilucin de los productos se debe preparar de la siguiente manera: Prepare: Solucin A: Disuelva 19,84 g de cloruro de magnesio anhidro (MgCl2) o un cloruro de magnesio hidratado equivalente y 46,24 g de cloruro de calcio anhidro (CaCl2) o un cloruro de calcio hidratado equivalente en agua (vase el numeral 5.2.2.2) y diluya hasta completar 1 000 ml. Esterilice en autoclave (vase el numeral 5.3.1). Almacene la solucin a una temperatura entre 2C y 8C durante un perodo no superior a un mes. Solucin B: Disuelva 35,02 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) en agua (vase el numeral 5.2.2.2) y diluya hasta completar 1 000 ml. Esterilice mediante filtracin por membrana (vase el numeral 5.3.2.7). Almacene la solucin a una temperatura entre 2 C y 8 C durante un perodo no superior a una semana. Agua dura: Para la preparacin de 1 litro, vierta por lo menos 600 ml de agua (vase el numeral 5.2.2.2) en un matraz volumtrico de 1 000 ml (vase el numeral 5.3.2.12) y adicione 6,0 ml de la solucin A, luego 8,0 ml de la solucin B. Mezcle y diluya hasta completar 1 000 ml con agua (vase el numeral 5.2.2.2). El pH del agua dura debe ser de 7,0 +/- 0,2. Si es necesario, ajuste el pH utilizando una solucin de aproximadamente 40 g/l (cerca de 1 mol/l) de hidrxido de sodio (NaOH) o aproximadamente 36,5 g/l (cerca de 1 mol/l) de cido clorhdrico (HCl). El agua dura debe ser de preparacin reciente bajo condiciones aspticas y se debe utilizar en un perodo de 12 h.
NOTA Cuando se preparan las soluciones de ensayo del producto (vase el numeral 5.4.2), la adicin del producto a esta agua dura produce una dureza final del agua diferente en cada uno de los tubos de ensayo.
En todo caso la dureza final es inferior a 300 mg/kg de carbonato de calcio (CaCO3) en el tubo de ensayo. 6

5.3 5.3.1
NTC 5732
EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO Generalidades
Esterilice el material de vidrio y las partes del equipo que tendrn contacto con el medio de cultivo y los reactivos o la muestra, excepto aquellos que se suministran estriles, mediante uno de los siguientes mtodos: a) en un autoclave (vase el numeral 5.3.2.1) conservando una temperatura de 121+30 C durante un tiempo continuo mnimo de 15 min; en un esterilizador de calor seco (vase el numeral 5.3.2.1) conservando una temperatura de 180 C durante un tiempo continuo mnimo de 30 min, 170 C para un tiempo continuo mnimo de 1 h o 160 C para un tiempo continuo mnimo de 2 h. Equipo microbiolgico de laboratorio comn2) y, en particular, el siguiente:
b)
5.3.2
5.3.2.1 Equipos para esterilizacin a) Para esterilizacin con calor hmedo, un autoclave con capacidad para conservar una temperatura de 121+30 C para un tiempo continuo mnimo de 15 min; Para esterilizacin con calor seco, un horno de aire caliente con capacidad para conservar una temperatura de 180 C durante un tiempo continuo mnimo de 30 min, 170 C para un tiempo continuo mnimo de 1 hora o 160 C para un tiempo continuo mnimo de 2 h.
b)
5.3.2.2 Baos de agua o de mara, con capacidad para controlar la temperatura a 20 C 1 C y 45 C 1 C.2 5.3.2.3 Incubadora, con capacidad para controlar la temperatura a 36 C 1 C o 37 C 1 C. Se puede utilizar una incubadora a 37 C 1 C si no se dispone de una incubadora a 36 C 1 C. 5.3.2.4 Medidor de pH con una exactitud de calibracin de 0,1 unidades de pH a 25 C. 5.3.2.5 Cronmetro 5.3.2.6 Agitador (agitador electromecnico, como el mezclador Vortex .3
5.3.2.7 Equipo para filtracin por membrana construido con un material compatible con el producto que se somete a ensayo, con un porta filtro de volumen utilizable mnimo de 50 ml y adecuado para utilizar con filtros de dimetro entre 47 mm y 50 mm, con tamao de poro 0,45 m (para el mtodo de filtracin por membrana) y tamao de poro de 0,22 m (para esterilizacin por filtracin). La fuente de vaco utilizada debe suministrar una tasa de flujo de filtracin uniforme. Con el fin de obtener una distribucin uniforme de los microorganismos sobre la membrana en el mtodo
2)
El equipo desechable es una alternativa aceptable para el material de vidrio reusable. VORTEX es un ejemplo de un producto adecuado que se encuentra en el comercio. Esta informacin se suministra para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobacin de este producto por parte de ICONTEC.
NTC 5732
de ensayo de filtracin por membrana y para evitar una filtracin excesivamente prolongada, el dispositivo se debe ajustar de manera tal que se obtenga la filtracin de 100 ml del lquido de enjuague en un perodo entre 20 s y 40 s. 5.3.2.8 Recipiente: tubos de ensayo, frascos o matraces de cultivo con capacidad adecuada. 5.3.2.9 Pipetas graduadas, con capacidades nominales de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml, se pueden utilizar pipetas calibradas automticas. 5.3.2.10 Cajas de Petri que tengan un dimetro entre 90 mm y 100 mm.
NOTA Para el mtodo de recuento de caja, por el mtodo de dispersin, se pueden utilizar cajas de tamao superior (140 mm).
5.3.2.11 Perlas de vidrio con dimetro entre 3 mm y 4 mm. 5.3.2.12 Matraces volumtricos calibrados a 20 C. 5.3.2.13 Agitador mecnico 5.4 5.4.1 PREPARACIN DE LAS SUSPENSIONES Y LAS SOLUCIONES PARA ENSAYO Suspensiones bacterianas
5.4.1.1 Cultivos iniciales de los microorganismos de ensayo Los cultivos iniciales se deben conservar de acuerdo con los requisitos de la NTC 5593:2008 5.4.1.2 Cultivo de trabajo de los microorganismos Con el fin de preparar el cultivo de trabajo de las cepas (vase el numeral 5.2.1), realice un subcultivo a partir del cultivo inicial (vase el numeral 5.4.1.1) mediante trazos en los cultivos inclinados de TSA (vase el numeral 5.2.2.3) e incube (vase el numeral 5.3.2.3). Despus de un perodo entre 18 h y 24 h, prepare de la misma manera un segundo subcultivo a partir del primero y lleve a incubacin durante 18 h a 24 h. A partir de este segundo subcultivo se puede producir de la misma manera un tercer subcultivo. Nota. El segundo y/o tercer subcultivos representan el cultivo de trabajo. Si no es posible preparar el segundo subcultivo en un da particular, se puede utilizar un subcultivo de 48 h para el cultivo posterior, siempre que el subcultivo se haya conservado en una incubadora durante un periodo de 48 h. En estas circunstancias, prepare un cultivo de 24 h adicionales despus del procesamiento. No tome un cuarto subcultivo. 5.4.1.3 Suspensin bacteriana para ensayo Tome 10 ml del diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) y colquelo en un matraz de 100 ml con cinco gramos de perlas de vidrio (vase el numeral 5.3.2.11). Tome los cultivos de trabajo (vase el numeral 5.4.1.2) y transfiera con el asa redonda las clulas hacia el diluyente. Las clulas se deben suspender en el diluyente, sumergiendo el asa en ste y frotndola contra la pared lateral del matraz para desprender las clulas. Agite el matraz durante 3 min utilizando un agitador mecnico (vase el numeral 5.3.2.13). Aspire la suspensin de las perlas de vidrio y transfiera a otro tubo. Ajuste el nmero de clulas en la suspensiones hasta un 8
NTC 5732
valor entre 1,5 x 108 ufc/ml y 5 x 108 ufc / ml 4 utilizando el diluyente, estimando la cantidad de unidades mediante algn mtodo adecuado. Conserve esta suspensin en el bao de agua o mara a 20 C 1 C y utilice dentro de las 2 h siguientes. Prepare cuatro suspensiones bacterianas para ensayo, una utilizando Escherichia coli, una con Pseudomonas aeruginosa, otra con Enterococcus hirae y otra con Staphylococcus aureus. Para el recuento de la suspensin bacteriana para ensayo, prepare diluciones de 10-6 y 10-7 de la suspensin de ensayo utilizando el diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) y mezcle (vase el numeral 5.3.2.6). Tome una muestra de 1,0 ml de cada dilucin en duplicado e inocule usando la tcnica de siembra en caja o de dispersin en caja. (Siembra en superficie) Si se utiliza la tcnica de siembra en caja, (siembra en profundidad) vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml en cajas de Petri (vase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA (vase el numeral 5.2.2.3) fundido y enfriado a 45 C 1 C. Si se utiliza la tcnica de dispersin en caja, disperse cada muestra de 1,0 ml sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (vase el numeral 5.2.2.3). 5.4.1.4 Recuento de la suspensin bacteriana para ensayo Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) (vase el numeral 5.3.2.3.) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada muestra de 1,0 ml. Calcule el nmero de ufc/ml en la suspensin para ensayo (N) utilizando el mtodo que se indica en el numeral 5.6.1.1. 5.4.2 Solucin del producto para ensayo
5.4.2.1 Soluciones de ensayo para friccin de manos El producto para friccin de manos se utiliza sin diluir como solucin del producto para ensayo. Se deben registrar los detalles de las muestras de producto tal como se reciben. 5.4.2.2 Solucin de ensayo para lavado de manos Utilizando agua dura (vase el numeral 5.2.2.7.) como diluyente, prepare una dilucin al 55 % (V/V) de la preparacin del producto de lavado de manos para ensayo. La solucin del producto para ensayo debe ser de preparacin reciente y se debe utilizar durante un da de trabajo mximo (o menos si tiene baja estabilidad).
ufc/ml = unidades formadoras de colonias por mililitro

5.5 5.5.1 PROCEDIMIENTO Generalidades
NTC 5732
El mtodo de eleccin es el de dilucin-neutralizacin. Para determinar un neutralizador adecuado, se debe adoptar el siguiente procedimiento. La validacin del mtodo de dilucinneutralizacin (vase el literal A.4.1) se deben llevar a cabo utilizando un neutralizador adecuado, seleccionado de acuerdo con la experiencia del laboratorio y los datos publicados. Si este neutralizador no es vlido, repita el ensayo de validacin utilizando un neutralizador alterno que contenga una combinacin de: polisorbato 80 (30 g/l), saponina (30 g/l), L-histidina (1 g/l), lecitina (3 g/l), tiosulfato de sodio (5 g/l) bien sea en diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) o en 0,002 5 mol/l de solucin amortiguadora de fosfatos. Si ambos neutralizadores no son vlidos, se puede utilizar el mtodo de filtracin por membrana en lugar del mtodo de dilucinneutralizacin. 5.5.2 Mtodo de dilucin-neutralizacin
5.5.2.1 Generalidades Antes del ensayo, equilibre todos los reactivos (solucin del producto para ensayo, suspensin bacteriana para ensayo, neutralizador) a la temperatura de ensayo de 20C 1C utilizando el bao de agua o mara (vase el numeral 5.3.2.2). Verifique que la temperatura de los reactivos se estabilice en 20 C 1 C. 5.5.2.2 Procedimiento de ensayo para determinar la actividad bactericida de los productos para friccin higinica de manos o lavado higinico de manos, usados para el tratamiento poscontaminacin de las manos Vierta con pipeta 9,0 ml de la solucin de ensayo para friccin higinica de manos (vase el numeral 5.4.2.1) o de la solucin de ensayo para lavado de manos (vase el numeral 5.4.2.2) en un recipiente estril con capacidad aproximada de 25 ml. Aada 1,0 ml de una de las suspensiones bacterianas para ensayo (vase el numeral 5.4.1.3). Ponga en marcha inmediatamente el cronmetro, mezcle y coloque el recipiente en un bao de agua o mara controlado a 20 C 1.
NOTA Al aadir las suspensiones bacterianas para ensayo a los recipientes se recomienda tener precaucin para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente.
La actividad del producto se debe determinar para un tiempo de contacto de 1 min 5 s. Si el fabricante recomienda una exposicin inferior a 1 min, el producto tambin se debe ensayar en un tiempo de contacto de 30 s 5 s. Mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) justo antes de finalizar el tiempo de contacto seleccionado. En el tiempo de contacto seleccionado, vierta con pipeta 1,0 ml de la mezcla para ensayo en un tubo que contenga 8,0 ml de neutralizador (vase el numeral 5.2.2.5) y 1,0 ml de agua (vase el numeral 5.2.2.2). Mezcle y coloque en el bao de agua o mara controlado a 20 C 1 C. a) Los productos de ensayo para friccin de manos: despus del tiempo de neutralizacin de 1 min 5 s, prepare una dilucin de 10-1 de la mezcla neutralizada en el diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Tome una muestra de 1,0 ml de la mezcla y su dilucin de 10-1 en duplicado e inocule utilizando la tcnica de siembra en caja o dispersin en caja. Los productos de ensayo para lavado de manos: despus del tiempo de neutralizacin de 1 min 5 s, prepare una dilucin de 10-2 y 10-3 de la mezcla neutralizada en el 10
b)
NTC 5732
diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Tome una muestra de 1,0 ml de las diluciones de 10-2 y 10-3 de la mezcla neutralizada en duplicado e inocule utilizando la tcnica de siembra en caja o dispersin en caja ( siembra en superficie) Si se utiliza la tcnica de siembra en caja (siembra en profundidad), vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml en cajas de Petri (vase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA fundido (vase el numeral 5.2.2.3) y enfriado a 45 C 1 C. Si se utiliza la tcnica de dispersin en caja, disperse cada muestra de 1,0 ml sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (vase el numeral 5.2.2.3). Realice este procedimiento utilizando las otras suspensiones bacterianas para ensayo. 5.5.2.3 Recuento de la suspensin bacteriana para ensayo Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) (vase el numeral 5.3.2.3.) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento en las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en la mezcla para ensayo (Na) utilizando el mtodo que se indica en el numeral 5.6.1.2. Para calcular el recuento viable de la mezcla de ensayo, el factor de dilucin es 10-1 (para friccin de manos) o 10-2 y 10-3 (para lavado de manos). 5.5.2.4 Procedimiento de ensayo para la actividad bactericida de los productos para friccin quirrgica de manos y lavado quirrgico de manos Vierta con pipeta 9,0 ml de la solucin de ensayo para friccin quirrgica de manos (vase el numeral 5.4.2.1) o de la solucin de ensayo para lavado quirrgico de manos (vase el numeral 5.4.2.2) en un recipiente estril con capacidad aproximada de 25 ml. Aada 1,0 ml de una de las suspensiones bacterianas para ensayo (vase el numeral 5.4.1.3). Ponga en marcha inmediatamente el cronmetro, mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) y coloque el recipiente en un bao de agua o mara (vase numeral 5.3.2.2) controlado a 20 C 1 C.
NOTA Al aadir las suspensiones bacterianas para ensayo a los recipientes se recomienda tener precaucin para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente.
La actividad del producto se debe determinar para un tiempo de contacto de 5 min 10 s. Si el fabricante recomienda una exposicin inferior a 5 min, el producto tambin se debe ensayar para un tiempo de contacto de 1 min 5 s, 2 min 10 s, 3 min 10 s y/o 4 min 10 s. Mezcle justo antes de finalizar el tiempo de contacto seleccionado (vase numeral 5.3.2.6). En el tiempo de contacto seleccionado, vierta con pipeta 1,0 ml de la mezcla para ensayo en un tubo que contenga 8,0 ml de neutralizador (vase numeral 5.2.2.5) y 1,0 ml de agua (vase el numeral 5.2.2.2). Mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) y coloque en el bao de agua o mara (vase el numeral 5.3.2.2) controlado a 20 C 1 C. a) Los productos de ensayo para friccin de manos: despus del tiempo de neutralizacin de 5 min 10 s, prepare una serie de diluciones decimales de la mezcla neutralizada en el diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Tome una muestra de 1,0 ml de la mezcla y su dilucin de 10-1 por duplicado e inocule utilizando la tcnica de siembra en profundidad en caja o siembra en superficie.
11

b)
NTC 5732
Los productos de ensayo para lavado de manos: despus del tiempo de neutralizacin de 5 min 10 s, prepare una serie de diluciones de decimales de a mezcla neutralizada en el diluyente (vase el numeral 5.2.2.4). Tome una muestra de 1,0 ml de las diluciones de 10-2 y 10-3 de la mezcla neutralizada por duplicado e inocule utilizando la tcnica de siembra en profundidad en caja o siembra en superficie.
Si se utiliza la tcnica de siembra en profundidad, vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml en cajas de Petri (vase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA fundido (vase el numeral 5.2.2.3) y enfriado a temperatura de 45C 1C. Si se utiliza la tcnica de siembra en superficie, disperse cada muestra de 1,0 ml sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (vase el numeral 5.2.2.3). Realice este procedimiento utilizando las otras suspensiones bacterianas para ensayo. 5.5.2.5 Recuento de la suspensin bacteriana para ensayo Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) (vase el numeral 5.3.2.3) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en la mezcla para ensayo (Na) utilizando el mtodo que se indica en el numeral 5.6.1.2. Para calcular el recuento viable de la mezcla de ensayo, el factor de diluciones es 10-1 (para friccin de manos) o 10-2 y 10-3 (para lavado de manos). 5.5.3 Mtodo de filtracin por membrana
5.5.3.1 Generalidades Antes del ensayo, lleve todos los reactivos (solucin del producto para ensayo, suspensin bacteriana para ensayo, solucin de enjuague) a la temperatura de ensayo de 20 C 1 C utilizando el bao de agua o mara (vase el numeral 5.3.2.2) y controle la temperatura a 20 C 1 C. Verifique que la temperatura de los reactivos se estabilice en 20 C 1 C. 5.5.3.2 Procedimiento de ensayo para la actividad bactericida de los productos para friccin higinica de manos o lavado higinico de manos Vierta con pipeta 9,0 ml de la solucin de ensayo para friccin higinica de manos (vase el numeral 5.4.2.1) o de la solucin de ensayo para lavado de manos (vase el numeral 5.4.2.2) en un recipiente estril con capacidad aproximada de 25 ml. Aada 1,0 ml de una de las suspensiones bacterianas para ensayo (vase el numeral 5.4.1.3). Ponga en marcha inmediatamente el cronmetro, mezcle y coloque el recipiente en un bao de agua o mara controlado a 20 C.
NOTA 1 Al aadir las suspensiones bacterianas para ensayo a los recipientes se recomienda tener precaucin para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente.
La actividad del producto se debe determinar para un tiempo de contacto de 1 min 5 s. Si el fabricante recomienda una exposicin inferior a 1 minuto, el producto tambin se debe ensayar en un tiempo de contacto de 30 s 5 s. Mezcle justo antes de finalizar el tiempo de contacto seleccionado (vase el numeral 5.3.2.6). En el tiempo de contacto seleccionado, vierta con pipeta dos muestras de 1,0 ml de la mezcla 12
NTC 5732
para ensayo y transfiera cada muestra hacia un equipo de filtracin por membrana independiente que disponga de una membrana y que contenga 50 ml de la solucin de enjuague (vase el numeral 5.2.2.6). Filtre inmediatamente. El tiempo necesario para transferir y filtrar no debera exceder 1 min. Si es superior a 1 min, este tiempo se debe registrar en el informe del ensayo. Enjuague con 150 ml como mnimo pero no ms de 500 ml de solucin de enjuague (vase el numeral 5.2.2.6). Luego transfiera las membranas sobre la superficie de dos cajas individuales de TSA (vase el numeral 5.3.2.10).
NOTA 2 Al realizar la transferencia, se debe tener precaucin para garantizar que las bacterias se encuentran en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre el TSA y que no quede aire atrapado entre la membrana y la superficie de agar.
Realice este procedimiento utilizando las otras suspensiones bacterianas para ensayo. 5.5.3.3 Recuento de la mezcla de ensayo Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) durante 24 h (vase el numeral 5.3.2.3). Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento en las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en la mezcla para ensayo (Na) utilizando el mtodo que se indica en el numeral 5.6.1.2. 5.5.3.4 Procedimiento de ensayo para la actividad bactericida de los productos de friccin quirrgica de manos y lavado quirrgico de manos Vierta con pipeta 9,0 ml de la solucin de ensayo para friccin quirrgica de manos (vase el numeral 5.4.2.1) o de la solucin de ensayo para lavado quirrgico de manos (vase el numeral 5.4.2.2) en un recipiente estril con capacidad aproximada de 25 ml. Aada 1,0 ml de una de las suspensiones bacterianas para ensayo (vase el numeral 5.4.1.3). Ponga en marcha inmediatamente el cronmetro, mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) y coloque el recipiente en un bao de agua o mara (vase el numeral 5.3.2.2) controlado a 20 C 1 C.
NOTA 1 Al aadir las suspensiones bacterianas para ensayo a los recipientes se recomienda tener precaucin para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente.
La actividad del producto se debe determinar para un tiempo de contacto de 5 min 10 s. Si el fabricante recomienda una exposicin inferior a 5 min, el producto tambin se debe ensayar para un tiempo de contacto de 1 min 5 s, 2 min 10 s, 3 min 10 s y/o 4 min 10 s. Mezcle justo antes de finalizar el tiempo de contacto seleccionado (vase el numeral 5.3.2.6). En el tiempo de contacto seleccionado, vierta con pipeta dos muestras de 1,0 ml de la mezcla para ensayo y transfiera cada muestra hacia un equipo de filtracin por membrana independiente que disponga de una membrana y que contenga 50 ml de solucin de enjuague (vase el numeral 5.2.2.6). Filtre inmediatamente. El tiempo necesario para transferir y filtrar no debera exceder 1 minuto. Si es superior a 1 minuto, este tiempo se debe registrar en el informe del ensayo. Enjuague con 150 ml como mnimo pero no ms de 500 ml de solucin de enjuague (vase el numeral 5.2.2.6). Luego transfiera las membranas sobre la superficie de dos cajas individuales de TSA (vase el numeral 5.3.2.10).
NOTA 2 Al realizar la transferencia, se debe tener precaucin para garantizar que las bacterias se encuentran en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre el TSA y que no quede aire atrapado entre la membrana y la superficie de agar.
Realice este procedimiento utilizando las otras suspensiones bacterianas para ensayo. 13
NTC 5732
5.5.3.5 Recuento de la mezcla de ensayo Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) (vase el numeral 5.3.2.3) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento en las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en la mezcla para ensayo (Na) utilizando el mtodo que se indica en el numeral 5.6.1.2. 5.5.4 Validacin del mtodo de dilucin-neutralizacin y del mtodo de filtracin por membrana
Los mtodos de dilucin-neutralizacin y de filtracin por membrana se deben validar para cada uno de los de los cuatro microorganismos de ensayo (vase el Anexo E), segn se indica en el Anexo A. El ensayo de validacin (vase el Anexo A) tambin se debe realizar al mismo tiempo que el procedimiento (vase el numeral 5.5) utilizando las mismas condiciones (suspensiones bacterianas para ensayo, solucin del producto para ensayo, agua dura si se utiliza y neutralizador o solucin de enjuague) usadas en el ensayo (Vanse los numerales 5.5.2 y 5.5.3). 5.6 5.6.1 CLCULO Y EXPRESIN DE RESULTADOS Clculo de los recuentos viables (ufc/ml)
5.6.1.1 Suspensin bacteriana para ensayo Los recuentos viables de la suspensin bacteriana para ensayo (vase el numeral 5.4.1.4) se deben calcular segn los principios que se describen a continuacin: a) Se deben tener en cuenta nicamente los recuentos de colonias inferiores a 300 ufc/caja para el clculo de los recuentos viables. Para que un resultado sea vlido, por lo menos una caja debe contener 15 o ms colonias; es recomendable calcular los recuentos viables utilizando por lo menos un par de cajas, en las cuales una o ambas cajas contengan ms de 15 colonias y ambas contengan menos de 300 colonias. Si las cajas provenientes de dos diluciones estn dentro de este rango, se calcula el nmero de ufc/ml como el recuento recuento medio ponderado. Si las cajas provenientes de una sola dilucin estn dentro de este rango, se calcula la media aritmtica.
Para el clculo del recuento medio ponderado (en ufc/ml) se utiliza la frmula (1):
c d ( n1 + 0,1 n2 ) en donde c n1 n2 d es el nmero de colonias contadas en todas las cajas consideradas; es el nmero de cajas consideradas en la primera dilucin; es el nmero de cajas consideradas en la segunda dilucin; es el factor de dilucin correspondiente a la primera dilucin considerada. (1)
14
NTC 5732
Los resultados calculados se aproximan hasta dos cifras decimales. Para ello, si la ltima cifra est por debajo de cinco, la cifra anterior no se modifica; si la ltima cifra est por encima de 5, la cifra precedente se incrementa en una unidad; si la ltima cifra es igual a cinco, se aproxima la cifra precedente hasta la cifra superior ms prxima. Prosiga por pasos hasta obtener dos cifras decimales. a) como resultado, la cantidad de ufc/ml se expresa con un nmero entre 1,0 y 9,9 multiplicado por la potencia de 10 adecuada.
EJEMPLO:
168 + 215 + 14 + 25 ( 2 + 0,1 2 ) 10 6
422 2,2 10 6
= 1,918 2 x 108 1,9 x 108 (en ufc / ml )
(1)
5.6.1.2 Procedimiento y validacin del ensayo Para el procedimiento de ensayo (vanse los numerales 5.5.2.2, 5.5.2.4, 5.5.3.2 y 5.5.3.4) y el ensayo para la validacin (vanse los literales A.2, A.4.1 y A.4.2) el recuento viable se debera calcular utilizando el siguiente mtodo. Se recomienda utilizar nicamente los recuentos de colonias inferiores a 300 ufc por caja para el clculo de los recuentos viables. Tales recuentos se deberan calcular utilizando las colonias provenientes de ambas cajas. Cuando por lo menos una caja contienen 15 o ms colonias, se utiliza la siguiente frmula (2) para el clculo de los recuentos viables (en ufc/ml):
c n d V
(2)
en donde: c n d es la suma de las colonias contadas en ambas cajas; es la cantidad de cajas consideradas; es el factor de dilucin que corresponde a la dilucin considerada. Para el procedimiento de ensayo de dilucin-neutralizacin (vanse los numerales 5.5.2.3 y 5.5.2.5) y la suspensin bacteriana (vase el literal A.2) el factor de dilucin es 10-1; es el volumen de la muestra. Para el mtodo de dilucin-neutralizacin y el procedimiento de validacin (vanse los numerales 5.5.2.2, 5.5.2.4 y Anexo A literal A.4.1) y la suspensin bacteriana (vase el Anexo A.2), el volumen de la muestra es de 1,0 ml. Para el mtodo filtracin por membrana y el procedimiento de validacin (vanse los numerales 5.5.3.2, 5.5.3.4 y Anexo A.4.2) el volumen de la muestra es de 0,1 ml.
Para el procedimiento de ensayo (vase el numeral 5.5) cuando el nmero de ufc en todas las cajas contadas es inferior a 15, registre la cantidad de recuentos viables de la mezcla de ensayo como inferior a 1,5 x 101 ufc/ml (<1,5 x 101 ufc/ml). Cuando el nmero de ufc en todas las cajas contadas es superior a 300, registre el recuento viable de la muestra de ensayo como superior a 3 x 102 ufc/ml (> 3 x 102 ufc/ml).
15

5.6.2 Verificacin de la metodologa
NTC 5732
5.6.2.1 Mtodo de dilucin-neutralizacin Asegrese de lo siguiente: a) ningn recuento de caja individual utilizado para calcular el valor de N, A y B debe ser superior a 300 ufc/ml; N, A y B estn entre 100 ufc/ml y 300 ufc/ml; B y A son iguales o superiores a 0,5 veces N; C es igual o superior a 0,5 veces B.
b) c) d)
en donde N es el recuento promedio de la caja del control de la suspensin de ensayo (en ufc/ml) (vase el numeral 5.4.1.4); es el recuento promedio de la caja del control de la suspensin de ensayo para la validacin de las condiciones experimentales (agua dura) (en ufc/ml) (vase el Anexo A A.4.1.2); es el recuento promedio de la caja de no toxicidad del control del neutralizador (en ufc/ml) (vase el Anexo A A.4.1.3); es el recuento promedio de la caja del control del mtodo de dilucin-neutralizacin (en ufc/ml) (vase el Anexo A A.4.1.4)
5.6.2.2 Mtodo de filtracin por membrana Asegrese de lo siguiente: a) ningn recuento de caja individual empleado para el clculo de N y A es superior a 300 ufc/ml y que N y A estn entre 100 ufc/ml y 300 ufc/ml; ningn recuento de caja individual empleado para el clculo de B es superior a 150 ufc/ml y que B est entre 50 ufc/ml y 150 ufc/ml; C es igual o superior a 0,5 veces B.
b)
c)
en donde N es el recuento promedio de la caja del control de la suspensin de ensayo (en ufc/ml) (vase el numeral 5.4.1.4); es el recuento promedio de la caja del control de la suspensin de ensayo para la validacin de las condiciones experimentales (agua dura) (en ufc/ml) (vase el Anexo A literal A. 4.2.2); es el recuento promedio del control de filtracin (en ufc/ml) (vase el Anexo A literal A.4.2.3); es el recuento promedio de la caja del control del mtodo de filtracin por membrana (en ufc/ml) (vase el Anexo A literal A.4.2.4).
B C
16

5.7 CONCLUSIN
NTC 5732
5.7.1 Se considera que los productos para la friccin higinica de manos que demuestran una reduccin de 105 en los recuentos viables en un periodo de 1 minuto 5 s a 20 C en las condiciones definidas por este ensayo cuando los organismos de ensayo son Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus, se considera aprobado el ensayo. Si el fabricante recomienda tiempos de exposicin inferiores a 1 minuto, se considera que el producto ha pasado la prueba si se logra una reduccin similar en 30 s 5 s. Los productos que aprueban el ensayo se pueden describir como preparaciones bactericidas para desinfeccin higinica de manos y se puede proseguir a la evaluacin adicional para calificar su eficacia en las condiciones que simulan su uso sobre las manos UNE- EN 1500). 5.7.2 Se considera que los productos para lavado higinico de manos que demuestran una reduccin de 103 en los recuentos viables en un periodo de 1 min 5 s a 20 C en las condiciones definidas por este ensayo cuando los organismos de ensayo son Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus han aprobado el ensayo. Si el fabricante recomienda tiempos de exposicin inferiores a 1 minuto, se considera que el producto ha aprobado el ensayo si se logra una reduccin similar en 30 s 5 s. Los productos que aprueban el ensayo se pueden describir como preparaciones bactericidas para desinfeccin higinica de manos y se puede proseguir la evaluacin adicional para determinar su eficacia en las condiciones que simulan las prcticas rutinarias de uso (EN 1499) 5.7.3 Se considera que los productos para friccin quirrgica de manos que demuestran una reduccin de 105 en los recuentos viables en un periodo de 5 min 10 s a 20 C en las condiciones definidas por este ensayo cuando los organismos de ensayo son Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus han aprobado el ensayo. Si el fabricante recomienda tiempos de exposicin inferiores a 5 min, se considera que el producto ha aprobado el ensayo si logra una reduccin similar en 1 min 5 s, 2 min 10 s, 3 min 10 s y/o 4 min 10 s. Los productos que aprueban el ensayo se pueden describir como preparaciones bactericidas para desinfeccin quirrgica de manos y se puede proseguir la evaluacin adicional para determinar su eficacia en las condiciones que simulan las prcticas rutinarias de uso (EN 12791). 5.7.4 Se considera que los productos para lavado quirrgico de manos que demuestran una reduccin de 103 en los recuentos viables en un periodo de 5 min 10 s a 20 C en las condiciones definidas por este ensayo cuando los organismos de ensayo son Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae y Staphylococcus aureus han aprobado el ensayo. Si el fabricante recomienda tiempos de exposicin inferiores a 5 min, se considera que el producto ha aprobado el ensayo si logra una reduccin similar en 1 min 5 s, 2 min 10 s, 3 min 10 s y/o 4 min 10 s. Los productos que aprueban el ensayo se pueden describir como preparaciones bactericidas para desinfeccin quirrgica de manos y se puede proseguir la evaluacin adicional para determinar su eficacia en las condiciones que simulan las prcticas rutinarias de uso EN 12791). 5.7.5 Se considera que los productos que han cumplido con los requisitos para ficcin higinica de manos ( vase el numeral 4.2) tambin han cumplido con los requisitos para friccin quirrgica de manos (vase el numeral 4.4). Los productos que han cumplido con los requisitos para lavado higinico de manos (vase el numeral 4.3) tambin se consideran conformes con los requisitos para el lavado quirrgico de manos (vase el numeral 4.5).
17

5.8 INFORME DE ENSAYO
NTC 5732
El informe debe hacer referencia a esta norma. El informe de ensayo debe indicar como mnimo la siguiente informacin: a) b) Identificacin del laboratorio que realiza el ensayo. Identificacin de la muestra: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) c) nombre del producto; nmero del lote; fabricante; fecha de entrega; condiciones de almacenamiento; principios activos y sus concentraciones ; diluyente para usar con el producto recomendado por el fabricante.
Mtodo de ensayo y su validacin: si se utiliz el mtodo de dilucin-neutralizacin, se deben suministrar detalles completos de los ensayos para la validacin del neutralizador. si se utiliz el mtodo de filtracin por membrana, se deben suministrar detalles completos de los ensayos para la validacin del mtodo. Tambin se deben indicar todos los detalles de procedimiento que se realizaron para justificar el uso del mtodo de filtracin por membrana.
d)
Condiciones experimentales: 1) 2) 3) 4) 5) 6) perodo de anlisis; concentraciones del producto para ensayo; temperatura de ensayo; tiempos de contacto; procedimiento de recuento; temperatura de incubacin.
e)
Resultados de ensayo: ensayos de validacin. valuacin de la actividad bactericida (vanse tambin las Tablas D.1 y D.2). 18

f) g)
NOTA
NTC 5732
Conclusin. Localidad, fecha y firma identificada.

En el Anexo D se suministra un ejemplo de un informe de ensayo tpico.
19
NTC 5732
ANEXO A (Normativo)
MTODO DE ENSAYO PARA LA VALIDACIN DE LOS MTODOS DE DILUCINNEUTRALIZACIN Y FILTRACIN POR MEMBRANA A.1 PRINCIPIO
Para cada producto se selecciona un neutralizador segn las indicaciones de vase el Anexo A literal A.4.1 (vase el numeral 5.5). Si no se puede encontrar un neutralizador adecuado, se usa el mtodo de filtracin por membrana segn las indicaciones de vase el Anexo A literal A.4.2. A.2 Preparacin de la suspensin bacteriana
Para preparar la suspensin bacteriana, diluya la suspensin bacteriana para ensayo (vase el numeral 5.4.1.3) con el diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) para obtener la suspensin bacteriana de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml. Para el recuento de la suspensin, prepare una dilucin de 10-1 con el diluyente (vase el numeral 5.2.2.4) y mezcle (vase el numeral 5.3.2.6). Tome una muestra de 1,0 ml de la dilucin de 10-1 en duplicado e inocule usando la tcnica de siembra en profundidad o siembra en superficie. Si se utiliza la tcnica de siembra en profundidad, vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml de la mezcla en cajas de Petri (vase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA (vase el numeral 5.2.2.3) fundido y enfriado a 45 C 1 C. Si se utiliza la tcnica de siembra en superficie, disperse cada muestra de 1,0 ml de la mezcla sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (vase el numeral 5.2.2.3). Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en la suspensin bacteriana (Nv) utilizando el mtodo que se indica en el numeral 5.6.1.2. A.3 PREPARACIN DE LA SOLUCIN DEL PRODUCTO PARA ENSAYO
Vase el numeral 5.4.2. Para productos de friccin de manos, el producto se utiliza sin diluir como la solucin de producto para ensayo. Para productos de lavado de manos, prepare una dilucin al 55% (V/V) del producto de lavado de manos de ensayo en agua dura (vase numeral 5.2.2.7) como solucin del producto para ensayo A.4 ENSAYO PARA VALIDACIN
A.4.1 Mtodo de dilucin-neutralizacin A.4.1.1 Generalidades Antes del ensayo, equilibre todos los reactivos (solucin del producto para ensayo, agua, suspensin bacteriana para ensayo, neutralizador) a la temperatura de ensayo de 20 C 1 C 20
NTC 5732
utilizando el bao de agua (vase el numeral 5.3.2.2) controlado a 20 C 1 C. Verifique que la temperatura de los reactivos se estabilice en 20 C 1 C. A.4.1.2 Validacin de las condiciones experimentales (agua dura) seleccionadas (A) Este ensayo de validacin se lleva a cabo para productos de lavado de manos nicamente, los cuales se deben someter a ensayo en una dilucin de 55 % (V/V) en agua dura. Coloque 9,0 ml de agua dura (vase el numeral 5.2.2.7) en un tubo de ensayo estril. Adicione 1,0 ml de una suspensin bacteriana diluida que contengan de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml preparada segn se indica en el Anexo A. literal A.2. Ponga en marcha inmediatamente el cronmetro y mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Deje en el bao de agua a 20 C 1 C durante un tiempo de contacto de 1 min 5 s (lavado higinico de manos) o 5 min 10 se (lavado quirrgico de manos.
NOTA 1 Al aadir las suspensiones bacterianas a los recipientes se recomienda tener precaucin para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente. NOTA 2 Los productos destinados para uso tanto en lavado higinico de manos como lavado quirrgico de manos se deberan someter a ensayo nicamente para el tiempo de contacto ms prolongado de 5 min.
Al final del tiempo de contacto mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Tome una muestra de 1,0 ml de la mezcla en duplicado e inocule utilizando la tcnica de siembra en profundidad o de siembra en superficie, Si se utiliza la tcnica de siembra en profundidad, vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml de la mezcla en cajas de Petri (vase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA (vase numeral 5.2.2.3) fundido y enfriado a 45C 1C. Si se utiliza la tcnica de siembra en superficie, disperse cada muestra de 1,0 ml de la mezcla sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (vase el numeral 5.2.2.3). Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en el control de las condiciones experimentales (agua dura) (A) utilizando el mtodo que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo de ensayo. A.4.1.3 Validacin de no toxicidad del neutralizador (B) Coloque 9,0 ml de neutralizador (vase el numeral 5.2.2.5) en un tubo de ensayo estril. Adicione 1,0 ml de una suspensin bacteriana diluida que contengan de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml preparada segn se indica en el Anexo A literal A.2. Ponga en marcha inmediatamente el cronmetro y mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Deje en el bao de agua a 20 C 1 C durante un tiempo de contacto de 1 min 5 s (lavado higinico de manos o friccin higinica de manos) o 5 min 10 s (lavado quirrgico de manos o friccin de manos quirrgica).
NOTA 1 Al aadir las suspensiones bacterianas a los recipientes se recomienda tener precaucin para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente.
21
NTC 5732
NOTA 2 Los productos de friccin y lavado de manos destinados para uso tanto de tratamiento poscontaminacin como para desinfeccin de manos quirrgica se deberan someter a ensayo nicamente para el tiempo de contacto ms prolongado de 5 min.
Al final del tiempo de contacto mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Tome una muestra de 1,0 ml de la mezcla en duplicado e inocule utilizando la tcnica de siembra en profundidad o de siembra en superficie. . Si se utiliza la tcnica de siembra en profundidad, vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml de la mezcla en cajas de Petri (vase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA (vase el numeral 5.2.2.3) fundido y enfriado a 45 C 1 C. Si se utiliza la tcnica de siembra en superficie, disperse cada muestra de 1,0 ml de la mezcla sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (vase el numeral 5.2.2.3). Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en el control de no toxicidad del neutralizador (B) utilizando el mtodo que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo de ensayo. A.4.1.4 Validacin de la neutralizacin del mtodo de dilucin-neutralizacin (C) Coloque 1,0 ml de diluyente para la suspensiones bacterianas (vase el numeral 5.2.2.4) en un tubo estril y luego, simultneamente, encienda el cronmetro y adicione 9,0 ml de la solucin del producto para ensayo (vase el numeral 5.4.2). Deje en el bao de agua a 20 C durante 5 min 10 s. Despus, transfiera 1,0 ml de la mezcla en un tubo de ensayo que contenga 8,0 ml de neutralizador (vase el numeral 5.2.2.5) que se ha mantenido previamente en un bao de agua a 20 C 1 C. Deje en el bao de agua durante 5 min 10 s. Adicione 1,0 ml de una suspensin bacteriana que contengan de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml preparada segn se indica en el Anexo literal A A.2. Ponga en marcha inmediatamente el cronmetro y mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Deje en el bao de agua a 20C 1C durante un tiempo de contacto de 1 min 5 s (lavado higinico de manos o friccin higinica de manos)) o 5 min 10 s (desinfeccin quirrgica de manos).
NOTA 1 Al aadir las suspensiones bacterianas a los recipientes se recomienda tener precaucin para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente. NOTA 2 Los productos de friccin y lavado de manos destinados para uso tanto de tratamiento de las manos poscontaminacin como para desinfeccin de manos quirrgica se deberan someter a ensayo nicamente para el tiempo de contacto ms prolongado de 5 min.
Al final del tiempo de contacto mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Tome una muestra de 1,0 ml de la mezcla en duplicado e inocule utilizando la tcnica de siembra en profundidad o de siembra en superficie Si se utiliza la tcnica de siembra en profundidad, vierta con pipeta cada muestra de 1,0 ml de la mezcla en cajas de Petri (vase el numeral 5.3.2.10) independientes y adicione 12 ml a 15 ml de TSA (vase el numeral 5.2.2.3) fundido y enfriado a 45 C 1 C. 22
NTC 5732
Si se utiliza la tcnica de siembra en superficie, disperse cada muestra de 1,0 ml de la mezcla sobre una cantidad adecuada de cajas secas que contengan TSA (vase el numeral 5.2.2.3). Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en el control del mtodo de dilucin-neutralizacin (C ) utilizando el mtodo que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo de ensayo. A.4.2 Mtodo de filtracin por membrana A.4.2.1 Generalidades Antes del ensayo, equilibre todos los reactivos (solucin del producto para ensayo, agua, suspensin bacteriana para ensayo, lquido de enjuague) a la temperatura de ensayo de 20 C 1 C utilizando el bao de agua (vase el numeral 5.3.2.2) controlado a 20 C 1 C. Verifique que la temperatura de los reactivos se estabilice en 20 C 1 C. A.4.2.2 Validacin de las condiciones experimentales (agua dura) seleccionadas (A) Este ensayo de validacin se lleva a cabo para productos de lavado de manos nicamente, los cuales se deben someter a ensayo en una dilucin de 55 % (V/V) en agua dura. Coloque 9,0 ml de agua dura (vase el numeral 5.2.2.7) en un tubo de ensayo estril. Adicione 1,0 ml de una suspensin bacteriana diluida que contengan de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml preparada segn se indica en el Anexo A literal A.2. Ponga en marcha inmediatamente el cronmetro y mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Deje en el bao de agua a 20 C 1 C durante un tiempo de contacto de 1 minuto 5 s (lavado higinico de manos) o 5 min 10 s (lavado quirrgico de manos). Nota 1. Al aadir las suspensiones bacterianas a los recipientes se recomienda tener precaucin para evitar tocar la parte superior de los lados del recipiente. Nota 2. Los productos destinados para uso tanto en lavado higinico de manos como lavado quirrgico de manos se deberan someter a ensayo nicamente para el tiempo de contacto ms prolongado de 5 min. Al final del tiempo de contacto, mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) durante unos segundos. Tome dos muestras de 0,1 ml de la suspensin bacteriana y transfiera cada muestra hacia un equipo de filtracin por membrana independiente, que disponga de una membrana y que contenga 50 ml del lquido de enjuague (vase el numeral 5.2.2.5). Filtre y enjuague con 50 ml del lquido de enjuague (vase el numeral 5.2.2.6) y luego transfiera las membranas sobre la superficie de dos cajas individuales de TSA (vase el numeral 5.2.2.3). El tiempo necesario para transferir y filtrar no debera exceder 1 min. Si es superior a 1 min, este tiempo se debe registrar en el informe de ensayo.
NOTA 3 Al realizar la transferencia, se debe tener precaucin para garantizar que las bacterias se encuentran en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre el TSA y que no queda aire atrapado entre la membrana y la superficie del agar.
23
NTC 5732
Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento recuento de las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en el control de las condiciones experimentales (agua dura) (A) utilizando el mtodo que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo ensayo A.4.2.3 Control del procedimiento de filtracin (B) Tome dos muestras de 0,1 ml de una suspensin bacteriana diluida que contengan de 4,5 x 102 ufc/ml a 3 x 103 ufc/ml preparada segn se indica en el literal A.2 y transfiera cada muestra hacia un equipo de filtracin con una capacidad mnima de 50 ml, que disponga de una membrana independiente. Filtre y enjuague con 50 ml del lquido de enjuague (vanse los numerales 5.2.2.5 y 5.2.2.6) y luego transfiera las membranas sobre la superficie de dos cajas individuales de TSA (vase el numeral 5.2.2.3). El tiempo necesario para transferir y filtrar no debera exceder 1 minuto. Si es superior a 1 minuto, este tiempo se debe registrar en el informe de ensayo. Nota. Al realizar la transferencia, se debe tener precaucin para garantizar que las bacterias se encuentran en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre el TSA y que no quede aire atrapado entre la membrana y la superficie del agar. Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en el control del procedimiento de filtracin (B) utilizando el mtodo que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo de ensayo. A.4.2.4 Validacin de la neutralizacin mediante el mtodo de filtracin por membrana (procedimiento de filtracin) Coloque 1,0 ml de diluyente para las suspensiones bacterianas (vase el numeral 5.2.2.3) en un tubo estril y luego, simultneamente, active el cronmetro y adicione 9,0 ml de la solucin del producto para ensayo (vase el numeral 5.4.2). Mezcle y deje en el bao de mara a 20 C durante 5 min 10 s. Al final del tiempo de contacto mezcle (vase el numeral 5.3.2.6) durante unos s. Tome dos muestras de 0.1 ml de la mezcla y transfiera cada muestra hacia un equipo de filtracin con una capacidad mnima de 50 ml, que disponga de una membrana independiente , Filtre y enjuague la membrana con no menos de 150 ml y no ms de 500 ml del lquido de enjuague (vanse los numerales 5.2.2.5 y 5.2.2.6). Luego cubra las membranas con 150 ml de lquido de enjuague y adicione 0,1 ml de la suspensin bacteriana diluida que contenga de 1 x 102 ufc/ml a 3 x 102 ufc/ml preparada segn se indica en el literal A.2.
24
NTC 5732
Transfiera las membranas sobre la superficie de dos cajas individuales de TSA (vase el numeral 5.2.2.3). El tiempo necesario para transferir y filtrar no debera exceder 1 min. Si es superior a 1 minuto, este tiempo se debe registrar en el informe de ensayo.
NOTA Al realizar la transferencia, se debe tener precaucin para garantizar que las bacterias se encuentran en la cara superior de la membrana cuando se coloca sobre el TSA y que no queda aire atrapado entre la membrana y la superficie del agar.
Incube las cajas a temperatura de 36 C 1 C (o 37 C 1 C) durante 24 h. Deseche las cajas que, por cualquier razn, no se puedan contar. Realice el recuento de las cajas y determine el nmero de unidades formadoras de colonias en cada una. Incube las cajas durante 24 h adicionales. No vuelva a contar las cajas que ya no presentan colonias bien separadas. Vuelva a contar las cajas restantes. Determine el mayor nmero de colonias para cada caja. Calcule el nmero de ufc/ml en el control del mtodo de filtracin por membrana (C) utilizando el mtodo que se describe en el numeral 5.6.1.2. Repita el procedimiento anterior para cada organismo de ensayo. A.5 Validacin
Verifique que los resultados de ensayo cumplen con los requisitos correspondientes de los numerales 5.6.1.2 o 5.6.2.
25
NTC 5732
ANEXO B (Informativo)
NEUTRALIZADORES
Cuando se especifica un neutralizador, se puede utilizar cualquiera de los que se indican a continuacin.
NOTA La siguiente lista no es exhaustiva y se pueden probar otros medios. Tabla B.1. Ejemplos de neutralizadores Desinfectante Gluconato de clorhexidina Neutralizadores (concentracin por litro de fluido o diluyente de muestreo) polisorbato 80 a) (30 ml) + lecitina de huevo (3 g) + histidina (1 g) (puede ser necesario utilizar concentraciones superiores, hasta cinco veces, para la neutralizacin completa) polisorbato 80 a) (30 ml) + lecitina de huevo (3 g) + histidina (1 g) + tiosulfato de sodio (5 g) + albmina de suero bovino, liofilizada (1 g) polisorbato 80 a) (30 ml) + lecitina de huevo (3 g) + histidina (1 g) + tiosulfato de sodio (5 g) amonio polisorbato 80 a) (30 ml) + saponina (30 g) + histidina (1 g) + cistena (1 g)
Compuestos de cloro y yodo povidona
Compuestos fenlicos
Compuestos cuaternario
de
a)
Con grado analtico, no hidrolizado segn el documento Farmacopea Europea volumen 1 TWEEN 80 es un ejemplo de un producto adecuado disponible en el comercio. Esta informacin se suministra para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobacin de este producto por parte de ICONTEC
26
NTC 5732
ANEXO C (Informativo)
LQUIDOS DE ENJUAGUE Se puede utilizar cualquiera de los siguientes lquidos de enjuague: NOTA
agua (vase el numeral 5.2.2.2); diluyente (vase el numeral 5.2.2.4); solucin acuosa al 0,1 % (V/V) de polisorbato 80 5); solucin acuosa al 0,5 % (V/V) de polisorbato 80 5); solucin acuosa al 0,5 % (V/V) de polisorbato 805) 5) y 0,07 % de lecitina; neutralizador (vase el numeral 5.2.2.5); soluciones amortiguadoras.
Esta lista no es exhaustiva y se pueden probar otros lquidos de enjuague.
5)
Con grado analtico, no hidrolizado segn el documento Farmacopea Europea volumen 1 TWEEN 80 es un ejemplo de un producto adecuado disponible en el comercio. Esta informacin se suministra para conveniencia de los usuarios de esta norma y no constituye una aprobacin de este producto por parte de ICONTEC
27
NTC 5732
ANEXO D (Informativo)
EJEMPLO DE UN INFORME DE ENSAYO TPICO
Actividad bactericida de un producto de lavado higinico de manos destinado para el tratamiento postcontaminacin de las manos 1. Identificacin del laboratorio de ensayo Besson Test House
2. Identificacin de la muestra Nombre del producto......................................................... Lavado de manos Bacticen Nmero de lote ................................................................. 96-71-51 Fabricante ......................................................................... Centipede Formulations Inc. Fecha de entrega .............................................................. 1996-05-11 Condiciones de almacenamiento ..................................... aquellas del fabricante Sustancias activas y sus concentraciones (opcional) ........ no se indican Diluyente para uso con el producto recomendado por el fabricante ................................................................. agua dura 3. Mtodo de ensayo y su validacin Mtodo ............................................................................... dilucin-neutralizacin Neutralizador ..................................................................... 30 g/l, lecitina, esterilizada en autoclave 4. Condiciones experimentales Perodo de anlisis ............................................................ 1996-02-20 a 1996-03-12 Concentracin del producto para ensayo........................... producto diluido al 55 % (V/V) en agua dura Temperatura de ensayo .................................................... 20 C 1 C Tiempo de contacto .......................................................... 1 minuto Procedimiento de recuento ........................................ siembra en superficie Temperatura de incubacin .............................................. 36 C 1 C 5. Resultados de ensayo Vanse las Tablas D.1 y D.2. 6. Conclusin Segn el documento EN 12054, el lote 96-71-51 del producto "lavado de manos Bacticen" tiene una actividad bactericida para las cepas indicadas de Escherichia coli (K 12) NCTC 10538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Enterococcus hirae ATCC 10541 en un tiempo de contacto de 1 minuto acorde con los requisitos para un producto de lavado higinico de manos. 7. Localidad, fecha y firma identificada
NOTA El producto, el nmero de lote y el fabricante se suministran nicamente como ejemplos imaginarios.
28
NTC 5732
Tabla D.1. Verificacin de la metodologa y la validacin del mtodo de dilucin-neutralizacin A) validacin del mtodo de dilucin-neutralizacin Organismo de ensayo Recuentos de colonias por caja (cantidad promedio de ufc) Suspensin bacteriana Validacin de la neutralizacin para ensayo (vase el numeral 5.4.1.4) Control Ensayo 149, 147 135, 143 129, 121 Staphylococcus aureus (N = 148) (B = 139) (C = 125) 143, 149 134, 140 128, 131 Pseudomonas aeruginosa (N = 146) (B = 137) (C = 130) 142, 150 135, 139 120, 124 Escherichia coli (N = 146) (B = 137) (C = 122) 149, 141 133, 140 143, 131 Enterococcus hirae (N = 145) (B = 137) (C = 137) Para las cepas sometidas a ensayo: N y B estn entre 100 ufc y 300 ufc; B es mayor a 0,5 veces N; C es mayor a 0,5 veces B. La neutralizacin se valida con el neutralizador que se ensaya. B) Validacin de las condiciones experimentales (agua dura) Organismo de ensayo Recuentos de colonias por caja (cantidad promedio de ufc) Suspensin bacteriana para Ensayo experimental con ensayo (vase el numeral agua dura 5.4.1.4) 149, 147 142, 148 Staphylococcus aureus (N = 148) (A = 145) 143, 149 139, 147 Pseudomonas aeruginosa (N = 146) (A = 143) 142, 150 146, 142 Escherichia coli (N = 146) (A = 144) 149, 141 139, 145 Enterococcus hirae (N = 145) (A = 142) Para las cepas sometidas a ensayo: N y A est entre 100 ufc y 300 ufc; A es mayor a 0,5 veces N. El mtodo se valida para la condiciones experimentales de la dilucin del producto al 55 % (V/V) en agua corriente. Tabla D.2. Resultados de ensayo para el producto de lavado de manos diluido al 55% en agua dura
Organismo de ensayo
Muestra de ensayo
Recuento de colonias por caja despus de 1 min de contacto
ufc/ml de la mezcla de ensayo Recuento inicial (N) En tiempo de contacto de 1 min (C) 1,04 x 103 2,8 x 1 03 1,12 x 103
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli
dilucin 10-2 dilucin 10-3 dilucin 10 -3 dilucin 10 dilucin 10-2 dilucin 10-3 dilucin 10-2 dilucin10-3
-2
110 ; 98 2;0 >300 ; >300 29 ; 29 114 ; 110 10 ; 9 143 ;139 19 ; 11
1,48 x 10
1,46 x 107 1,46 x 10

7
Enterococcus hirae
1,45 x 10
1,41 x 103
29
NTC 5732
ANEXO E (Informativo)
CEPAS DE REFERENCIA CORRESPONDIENTE EN OTRAS COLECCIONES DE CULTIVO
Pseudomonas aeruginosa:
ATCC CIP DSM NCIMB ClP NCTC NCIMB ATCC CIP DSM NCTC NCIMB ATCC CIP DSM NCIMB
15442 103467 939 10421 54.117 10538 10083 6538 4.83 799 10788 9518 10541 58.55 3320 8192
Escherichia coli:
Staphylococcus aureus:
Enterococcus hirae:
30
NTC 5732
ANEXO F (Informativo)
INFORMACIN SOBRE LA APLICACIN Y LA INTERPRETACIN DE LAS NORMAS EUROPEAS SOBRE DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS QUMICOS
El comit CEN/TC 216 quiere llamar la atencin del lector de esta norma a los acuerdos logrados con respecto a la relacin entre esta norma y normas futuras. Se recomienda tener en cuenta esta informacin cuando se utilizan las Normas Europeas sobre desinfectantes y antispticos qumicos. F.1 GUA GENERAL PARA LA APLICACIN E INTERPRETACIN DE LOS MTODOS DE ENSAYO SEGN LAS NORMAS EUROPEAS PARA DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS QUMICOS Todas las "recomendaciones de uso" para los productos desinfectantes y antispticos qumicos debern estar sustentadas por los resultados de ensayos bactericidas, fungicidas, esporicidas y virucidas de EN que sean adecuados para el campo y el mtodo de aplicacin previstos. Para tal fin, los productos desinfectantes y antispticos qumicos se deberan someter a un programa especfico de ensayo que incluya ensayos de fase 1, fase 2/etapa 1 y fase 2/etapa 2, excepto para las situaciones que se indican en los tems e), f) y g). Las recomendaciones de uso deben estar soportadas por los resultados de los ensayos en fase 3, los cuales son apropiados para el campo de aplicacin y el mtodo de aplicacin. Las diversas fases y etapas se definen as: ensayo de suspensin de fase 1 para la actividad bsica del producto; ensayo de suspensin de fase 2/etapa 1 bajo las condiciones representativas del uso prctico; otros ensayos de laboratorio de fase 2/etapa 2, por ejemplo ensayos de superficies, de lavado y friccin de manos que simulen las condiciones prcticas; ensayos de campo de fase 3 bajo condiciones prcticas.
a)
b)
c)
d)
e)
Se acepta que para algunas aplicaciones, los ensayos de fase 2/etapa 1 y fase 2/etapa 2 pueden suministrar suficiente informacin para la aplicacin particular y que los ensayos adicionales de fase 1 pueden no ser pertinentes. Para las aplicaciones en las que se utilizan los ensayos de fase 2/etapa 1 y fase 2/etapa 2 sin ensayos de fase 1 para sustentar las recomendaciones de uso, se recomienda indicar la justificacin para omitir los ensayos de fase 1. Tales aplicaciones estarn indicadas en la propia norma o en la norma adicional que especifica las directrices para la aplicacin e interpretacin de los ensayos.
31

f)
NTC 5732
Se acepta que para algunas aplicaciones, los ensayos de suspensin de fase 2/etapa 1 pueden suministrar suficiente informacin para la aplicacin particular y que los ensayos adicionales de fase 2/etapa 2 pueden no ser pertinentes. Para las aplicaciones en las que se utilizan los ensayos de fase 2/etapa 1 sin ensayos de fase 2/etapa 2 para sustentar las recomendaciones de uso, se recomienda indicar la justificacin para omitir los ensayos de fase 2/etapa 2. Tales aplicaciones estarn indicadas en la propia norma o en la norma adicional que especifica las directrices para la aplicacin e interpretacin de los ensayos.
g)
Se acepta que para algunas aplicaciones los ensayos de fase 2/etapa 2 junto con ensayos de fase 1 pueden suministrar suficiente informacin para la aplicacin particular y que los ensayos adicionales de fase 2/etapa 1 pueden no ser pertinentes. Para las aplicaciones en las que se utilizan los ensayos de fase 2/etapa 2 sin ensayos de fase 2/etapa 1 para sustentar las recomendaciones de uso, se recomienda indicar la justificacin para omitir los ensayos de fase 2/etapa 1. Tales aplicaciones pueden estar indicadas en el "mtodo estandar" o en la norma para la aplicacin e interpretacin de los ensayos.
h)
Todas las declaraciones de bactericidas, fungicidas, esporicidas como "sustancias bioactivas" deben estar sustentadas por ensayos de fase 1 adecuados.
F.2 Gua para la interpretacin de los ensayos para desinfectantes y antispticos qumicos Se elaborar una norma (o normas) independiente que ser utilizada como "gua para la interpretacin de los ensayos para desinfectantes y antispticos qumicos" despus de que se pacten los mtodos de ensayo normales; el propsito de esta norma ser especificar en detalle la relacin entre los diversos ensayos entre s y con las recomendaciones de uso.
32

DOCUMENTO DE REFERENCIA
NTC 5732
EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION. EUROPEAN STANDARD, Chemical Disinfectants and Antiseptics. Quantitative Suspension Test for the Evaluation of Bactericidal Activity of Products for Hygienic and Surgical Handrub and Handwash Used in Human Medicine. Test Method and Requirements (Phase 2/step 1). Bruselas, Blgica. 2001, 31 p. (prEN 12054:2001 E)
33

NTC5732

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

NTC5732

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

NORMA TCNICA COLOMBIANA

LABORATORIO SFC LTDA. LABORATORIOS EUFAR S.A. LAOREM INTERNATIONAL LTDA.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA SECRETARA DISTRITAL DE SALUD UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

Pgina 1. ALCANCE ....................................................................................................................1

REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1

TRMINOS Y DEFINICIONES .....................................................................................2

4. 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6

5. 5.1 5.2 5.3 5.4

5.5 5.6 5.7 5.8

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

MTODO DE ENSAYO PRINCIPIO

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NCTC1) 10538 ATCC1) 15442 ATCC1) 6538 ATCC1) 10541

Medios de cultivo y reactivos

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO Generalidades

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

ufc/ml = unidades formadoras de colonias por mililitro

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

168 + 215 + 14 + 25 ( 2 + 0,1 2 ) 10 6

= 1,918 2 x 108 1,9 x 108 (en ufc / ml )

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

Conclusin. Localidad, fecha y firma identificada.

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

Compuestos de cloro y yodo povidona

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

EJEMPLO DE UN INFORME DE ENSAYO TPICO

NORMA TCNICA COLOMBIANA

Recuento de colonias por caja despus de 1 min de contacto

Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli

110 ; 98 2;0 >300 ; >300 29 ; 29 114 ; 110 10 ; 9 143 ;139 19 ; 11

1,46 x 107 1,46 x 10

NORMA TCNICA COLOMBIANA

CEPAS DE REFERENCIA CORRESPONDIENTE EN OTRAS COLECCIONES DE CULTIVO

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NORMA TCNICA COLOMBIANA

You might also like