Eucariotas

REPLICACIN DEL DNA EN EUCARIONTES

Es similar a la de los procariontes, es decir, semi-conservadora, semi-discotinua y bidireccional. Existe una hebra conductora y una hebra retrasada con fragmentos de Okazaki. Se inicia en ORI (puede haber unos 100 o ms orgenes a la vez) El proceso es mucho mejor regulado y ms complejo por estar estrictamente adecuado al ciclo celular. Entre las diferencia, se comienza con las polimerasas, son ms complejas, y adems, la polimerasa de la hebra continua es diferente a la de la hebra discontinua. De la hebra continua se encarga la polimerasa y de la discontinua, la . Las helicasas difieren en estructura, las primasas se encuentran adosadas a la ADN-pol . El resto del proceso es muy parecido. El RNA cebador es retirado por el complejo de reparacin de la clula.

En los eucariotas, el DNA se encuentra bloqueado por Histonas y otras protenas nucleares (formando cromatina) y es por lo tanto imposible que pueda ser replicado sin mecanismos especiales de regulacin. En los eucariotas, por lo tanto, para que la replicacin pueda siquiera iniciar, la cromatina debe ser primero re-estructurada.

En los eucariotas la replicacin del DNA se realiza exclusivamente durante la fase S del ciclo celular La cromatina menos condensada (eucromatina), se replica temprano, mientras que los genes en la cromatina condensada (heterocromatina) se replican tarde Secuencias bien definidas en el DNA de un eucariota sencillo, como la levadura, funcionan como Orgenes de Replicacin. En los mamferos las secuencias de DNA que especifican el Origen de Replicacin han sido hasta ahora difciles de identificar Una vez que la nueva cadena abandona la horquilla de replicacin, el DNA se reestructura formando nuevamente nucleosomas Se requiere un complejo especial, la Telomerasa, para replicar los extremos finales de los cromosomas La longitud del telmero, es regulada por la clula y por el organismo

Ciclo Celular

Ms compleja y ms lenta que en procariotas por el mayor tamao y complejidad del genoma Mltiples orgenes de replicacin. Cada uno representa una unidad de replicacin (replicn) bidireccional La replicacin se encuentra regulada de acuerdo con el ciclo celular. La Sntesis de DNA est limitada a la fase S, y coordinada con la divisin celular (mitosis) - Los eucariotas poseen cinco DNA polimerasas

, inicia la sntesis , funcin de reparacin , replicacin del genoma mitocondrial , elongacin , papel desconocido

Existen por lo menos 15 DNA polimerasas, pero las ms importantes son cinco:

Pol (tambin llamada Primasa): una subunidad pequea (Pri S)

funciona como Primasa (sintetiza el RNA cebador), la subunidad mayor, con la actividad de polimerasa de la Pol , alarga el cebador utilizando desoxinucletidos trifosfatos. Despus de agregar unos 20 nucletidos se separa y el resto del alargamiento es realizado por la Pol (en la hebra conductora) y por la Pol (en la hebra retrasada). Pol : Esta implicada en la reparacin del DNA, en la supresin de bases y en el rellenado de espacios dejados en la hebra retrasada. Pol : Replica y repara el DNA mitocondrial. Pol : Altamente procesiva y con actividad de exonucleasa 3'5 para corregir errores. Es la polimerasa que se encarga, probablemente, de la replicacin de la hebra retrasada. Pol : Altamente procesiva y con actividad de exonucleasa 3'5 para corregir errores. Es la polimerasa que se encarga , probablemente, de la replicacin de la hebra conductora.

Identidad Incierta
Numerosas polimerasas participan en la replicacin de las hebras conductora y retardada del DNA genmico. Aunque han pasado 50 aos desde el descubrimiento y la descripcin de la primera DNA polimerasa en eucariotas, la identidad de las polimerasas ms importante en la sntesis de las hebras conductora y retrasada sigue siendo incierta. La replicacin del DNA en eucariotas requiere de la Polimerasa para iniciar la sntesis en el origen y para sintetizar los cebadores que inician la replicacin en los fragmentos de Okazaki en la hebra retardada, permitiendo que las DNA polimerasas (pol ) y (pol ) realicen el resto de la elongacin de la cadena. Pol est implicada en la replicacin de la hebra retrasada. Aunque la identidad de la(s) polimerasa(s) que replican la hebra conductora permanece en duda, la evidencia reciente indica que es la pol la que realiza este proceso. Esta evidencia refuerza la certeza de que las actividades de exonucleasa de pol y pol son las que participan en la edicin de los errores cometidos durante el apareamiento de bases en cada una de las hebras.

El Origen de la Replicacin
Los orgenes de replicacin son los puntos fijos, situados en la doble hlice de DNA, a partir de los cuales se lleva cabo la replicacin, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla. La cantidad de DNA que se puede sintetizar a partir de un nico origen de replicacin se denomina replicn o unidad funcional de replicacin. El genoma bacteriano es un replicn nico circular.

En organismos eucariticos, la replicacin del DNA se inicia en mltiples orgenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay multitud de replicones.

Orgenes de la replicacin del DNA

Todos los sitios que marcan en el DNA el origen para la replicacin, requieren dos componentes centrales:
1)

2)

Uno o ms sitios de fijacin especficos para la protena, o complejo proteico (ORC), de reconocimiento del origen, que se ha llamado Secuencia de Replicacin Autnoma (RAS) Una secuencia ms o menos larga de DNA que pueda desenrollarse con facilidad, llamada Elemento para Desenrollar el DNA (DNA-unwinding element, DUE). Esta secuencia DUE no es una secuencia especfica, pero debe tener una composicin de nucletidos que le d una baja temperatura de fusin.

El desenrollamiento del DNA se inicia en el DUE, y una vez producido, la sntesis de DNA puede iniciarse en cada una de las hebras de DNA resultantes. Componentes adicionales auxiliares para este proceso son indispensables, e incluyen uno o ms sitios para factores de transcripcin que faciliten la fijacin de otras protenas complementarias as como la aceleracin del desenrollamiento del DNA, pero que no son indispensables para el reconocimiento del origen.

Complejo de Pre-replicacin
Un Complejo de Pre-replicacin (pre-RC) es un complejo

proteico que se estructura en el punto de origen de la replicacin (Ori) durante la fase de inciacin de la replicacin del DNA. En los eucariotes, el pre-RC esta compuesto de los siguientes factores :
Un complejo de seis subunidades llamado Complejo de Reconocimiento

del Origen (ORC) que se fija a las secuencias de la doble hebra de DNA que sealan el origen. Dos protenas reguladoras llamadas Cdc6 y Cdt1 que son reclutadas por el ORC. Las MCMs o protenas minicromosomales de mantenimiento (Minichromosome Maintenance proteins), un complejo proteico que tal vez corresponde a la helicasa en eucariotes y que desplaza al Cdt1.

Todos estos factores se ensamblan en los orgenes de

reduplicacin durante la fase G1 del ciclo celular. Una vez que estas protenas estn ensambladas y la clula pase de la fase G1 a la fase S, las MCMs son fosforiladas y se incia realmente la replicacin.

ORC
En la levadura, se demostr inicialmente que un complejo proteico, formado or 6 subunidades diferentes, conocido como ORC (origin-recognition complex) se fija selectivamente a la Secuencia de Replicacin Autnoma (ARS) en un mecanismo dependiente de ATP. Este complejo, ORC, permanece unido al sitio de origen, ARS, durante todo el ciclo celular, incluyendo la mitosis, y durante la replicacin se asocia con otras protenas, un evento que dispara la iniciacin de la replicacin del DNA. Clulas de levadura con mutaciones en cualquiera de las seis protenas que forman el ORC son incapaces de dividirse. Todas las clulas eucariotas expresan homlogos de estas protenas, atestiguando su importancia esencial en la iniciacin de la replicacin del DNA en estos organismos.

En relacin con el progreso del ciclo celular

Complejo de Iniciacin en Eucariotes

a)

b) c)

d)

e)

El ORC (Complejo de reconocimiento del origen) es el primer elemento reclutado en el origen de replicacin. El ORC recluta al Cdc6 y al Cdt1. El ORC, Cdc6 y Cdt1 juntos, fijan a los hexmeros proteicos de mantenimiento (Mcm)27 en el punto de origen, lo cual permite que se acte para iniciar la replicacin. Los complejos competentes de Iniciacin son probablemente formados por el ensamble, espalda con espalda, de dos complejos de Mcm27. Puesto que el ORC es asimtrico, esto debe requerir el ensamble de un segundo complejo ORC para cargar las Mcm27 en la direccin opuesta.

MCM

MCM es una familia de seis protenas (Mcm 27, pesos moleculares de 101, 91, 97, 82, 93, y 81 kDa). Todas las protenas del complejo MCM son esenciales durante el progreso de la horquilla de replicacin y por lo mismo son esenciales para la viabilidad celular en todos los eucariotas. Adems de formar normalmente el htero hexmero, se ha encontrado, tanto in vivo como in vitro, que las subunidades pueden combinarse independientemente para formar varios complejos diferentes. Se ha confirmado que un complejo dimrico, formado por dos htero trmeros de las subunidades Mcm 4, 6, 7, contiene las actividades de fijacin al DNA de hebra sencilla, de ATPasa dependiente del DNA y, sobre todo, de la DNA Helicasa responsable de la fusin del DNA en eucariontes. Por el contrario las subunidades Mcm 2 o el dmero Mcm 3, 5 poseen actividad inhibidora de la Helicasa. Esto nos habla de una cuidadosa regulacin del proceso.

Las diferencias de altura entre los escalones implican la presencia de factores de regulacin. Las partes del complejo ya agregadas se indican con figuras ms suaves

El complejo de reconocimiento ORC se fija al origen de replicacin al final de la mitosis. Esto permite la fijacin posterior del Cdc18 (CDC6 en los mamferos) y del Cdt1. Estas protenas reclutan al complejo proteico MCM que funcionaran como Helicasa para desenrrollar las dos hebras del DNA. Queda as formado el complejo de prereplicacin (pre-RC). Varios otros factores se fijan a este complejo. La fosforilacin (flechas) de algunos de estos factores por la Ciclina- cinasa (CDK) o por la Hsk1 (Cdc-7 cinasa 1) y su subunidad reguladora, Dfp1, parece ser un paso previo a la fijacin del Cdc45 en el complejo de origen. La unin de la protena Cdc45 en el origen completa la formacin del complejo de pre-iniciacin (pre-IC). Una vez formado el complejo de pre-iniciacin todo est listo para la unin de la Primasa y la DNA Polimerasa que realizarn la replicacin del DNA en la fase S del ciclo celular. Al mismo tiempo el complejo Hsk1-Dfp1 fosforila la MCM y activa su funcin de Helicasa .

La fosforilacin del complejo MCM ocurre al iniciarse la fase S del ciclo celular y se produce por el reclutamiento de la Cdc7Dfb4 cinasa al complejo de origen. La fosforilacin del complejo MCM provoca un cambio de conformacin del complejo que resulta en la fusin del DNA en el sitio de origen. Se postula que este cambio conformacional convierte el complejo MCM inactivo en una Helicasa activa, cuya estructura anular se une topolgicamente al DNA. La activacin y disociacin del complejo MCM-Helicasa y del Mcm10, debida a la fosforilacin inducida por Cdc45, inicia la fusin del DNA y permite el reclutamiento de la primasa, la RPA y la DNA Polimerasa para inicar realmente la replicacin del DNA.

Durante la transicin Mitosis-Fase G1, el ORC fijo al DNA recluta a CDC6 y CDT1, lo cual propicia la fijacin del complejo de la Helicasa que consiste del complejo MCM 2-7. Esto resulta en la formacin del complejo llamado de pre-replicacin (Pre-RC). El Pre-RC recluta nuevos factores, incluyendo CDC45, SLD2-3, DPB11, el complejo GINS (SLS1, y PSR1-3) y el MCM10 para formar el complejo de pre-Iniciacin (Pre-IC). La iniciacin misma requiere ahora la fosforilacin de algunas de estas protenas.

Protena de Replicacin A (RPA)

RPA (tambin llamada Factor de Replicacin A, RFA) corresponde, en los eucariotes, a las protenas unidoras, estabilizadoras, del DNA de hebra sencilla, SSB. Es un htero trmero proteico, cuyos componentes son todos ellos esenciales para los eucariotes. Este complejo proteico, RPA o SSB, es un componente esencial en todos los sistemas de replicacin, procariotes y eucariotes. Estas protenas recubren el DNA de hebra sencilla por detrs de la Helicasa, protegindolo del ataque por exonucleasas e impidiendo que vuelva a formar hebras dobles entre las bases componentes. La RPA estimula la actividad de la DNA Polimerasa creando un sustrato uniforme para su actividad y parece desempear un papel importante en la coordinacin de la sntesis de DNA en la hebra retardada.

El complejo de reconocimiento del origen (ORC) recluta a la Cdc6, al complejo llamado de mantenimiento de minicromosomas (Mcm) y al factor Cdt1, para formar el Complejo de Pre-Replicacin (pre-RC). El factor Cdc28, asociado a las ciclinas Clb5 y Clb6, que se sintetizan en la fase S del ciclo celular, promueve la fijacin de la cinasa Cdc45 (no ilustrada), la cual es esencial para la iniciacin de la replicacin, y de la Protena de Replicacin A (RPA), tampoco ilustrada en el diagrama. Clb5Cdc28 y Clb6Cdc28 fosforilan la protena de replicacin Sld2, lo cual permite el reclutamiento, dependiente de la accin del factor Dpb11, de la Polimerasa al origen de iniciacin. La subunidad Dpb2 de la Polimerasa es tambin fosforilada por la accin del complejo ciclina/Cdk. Pol2 es la subunidad cataltica de la Polimerasa, que tambin comprende las subunidades Dpb24.

DNA Primasa

Las DNA polimerasas en eucariotes tambin requieren de cortos segmentos de RNA que acten como cebadores. En eucariotes, la DNA Primasa es parte de un complejo tetraunitario (pesos moleculares 180, 68, 58 y 48 kDa), el complejo Pol /Primasa. Dos de estas subunidades, p48 y p58, son requeridas para la actividad de Primasa, siendo P48 la subunidad cataltica. La Primasa sintetiza segmentos cortos de RNA (812 nucletido) que son alargados por la Pol hasta unos 30 nucletidos, formando fragmentos pre-Okazaki. Estos hbridos de RNA-DNA son reconocidos por el complejo accesorio de la polimerasa (RFC) para iniciar la sntesis procesiva de DNA por la polimerasa replicativa (Pol o Pol ). En la hebra retrasada, la actividad de la Pol /Primasa es requerida para la iniciacin de la sntesis de cada uno de los fragmentos de Okazaki.

Inicio de la Replicacin del DNA en eucariotes

Unin de la Primasa y sntesis del RNA cebador. Despus se une la DNA Pol y sintetiza un corto segmento de DNA, llamado DNA iniciador (iDNA)

El factor de Replicacin (RFC) se asocia al DNA y ayuda a la DNA Polimerasa, o , a fijarse adecuadamente a la hebra molde de DNA

Se posiciona la DNA polimerasa adecuada (Pol para la sntesis de la hebra retrasada, y posiblemente Pol para la sntesis de la hebra conductora) y despus se carga la abrazadera deslizante que asegurara su procesividad

Se inicia el alargamiento de la nueva cadena de DNA, catalizada por la Polimerasa (en el caso de la hebra retrasada)

Antgeno Nuclear de Proliferacin Celular (PCNA)

PCNA, la abrazadera deslizante en eucariotes, es un homotrmero proteico de forma anular de 29 kDa. Despus de su ensamblaje, por la actividad de la RFC, alrededor del cebador, tanto en la hebra conductora como en la retrasada, PCNA se asocia con las polimerasas para iniciar la sntesis procesiva del DNA. Estudios in vitro han demostrado que una vez ensamblada alrededor de la cadena de DNA, PCNA puede deslizarse libremente en cualquier direccin. Aunque PCNA no posee actividad enzimtica, adems de su papel en el aumento de la procesividad de ambas polimerasas acta como un factor regulador importante en la replicacin. Varias protenas que inhiben la sntesis de DNA, operan por medio de su interaccin con el PCNA impidiendo su asociacin con las polimerasas. Al terminan la sntesis de cada fragmento de Okazaki, PCNA se desenlaza de la polimerasa y permanece rodeando a la doble cadena de DNA.

FACTOR de REPLICATION C (RFC)

El RFC representa en los eucariotes, el complejo proteico encargado de estructurar la abrazadera (PCNA) alrededor del DNA. Es un htero pentmero, cuyas cinco subunidades son indispensables para realizar su actividad. El RFC reconoce el extremo 3 del pre-fragmento de Okazaki y, mediante la hidrlisis del ATP, ensmabla el PCNA alrededor de la doble cadena de DNA Se ha demostrado que el RFC, junto con el RPA, ejerce un papel cono disparador en el proceso que elimina del DNA el complejo Pol /Primase, permitiendo as el ensamblaje del PCNA. Adems de su papel como ensamblador de la abrazadera, se ha demostrado que el RFC tambin debe actuar como su desensamblador, es decir en la descarga del PCNA de su posicin alrededor del DNA.

Sntesis de la Hebra Conductora

La hebra conductora es sintetizada continuamente Se inicia con un solo cebador de RNA (primer) que es sintetizado, segn la especie, por una RNA polimerasa o por la Primasa. Una vez que la Helicasa y la Polimerasa son cargadas sobre el molde de DNA, tericamente, pueden permanecer unidas a ste hasta terminar la sntesis completa del cromosoma. La subunidad del cargador de la Abrazadera conecta la holoenzima de la Polimerasa con la Helicasa. La velocidad de sntesis de la Polimerasa, cuando se encuentra fija en la horquilla de replicacin junto con la Helicasa, es mucho mayor que cuando ambas enzimas trabajan de manera aislada. Aunque la sntesis de la hebra conductora es extremadamente procesiva, la evidencia reciente indica que, en bacterias, la horquilla de replicacin se detiene antes de la sntesis completa del cromosoma y debe ser re-ensamblada.

La Primasa sintetiza segmentos cortos de RNA (812 nucletido) que son alargados por la Pol hasta unos 30 nucletidos, formando fragmentos pre-Okazaki.

Pol primasa

Mcm 4,6,7 htero trmero, parte del complejo MCM, contiene la actividad de DNA Helicasa, y la actividad de ATPasa dependiente de DNA.

El RFC representa en los eucariotes, el complejo proteico encargado de estructurar la abrazadera (PCNA) alrededor del DNA.

Pol o Pol

RFA (Replicator Factor A) es homlogo a las SSB, protenas de unin al DNA de hebra simple

Sntesis de la Hebra Retrasada

Puesto que la hebra retrasada es construida por la unin de varios segmentos cortos, existe un ciclo de reacciones necesarias para iniciar, alargar y reunir cada uno de los fragmentos recin sintetizados con el resto de la cadena. Puesto que la hebra retrasada y la hebra conductora son sintetizadas por la misma estructura retenida sobre el DNA molde por las abrazaderas, este ciclo de reacciones debe estar muy bien coordinada, no solamente entre ellas mismas, sino con las reacciones de sntesis de la hebra conductora. El ciclo de reacciones que son necesarias para la sntesis de la hebra retrasada se completan en tiempos muy breves, pocos segundos, a causa de que cada fragmento esta formado por 10003000 bases, y la replicacin se realiza a 4001000 bases/segundo.

La sntesis de cada fragmento de Okazaki termina cuando la DNA pol se encuentra con el cebador de RNA unido al extremo 5 del fragmento anterior de DNA

Eliminacin del Cebador Elongacin del fragmento para rellenar con DNA el hueco Unin de los extremos resultantes para dar una hebra continua

Polimerasa Polimerasa

Tanto Pol como Pol son polimerasas indispensables para la replicacin del DNA en eucariotes. Sin embargo, su funcin especfica en la horquilla de replicacin se desconoce con precisin hasta este momento. Tanto Pol como Pol requieren del PCNA (abrazadera o clamp) para catalizar la sntesis procesiva del DNA en presencia de concentraciones salinas fisiolgicas. Sin embargo a concentraciones inicas bajas, solo la Pol puede actuar alargando las cadenas de DNA despus de construdo el cebador Experimentos tanto in vivo como in vitro indican que en el sistema de replicacin libre de clulas del Xenopus, ambas polimerasas, y , son indispensables para efectuar la replicacin Estudios de la frecuencia de mutaciones en S. cerevisiae sugieren que la actividad correctora de cada una de las enzimas acta en hebras de DNA diferentes Obviamente se requieren estudios mas pormenorizados para determinar las funciones de cada una de estas polimerasas.

Topoisomerasas
Todas nuestras clulas poseen dos tipos de topoisomerasas capaces de relajar la tensin helicoidal del ADN. Curiosamente, sus mecanismos de accin son muy distintos:

la topoisomerasa 1, corta slo una de las dos hebras del ADN.

La hebra intacta acta entonces como pivote y el ADN rota axialmente. Su actividad no depende de ATP. la topoisomerasa 2, corta simultneamente las dos hebras del ADN y permite cruzar -a travs de dicho corte- a otra doble hlice de ADN. Este efecto de la Topoisomerasa 2 requiere la inversin de energa producida por la hidrlisis del ATP. Con este mecanismo, las hebras de ADN se comportan como "cadenas fantasma", ya que un segmento de ADN puede "atravesar" a otro como si no estuviera gracias a una "puerta" temporal abierta por la topoisomerasa 2. La topoisomerasa 2 hace desaparecer de este modo -uno a uno- todos los nudos y entrecruzamientos del ADN generados por la tensin helicoidal.

DNA Girasa

La DNA girasa es una de las topoisomerasas de DNA que acta durante la replicacin del ADN para reducir la tensin molecular causada por el superenrollamiento. La DNA girasa produce cortes de doble cadena y despus los une. La DNA girasa, como topoisomerasa, tiene una funcin muy importante en la modulacin del estado topolgico del DNA, pues regula su estructura superhelicoidal. A diferencia de la DNA girasa, la topoisomerasa 1 corta solo una de las dos cadenas de la doble hlice del DNA; y acta en la transcripcin del DNA. Mientras, la DNA girasa (o topoisomerasa 2) corta ambas cadenas del DNA para aliviar el superenrrollamiento, y acta durante la replicacin del DNA.

Las molculas ADN doble hlice lineal tienen problemas para replicar sus extremos, ya que las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que ir aadiendo nucletidos. Uno de los extremos de cada hlice (el extremo 5') se puede copiar sin problemas debido a que viene cebado desde atrs, sin embargo, el extremo contrario (extremo 3') no podra replicarse ya que no puede ser cebado desde atrs. Como consecuencia quedara un corto segmento al final sin copiarse y se ira acortando el ADN por ese extremo en cada ronda de replicacin.

Problemas de replicacin de los extremos

Telmeros
En un cromosoma existen dos tipos de DNA : el DNA codificante, que constituye los genes, es decir, porciones del cromosoma donde se encuentra la informacin que codifica las protenas y los cidos ribonucleicos que desempean funciones dentro de la clula, disperso entre una gran cantidad de DNA no codificante. Entre el DNA no codificante se encuentran el que forma los telmeros de los cromosomas. Los telmeros juegan un importante papel en la vida de las clulas ya que mantienen la integridad de las terminaciones de los cromosomas impidiendo que se enmaraen y adhieran unos con otros, ayudan a que los cromosomas homlogos se emparejen y entrecrucen durante la profase de la meiosis. Los telmeros humanos y murinos contienen hasta 2.000 veces repetida la secuencia 5' TTAGGG 3'

Telmeros
A diferencia de los organismos procariotas que tienen un genoma circular, los organismos eucariotas poseen cromosomas lineales en los cuales se presenta el problema de su acortamiento durante la replicacin debido a que al eliminar el cebador de los fragmentos de Okazaki del extremo 5' de la cadena retardada del telmero del nuevo cromosoma lineal se produce un hueco que no puede ser rellenado por accin de la DNA polimerasa, puesto que solo funcionan en direccin 5' - 3' y necesitan un extremo 3'OH, y en el final del cromosoma no hay espacio para regenerar el RNA cebador necesario para donar el extremo 3'OH y completar la sntesis del ltimo fragmento de Okazaki. De esta manera, en las clulas somticas ya maduras se acortan los telmeros a razn de 100 a 150 nucletidos en cada proceso replicativo. La telomerasa (TERT) es una transcriptasa reversa que sintetiza DNA a partir de un molde de RNA. Se trata de una ribonucleoproteina que, en el ser humano, contiene en su molcula la secuencia AAUUCCC capaz de crear e insertar los fragmentos TTAAGGG que se pierden en cada division.

Telmeros y Telomerasa

Los extremos de los cromosomas lineales no pueden ser replicados por ninguno de los mecanismos vistos hasta ahora. Ello es debido a que el RNA cebador situado en el extremo 5' de la hebra retrasada, cuando ya ha sido completada su sntesis, no puede ser reemplazado por DNA, ya que no existe el mecanismo necesario para ello. Para replicar las secuencias de DNA de los extremos de los cromosomas eucariticos, es decir, los telmeros, se requiere un procedimiento diferente El DNA telomrico posee una secuencia poco corriente, que consta de hasta mil o ms repeticiones en tndem de una sencilla secuencia rica en G, dependiente de especie, situada en la hebra del extremo 3', al final del cromosoma. As, por ejemplo, el protozoo ciliado Tetrahymena, tiene la secuencia telomrica repetida TTGGGG, mientras que en el hombre, y en general en los vertebrados, es TTAGGG.

Las molculas ADN doble hlice lineal tienen problemas para replicar sus extremos, ya que las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que ir aadiendo nucletidos. Uno de los extremos de cada hlice (el extremo 5') se puede copiar sin problemas debido a que viene cebado desde atrs, sin embargo, el extremo contrario (extremo 3') no podra replicarse ya que no puede ser cebado desde atrs. Como consecuencia quedara un corto segmento al final sin copiarse y se ira acortando el ADN por ese extremo en cada ronda de replicacin.

Problemas de replicacin de los extremos

Telomerasa

El DNA telomrico se sintetiza a travs de un mecanismo nico. La enzima que sintetiza la hebra rica en G del DNA telomrico se llama telomerasa. La telomerasa de Tetrahymena, por ejemplo, aade repeticiones en tndem de la secuencia telomrica TTGGGG al extremo 3' de cualquier oligonucletido telomrico rico en G, independientemente de cualquier molde exgeno aadido. Ello se dedujo a partir del descubrimiento de que las telomerasas son ribonucleoprotenas, cuyos RNAs componentes contienen un segmento que es complementario de la secuencia telomrica repetida. Al parecer, esta secuencia acta como molde en una reaccin del tipo transcriptasa inversa que sintetiza la secuencia telomrica Una vez terminada la sntesis de una secuencia, la Telomerasa se transloca hacia el nuevo extremo 3' del DNA y repite el proceso, tantas veces como sea necesario.

Telomerasa
La telomerasa es una enzima que se encarga de la adicin de desoxirribonucletidos a los extremos de los telmeros, pero dicha adicin est dirigida por una secuencia de ribonucletidos o RNA, por lo que podemos decir que se trata de una transcriptasa inversa de caractersticas especiales. Hablamos de una ribonucleoprotena que siempre sintetiza la misma secuencia de DNA. La telomerasa est formada por dos componentes:

Componente ribonucleotdico: se trata de la porcin de RNA de la

telomerasa (tambin llamado TR o TERC, de telomerase RNA component) que se encuentra totalmente integrado en la enzima. Segn las especies, ste puede ser de entre 146 a 1544 nucletidos de longitud. La secuencia molde del telmero suele tener una longitud de entre 9 y 28 nucletidos y es caractersticas de cada especie. Componente proteico: es la parte de la enzima que contiene la capacidad transcriptasa inversa (TRT o TERT de telomerase reverse transcriptase); invierte el curso normal (DNA hacia RNA) y va del RNA al DNA. La transcriptasa inversa de virus y todas las DNA polimerasas necesitan un cebador para sintetizar DNA, sin embargo, la telomerasa no necesita dicho cebador.

Sntesis de telmeros por la telomerasa. a) La telomerasa se une al telmero; b) La telomerasa alarga los extremos de la cadena 3; c) La telomerasa se transloca; d) La DNA polimerasa sintetiza la cadena retrasada. e) Se estima que cada telmero humano pierde unas 100 pares de bases de DNA telomrico en cada replicacin. Esto representa unos 16 fragmentos TTAAGGG.

Telmeros

Los telmeros son cruciales en la vida de la clula. Ellos son necesarios para la duplicacin completa del cromosoma, los protegen de las nucleasas, evitan que los extremos del cromosoma se fusionen entre s y facilitan la interaccin del cromosoma con la envoltura nuclear. Los telmeros de las clulas humanas contienen la secuencia 5'TTAGGG3, que se repite aproximadamente 2000 veces.

5 '... ..TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG..... 3 ' 3 '... ..AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC A..... 5 '

La cadena rica en guanosina corre en direccin 5' a 3', extendindose 12 a 15 nucletidos ms all de la cadena rica en citosina, formando un apndice en una de las cadena en cada extremo del cromosoma. Este desnivel se mantiene de generacin en generacin por medio de una enzima especial, la telomerasa, que agrega nuevas unidades al extremo 3' de la cadena rica en guanosina. La telomerasa es una ribonucleoprotena con actividad de transcriptasa inversa, la cual provee un molde de AAUCCC que gua la insercin de la secuencia TTAGGG en tantas repeticiones como sea necesario. Las clulas con telomerasa activa pueden compensar el acortamiento de los telmeros durante la duplicacin del ADN.

La telomerasa muestra un patrn de expresin particular y slo se encuentra activa, en las clulas madre embrionarias, en las clulas madre del adulto , clulas germinales y clulas tumorales. Mientras que en las clulas somticas que son las que constituyen la mayor parte de los tejidos diferenciados se encuentra inactiva.

* La secuencia de la molcula molde de RNA puede variar en las diferentes especies

El gene de la telomerasa no se expresa en las clulas somticas y cada vez que la clula se divide debido al mecanismo de replicacin del DNA - los telmeros se acortan. As, con cada divisin mittica los telmeros resultan cada vez ms cortos, se ha postulado que este acortamiento del telmero afecta la estabilidad de los cromosomas impidiendo que las clulas puedan dividirse en forma indefinida. Cuando la clula ya no puede dividirse ms debido a sus telmeros acortados, muere. Algunos investigadores opinan que este lmite al nmero de divisiones celulares que una clula puede realizar es una forma de proteccin contra el cncer.