UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE FAUSTINO SANCHEZ CARRION FACULTAD DE HUMANA E.A.

P DE MEDICINA HUMANA

CUADERNO DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

ALUMNO:

DOCENTES:

Dra. Zoila F. Honorio Durand Dra. Emma del R. Guerrero Hurtado Mg. Mara Luisa S. Solano Timoteo HUACHO-2011

Dra. Zoila Honorio Duran

PRESENTACION

TODO CONCEPTO TEORICO DEBE PROBARSE, PERO PARA QUE EL TRABAJO SEA EFECTIVO DEBEMOS DE PROGRAMAR LO QUE QUEREMOS HACER. POR ESO PRESENTAMOS EL CUADERNO DE LABORATORIO, CUYO DESARROLLO NOS PERMITA COMPROBAR DICHOS CONCEPTOS. TODO SERA MAS LLEVADERO SI ANTES DE INGRESAR AL LABORATORIO LEES TU CUADERNO, PARA CONOCER EL TEMA A DESARROLLAR, TRAES LOS MATERIALES A UTILIZAR Y DURANTE LA PRACTICA APLICAS LO ESTUDIADO EN CLASE. EL TRABAJO EN LABORATORIO, ES MUY ESPECIAL, TENEMOS QUE PREPARARNOS PARA TENER XITO. TODO DEPENDE, EN ESPECIAL DE TI.

Las docentes

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NORMAS DEL LABORATORIO DE BIOQUIMICA

En el Laboratorio de Bioqumica se exige: respeto, limpieza, cuidado en el uso de materiales, equipos y muchos deseos de trabajar, por eso antes de ingresar al laboratorio debes tener en cuenta lo siguiente: 1.- Previamente leer tu cuaderno para saber lo que vas a hacer en el Laboratorio 2.- Tener puesto tu mandil, de preferencia de algodn de color blanco. 3.- Tener el cabello recogido (gancho, cinta, etc). 4.- Tener en cuenta la limpieza del lugar donde vas a trabajar. 5.- Llevar a la mesa slo tu cuaderno de laboratorio. 6.-Antes de usar cualquier material preguntar al docente. 7.-Dejar limpio el laboratorio para que los dems compaeros puedan seguir trabajando.

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PROGRAMACION

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Determinacin de pH de muestras biolgicas. Determinacin de cidos titulables en orina como efecto de una dieta. Espectrofotometra Factores que alteran la actividad cataltica de los enzimas. Determinacin de la Actividad de Succinato Deshidrogenasa Digestin enzimtica del almidn. Determinacin de glucosa en sangre Accin de la lipasa pancretica. Determinacin de Triglicridos

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5. 6.

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10. Determinacin de Colesterol en sangre. 11. Hidrlisis enzimtica de las protenas. Propiedades de aminocidos y protenas. 12. Cromatografa de capa fina. 13. Obtencin de cadena de cidos nucleicos.

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INTRODUCCION

Las prcticas que se desarrollaran en el presente semestre se harn en plasma, orina, saliva y en alimentos. La sangre ser extrada de la puncin venosa y puncin cutnea. Como conocimiento previo debemos de saber la conservacin de las muestras, segn el anlisis que se quiera realizar ya que los metabolitos pueden sufrir alteraciones estructurales por factores externos que van a dificultar su reconocimiento. An sabiendo mantener las muestras en forma adecuada, el anlisis bioqumico slo se completa con el conocimiento del manejo instrumental y de materiales de laboratorio en forma adecuada. Las sesiones de laboratorio van a estar alternadas con el desarrollo de prcticas instrumentales, con el Objetivo de que antes de realizar el anlisis en los especimenes biolgicos debemos de saber el fundamento y el uso laboratorio. adecuado de los equipos del

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Prctica N 01 DETERMINACIN DE pH DE LIQUIDOS BIOLOGICOS.

I.-GENERALIDADES.Tal como se ha estudiado en las clases tericas, la concentracin de H+ es vital para los procesos biolgicos. Es importante tambin determinar la concentracin de H+ en los alimentos, como control de calidad. El mtodo ms exacto es por potenciometra. Con la finalidad de cumplir con el objetivo sealado en la introduccin estudiaremos las caractersticas de un potencimetro. Las tcnicas potencio mtricas se basan en la medicin de una fuerza electromotriz (f.e.m) producida por una clula electroqumica. En forma bsica, la clula consiste de dos electrodos de alambre cada una sumergida en una solucin distinta, constituyendo cada una la semiclula. Las soluciones tienen compuestos o iones fcilmente reducibles u oxidables y estn unidos a travs de un puente de agar/cloruro de potasio. Estas soluciones pueden coger electrones del alambre, cargndose stos positivamente, establecindose una diferencia de potencial entre la solucin y el alambre. El metal es parte de un circuito, y as, si un compuesto menos reductor u oxidante est en contacto con el otro metal, habr un flujo de electrones (una corriente) el que queda registrado por el circuito potenciomtrico (que une a los 2 alambres).

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A fin de establecer valores, una de las semiclulas es considerada como Electrodo de referencia, tales como de: Hidrgeno, se usa un gas de hidrgeno puro a presin constante y como metal platino recubierto de negro de platino, y solucin de HCl, (1,228 mox 100ml de HCl) establecindose un potencial estable en el platino por el equilibrio entre el gas de hidrgeno y los hidrogeniones. La desventaja de este electrodo es que no debe haber presencia de oxgeno, es decir en la muestra no debe contener oxidantes ni sales metlicas porque se destruye fcilmente, en el caso que contenga protenas, puede haber reacciones qumicas entre el hidrgeno gaseoso y los componentes de la solucin problema (muestra). Electrodos de calomelanos, tiene como solucin cloruro mercurioso (calomelanos) y cloruro potsico, en contacto con cloruro mercurioso slido y mercurio. Hg / Hg2Cl2 / KCl saturado // disolucin muestra El no es sensible a los iones de H+. Electrodo de vidrio que en reemplazo a los calomenanos presenta plata/ cloruro de plata en una disolucin de HCl. Ag / AgCl / HCl El electrodo de vidrio es mucho menos susceptible a las interferencias y puede emplearse para determinar una amplia gama de pHs, (la solucin problema puede contener sales salinas y agentes reductores y oxidantes), sin embargo a pH muy alcalinos, mayores de 9 10, es menos exacto y se torna sensible al Ion sodio. El electrodo de vidrio se asa en que ciertos tipos de

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vidrio de borosilicato son permeables a iones de H+ pero no a otros cationes o aniones. NOTA: Los electrodos nuevos o secos deben ser remojados en una solucin tampn 7,0 durante varias horas. Los electrodos siempre deben de guardarse en agua destilada, pues si se secan se provoca un cambio del potencial asimtrico, por lo que se va a requerir calibrar el aparato. Los cambios de temperatura provocan desplazamiento del pH, especialmente en soluciones alcalinas, por lo que se recomienda tomar nota de la temperatura de la muestra. NOTA: Los potencimetros generalmente son estandarizados con una solucin de pH conocido. Entre los ms usados tenemos: 1. Ftalato monobsico de potasio 0,050M de pH 4,01 2.-Fosfato de potasio monobsico 0,025M y Fosfato de sodio dibsico 0.025M con un pH de 6,86 3.-Tetraborato sdico 0,010 M de pH 9,18 Siempre hay que verificar los niveles de la solucin de KCl dentro del electrodo, si est por debajo de lo normal, adicionar la solucin saturada de KCl por el orificio superior ayudndose con una jeringa descartable sin aguja. La membrana de vidrio no debe ser tocada o secada en forma brusca, ya que es muy sensible a los pasos de iones de H. Si las lecturas son lentas en estabilizar o no son reproducibles, se recomienda reactivarlo, sumergiendo el electrodo en HCl 0,1 M durante 2 horas. No se debe medir el pH de muestras muy concentradas de protenas ni de muestras precipitadas porque pueden taponar el

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orificio que pone en comunicacin el KCl /es el puente salino) del electrodo con la solucin problema. Con la finalidad de medir el contenido de acidez en el estmago, se utilizan electrodos de estmago (que pueden ser deglutidos), en caso de detectar las lceras. Otros electrodos especiales se usan para determinar el pH de la piel, del msculo y otros fluidos corporales.

II.- OBJETIVO. Al trmino de la prctica el alumno debe de explicar el fundamento del potencimetro o pHmetro y calcular las concentraciones de H+ y OH- de las muestras biolgicas.

III.-MATERIALES Vasos de precipitacin Frascos lavadores con agua destilada Potencimetro con sensibilidad de 0,001 pH

IV.-PROCEDIMIENTO.Tomar en cuentas lo indicado en NOTAS, Calibrar el potencimetro con patrones de pH 7,0 y 4,5. Lavar con agua destilada el electrodo (tener cuidado ya que el bulbo es muy sensible).

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Colocar la muestra en el vaso de precipitacin, introducir el electrodo teniendo en cuenta que la muestra cubra el bulbo de vidrio. Tomar nota de la temperatura y de la lectura de pH Lavar inmediatamente el electrodo con agua destilada

V.- RESULTADOS.Completa el siguiente Cuadro muestra temperatura pH pOH H+ OH-

Interprete los resultados

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Prctica N 02 DETERMINACION DE ACIDOS TITULABLES EN ORINA

I.- GENERALIDADES.Las fuentes del cido titulable son a travs de 2 vas: Exgenos.- Los alimentos que contienen altas concentraciones de cloruro, fsforo o azufre como la palta, carne, pescado, aves, huevos, cereales, nueces son formadoras de cidos en los lquidos corporales. El S de los AA (METIONINA Y CISTEINA) se oxidan hasta cido sulfrico, el fosfato de los fosfolpidos y otros que contienen fsforo se oxidan a cido fosfrico (los dos cidos son fijos, no voltiles). Endgenos.- A travs de los procesos metablicos se general cidos inorgnicos como sulfatos y fosfatos y como cidos orgnicos tenemos mayormente al cido lctico y a los cetocidos En condiciones fisiolgicas la acidez titulable urinaria se debe en gran parte a los fosfatos. La acidez es baja en las infecciones de las vas urinarias, por transformacin de la urea en amoniaco, en las dietas ricas en vegetales o por la ingesta de lcalis. La acidez es alta en caso de una acidosis, en caso de ayuno, procesos febriles y ciertos trastornos cardiorrenales, despus de ejercicios violentos o por la ingestin de una dieta rica en carne o de ciertas frutas como el caso de las ciruelas Carga cida urinaria diaria: Acidez titulable (H2PO4-) = 25-30 mEq

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Acidez no titulable (NH+ 4) = 30-35 mEq H+ libres = pH 5,0 = 0,01 mEq En el caso de expresarlo en ml de NaOH 0,1N gastados el valor normal es de 250 a 400 ml

II.- OBJETIVO 1.-Comparar mediante valoracin del cido titulable en orina el efecto de una dieta rica en protenas y de una dieta rica en vegetales.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS Solucin de NaOH 0,1 N Erlemeyer de 250ml Bureta de 50ml Solucin alcohlica de fenolftaleina al 1% Oxalato de potasio pulverizado

IV.-PROCEDIMIENTO Mtodo de Folin. Recoger en un frasco limpio con tapa y de boca ancha, es preferible recoger la primera orina de la maana, desechando el primer chorro. El anlisis debe ser dentro de las 2 horas de haber sido recogida la muestra o refrigerarlo de 2 a 8 C Medir unos 25 ml de orina y colocarlo en el erlenmeyer de 250ml de capacidad.

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Aadir unos 15 gramos de oxalato de potasio para precipitar el calcio y evitar la formacin de fosfato de calcio. Aadir III gotas de fenolftalena. Mezclar. Titular con una solucin de NaOH 0,1N lcali hasta cambio de color ligeramente rosado persistente Anotar el volumen gastado. La cantidad de lcali aadido equivale a la acidez titulable urinaria, que se expresa como una cantidad determinada de mili equivalentes de hidrgeno excretado en el mismo tiempo.

Interprete los datos obtenidos de acuerdo al objetivo planteado

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Prctica N 03 ESPECTROFOTOMETRIA I.- GENERALIDADES.Son mtodos de anlisis cuali y cuantitativos, basados en la interaccin de la luz con los tomos y las molculas de las sustancias problemas que se quieren analizar, pudindose identificar compuestos desconocidos por su espectro de absorcin caracterstico en el UV, VIS o IR. As como tambin se pueden determinar las concentraciones de compuestos conocidos midiendo la absorcin de luz a una o ms longitudes de onda, generalmente a la longitud de onda de mxima absorcin. A fin de que la presente prctica facilite el entender, aplicar y explicar el mtodo en la determinacin de los metabolitos bioqumicos indicadores del estado de salud del hombre se explica algunas de las propiedades de la luz La luz se manifiesta mediante radiaciones electromagnticas la cual puede considerase como corpuscular o en la forma de onda. Algunas propiedades fsicas de la luz se entienden mejor mediante sus caractersticas de onda. Otras propiedades pueden explicarse a travs de su naturaleza corpuscular o de partculas. Las caractersticas de una onda son:
UN CICLO

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: longitud de onda: distancia a la que se mueve la onda durante un ciclo. Unidades: A (armstrongs) = 10-10 m cm (centmetro) = 10 7 nm nm (nanmetro) = 10-9 m = 10 -6 mm = 10-7 cm m (milimicras ) = 10 -6 mm : perodo: tiempo que se requiere para que un ciclo completo pase por un punto. Unidad: seg/ciclo o s/ciclo : frecuencia de oscilacin: nmero de ciclos que se presenta en cada segundo. Unidad ciclos/seg Hz. La relacin entre la longitud de onda () y la frecuencia () para una onda de luz es: = C C es la velocidad de luz (3,0 x 108 m/s 3,0 x 1010 cm/s) La relacin entre la frecuencia y el perodo es inverso: v = 1/T La luz por su naturaleza corpuscular o de partculas puede considerarse como una corriente de paquetes de energa que se desplazan a gran velocidad (3,0 x 10 10 cm/s). Estos paquetes de energa se denominan fotones. La frecuencia ( ) de la teora ondulante puede relacionarse con la energa de los fotones (E) de la teora de las partculas mediante la Ecuacin de Planck.

E = h

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h es la constante de Planck cuyo valor es de 6,63 x 10 -34 joule . s El nmero de onda es una caracterstica de onda que es proporcional a la energa y se define como el nmero de ondas por centmetro: = 1/

Unidad: cm -1 La radiacin electromagntica se divide en regiones denominadas: Ondas de radio, Microondas, Infrarrojo, Visible, Ultravioleta y Rayos X, las que se encuentran asociadas con las longitudes de onda, nmero de ondas, frecuencias y energa, se presentan en el siguiente grfico. El espectro ptico o electromagntico es detectado por equipos especiales como: FOTOCOLORIMETRO: Cuya zona de observacin es en la Zona visible: (400 700 nm). ESPECTROFOTOMETRO: Estas pueden ser de dos clases: 1. Espectrofotmetro UV que comprende de 10 400 nm. * UV cercano 200 400 nm * UV lejano 10 200 nm 2. Espectrofotmetro IR que comprende de 760 10 000 nm

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* IR cercano 0,75 2,50 m * IR medio 2,50 5,00 m * IR lejano 5,00 10 m Las molculas biolgicas absorben las radiaciones de la regin UV cercana (200 400 nm). Las protenas lo hacen en el UV lejano debido a los enlaces peptdico, mientras que la Fenilalanina, Tirosina y Triptfano absorben a 280 nm lo cual constituye el fundamento de una tcnica muy sensible para determinar protenas sin que se destruya la muestra. Los esteroides, las bases pricas y pirimidnicas, nuclesidos y nucletidos lo hacen tambin en la regin UV. Los enlaces o grupos funcionales como: amino, carboxilo, metilo, amida absorben las radiaciones de la regin IR. La molcula o parte de ella que se excita por la luz como consecuencia de la absorcin de sta se denomina CROMOFORO. Cuando la luz continua se hace pasar a travs de un prisma, la luz sufre una dispersin de sus longitudes de onda componentes. Cuando estas longitudes de onda dispersas se les hacen pasar a travs de una celda que contiene la muestra problema (tomos o molculas), la luz emergente deja de ser continua ya que parte de las ondas de luz han interaccionado con los tomos o molculas y han sido absorbidos por stos. Las longitudes de ondas faltantes se detectan cuando la luz emergente de la celda que contiene la muestra problema incide sobre una placa fotogrfica o sobre algn dispositivo o detector. A este procedimiento se le denomina ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION.

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Dibuje las partes bsicas de un espectrofotmetro tpico.

La longitud de onda en la que las molculas o tomos de la muestra absorben con mayor intensidad la luz, se denomina LONGITUD DE MAXIMA ABSORCION. Los procesos de absorcin de las radiaciones electromagnticas son explicados por la Ley de Lambert-Beer que relaciona la intensidad de la luz incidente (Io) y la transmitida (It) en funcin de la concentracin de las molculas y tomos que absorben la luz. Su expresin es: A = log Io/It = e. l. C A = - log It/Io = e. l. C

Donde: A: Absorbancia o Extincin e : Coeficiente de extincin molar. Valor constante que depende de la naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda. L: ancho del recipiente de la muestra = 1 cm C: Concentracin de la muestra problema

A.- Uso del Espectrofotmetro.

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Vamos a aplicar los conceptos hasta hoy estudiados usando el espectrofotmetro UV, para el cual usaremos un reactivo coloreado como ejemplo antes de usar las muestras que usaremos para el anlisis de glucosa.

II.- MATERIALES Y REACTIVOS Equipos: Balanza analtica Espectrofotometro UV Muestra: solucin de Permanganato de Potasio (KMnO4 ) 4 mg/litro.

III.- PROCEDIMIENTO 4.1 Bsqueda de la longitud de onda ( ) ptima para la muestra . Encender el espectrofotmetro 30 min antes de empezar a trabajar. Seleccionar la regin visible (VIS) del espectro, e Iniciar las lecturas desde 400 nm. Colocar en la cubeta agua destilada y llevar a CERO de Absorbancia y 100% de Transmitancia. Colocar en otra cubeta la solucin problema. Realizar la lectura en Absorbancia y anotar el valor obtenido. Aumentar la a 420 nm . Recuerde que cada vez que se cambie de longitud de onda es

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necesario graduar el instrumento en CERO con agua destilada en la cubeta. Luego: LEER la absorbancia. Repetir la misma operacin DE 20 nm cada vez hasta llegar a 700 nm En el papel milimetrado dibuje la Curva Espectral A vs

DATOS: Lectura (A) Lectura (A)

Explicacin de los resultados:

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Prctica N04 FACTORES QUE ALTERAN LA ACTIVIDAD CATALITICA DE LOS ENZIMAS

I.- GENERALIDADES.Las enzimas son protenas biocatalizadores, sensibles de modificar su actividad por la alteracin de las condiciones de su medio de accin ya que actan solo bajo condiciones definidas de pH, temperatura, concentracin de sustratos, cofactores, etc. Sobre los cofactores hay que recordar que los enzimas para su actividad requieren de sustancias no proteicas que pueden ser de naturaleza orgnica (coenzimas) o inorgnicas (minerales) los que cumplen funciones especificas como la de coordinar entre el centro activo del enzima con el sustrato antes de la transformacin de ste a producto. Hay medicamentos que actan como competidores de las vitaminas las que son coenzimas y por lo tanto bloquean la accin de los enzimas o lo que es ms inhiben la sntesis de los enzimas especficos, por ejemplo el metrotexato (MTX), empleado para el tratamiento de la leucemia y artritis reumatoide que libera al folato de la enzima hidrofolato reductasa. Los enzimas se clasifican por su accin en seis clases; tambin toman el nombre genrico segn el sustrato por ejemplo los enzimas proteo lticos como la pepsina, quimotripsina, tripsina, etc.

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II. OBJETIVO Demostrar el efecto de los factores: Concentracin de Sustrato, Concentracin de Enzima, pH y Temperatura sobre la actividad enzimtica de la Amilasa salival sobre el almidn.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS. Solucin de almidn al 1% Enzima: Solucin de alfa amilasa salival 1% Sol. Buffer fosfato 0,1M a pH 4,6; 6,8 y 9,0 Sol. Yodo iodurada (Lugol) Sol Cloruro de sodio 0,2%

dializada

IV.- PROCEDIMIENTO: Coleccin de la saliva: El alumno donante no debe haber ingerido alimento unas 2 horas antes como mnimo. Previamente se tiene que enjuagar la boca con agua, luego manteniendo la boca cerrada por unos 5-7 minutos esperar que su boca se llene de saliva. Luego en un vaso dejar fluir por gravedad la saliva para evitar que se forme espuma. Preparacin de la solucin de saliva al 1%: Previamente la saliva recolectada se debe de filtrar y luego medir 1ml y diluirlo con agua destilada en una fiola de 100ml

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Seguir las indicaciones de las siguientes tablas.a.- Batera N01 Reac.\tub o Sol. Almidn 1% Buffer pH4,6 Buffar pH 6,8 Buffer pH 9,0 Sol. NaCl Agua dest. 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1,5 7 1 8 1 9 1

5 1,4 2,6

5 1,4 2,0

5 1,4 2,0

5 1,4 2,0

5 1,4 2,4

5 1,4 1,5

5 3,4

5 1,4 2,0

5 1,4 2,0

HOMOGENIZAR CADA TUBO Colocar en bao mara a 37C los tubos del 1 al 7 por 5 minutos. El tubo 8 llevar a 0C por 5 minutos y el tubo 9 a bao mara de 100C por 5 minutos Cumplido los 5 minutos, agregar la solucin enzimtica, como se indica en el siguiente Cuadro: Sol. 0,0 enzimtico 0,6 0,6 0,6 0,2 0,6 0,6 0,6 0,6

MEZCLAR BIEN CADA TUBO SIN RETIRARLO DEL MEDIO EN QUE SE ENCUENTRAN

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Continuar la incubacin, considerando un control de 20 minutos, desde el momento que el preparado enzimtico fue agregado a cada tubo. Cumplido el tiempo exacto de 20 minutos, medir 0,5 ml de cada tubo y aadir a la batea N02 tal como se indica en la siguiente Tabla b.- Batera N02. Reac\tubo Sol HCl 0.05N (ml) Sol. Lugol (ml) Incubado (ml) 1 2, 5 5, 0 0, 5 2 2, 5 5, 0 0, 5 3 2, 5 5, 0 0, 5 4 2, 5 5, 0 0, 5 5 2, 5 5, 0 0, 5 6 2, 5 5, 0 0, 5 7 2, 5 5, 0 0, 5 8 2, 5 5, 0 0, 5 9 2,5

5,0 0,5

MEZCLAR.

Explicar los resultados

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APLICACIONES DE MODELO DE LINEWEAVER BURCK: CINETICA ENZIMATICA

GENERALIDADES.- La cintica de Michaelis-Mentes describe la velocidad de reaccin de muchas reacciones enzimticas. Su nombre es en honor a Leonor Michaelis y Maud Menten. Este modelo slo es vlido cuando la concentracin del sustrato es mayor que la concentracin de la enzima. Los parmetros cinticos de una enzima son el Km y la Vmax. Recordemos los que significa el Km (Constante de MichaelisMenten): Concentracin de sustrato para la que se alcanza la velocidad igual a la mitad de la mxima (Vmax) Afinidad de un enzima por un sustrato determinado Permite comparar la afinidad de un enzima por distintos sustratos y la afinidad de varios enzimas por el mismo sustrato Se puede determinar con facilidad en el laboratorio La velocidad de reaccin es muy sensible a cambios en [S] en la zona de Km. Las Km y Vmax pueden determinarse con mayor facilidad y en forma experimental aplicando el recproco de la Ecuacin de Michaelis-Menten conocido como ecuacin de Lineweaver-Burk:

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Lo que facilita la grfica para calcular las constantes cinticas: Km y Vmax.

formas de INHIBICION ENZIMATICA. Cuando se usa para determinar el tipo de inhibicin de la enzima, la Lineweaver-Burk puede distinguir competitivos, no competitivos y acompetitivos inhibidores con las respectivas caractersticas ya estudiadas en teora. OBJETIVO: Demostrar la aplicacin del grfico de Lineweaver-Burk en el clculo de Km y Vmax con datos tericos y los obtenidos mediante un trabajo experimental. PROCEDIMIENTO: 1.- TEORICO: Al estudiar la cintica de inhibicin de cierto enzima se han obtenido los resultados de la tabla siguiente:

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________________________________________________ Sustrato (mM) v (mol/min) [I]= 0 0,02 0.05 0.10 0.20 0.50 1,18 1,43 1,54 1,60 1,64 [I]= 0,1 mM 2,90 5,00 6,67 8,13 9,09 [I]= 1 mM 2,52 4,02 5,02 5,72 6,25

Determinar grficamente: a) el tipo de inhibicin; b) el valor de Km del enzima; c) la velocidad mxima y d) el valor de Ki Sol.: a) Inhibicin acompetitiva; b) Km= 0,05 mM; c) Vmax= 10 moles/ min; d) Ki= 0,2 mM. 2.- EXPERIMENTAL: 2.1.-Materiales y reactivos Sustrato: soluciones de glucosa a diferentes concentraciones Enzima: glucosa oxidasa 8 tubos de ensayo pequeos 9 pipetas de 1ml Agua destilada HCl concentrado

2.2.-Procedimiento Preparar soluciones de glucosa de las siguientes concentraciones:

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1;

2,5;

5,0;

10;

25 y

100 mM

2.3.- Seguir las indicaciones expuestas en el siguiente Cuadro: REAC/TUB O Sol. glucosa 0,1ml de Agua (ml) Rvo. Color(ml) 1 0,1 0.9 2 1 mM 0,9 3 2,5 mM 0,9 4 5,0 mM 0,9 5 10 mM 0,9 6 25 mM 0,9 7 100 mM 0,9

Agitar, incubar 20 min a temperatura ambiente. Al finalizar la incubacin, agregar 3 gotas de HCl concentrado. Agitar levemente. Leer a 492 505 nm. ABSORBA NCIA CONC. mg/ml GRAFICO: Usando los resultados elaborar un grfico de Lineweaver-Burk y calcular Km y Vmax. Prctica N05 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

I.- GENERALIDADES.-

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Durante el proceso metablico se llevan a cabo reacciones en las que hay transferencia de electrones desde un dador (el reductor) hasta un aceptor electrnico (el oxidante). En ciertas reacciones de oxido reduccin la transferencia de electrones se realiza por medio de la transferencia de tomos de hidrgeno por lo que una deshidrogenacin equivale a una oxidacin, estas reacciones son catalizadas por deshidrogenasas las que se encuentran ampliamente distribuidas. La cadena respiratoria es el proceso donde se dan mayormente estos tipos de reacciones, dando origen a los enlaces fosfricos del ATP. Ejm.: NADH + CoQ CoQ Reductasa NAD + CoQH2 Otro ejemplo de estas reacciones se dan en el ciclo de Krebs: Succinato FADH2 + FAD Succinato deshidrogenasa Fumarato +

La oxidacin del succinato a fumarato es catalizado por el complejo de la succinato deshidrogenasa (succinato deshidrogenasa). Este complejo consiste en varios polipptidos e incluye un grupo prosttico FAD unido covalentemente a un residuo de histidina de la enzima, protenas con fierro y azufre y una molcula de citocromo. Estos cofactores de transporte de electrones participan en la remocin de electrones del succinato y en la donacin de electrones a la ubiquinona. En el experimento esos electrones son transferidos a travs del FADH2, centro Fe-S hasta un aceptor artificial como el azul de metileno (oxidado) el cual al reducirse presenta un cambio en su espectro de absorcin (incoloro). II.- OBJETIVOS

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Demostrar la actividad de las deshidrogenasas III.-MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de prueba de Hgado Fiolas Pipetas Termmetros Mechero IV.- PROCEDIMIENTO 4.1Determinacin de la Presencia de deshidrogenasas, Seguir las indicaciones del siguiente cuadro: Soluciones/tubos Ml homogeneizado de hgado Gotas de azul de metileno Ml vaselina lquida *Previamente hervido 1 2* 2 2 2 2 2 2 3 2 2 homogeneizado Acido succnico Azul de metileno ClNa 0,9% vaselina lquida

Llevar a Bao Maria de 37C. Controlar el tiempo que demora cada tubo en decolorar el azul de metileno. 4.2 investigacin de la deshidrogenasa succnica Soluciones 1 /tubos ml. de 1 homogenizado sol. buffer pH 1 2 1 1 3 1 1 4 1 1 5 2 1

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7.4 Ac. Succinico 0. 2N Agua destilada 2 Azul de 2 metileno gotas

1 1 2

1 0.8 4

2 2

1 2

Mezclar, aadir 0,5 ml. de vaselina. Llevar a bao Mara a 37 C. Explique los resultados.

Prctica N06 DIGESTION ENZIMATICA DEL ALMIDN

I.-GENERALIDADES.El almidn es el polisacrido principal fuente de energa para el hombre. Estructuralmente est constituido por dos cadenas: la amilosa (polmero de D- glucosas unidas por enlaces 1-4 , de

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forma lineal helicoidal) y la amilopectina (polisacrido de Dglucosas unidas por enlaces 1-4 y 1-6 de forma ramificada). El enzima amilasa, presente en la saliva y en la secrecin pancretica es la responsable de la hidrlisis de los enlaces 1-4 glucosdicos del almidn, a pH 6,8-7,2. Los productos finales de su accin cataltica es un alto porcentaje de maltosa, glucosa, isomaltosas y dextrinas. II.- OBJETIVO: . Determinar los productos de la accin enzimtica en la digestin del almidn. III.- MATERIALES Y REACTIVOS 1.- Bao Mara 2.-Tubos de precipitacin 3.- Sol. de almidn al 1% 4.- Buffer fosfato 0,1 M pH 6,8 5.-Sol. HCl 0,5 N 6.-Sol. NaCl 0,9% 7.- Reactivo de Lugol 8.- Reactivo de Benedict IV.- PROCEDIMIENTO 1.- Solucin de saliva al 1%.- Proceder igual a la Prctica N 04. 2.- Digestin del almidn: Seguir las indicaciones Tubos Sol. almidn 1% 1 1, 2 1, 3 1,0

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Buffer fosfato 6,8 Sol HCl 0,5 N Agua destilada Sol NaCl 0,9%

0 pH 0, 5 1, 2

0 0, 5 1, 2 -

1,2 0,5 -

Llevar a B.M. a 37 C por 5 minutos. Luego aadir 0,5 ml de sol. de saliva al 1% en los 3 tubos. Incubar a B.M a 37 C por 10 minutos y cada 3 minutos agitar cada tubo para evitar que se sedimente el almidn. Retirar del Bao Mara y agitando cada tubo preparar las siguientes bateras: 3.- Reconocimiento de los productos por reaccin con el Lugol: Tubos Digestin 1 Digestin 2 Digestin 3 Sol. HCl 0,5 N 1 1, 0 2 1, 0 0, 5 2, 0 3 1,0 0,5 2,0

0, 5 Reactivo de Lugol 2, 0

Mezclar cada tubo y observar los resultados: Interpretar:

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4.- Reconocimiento de los productos por reaccin con el Benedict: Tubos Digestin 1 Digestin 2 Digestin 3 Reactivo Benedict 1 0, 5 0, 5 2 0, 5 0, 5 3 0,5 0,5

Mezclar cada tubo y llevar a Bao Mara hirviente por 5 minutos. Dejar reposar y comparar los precipitados. Interpretar los resultados

Prctica N07

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DETERMINACION DE GLUCOSA EN PLASMA

I.-GENERALIDADES.Los carbohidratos de la dieta estn constituidos por azcares simples (Glucosa, fructosa y galactosa), disacridos (sacarosa, lactosa y manosa) y complejos (almidn). Las enzimas, como la amilasa y, dems enzimas glucolticas presentes en el intestino convierten a los disacridos y al almidn en hexosas, siendo la glucosa la principal. La funcin principal de la glucosa es como fuente de energa para el trabajo de las clulas. Rol que cumple cuando ingresa a las clulas donde se activa por accin de la Hexocinasa, la cual presenta 4 isoenzimas (I, II, III y Glucocinasa). El transporte de la glucosa a travs de la membrana celular, mayormente se encuentra relacionado con la Insulina quien junto con el hgado regula los niveles de glucosa srica. Los niveles altos de glucosa en suero caracteriza a la enfermedad conocida como Diabetes I y II. prctica. Qumicamente la glucosa puede estar bajo la forma de una estructura aldehdica (estructura abierta) y que por el pH fisiolgico se encuentra bajo la forma enodilica (Cclica). El equilibrio entre la forma aldehdo/enodiol permite que la glucosa pueda ser reducida y oxidada con facilidad. La determinacin de la glucosa se basa en la capacidad reductora de este azcar sobre el in cprico (Cu++) a quien transforma en in cuproso (Cu+). Este in monovalente en un medio alcalino y en calor se transforma en xido cuproso (Cu2O). Este compuesto puede ser detectado por diferentes mtodos como: Folin-Wu,

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Somogyi-Nelson y las modificaciones de estos conocidos como Benedict. Sin embargo, slo son indicadores cualitativos o semicuantitativo. Actualmente la determinacin de glucosa en suero se realiza por mtodos enzimtico como el conocido: MTODO ENZIMATICO (TRINDER)GLUCOSA-OXIDASA (GOD), cuyo fundamento es que : la glucosa es oxidada por la Glucosa oxidasa a cido glucnico ms perxido de hidrgeno, el agua oxigenada en presencia de una peroxidasa produce la copulacin oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4AF), dando lugar a la formacin de un cromgeno rojo-cerezo con absorbancia mxima a 505 nm. GLUCOSA+ O2 + HOH H2O2+4AF +fenol
GOD

Ac.Glucnico + H2O2

CROMOGENO + 4 HOH

II.-OBJETIVO: Determinar y cuantificar a travs de mtodo enzimtico los valores de glucosa en el plasma por espectrofotometra. III.-MATERIALES Y REACTIVOS Muestra: plasma -Tubos de ensayo 13 x 100 mm -Bao Maria -Espectrofotmetro a 505 nm -Kit de Trabajo de procedencia conocida.

IV.- PROCEDIMIENTO

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DETERMINACIN DE LA GLUCOSA EN SOLUCION PREPARADA: Proceder segn las indicaciones del Cuadro siguiente: Tubos Estndard (ul) Muestra (ul) Rvo.trabajo (ml) Blanco (b) 2.0 Estndard (s) 20 2.0 Desconocid o (D) 20 2.0

Incubar a 37c por 10 minutos. Retirar de B.M y enfriar a chorro de agua fra por Llevar a lectura espectrofotomtrica a 505 nm., aparato a cero con el blanco. CALCULOS: GLUCOSA (g/L) = D x F

1-3 min. llevando el

DETERMINACION DEL FACTOR (F):

F = 1.0 g/lt Lec.Est

Resultados:

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Prctica N08 ACCIN DE LA LIPASA PANCREATICA

I.- GENERALIDADES. La lipasa, al igual que la amilasa; tripsina y pepsina, pertenecen a las hidrolasas, diferencindose de otros estearasas por actuar especficamente en la interfase steragua y ser inactiva frente a sustratos hidrosolubles. Es secretado por las clulas acinosas del pncreas y acta a pH alcalino. Su accin hidroltica la ejerce a nivel de yeyuno, favorecido por la propiedad emulsificante de las sales biliares (glicocolato y transcocolato) posicin;rompen los enlaces steres de la glicerina (triglicridos en liberando monoglicridos los que sern atacados posteriormente por lipasas especficas para posicin o por las isomerasas quienes cambian la posicin por pero debido a que la accin de las isomerasas es lenta; los productos de la digestin de trigliceridos son: abundantes monoglicridos, pequea cantidad de di y triglicridos, glicerol y cidos grasos libres. La lipasa pancretica, de gran inters clnico, se presenta en la sangre en escasas concentraciones (0 a 1.5 unidades de Cherry Grandall), niveles altos son indicadores de pancreatitis aguda, carcinoma de pncreas, peritonitis aguda y obstruccin intestinal.

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II.- OBJETIVO Demostrar experimentalmente la hidrlisis enzimtica de los triglicridos.

III.- ACTIVIDAD EXPERIMENTAL MATERIALES Pipetas simples de 5 y 10 ml Bao Mara 37C Bureta de 50 ml Matraces 125 ml REACTIVOS Buffer fosfato pH 8.0 Hidrxido de sodio 0.1 N Hidrxido de sodio 0.01 N Solucin alcohlica fenolftalena Solucin de pancreatina y sales biliares.

IV.- PROCEDIMIENTO.- Muestra con que se trabajar la Experiencia: Aceite Neutralizado. 1.-Neutralizacin del aceite de pepita. Colocar 50 ml. De aceite de pepita en un matraz, aadir 2 gotas de solucin alcohlica de fenolftalena. Mezclar y agregar poco a poco Hidrxido de Sodio 0.01 N hasta una coloracin ligeramente rosada. 2.Solucin de pancreatina y sales biliares.- Para su preparacin se har uso de frmacos comerciales como el

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Helopanzyn que contiene 200 mg. de pancreatina y 50 mg. de sales biliares. Disolver 5 pastillas en 100 ml. de buffer fosfato pH 8.0. 3.- Hidrlisis del aceite de pepita (Triglicrido).- Seguir las indicaciones del siguiente cuadro. SOLUCIONES TUBOS 1 2 4 10 2 2 4 3 2 4 4 2 4 -

g aceite neutralizado ml buffer fosfato pH 8.0 ml. agua destilada

Agitar bien. Si el color ligeramente rosado no persiste aadir Hidrxido de Sodio 0.1 N poco a poco agitando continuamente hasta obtener el color. Aadir ml. de solucin pancreatina a los tubos, 2 y 3 al tubo 4 el mismo volumen pero previamente hervida. Llevar a B.M. de 37C por una hora. Titular el contenido de cada tubo con Hidrxido de sodio 0.01 N hasta color rosado usando solucin alcohlica de fenolftalena como indicador. CALCULOS: A.G.L% = Gasto NaOH N/100 x Fact.conversin Ac.Olico x N x 100 gramos de muestra

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Interpretar.Prctica N09 DETERMINACIN DE TRIGLICERIDOS

I.- GENERALIDADES.Es la forma como se encuentran almacenados los lpidos en los tejidos adiposos. Forman parte de las lipoprotenas. Pueden ser exgenos o endgenos. Se encuentran en mayor porcentaje en los quilomicrones y en la VLDL. La determinacin de TG totales se fundamenta en las siguientes reacciones: Trigliceridos + H20 LPL Glicerol + Acidos grasos

Glicerol + ATP GK Glicerol 3 fosfato + O2 GPO

Glicerol 3 fosfato + ADP

Dihidroxicetona fosfato + H2O2 POD Rojo de Quinona + 4H2O

2H2O2 + 4-amino antipirina + 4-clorofenol

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El rojo quinona es ledo a 510 nm a una temperatura de 37 C.

II.- OBJETIVO Determinar la concentracin de triglicridos en sangre.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS Muestra: Suero o plasma REACTIVOS: ESTANDAR: Triglicridos 2,2 mmol/L 200 mg/dl Buffer pH 6,9 40 mmol/L 4-Clorofenol 5.0 mmol/L Lipoprotein Lipasa 1,4 U/ml Glicerol Kinasa1,0 U/ml Glicerol 3 fosfato oxidasa 1,5 U/ml Peroxidasa 0,5 U/ml 4 Amino antipirina 0,4 mmol/L ATP 1,0 mmol/L Magnesio 5,0 mmol/L Detergentes

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IV.- PROCEDIMIENTO.- Segn las indicaciones

Blanco Reactivo de trabajo Estndar Muestra 1 ml -

Estndar 1ml 10 ul -

Muestra 1ml 10 ul

Mezclar e incubar a 37C por 5 minutos. Leer a 510 nm. CALCULOS: mg/dl = Conc estandar X Lectura de Muestra Lectura de estndar

VALORES DE REFERENCIA: Varones: 0,68 1,88 mmol/L 60,2 166,4 mg/dl Mujeres: 0,63 1,60 mmol/L 56,6 141,6 mg/dl

Resultados e interpretacin

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Prctica N 10 DETERMINACION DE COLESTEROL EN SANGRE

I.- GENERALIDADES.El colesterol presente en el organismo humano, procede de la dieta el que es absorbido a nivel del tracto intestinal junto con los cidos grasos. Tambin se obtiene por sntesis (en el hgado) a partir del acetato por va del escualeno. El colesterol est integrado por las lipoprotenas VLDL ( 13%) + LDL (70%) + HDL (17%). Quiz es el lquido de mayor inters particular, se encuentra en los ms variados tejidos (nervioso, graso, bilis donde puede formar gran parte de los clculos biliares, sangre, entre otros), es excretado normalmente por las heces, donde tambin se encuentran algunos de sus derivados (coprosterol). El colesterol es uno de los principales componentes de la fraccin insaponificable de la sangre, donde 2/3 se encuentran sobre la forma estrica y 1/3 libre. Esa proporcin es normalmente constante y las dos porciones se hallan dbilmente ligadas a las protenas plasmticas (+/- 75% en las beta-lipoprotenas).

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II.- OBJETIVO Determinar y cuantificar a travs de mtodo enzimtico los valores de Colesterol sanguneo.

III.-MATERIALES Y REACTIVOS Mtodo: ENZIMATICO (CHOD) - TRINDER COLESTEROL-OXIDASA

Fundamento: El Colesterol es oxidado enzimticamente por el colesteroloxidasa (CHOD) previa hidrlisis enzimtica de los steres mediante una Lipasa de origen fungal. El agua oxigenada generada en la oxidacin, produce la copulacin oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4AF), mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa. El producto es una quinona roja con absorbancia mxima 505 nm.
LIPASA

ESTERES DE COLESTEROL COLESTEROL + 02 H2O2

CHOD

COLESTEROL + AG Colesten-3-ona +

H2O2 + 4AF + FENOL 4 imino)-

POD

(P-benzoquinona-monofenazona + 4H20

REACTIVOS: Solucin Stndard de Colesterol: 2 g/litro

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Solucin de Enzimas: . -Lipasa Fungal (300 U/ml) -Colesterol-oxidasa (34 U/ml) -peroxidasa (20 U/ml) Solucin 4-aminofenazona: 25 mmol/litro Solucin de Fenol: 55 mmol/litro.

IV.- PROCEDIMIENTO.Toma demuestra: Paciente en Ayuno por 12 16 Horas - Se debe proceder a la extraccin de 5 cc. De sangre, tomada en un tubo de 13 x 100 mm. - Cada muestra ser centrifugada a 2500 rpm x 5 min. y se separar el suero, en otro tubo. NOTA: Si se trabaja con plasma, la muestra de sangre debe haber sido tratada solamente con Heparina como anticoagulante. Seguir las indicaciones de la tabla Tubos Estandard (ul) Muestra (ul) Rvo.Trabajo (ml) Blanco (B) ------2.0 Estandar (S) 20 ---2.0 Muestra --20 2,0

- Incubar a 37C por 15 minutos o 30 min. a temperatura ambiente. - Retirar de B.M. y enfriar a chorro de agua fra por 1-3 min.

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- Llevar a lectura espectrofotomtrica a 505 nm., llevando el aparato a CERO con el BLANCO. CALCULOS: COLESTEROL (g/L) = M x F

DETERMINACION DEL FACTOR (F):

F = 2.0 g/lt S

VALORES DE REFERENCIA: SUERO o PLASMA: HOMBRES: 1,72 2,48 g/L. MUJERES : 1,75 2,40 g/L.

Resultados e interpretacin

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Prctica N 11 HIDRLISIS DE LAS PROTEINAS: PROPIEDADES DE AMINOCIDOS Y PROTENAS

I.- GENERALIDADES.Las protenas son polmeros de aminocidos unidos por enlaces amdicos denominado peptdico. La hdrlisis enzimtica se realiza en un medio cido con la accin de la pepsina, renina o en medios alcalinos (pH 8,0) por accin de la tripsina, quimotripsina, carboxipeptidasa, aminopeptidasa, etc. Los productos de la accin enzimtica son aminocidos libres, peptidos de diversos nmeros de aminocidos. Qumicamente el grado de hidrlisis se puede determinar por el incremento de los grupos carboxlicos, amnicos o ambos. El incremento en grupos amino se puede medir por titulacin con lcali en presencia de formaldehdo o etanol. En la titulacin por el formol se forman compuestos mono o dimetillicos. As se reduce grandemente la basicidad aparente de los grupos amino, de tal manera que los N-

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hidroximetilaminocidos pueden titularse con lcali fenolftaleina en la misma forma que los cidos grasos.

Cada equivalente de lcali consumido corresponde a un equivalente de enlace peptdico escindido.

II.-OBJETIVO: Determinar el grado de hidrlisis de la protena por titulacin de losN-hidroximetilaminocidos.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS Muestra: casena Bao Mara, Bureta, Erlemeyer Sol. Carbonato de sodio al 0,3% Tolueno Sol. de pancreatina al 2% Sol. NaOH 0,02N Sol de Formol neutralizado con NaOH al 0,1 N Indicador de fenolftalena 1%

IV.-PROCEDIMIENTO: 1.- Solucin de casena: disolver 2g de casena en 75ml de una solucin de carbonato de sodio al 0,3%, aadir unas gotas de tolueno y fenoftalena. Si la solucin no es alcalina aadir lcali

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hasta que la solucin se torne de color rosado. Continuar disolviendo la casena y aadir HCl 0,1N. hasta que el color rosado desaparezca. 2.- Hidrlisis de la protena.- En un erlemeyer medir 40ml de sol. de casena en carbonato de sodio al 0,3%, aadir 10ml de sol. de pancreatina al 2% y agitar por medio minuto. Tomar 10ml de la mezcla de la digestin y proceder a titularla segn la tcnica que se indica ms abajo. Poner el resto a incubar a 40C tomando muestras cada 30minutos hasta completar 90 minutos. Titular las muestras y anotar los resultados. 3.-Titulacin.- Tomar 10ml de la mezcla de digestin, colocarla durante un minuto en bao mara a 100C para inactivar la enzima, enfriar, aadir 10 ml de formol y III gotas de fenoftalena, mezclar y titular con NaOH 0,02 N. Resultados e Interpretacin

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Prctica N12 CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

I . GENERALIDADES.La separacin de compuestos (de una muestra problema) por cromatografa es una de las tcnicas ms recomendadas en los trabajos de bioqumica, la ventaja es de que los compuestos no sufren cambios en su estructura. Para obtener los resultados deseados se recomienda la atencin y cuidado cuando se preparan los materiales, reactivos y la muestra. El fundamento de la tcnica cromatogrfica se basa en la separacin de los compuestos (solutos) por la distribucin fsica de ellos entre dos sustancias conocidas como fases: estacionaria y mvil o dinmica. La fase estacionaria estacionaria puede ser un slido o un lquido (o sorbente). El sorbente tiene como soporte a un slido denominado matriz. Por otro lado, la fase mvil o estacionaria puede ser lquida o gaseosa, sta fase es conocida como solventes o eluyentes.

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Los compuestos o solutos de una muestra problema que se encuentran disueltas en la fase mvil y van a separarse dependiendo de la fuerza de atraccin de stos por la fase estacionaria. Los componentes fuertemente atrados se mueven ms lentamente, desplazndose los dems compuestos de la muestra. La cromatografa puede ser de las siguientes clases: Cromatografa de Adsorcin, Cromatografa de Intercambio Inico, Cromatografa de Particin, Cromatografa en Capa Fina y Cromatografa en Columna, Cromatografa de Alta Resolucin, Cromatografa de Gases, Cromatografa de Plasma. Como un resumen de las caractersticas de algunas clases de cromatografa comentaremos que: En la C. de Adsorcin los compuestos son adsorbidos en la fase estacionaria crendose un equilibrio entre los compuestos ( que deseamos separar ) unidos al soporte y los otros que estn libres en la solucin. La unin va a depender de las cargas, fuerza de Van der Waals, interacciones bipolares, enlaces de hidrgeno entre los solutos y el soporte y por la estructura de los solutos. Esta clase de cromatografa se recomienda para las sustancias que son muy solubles en solventes orgnicas y poco solubles en agua. En la C. de Intercambio Inico, la separacin de los compuestos se hacen sobre un soporte o matriz insoluble que contiene iones intercambiables con los iones del medio que le rodea. Las sustancias que se desean separar deben de poseer cargas inicas opuestas a la del soporte para que se pueda adsorber por enlace electrosttica. El soporte o matriz son resinas especiales para el tipo de solutos que se quieren separar (cationicos o anionicos), por ejemplo las

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resinas de intercambio inico son ideales para separar a los aminocidos los que son fcilmente ionizables por los grupos qumicos que poseen (-COOH, -OH, -NH2 ). La C. de I.I. se recomienda para las sustancias que son ionizables e hidrosolubles. La C. de particin es til para los compuestos que son muy solubles en solventes orgnicos y poco solubles en agua. Por ello, el compuesto al mezclarse en los dos solventes (agua y solvente orgnico) se van a encontrar equitativamente en ellos. La razn de la concentracin el compuesto en los dos solventes es constante y se conoce como coeficiente de particin (alfa). = Concentracin de X en Solvente 1 Concentracin de X en Solvente 2

En la C.P., generalmente el solvente agua permanece en la fase estacionaria (puede ser una columna o una pelcula de material inerte). El solvente orgnico es la fase mvil que va ha estar saturado con agua. La sustancia o solutos se van a separar si el coeficiente de particin es diferente a 1. A esta clase de cromatografa pertenece la Cromatografa en papel, la que ser empleada en la presente prctica. La Cromatografa en capa fina es muy semejante a la del papel, usa como soporte sustancias como gel, slica gel. Tiene ventajas sobre la C. de papel, una de ellas es de que puede separar sustancias que se encuentren en bajas concentraciones, el mtodo es ms rpido, se puede usar materiales corrosivos, altas temperaturas, etc.

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II.- OBJETIVOS 1.Separar los aminocidos de una mezcla a travs de la cromatografa en papel. 2.Identificar los aminocidos separados a travs de su Rf.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS *0 Mezcla de aminocidos *1 Solvente: Butanol: Acido actico: agua (4 : 1 :5) *2 Aminocidos Patrn *3 Cmara Cromatogrfica *4 Revelador: Sol.de Ninhidrina 10% (pesar 0,3 g de ninhidrina y disolver en 95 ml de butanol y 5ml de ac. actico) *5 Estufa *6 Pipetas Pasteur y/o capilares *7 Papel Watman *8 Pinzas *9 Tijeras *10 Regla y lpiz

IV.- PROCEDIMIENTO: *11 Cortar el papel Watman (usar la pinza para coger el papel) en forma de tiras. *12 A una distancia de 1-2 cm del extremo inferior de la tira trazar una lnea con el lpiz.

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*13 Sobre e la lnea (en el extremo izquierdo) sembrar con cuidado la mezcla de aminocidos usando para ello la pipeta pasteur y/o el capilar, siguiendo las instrucciones del Profesor. *14 En el extremo derecho (sobre la lnea sembrar el patrn de aminocidos. *15 Esperar que seque. Colocar con mucho cuidado la tira de papel en la cmara de vidrio que contiene los solventes (los cuales habrn sido colocados con anticipacin en la cmara el que permanecer cerrada a fin de que se sature). *16 Dejar que los solventes asciendan hasta el extremo superior del papel. *17 Sacar con cuidado el papel de la cmara y trazar una lnea con el lpiz que indique el desplazamiento final del solvente (debe ser hasta unos 2 cm antes del extremo final) *18 Rociar el papel con el revelador (tener cuidado de no inhalar los vapores). *19 Medir la distancia (desde la lnea inicial) de desplazamiento del solvente y de las manchas. *20 Dividir los valores: distancia (cm) del recorrido de las manchas sobre la distancia del desplazamiento del solvente. El Valor encontrado corresponde al Rf de cada aminocido.

Distancia en cm del punto de partida hasta el centro de la mancha Rf = Distancia del Pto de partida hasta el
Interprete los Resultados:

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Prctica N13 OBTENCIN DE CADENA DE CIDOS NUCLEICOS.

I.- INTRODUCCION.El ADN y el ARN son transportadores de la informacin gentica de la clula, as mismo tienen funciones estructurales y metablicas. Casi todas las clulas contienen ADN, pero la cantidad presente en algunos tejidos es pequea. Adems, algunos tejidos contienen actividades altas de desoxiribonucleasa (DNasa ) lo cual fragmenta el ADN. Para la liberacin y aislamiento del ADN en forma soluble se logra mediante la destruccin de las membranas celulares y de las membranas de las partculas sub-celulares, ncleo, etc; igualmente por la disposicin de los complejos ADN-protena por desnaturalizacin proteica.

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El ADN es insoluble en alcohol, pero se disuelve en soluciones salinas . Para purificar el ADN se efectan por ello, una serie de precipitaciones alcohlicas y extracciones salinas. Para evitar que durante el aislamiento se produzcan cambios estructurales en la molcula debemos considerar los agentes capaces de producir tales alteraciones: La la tensin mecnica y condiciones fsicas que puedan acortar y separar las dos cadenas. La DNasa presente en el homogenizado inhibir con Citrato de Sodio para ligar Ca ++ y Mg ++ los cuales son cofactores de la DNasa. Temperaturas superiores a 80C. II.- OBJETIVOS.Observar las fibras que corresponden a la naturaleza fibrosa del ADN.

III.- MATERIALES Y METODOS.Materiales: - Mortero u homogenizador - Matraz o probeta con tapa de 50 ml. - Vaso de 100 ml. - Varilla de vidrio - Tubos para centrfuga - Papel secante o filtro Reactivos: - Tejido gonodal de concha de abanico - Solucin salina 0.1 M NaCl

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Dodecil Sulfato de Sodio NaCl 5M Mezcla de cloroformo alcohol isoamlico (24:1) Etanol absoluto

IV.- FUNDAMENTO.Se basa en que el ADN es soluble en soluciones de alta concentracin inica (solucin salina 5M), pero insolubles en soluciones de baja concentracin inica (0.05 0.25 mol-l) y precipitan en alcohol absoluto fro. V.- PROCEDIMIENTO.1.- Pesar 1 g. de tejido gonodal de argupectum purpuratus concha de abanico , al que se ha quitado previamente todo el tejido conjuntivo. Colocarlo en un mortero u homogenizador . 2.- Aadir 5 ml. de solucin salina 0.1M . Homogenizar y centrifugar a 800 rpm por 10 min.. 3.- Resuspender el residuo en 12.5 ml. de solucin salina 5M y colocar esta suspensin en un Matraz o probeta con tapa de vidrio. Aadir 1 ml. de SDS (Dodecil Sulfato de Sodio) al 25%. Agitar suavemente durante 10 minutos. 4.- Aadir 5 ml. de NaCl 5 M. Agitar suavemente. Tener en cuenta que la solucin es muy viscosa. 5.- Aadir 12.5 ml. de cloroformo alcohol isoamlico (24 : 1), teniendo cuidado de sujetar la tapa de vidrio; agitar

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lentamente durante 30 minutos para mezclar las dos fases. 6.- Centrifugar a 10 000 rpm por 10 minutos. 7.- Separar la fase acuosa (superior), colocarlo en un vaso de 100 ml. Hay que cuidar de que no se mezcle con la fase lechosa que se ha formado en el tubo de centrfuiga. 8.- Aadir en fase aproximadamente 2 volmenes de etanol absoluto fro. Con la varilla de vidrio se enrollan las hebras de ADN que se han formado. Resultados e interpretacin

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