Prcticas de Microbiologa

2 Curso (Lic. Biologa)

Departamento de Microbiologa y Gentica

Universidad de Salamanca

Prctica 1
TCNICAS DE MICROBIOLOGA BSICA: RESIEMBRA DE MICROORGANISMOS, MICROSCOPIO PTICO y TINCIONES. AISLAMIENTO Y MANEJO DEL

Introduccin 1. Obtencin y mantenimiento de cultivos puros

El trabajo con microorganismos no se realiza con clulas aisladas, sino con poblaciones extensas y homogneas del microorganismo a estudiar. Por lo tanto, el microbilogo utiliza tcnicas que permiten obtener un cultivo puro, y luego cultivar a gran escala dicho microorganismo. Para obtener cultivos puros se han de utilizar instrumentos estriles, es decir, libres de otros microorganismos no deseados (contaminantes). La esterilidad se consigue por diferentes mtodos: 1. 2. Calor seco. Para material de vidrio y de metal. Estos objetos (envueltos en papel o aluminio) se someten a una temperatura de 170C durante al menos 90 minutos. Calor hmedo. Se utiliza para soluciones acuosas y plsticos. Este material se somete a una temperatura de 120C durante 20 minutos en una atmsfera de vapor de agua a elevada presin, lo cual evita la ebullicin. Se realiza en el autoclave. Filtracin. Para esterilizar soluciones termolbiles, a las que se hace pasar a travs de un filtro con un tamao de poro que permite el paso de la solucin, pero no de los microorganismos. Esterilizacin qumica. Se utiliza para esterilizar material (generalmente algunos tipos de plstico) termolbil. Se utilizan sustancias como el xido de etileno, que se eliminan una vez finalizado el proceso de esterilizacin. Radiacin. La radiacin UV o las radiaciones o pueden utilizarse para esterilizar habitaciones o algunos plsticos.

3.

4.

5.

Para poder estudiar los microorganismos en el laboratorio el microbilogo tambin debe utilizar medios de cultivo que posean los nutrientes necesarios para el crecimiento de los mismos. Si los nutrientes estn en forma de solucin acuosa hablamos de medios de cultivo lquidos, mientras que si aaden solidificantes, como la gelatina o el agar (2-3%), obtenemos medios de cultivo slidos. A veces se utilizan medios de cultivo semislidos, si la concentracin de agar es 0,6-1,5%. Los medios de cultivo se esterilizan mediante calor hmedo. Para aislar un microorganismo de una mezcla de varios y obtener un cultivo puro del mismo, la tcnica ms utilizada es la de siembra por estra en placa Petri, en medio slido, que permite obtener colonias separadas de individuos que proceden por divisin de una nica

clula. Estas colonias nos sirven para iniciar un cultivo a gran escala. Otra tcnica consiste en obtener una suspensin de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las clulas en glicerol (10-30%) a -80C, en nitrgeno lquido a -173C, o mediante liofilizacin.

2. El microscopio
El microscopio es el instrumento ms necesario para un microbilogo, ya que permite la observacin de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios que, segn la fuente de iluminacin utilizada, se agrupan en: Microscopios pticos: La fuente de iluminacin es la luz. De campo claro. Permiten la observacin de preparaciones, en su color natural o contrastadas mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo ms brillante. De campo oscuro. Permiten la observacin de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales. De contraste de fases. Gracias a la utilizacin de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el ndice de refraccin de las clulas y el medio que las rodea, permiten la observacin de clulas vivas, ya que no es necesario realizar ninguna tincin de las mismas. De interferencia. Permiten observar clulas vivas sin teir, obtenindose una imagen en relieve de las mismas. De fluorescencia. La luz ultravioleta que excita ciertas molculas presentes en las clulas (bien de forma natural o aadidas a la preparacin) que emiten fluorescencia en el espectro visible. Confocal. Permite obtener imgenes bi y tridimensionales de alta resolucin. Es un microscopio computerizado que acopla un lser a un microscopio ptico obtenindose imgenes fluorescentes. Anlisis digital por ordenador. Tiene un diafragma especial llamado pinhole que elimina la seal de las regiones que se encuentran fuera de foco.

Microscopios electrnicos: La fuente de iluminacin es un chorro de electrones y las lentes son electroimanes. De transmisin. Permiten la observacin de muestras teidas con sustancias que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a lminas finas, denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que stos se envan a una pantalla que emite fluorescencia ms o menos intensa segn el nmero de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tian ms intensamente impedirn el paso de electrones y por lo tanto no permitirn la emisin de fluorescencia, por lo que estas

estructuras aparecern oscuras en un fondo ms brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos. De barrido. Permiten la observacin de clulas enteras, sin necesidad de cortes finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1.000 y 10.000 aumentos. Durante las prcticas se emplear el microscopio ptico de campo claro, cuyos componentes fundamentales (mecnicos, de iluminacin y pticos) se muestran en la Figura.

Oculares

Objetivos Pletina mvil Condensador Diafragma Filtros Tornillos de enfoque Fuente de iluminacin Soporte

Esquema del microscopio ptico

La capacidad de un microscopio para observar diferentes estructuras se refleja en el nmero de aumentos y en el lmite de resolucin (LR). El nmero de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que proporciona cada una de las lentes presentes entre la fuente de iluminacin y la lente ocular. El lmite de resolucin (LR) se define como la distancia mnima a la que se deben encontrar dos puntos para que puedan observarse separados. El microscopio es mejor cuanto menor sea el LR del mismo. El LR viene definido por la frmula:

LR = / 2nsen

: longitud de onda de la fuente de iluminacin.

2nsen: apertura numrica. Est definida por el valor de 2sen (caracterstica de cada microscopio y no se puede variar) y n, el ndice de refraccin del medio. Por lo tanto si queremos mejorar la capacidad de observacin de un microscopio se debe incrementar el nmero de aumentos y disminuir el lmite de resolucin (LR). Para conseguir lo primero, casi todos los microscopios disponen de varias lentes que se pueden cambiar segn el tamao de la muestra a observar. Para disminuir el LR podemos utilizar una fuente con menor longitud de onda (el caso extremo es el de los microscopios electrnicos) o bien aumentar n, para lo que podemos intercalar entre la preparacin y el objetivo un medio ms denso que el aire. Normalmente se utiliza aceite de inmersin. Es importante recordar que no todos los objetivos son impermeables al aceite. En los microscopios que se utilizarn en las prcticas, slo puede utilizarse el aceite de inmersin con el objetivo de 100 !!.

2. Observacin microscpica
Para observar una muestra al microscopio ptico podemos recurrir a: Preparacin hmeda. Se realiza colocando una gota de la suspensin de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente. Preparacin fijada. Se coloca una suspensin homognea de microorganismos en una gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes qumicos). Despus se tien mediante diferentes tcnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersin.

3. Tinciones
Son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante. Los colorantes pueden ser de distintos tipos: Catinicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las tien. Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina. Aninicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tien las clulas, sino el entorno. En este caso se habla de tincin negativa. Ejemplos: eosina, nigrosina. Liposolubles. Se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: negro sudn. Las tinciones pueden ser: Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina). Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo

que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes.

Objetivos
1. 2. 3. Obtencin de cultivos puros de microorganismos mediante estra en medio slido y mantenimiento de los mismos en tubos de agar inclinado. Manejo del microscopio ptico de campo claro. Realizacin de preparaciones hmedas de suspensiones de microorganismos y tinciones que nos permitirn observar la forma y tamao de distintos microorganismos, as como algunas estructuras especiales (esporas en Bacillus y corpsculos metacromticos en Lactobacillus). Tambin realizaremos tinciones diferenciales que nos permitirn clasificar microorganismos en distintos grupos (tincin de Gram y de cidoalcohol resistencia).

Materiales
Asa de siembra, placas de medio slido y tubos de agar inclinado (Agar Nutritivo). Mechero de alcohol. Microscopio ptico. Portaobjetos, cubreobjetos y colorantes. Suspensin de una mezcla de microorganismos. Resiembras de microorganismos: Bacillus megaterium, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Serratia marcescens. Yogurt preincubado a 37C. Agar Nutritivo (AN) Extracto de levadura 2 g/l Extracto de carne 1 g/l Peptona 5 g/l ClNa 5 g/l Agar 20 g/l pH 7,4

Procedimiento
1. AISLAMIENTO A partir de una suspensin de microorganismos se realizarn estras sucesivas en placas de medio slido. Las placas se incuban luego a 28C durante 24 horas.

2. RESIEMBRA Mediante el asa de siembra se transfieren microorganismos desde unos tubos de agar inclinados con la muestra a otros estriles. Luego se incuban a 28C durante 24 horas. 3. TINCIONES

Simples
a) Azul de metileno (Tincin positiva). Permite teir el interior celular. Tie microorganismos procariticos (vivos o muertos). Los eucariticos slo se tien si estn muertos. Algunas estructuras, como los corpsculos metacromticos, se tien ms intensamente con este colorante que el resto de la clula. Procedimiento 1. Extensin: poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra (Escherichia y Bacillus ) utilizando el asa de siembra. 2. Fijacin: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol, sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque. 3. Aadir Azul de metileno y esperar 2 minutos. 4. Lavar con agua 5. Secar. 6. Observar primero con el objetivo 40; luego se aade aceite de inmersin y se observa con el objetivo 100. b) Nigrosina (Tincin negativa). Se trata de un colorante aninico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una visin de la forma y el tamao celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro. Procedimiento 1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos. 2. Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra. 3. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra toda la superficie del primero. 4. Secar al aire. 5. Observar (primero 40 y luego 100 con aceite de inmersin).

Selectivas
a) Tincin de corpsculos metacromticos en clulas de Lactobacillus.

Procedimiento 1. Tomar una muestra de un yogurt con el asa de siembra y colocar en un portaobjetos. 2. Teir con azul de metileno como se ha descrito anteriormente. En esta preparacin se observan dos microorganismos: Lactobacillus (con los corpsculos metacromticos en su interior) y Streptococcus (forman cadenas). b) Tincin de endosporas. Las bacterias de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman endosporas. Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie en situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulacin de metabolitos txicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la clula bacteriana y cuando la clula muere y se lisa la endospora queda libre. Las endosporas germinarn cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los gneros Clostridium [ej. C. tetani (ttanos), C. perfringens (gangrena gaseosa) y C. botulinum (botulismo)] y Bacillus [ej. B. anthracis (antrax)]. Procedimiento 1. Extensin (B. megaterium). 2. Fijacin. 3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel con Verde malaquita y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisin de vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos. 4. Retirar el papel y lavar con agua. 5. Safranina 1 minuto. 6. Lavar con agua. 7. Secar. 8. Observar (100).

Diferenciales

a) Tincin de Gram. De gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Procedimiento 1. Extensin de la muestra (Escherichia y Bacillus). 2. Fijacin. 3. Cristal violeta 1-2 minutos. 4. Tirar el exceso de colorante (NO lavar con agua!). 5. Aadir lugol, esperar 1 minuto y tirar el exceso (No lavar con agua!) 6. Decolorar con etanol-acetona (20 segundos) 7. Lavar con agua. 8. Aadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto. 9. Lavar con agua. 10. Secar. 11. Observar (100).

Gram(+)
Peptidoglicano

Gram(-)
Peptidoglicano

Membrana Plasmtica

Membrana Plasmtica Espacio periplsmico Lipopolisacrido y Protena

Gram (-)
Exterior Polisacrido O Membrana externa Gram(-) Ncleo Polisacardico Protena Porina 8 nm Fosfolpido Lipoprotena Peptidoglicano Membrana Plasmtica Interior 9 Lpido A Lipopolisacrido (LPS)

Espacio Periplsmico

Protena asociada a la pared

Gram (+)

Acidos Teicoicos

Acidos Lipoteicoicos

Peptidoglicano

Membrana Plasmtica

b) Tincin de cido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen). Se basa en que ciertos microorganismos no son desteidos con alcohol cido si han sido previamente teidos con fucsina fenicada. A estos microorganismos se denominan cido-alcohol resistentes. Una vez realizada la decoloracin con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de metileno) para poder observar las clulas sensibles a la decoloracin con alcohol cido. Son microorganismos cido-alcohol resistentes las micobacterias, debido a la composicin de su pared celular (tiene cidos miclicos). Esta tincin tiene inters desde el punto de vista del diagnstico clnico puesto que algunos microorganismos patgenos son cido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis) o M. leprae (lepra). Procedimiento 1. Extensin (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus). 2. Fijacin. 3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel con Fucsina fenicada y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisin de vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama, volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos. 4. Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua. 5. Aadir cido-alcohol y esperar 30 segundos. 6. Lavar con agua 7. Aadir azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2 minutos. 8. Lavar con agua. 9. Secar. 10. Observar (100).

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Prctica 2
DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO DE UN MICROORGANISMO

Introduccin
El crecimiento microbiano se define como un incremento en el n de clulas, es decir, se refiere al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada clula individual y su divisin celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como: 1. 2. El microorganismo en s. As por ejemplo, en condiciones ptimas E.coli tiene un ciclo de vida de 15-20 minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas. La composicin del medio de cultivo. Las clulas crecern ms lentamente en un medio mnimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecern ms o menos rpidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de carbono que con galactosa (Gal). Las condiciones de incubacin. La temperatura de incubacin, la concentracin de CO2 en la atmsfera de cultivo, la agitacin, etc... son factores importantes. La procedencia y caractersticas del inculo. La curva de crecimiento variar dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc.

3. 4.

Existen varios mtodos para medir el crecimiento microbiano:

Mtodos directos: son aquellos en los que se cuenta el n total de clulas en un volumen
conocido y as se estima el n total en la poblacin. Entre ellos: Recuento directo del n de clulas al microscopio. Se utilizan portas especialmente diseados para el recuento celular y denominados cmaras de recuento. Existen varios tipos de cmaras de recuento, una de ellas es la cmara Thoma que es la que nosotros utilizaremos. Este mtodo tiene el inconveniente de que no diferencia entre clulas viables y no viables. Es poco preciso. Contadores electrnicos. Las clulas son suspendidas en un fluido conductor que pasa lentamente a travs de una abertura fina por la que pasa una corriente elctrica. Cada clula que pasa produce un cambio en la conductividad y estos cambios o pulsos convenientemente amplificados son registrados electrnicamente dando una medida directa del n de clulas en el medio. No diferencia entre clulas viables y no viables ni entre clulas o partculas inertes.

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Recuento de clulas viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre placas Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una nica clula. Si se multiplica por el factor de dilucin tendremos el n de clulas en cultivo. Slo detecta viables pero es un mtodo lento y caro por el elevado nmero de placas que hay que utilizar para que los resultados sean significativos.

Mtodos indirectos: son aquellos que utilizan parmetros distintos del n de clulas, pero
que pueden relacionarse de forma directa con ste (masa celular, actividad metablica, etc..). Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y as la velocidad de crecimiento de la poblacin puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parmetros. Entre los mtodos indirectos se encuentran: Determinacin del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar el n de clulas proporcional a sta. Determinacin del nitrgeno celular. Medir el contenido proteco del cultivo. Determinacin del DNA Determinacin de una actividad metablica segn el tipo de microorganismo: consumo de oxgeno (en aerobios), liberacin de CO2 u otro producto de fermentacin, aumento de la concentracin de alguna enzima constitutiva, incorporacin en la clula de algn material radiactivo, etc. Medida de la turbidez del cultivo. Se basa en la capacidad de las clulas y partculas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece turbio porque las clulas dispersan la luz que atraviesa la suspensin. La turbidez es proporcional al nmero de clulas y puede medirse utilizando un espectrofotmetro. El espectrofotmetro es un aparato que hace pasar la luz a travs de una suspensin celular y detecta la luz no dispersada.

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Este instrumento mide la relacin de intensidad entre la luz incidente y la emergente despus de atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el n de clulas mayor es la turbidez del cultivo o densidad ptica (DO) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras atravesar la muestra. Por tanto, la DO de un cultivo es proporcional a la densidad celular. Sin embargo, esto es as dentro de ciertos lmites, puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse agregados celulares y producirse un efecto pantalla de unas clulas sobre otras (en el caso de S. cerevisiae la relacin entre la DO y la concentracin de clulas es lineal hasta un valor de DO de aproximadamente 0,3). Por tanto, en algunos casos ser necesario diluir la muestra antes de realizar la medida (ej. para hacer una dilucin 1/10 se mezclara 1 ml de cultivo con 9 ml de medio de cultivo o agua). Cuando la dilucin sea alta (mayor de 1/10) conviene hacer diluciones seriadas para reducir el error (ej. para una dilucin 1/50 primero se hace una dilucin 1/10 y despues se hace una dilucin 1/5 de la dilucin 1/10).

Clculo del tiempo de generacin

El tiempo requerido para que una clula microbiana se divida dando lugar a dos clulas se denomina tiempo de generacin (g). Por tanto, g es el tiempo que necesita una poblacin para duplicar el n de clulas. Si consideramos que entre un tiempo inicial (To) y otro final (Tf) han transcurrido n generaciones, el valor de g se expresar como: g = (Tf - To)/n (A) Si inicialmente tenemos en el cultivo N0 clulas, despus de la primera divisin el nmero de clulas ser N0 21; despus de la segunda divisin N0 22; despus de la tercera divisin N0 23.; despus de n divisiones, el nmero final de clulas (Nf) ser N0 2n. Por tanto, se trata de una progresin geomtrica cuya sucesin se puede expresar como: Nf = No 2n (B) Despejando el valor de n se aplican logaritmos: Log Nf = log(No 2n) log Nf = log No + n log 2 n = (log Nf log No)/log 2 Conocido el valor de n, lo sustituimos en la ecuacin (A) y obtenemos el valor de g: g = 0,3 (Tf - To)/ (log Nf log No) El crecimiento de una poblacin en el que el nmero de clulas se dobla cada un tiempo g se conoce como crecimiento exponencial y est representado por la ecuacin (B).

N de Clulas (escala aritmtica)

Logartmica

N de Clulas (escala logartmica)

Aritmtica

Tiempo (horas)

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Sin embargo, cuando seguimos el crecimiento de una poblacin microbiana, midiendo por ejemplo su DO en funcin del tiempo, obtenemos su curva de crecimiento, que nos viene dada por una grfica del tipo:

Fases de Crecimiento Latencia Exponencial Estacionaria Muerte

Viables

Turbidez (D.O.)

Tiempo

El incremento en el nmero de clulas es lento al principio y despus llega a ser de forma exponencial. Esta grfica es caracterstica de un cultivo en un recipiente cerrado en el que los nutrientes son limitados. En la curva se distinguen cuatro fases: Fase de latencia. Fase de adaptacin de las clulas a las nuevas condiciones del medio de incubacin al que han sido transferidas. Las clulas no crecen inmediatamente sino despus de este tiempo de latencia. Las clulas son metablicamente activas, se adaptan al medio y eventualmente lo modifican. Para un mismo inculo, esta fase de latencia varia dependiendo del medio al que se transfieren y de las condiciones de incubacin. Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las clulas se estn dividiendo regularmente a ritmo constante. En condiciones apropiadas durante esta fase, el grado de desarrollo es mximo. Es en este periodo donde puede calcularse el tiempo de generacin de un microorganismo. Fase estacionaria. El n de clulas no se incrementa ms porque los nutrientes del medio se van agotando y posibles sustancias txicas pueden ir acumulndose. No hay incremento neto del n de clulas, el n de clulas que se originan es igual al n de las que mueren. Fase de muerte celular. Las clulas mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al agotamiento total de los nutrientes y/o excesiva acumulacin de sustancias txicas. A veces la muerte va acompaada de lisis celular y sto disminuye la absorbancia del cultivo.

Objetivos
1. Medir el crecimiento de una poblacin microbiana (S.cerevisiae) utilizando dos mtodos distintos: Medir de la turbidez del cultivo (mtodo indirecto) y recuento del n de clulas al microscopio (mtodo directo) Determinar el tiempo de generacin de la poblacin (S.cerevisiae).

2.

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Materiales
Inculo de Saccharomyces cerevisiae 1 ml (DO: 1,25). Matraz con 25 ml de medio YED (extracto de levadura y glucosa). Pipetas estriles, cmara de recuento (Cmara Thoma), microscopio ptico, espectrofotmetro. Mecheros de alcohol, incubadores a 28 C.

Procedimiento
1. Para la determinacin de la curva de crecimiento: Inocularemos el matraz que contiene el medio de cultivo con un preinculo. Mediremos la D.O. a 600 nm y comprobaremos que esta D.O. inicial (to) es aproximadamente de 0.05. Seguiremos la evolucin de la turbidez del cultivo midiendo la D.O. a diferentes tiempos durante unas 24 horas. Tomaremos muestras cada dos horas. Y en algunos de estos puntos tendremos que hacer diluciones para medir la D.O. Representaremos en una grfica los valores de D.O. obtenidos a lo largo del tiempo. La curva obtenida ser la curva de crecimiento del cultivo. 2. Al mismo tiempo haremos una recta patrn usando la cmara de recuento y suspensiones celulares de D.O. conocida. Utilizando esta curva patrn, calcularemos por extrapolacin el n de clulas que corresponden a los valores de D.O. obtenidos en nuestras lecturas al espectrofotmetro y haremos una grfica del n de clulas en funcin del tiempo. Recuento directo del nmero de clulas al microscopio. La cmara de recuento consiste en un porta modificado con una hendidura de 0,1 mm de profundidad. Est dividida en 16 cuadrados y stos a su vez divididos en 16 25 celdillas. Cada celdilla tiene una superficie de 0,0025 mm2 y una profundidad de 0,1 mm. Por tanto el volumen de cada celdilla (Vc) es de 0,00025 mm3. Como hay 16 celdillas por cuadrado, el volumen total de una celda (VT) es de Vc 16 = 0,004 mm3. Como 1 mm3 = 10-3 ml. V = 4 10-6 ml (volumen de una celda) Se cuentan 6 celdas al azar, se calcula la media (X) de clulas por celda y se expresa la concentracin en clulas por ml: X cel / 4 10-6 ml = X 25 104 clulas/ml Los valores de clulas/ml se representan grficamente frente a su DO correspondiente para obtener la curva patrn. 3. Por ltimo, haremos un clculo de g de nuestro cultivo, S. cerevisiae, utilizando dos valores consecutivos comprendidos dentro de la fase exponencial de crecimiento.

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Prctica 3
ANTIBITICOS

Introduccin
Los antibiticos son compuestos orgnicos de bajo peso molecular sintetizados por microorganismos, que a bajas concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros microorganismos. Se caracterizan por: -Inhiben el crecimiento (bacteriostticos) o matan (bactericidas). -Son efectivos a bajas concentraciones. -Poseen toxicidad selectiva: actan sobre el patgeno sin afectar al organismo hospedador. -Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas. -Pueden ser de accin muy especfica o de amplio espectro. -Solubles en agua. -Poseen estabilidad qumica. -Son productos del metabolismo secundario. Es importante tener en cuenta la posibilidad de aparicin de resistencia a determinados antibiticos en algunos microorganismos durante el tratamiento de una infeccin. Los microorganismos productores se encuentran tanto dentro del grupo de procariotas (Bacillus, Streptomyces, Nocardia) como en el de eucariotas (Penicillium, Aspergillus, Cephalosporium) Se pueden clasificar segn: Su origen Naturales: sintetizados por microorganismos. Sintticos: obtenidos completamente por sntesis qumica. Semisintticos: parte de compuesto sintetizada por microorganismos y otra parte sintetizada qumicamente. Su estructura qumica -lactmicos: penicilinas, cefalosporinas. Macrlidos: eritromicina. Aminoglucsidos: estreptomicina. Polipeptdicos: bacitracina. Polinicos: anfotericina B Tetraciclinas Derivados del benceno: cloranfenicol. Su mecanismo de accin Actan sobre la pared celular bacteriana inhibiendo su sntesis: penicilinas. Actan sobre la membrana celular alterando su permeabilidad. Inhiben la sntesis proteica. Inhiben la sntesis de cidos nucleicos: mitomicina. 16

Objetivos
1. 2. 3. Detectar la produccin de antibitico por microorganismos Valorar la cantidad de antibitico presente en una solucin Determinar qu antibitico entre varios es ms efectivo frente a un organismo (antibiograma).

Materiales
Tubos con 20 ml de AN y YED fundido, bao a 50C, placas Petri, mecheros, pipetas pasteur, pipetas estriles, regla, papel semilogartmico de 3 periodos, antibiticos: penicilina G 25, 50, 100 g/ml y concentracin desconocida; bacitracina: 10 mg/ml; cicloheximida: 2 mg/ml; microorganismos: Streptomyces, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis.

Procedimiento
1. PRUEBA DE PRODUCCIN DE ANTIBITICOS Mediante un bioensayo en medio slido podemos determinar si un microorganismo produce algn antibitico capaz de inhibir el crecimiento de un organismo de prueba. Para ello se emplearn dos posibles microorganismos productores del gnero Streptomyces y un microorganismo sensible (Saccharomyces cerevisiae). Procedimiento 1. Tomar un tubo con medio YED fundido mantenido a 45-50C en un bao a dicha temperatura. 2. Aadir 1 ml de la suspensin de clulas de S.cerevisiae (organismo sensible). 3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vaca. 4. Cuando el medio est slido (despus de unos 20) colocar encima 2 tacos de agar, cada uno con uno de los microorganismos a ensayar. 5. Poner la placa a 4C durante 2 horas para permitir la difusin del antibitico. 6. Incubar la placa a 28C durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar la existencia o no de halos de inhibicin del crecimiento de Saccharomyces cerevisiae. 2. VALORACIN DE LA CONCENTRACIN DE ANTIBITICO La concentracin de un antibitico en una solucin se puede determinar por comparacin con el efecto de cantidades conocidas del mismo antibitico sobre un microorganismo sensible, Bacillus subtilis. Esta tcnica se emplea en los procesos de mejora de la produccin de un 17

determinado antibitico por la especie productora. El proceso se lleva a cabo mediante bioensayo en placa sobre un microorganismo sensible. Se valorar la concentracin de Penicilina G en una solucin frente a una recta patrn generada con cantidades conocidas del mismo antibitico. Procedimiento 1. Tomar un tubo con medio AN fundido. 2. Aadir 1 ml de la suspensin de clulas de B. subtilis (organismo sensible). 3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vaca. 4. Cuando el medio est slido (despus de unos 15 minutos) colocar con ayuda de pinzas cuatro discos de papel saturados con la correspondiente solucin de antibitico. 5. Poner la placa a 4C durante 2 horas para permitir la difusin del antibitico. 6. Incubar la placa a 28C durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar el tamao de los halos de inhibicin del crecimiento, medir los dimetros con una regla, hacer la representacin grfica sobre papel semilogartmico de 3 periodos y deducir la concentracin de antibitico desconocida. 3. ANTIBIOGRAMA El antibiograma se utiliza para comprobar cul de una serie de antibiticos es ms activo frente a un determinado microorganismo, Bacillus subtilis en este caso. Se compararn tres antibiticos, Penicilina G (0,1 mg/ml), Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml). Procedimiento 1. Tomar un tubo con medio AN fundido. 2. Aadir 1 ml de la suspensin de clulas de B. subtilis (organismo sensible). 3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vaca. 4. Cuando el medio est slido (despus de unos 20 minutos) colocar con ayuda de pinzas tres discos de papel saturados con la correspondiente solucin de los diferentes antibiticos: Penicilina G (0,1 mg/ml), Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml). 5. Poner la placa a 4C durante 2 horas para permitir la difusin del antibitico. 6. Incubar la placa a 28C durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo sensible. Resultado: Observar la aparicin o no de halos de inhibicin del crecimiento y su tamao. Indicar qu antibitico es el ms efectivo frente a B. subtilis.

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Prctica 4
ANLISIS MICROBIOLGICO DEL AGUA

Introduccin
En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos, los cuales afectan en mayor o menor medida a la potabilidad del agua y a sus caractersticas organolpticas. Adems de la flora normal (Bacillus, Pseudomonas, etc.), en el agua pueden existir microorganismos contaminantes. Una de las fuentes principales de contaminacin son las aguas residuales, las cuales suelen contener restos de heces que pueden portar microorganismos patgenos. Aparte del problema de transmisin de enfermedades, la contaminacin del agua tambin acarrea otras consecuencias. Por ejemplo, la degradacin biolgica por los microorganismos de grandes cantidades de residuos orgnicos vertidos al agua hace disminuir rpidamente el oxgeno existente, creando un ambiente desprovisto de toda forma de vida que no sea anaerbica: mueren los peces, disminuye la vida vegetal y se produce el hedor caracterstico debido a las actividades de los microorganismos anaerobios.

Objetivo
1. Determinar si el agua est contaminada por heces humanas o de otros animales.

La calidad del agua se determina principalmente por anlisis bacteriolgicos. Las pruebas que se realizan son: Recuento de aerobios totales Colimetra Estreptometra Clostridiometra Estos ensayos siguen en lneas generales la normativa publicada en el BOE de 20-IX-1990. No obstante, a partir de marzo de 2003 los criterios de calidad del agua de consumo humano se determinan de acuerdo a la normativa publicada en el BOE de 21 de febrero de 2003.

Materiales
Muestra de agua (aprox. 100 ml). Medios de cultivo: Placas de agar nutritivo (AN) (4), tubos de medio Caldo Lactobiliado (3 EC concentrado y 6 EC simple), tubos de medio Caldo Azida de Rothe (3 AR concentrado, 6 AR simple), medio Wilson Blair (1 tubo de agar WB fundido), placa de medio Eosina Azul de Metileno (EMB). Tubos con 1 ml de agua estril para

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diluciones. 1 tubo de vidrio estril. Pipetas estriles (de 1 y 10 ml). Parafilm. Bao a 80C. Bao a 60C. Estufa incubadora a 37C. Tabla estadstica de Nmero Ms Probable (NMP). Asa de vidrio, mechero de alcohol y alcohol de quemar.

1. Bacterias aerobias totales

Las bacterias que vamos a identificar en este ensayo son bacterias hetertrofas, aerobias y anaerobias facultativas, mesfilas, capaces de crecer en un medio rico (AN). El ensayo se basa en contar el n de colonias capaces de crecer en una placa de medio rico, en la que se ha sembrado un volumen de agua conocido, transcurrido un determinado tiempo de incubacin a 37 C. Este ensayo slo nos indica la cantidad de microorganismos de este tipo que hay en la muestra de agua, pero NO IDENTIFICA microorganismos concretos. Al incubar a 37C se seleccionan bacterias de origen fecal (adaptadas a vivir en el interior del cuerpo de los animales). Si se hiciera el mismo ensayo a 22 C nos dara una idea de la flora autctona. Procedimiento 1. Preparar diluciones seriadas de la muestra original: 1/2, 1/4 y 1/8. 1. Sembrar 0,2 ml de la muestra original y de cada una de las diluciones (1/2, 1/4 y 1/8) en cuatro placas de AN. 2. Incubar las placas a 37 C durante 24 horas. Resultados: Contar el nmero de colonias existentes en cada placa, seleccionar la placa que contenga entre 30 y 300 colonias para la realizacin de los clculos. El resultado se expresa como microorganismos por ml de agua. Hay que tener en cuenta las diluciones!.

2. Bacterias coliformes (Colimetra)

Son bacterias de morfologa bacilar, Gram (-), aerobias o anaerobias facultativas, oxidasa negativas, no esporgenas y capaces de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 37C en un tiempo mximo de 48 horas. Las bacterias coliformes de origen fecal se incluyen dentro de las bacterias entricas o "enterobacterias" y se caracterizan por habitar el tracto gastrointestinal del hombre y otros animales. Este grupo incluye los gneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. Las heces pueden ser vehculos de transmisin de otras bacterias no coliformes que son patgenas como Salmonella, Proteus y Shigella, algunas de cuyas especies causan infecciones intestinales como la fiebre tifoidea y la disentera bacilar. Ya que los microorganismos patgenos son muy sensibles y se encuentran en bajas concentraciones se toma como indicador de contaminacin fecal la presencia en las aguas de los gneros arriba indicados y principalmente de Escherichia coli. Se realizan dos pruebas, presuntiva y confirmativa; el ensayo se considera positivo si dan positivas ambas pruebas.

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Prueba presuntiva:
El agua problema se siembra en el medio denominado caldo lactobiliado (EC), que permite el enriquecimiento e identificacin de bacterias coliformes. La lactosa existente es fermentada produciendo cido y gas que se detecta en la campana de Durham. La bilis inhibe el crecimiento de cocos Gram (+) y bacilos formadores de endosporas y no inhibe a los bacilos entricos Gram (-) ni otros ambientales (ej. Pseudomonas). Es un medio de enriquecimiento y selectivo. Procedimiento 1. Sembrar 10 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado concentrado (ECC) con campana de Durham. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien. 2. Sembrar 1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con campana de Durham. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien. 3. Sembrar 0,1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con campana de Durham. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien. 4. Incubar a 37C durante 24 horas. Resultados: se consideran "tubos gas +" aquellos en los que aparece enturbiamiento y acumulacin de gas en la campana. Los "tubos gas -" se incuban otras 24 h. La interpretacin se realiza segn la tabla de nmero ms probable (NMP) adjunta. Esta tabla indica el nmero ms probable de microorganismos presentes en 100 ml de agua (NMP), teniendo en cuenta los tubos en que hay crecimiento as como las diluciones y aplicando mtodos estadsticos.

Prueba confirmativa:
1. Siembra en estra en placas de EMB (medio selectivo y diferencial para coliformes) a partir de "tubos gas+". 2. Incubar a 37C durante 24 h. Resultados: En este medio los microorganismos fermentadores de lactosa forman colonias caractersticas opacas y pigmentadas en rosa, azul o violeta con o sin brillo metlico (por ejemplo, E. coli forma colonias de color verde-violeta oscuro metlico caractersticas sobre este medio). La prueba es + si aparecen este tipo de colonias fermentadoras de lactosa. Otra prueba confirmativa de la presencia de E. coli es sembrar los microorganismos que han crecido en caldo lactobiliado a 37C en este mismo medio pero incubando a 44C. E. coli es capaz de fermentar la lactosa en estas condiciones.

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3. Estreptococos fecales (Estreptometra)

Son cocos Gram (+), anaerobios aerotolerantes, catalasa negativos y fermentadores de glucosa con produccin de cido lctico a 37C en un tiempo mximo de 48 h. Este grupo comprende especies como Streptococcus faecalis, S. faecium, S. bovis y S. equinus. Los estreptococos fecales son residentes normales del intestino del hombre y animales y reciben la denominacin general de enterococos. El ensayo incluye prueba presuntiva y confirmativa y se considera positivo si ambas pruebas son positivas.

Prueba presuntiva
El ensayo se basa en saber si existen microorganismos capaces de crecer a 37 C en un medio lquido glucosado con agentes inhibidores selectivos. El medio utilizado, denominado caldo azida de Rothe (AR) es un medio selectivo que contiene azida que inhibe la cadena de transporte de electrones del metabolismo respiratorio de los microorganismos. Los estreptococos y otros microorganismos poseen un metabolismo fermentativo y carecen de cadena de transporte de electrones por lo que no se ven afectados por la azida. Procedimiento 1. Sembrar de la misma forma que en bacterias coliformes en medio selectivo para estreptococos, caldo azida de Rothe (3 tubos ARC, 6 tubos AR). Agitar 2. Incubar a 37C durante 24 h. Resultados: Se consideran "tubos +" aquellos en que existe enturbiamiento y/o sedimento. Interpretacin segn la tabla NMP (microorganismos/100 ml de agua).

Prueba confirmativa
Se trata de realizar una tincin de Gram del sedimento de los tubos con objeto de reconocer al microscopio los estreptococos, que se observarn como cadenas de cocos Gram (+).

4. Clostridios sulfito-reductores (Clostridiometra)

Son bacterias de morfologa bacilar, Gram(+), anaerobios estrictos, capaces de formar esporas y con actividad sulfito reductora (desasimilatoria). Algunas especies de Clostridium habitan en el tracto intestinal de animales, otras en el suelo, etc. El ensayo consiste en contar el nmero de bacterias anaerobias formadoras de endosporas con capacidad sulfito reductora en un medio que contiene sulfito sdico y una sal de hierro, denominado medio Wilson Blair (WB). Estas colonias aparecen de color negro debido a la formacin de sulfuro ferroso por reduccin del sulfito. Procedimiento 1. Fundir previamente el medio Wilson-Blair 2x (WB) y mantener en bao a 60C.

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2. Calentar la muestra de agua (10 ml) durante 10 minutos a 80C, para matar formas vegetativas e inducir la germinacin. Enfriar en el grifo. 3. Aadir la muestra de agua precalentada al tubo de WB 2x 4. Tapar bien el tubo con algodn y con Parafilm. Mezclar por inversin. 5. Incubar a 37C durante 24-48 horas. Resultados: Contar el n de colonias negras existentes en la totalidad del tubo (sin tener en cuenta las colonias puntiformes). El resultado se expresa como n de clostridios existentes en el volumen de agua sembrada. (Ver normas vigentes).

Interpretacin de los resultados

El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos estn dentro de los lmites establecidos por la ley. Las normas legales exigen: Aerobios totales: No existe lmite legal pero los valores mximos recomendados son: Aerobios a 37C: 10 /ml. Aerobios a 22C: 100 por ml. Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml. Estreptococos fecales: < 1 / 100ml. Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml.
NMP (Nmero ms probable) Con los intervalos de confianza del 95 por 100, entre los cuales pueden variar para diversas combinaciones de resultados positivos y negativos. Nmero de tubos que dan reaccin positiva entre 3 tubos de 10 ml
0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

3 tubos de 1 ml
0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3

3 tubos de 0,1 ml
1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2

ndice NMP/100ml
3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100

Lmite de confianza del 95 por 100 Lmite inferior

< 0,5 < 0,5 < 0,5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150

Lmite superior
9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 149 120 130 379 210 230 380 380 440 470 1300 2400 4800

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Composicin de los medios de cultivo empleados

Caldo lactobiliado (EC) Biotona 20,0 g/l Lactosa 5,0 g/l Fosfato de potasio 5,5 g/l Cloruro de sodio 5,0 g/l Sales biliares 1,5 g/l Caldo azida de Rothe (AR) Peptocomplex 15,0 g/l Extracto de carne 4,5 g/l Glucosa 7,5 g/l Cloruro de sodio 7,5 g/l Azida sdica 0,2 g/l Agar nutritivo (AN) Extracto de levadura Extracto de carne Peptona ClNa Agar

2 g/l 1 g/l 5 g/l 5 g/l 20 g/l

Medio Wilson Blair (WB) Peptona 10,0 g/l Sulfito sdico 0,5 g/l Citrato frrico 0,5 g/l Agar 15,0 g/l Medio EMB (Eosina-azul de metileno) Lactosa Sacarosa Peptona Difosfato potsico Eosina (indicador de pH, cambia de incoloro a negro a pH cido) Azul de metileno (inhibe el crecimiento de bacterias Gram +) Agar pH 7,2

5 g/l 5 g/l 10 g/l 2 g/l 0,4 g/l 0,065 g/l 13,5 g/l

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Prctica 5
DETERMINACIN DE ENTEROBACTERIAS

Introduccin
En esta prctica tratamos de simular un aislamiento de microorganismos a partir de una muestra (heces, agua o alimentos contaminados...), para identificarlos posteriormente mediante un conjunto de pruebas. Concretamente, vamos a realizar la determinacin de bacterias pertenecientes al grupo de bacilos Gram (-) anaerobios facultativos, en el que se incluyen las enterobacterias. Muchas de ellas forman parte de la flora normal del tracto digestivo del hombre pudiendo producir enfermedades en determinadas circunstancias. Otros como Salmonella o Vibrio pueden causar enfermedades por la ingestin de alimentos o agua contaminados. De ah la necesidad de desarrollar pruebas que permitan aislar e identificar rpidamente estos microorganismos. La correcta deteccin e identificacin de los microorganismos presentes en muestras clnicas o de otros orgenes es imprescindible para determinar el origen de las infecciones, seguir el curso de las enfermedades y decidir los tratamientos a aplicar. Todos los puntos del proceso son importantes, desde la forma de tomar y mantener las muestras hasta su manipulacin en el laboratorio. Se puede decir que en el proceso de identificacin de microorganismos se ponen en juego todos los conocimientos acumulados en Microbiologa. La identificacin de bacterias puede basarse en muchos caracteres: morfologa celular o de las colonias, tincin, fisiolgicos, bioqumicos, de tipo serolgico y de patogenicidad. Morfologa celular: forma (bacilos, cocos) y agrupamiento (diplococos, racimos, rosarios). Presencia o ausencia de estructuras especiales: flagelos, endosporas Morfologa de las colonias: forma, color, consistencia, borde, seccin... Tincin (Gram, cido-alcohol resistentes...) Fisiologa: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos; temperatura ptima de crecimiento; movilidad, etc. Bioqumica: presencia o ausencia de una enzima o de toda una ruta metablica; tipo de fermentacin de carbohidratos; utilizacin de citratos como nica fuente de carbono, etc Actualmente existen kits que agrupan muchas pruebas fisiolgicas y bioqumicas en un formato sencillo y que produce resultados rpidos. No obstante, todava muchas pruebas requieren el empleo de mtodos de cultivo tradicionales, selectivos, diferenciales y de enriquecimiento. El grupo de bacterias gram (-) anaerobias facultativas incluye bacilos o cocobacilos que pueden crecer en presencia o en ausencia de O2 (anaerobios facultativos).

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En anaerobiosis obtienen la energa por fermentacin. En este grupo se incluyen las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae.

Familia Enterobacteriaceae
Forma: bacilos, cocobacilos Movilidad: inmviles o mviles por flagelos peritricos Catalasa (+) y Oxidasa (-) La mayora de enterobactericeas pueden fermentar glucosa y otros azcares. La capacidad o no para fermentar algunos sustratos se utiliza para la identificacin de las distintas especies. Por ejemplo, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter fermentan la lactosa (coliformes), mientras que Salmonella, Shigella, Proteus no fermentan la lactosa (no coliformes).

Familia Vibrionaceae
Forma: bacilos ligeramente curvados. Movilidad: mviles por flagelos polares Catalasa (+) y Oxidasa (+) Las vibrionceas crecen bien en medio alcalino. La mayora son inofensivas y se encuentran en ambientes acuticos. Algunos son patgenos, como Vibrio cholerae que es el agente causal del clera.

Objetivo
Aislamiento e identificacin de las bacterias presentes en una muestra (suspensin que contiene una mezcla de microorganismos).

Materiales
Se describen para cada experimento

Procedimiento
1. AISLAMIENTO Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacterias, donde podremos ver la morfologa, color y otras caractersticas de los distintos tipos de microorganismos presentes en la muestra. Se llevarn a cabo inoculaciones en placas de medios slidos (Agar nutritivo, Verde Brillante, EMB, TCBS) y en medio lquido (Peptona alcalina), empleando las mezclas A o B.

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Procedimiento 1.1. Cultivos en placas

Tomar una muestra de la suspensin microbiana con un asa de siembra estril y sembrar por estra los siguientes medios, con el fin de obtener colonias bien aisladas: 1 placa de Agar nutritivo, 1 placa de Verde Brillante, 1 placa de EMB, 1 placa de TCBS. Incubar a 24 h a 37 C. Observar la morfologa de las colonias y determinar cuantos microorganismos distintos hay en cada mezcla. 1.2. Cultivos en medio lquido Aadir con una pipeta Pasteur estril varias gotas de la suspensin bacteriana en un tubo de peptona alcalina. Incubar a 37 C y observar la presencia o no de crecimiento bacteriano.

Caractersticas de los medios empleados Agar Nutritivo Extracto de levadura 2g/l Extracto de carne 1 g/l Peptona 5 g/l ClNa 5 g/l Agar 20 g/l No es un medio selectivo, por lo tanto permite el crecimiento de muchos microorganismos. Medio EMB (Eosina-azul de metileno) Lactosa Sacarosa Peptona Difosfato potsico Eosina (indicador de pH, cambia de incoloro a negro a pH cido) Azul de metileno (inhibe el crecimiento de bacterias Gram +) pH 7,2.

5 g/l 5 g/l 10 g/l 2 g/l 0,4 g/l 0,065 g/l

Es un medio selectivo de la familia Enterobacteriaceae. Tambin es un medio diferencial ya que nos permite saber por la coloracin de la colonia si los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa. Si las bacterias fermentan lactosa o sacarosa, acidifican el medio y la eosina vira a negro dando lugar a la aparicin de colonias oscuras. Las bacterias que no fermentan ni lactosa ni sacarosa originan colonias claras.

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Medio Agar Verde Brillante Lactosa Sacarosa Peptona Extracto de levadura NaCl Rojo de fenol (indicador de pH) Verde Brillante (colorante que inhibe el crecimiento de muchas bacterias) Agar pH 6,9

10 g/l 10 g/l 10 g/l 3 g/l 5 g/l 0,08 g/l 0,0125 g/l 20 g/l

Es tambin un medio selectivo de la familia Enterobacteriaceae y un medio diferencial ya que nos permite saber por la coloracin del medio si los microorganismos que crecen fermentan lactosa o sacarosa. Si crecen microorganismos fermentadores el pH del medio se acidifica y se torna amarillento debido al Rojo de Fenol. Si no son fermentadores, el pH se vuelve ms alcalino por la utilizacin de las peptonas, y medio vira a rosa o rojo debido al mismo colorante. Est indicado para el aislamiento de Salmonella (no para S. typhi). Las colonias de Salmonella son blanco-rosceas, con un halo rojo brillante. Medio Agar TCBS Tiosulfato Sdico Citrato frrico Bilis de vaca Sacarosa ClNa Colato de sodio pH 8,6

10 g/l 1 g/l 5 g/l 20 g/l 10 g/l 3 g/l

Extracto de levadura Citrato sdico Peptonas Azul de Timol Azul de Bromotimol Agar

5 g/l 10 g/l 10 g/l 0,04 g/l 0,04 g/l 14 g/l

Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo de la familia Vibrionaceae, en concreto de Vibrio cholerae y otros vibrios enteropatgenos. Las colonias de Vibrio son grandes, de color amarillo o azul. Este medio inhibe selectivamente el crecimiento de la Familia Enterobacteriaceae, aunque algunas especies pueden crecer dando pequeas colonias. Medio Peptona Alcalina Peptona 15 g/l NaCl 30 g/l pH 9,0 Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo la familia Vibrionaceae. Por su pH alcalino slo permite el crecimiento de Vibrio. Es un medio lquido, lo que se observa es la existencia de crecimiento por turbidez del medio.

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2. IDENTIFICACIN Las siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismos obtenidos en los aislamientos en placa. Se llevarn a cabo 4 pruebas individuales: Prueba de la oxidasa, Test de la Catalasa, Prueba de Kligler y Manita-movilidad. Adems se llevar a cabo una prueba compuesta por varias reacciones bioqumicas, el API20E. 2.1. Prueba de la Oxidasa. Se trata de determinar si un microorganismo posee citocromo c-oxidasa. Para ello se utiliza un compuesto orgnico que puede ser reducido por el sistema citocromo-oxidasa/citocromo c en presencia de oxgeno molecular, originando un producto coloreado fcilmente apreciable.
oxidasa

1-naftol + dimetilparafenilendiamina Procedimiento 1.

azul de indofenol

Tomar con el asa de siembra una colonia de la placa de EMB o TCBS (o bien hacer una suspensin de una colonia en agua) y depositar en un porta. 2. Poner la colonia sobre el porta y aadir una gota de sustrato cromgeno fresco (10 mg/ml). 3. Esperar 20-60 segundos y observar si existe algn cambio en la coloracin. Si se pone azul es (+). Resultado: Si la tira se pone de color azul oscuro, el microorganismo es oxidasa positivo. 2.2. Test de la Catalasa. Algunas bacterias poseen catalasa, una enzima capaz de destruir el agua oxigenada generada en algunos procesos metablicos. Esta enzima est presente en la mayora de las bacterias que contienen citocromos, bien aerobias o anaerobias facultativas.
catalasa

2 H2O2 Procedimiento

2 H2O + O2

Coger con cuidado una colonia con el asa de siembra (evitar coger agar) de la placa de EMB (Enterobacteriaceae) y TCBS (Vibrionaceae) 2. Poner la colonia directamente sobre un portaobjetos sin aadir agua. 3. Echar sobre la colonia una gota de agua oxigenada pura o al 30 %. 4. Observar si se forman burbujas de oxgeno. Resultado: La aparicin de burbujas indica que el microorganismo es catalasa positivo.

1.

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2.3. Test de Kligler. En este test se utiliza el medio de cultivo KIA ("Agar Hierro de Kligler") y proporciona varios datos fisiolgicos importantes para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, produce gas o cido sulfhdrico. Es un medio que requiere un procedimiento de inoculacin especial. Procedimiento 1. Inocular los microorganismos aislados en la placa de EMB en un tubo de medio KIA con el asa de siembra. La siembra se har de la siguiente manera: sembrar la superficie por estra y sembrar la parte interna del medio por picadura. Incubar 18-24 h a 37C. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio.

2.

En este medio se puede obtener la siguiente informacin fisiolgica: a) Fermentacin de glucosa y/o lactosa. El medio contiene una pequea cantidad de glucosa y una gran cantidad de lactosa. Los microorganismo capaces de fermentar cualquiera de estos compuestos darn lugar a la formacin de cidos que bajan el pH del medio. Como consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. La sucesin de eventos metablicos es la siguiente (ver dibujo): 1) El microorganismo utiliza la fuente de carbono ms asequible en el medio, la glucosa, pero como se encuentra en el medio en muy baja concentracin se agota rpidamente. Los productos de su degradacin acidifican el medio que cambia de rojo a amarillo. 2) Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas, pero slamente en aerobiosis (se corresponde a la zona de la lengeta del tubo). Este consumo da lugar a residuos amoniacales, produciendo una basificacin del medio. El indicador vira a rojo en esta parte del tubo. 3) Posteriormente se produce el consumo de lactosa, en el caso de los microorganismos que sean capaces de utilizar este disacrido. Esto da lugar a un descenso de pH por lo que cambiar el medio de rojo a amarillo.

La razn de que la lactosa se utilice despus es debido al tipo de regulacin de la galactosidasa, que es la enzima que hidroliza este disacrido para dar los correspondientes monosacridos. Se trata de una enzima inducible, lo que significa que existe un periodo de latencia entre el agotamiento de la glucosa y la produccin de las primeras molculas de galactosidasa, de tal forma que despus de un tiempo de consumo de peptonas se comienza a utilizar lactosa.

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Lac + Glc +

6h

10 h
Rojo

Amarillo

24 h
Amarillo

Lac Glc +

Rojo

Amarillo Rojo Amarillo

Medio KIA Extracto de carne Extracto de levadura Peptonas Lactosa Glucosa Tiosulfato sdico Sulfato ferroso (Fe2+) Rojo de fenol ClNa Agar pH 7,4 3 g/l 3 g/l 15 g/l 10 g/l 1 g/l 0,3 g/l 0,2 g/l 0,024 g/l 5 g/l 12 g/l

b) Produccin de gas. La produccin de gas se detecta por la formacin en el medio de burbujas de gas perfectamente visibles ya que cuartean el medio. El gas se origina mediante la reaccin catalizada por la formiato liasa a partir de cido frmico.

formiato liasa

H-COOH

CO2 + H2

Por tanto, son gas (+) aquellos microorganismos que produzcan esta enzima.

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c) Produccin de SH2. Algunas bacterias son capaces de llevar a cabo la siguiente reaccin a partir del tiosulfato aadido al medio:
tiosulfato reductasa

2 S2O3 + 4 e + 4 H

2+

2 SO32+ + 2 SH2

El cido sulfhdrico se detecta porque reacciona con las sales de metales pesados (Fe2+) presentes en el medio. Esto da lugar a la formacin de sulfuro de hierro que se deposita en gran parte del tubo, sobre todo en el fondo, oscureciendo el medio. 2.4. Manita-Movilidad. Se utiliza un medio semislido para detectar la movilidad de las bacterias. Este medio contiene manitol como fuente de carbono. Si el microorganismo es capaz de usar el manitol se produce una acidificacin del medio, lo que da lugar a un viraje del indicador de pH de rojo a amarillo.

Medio MM
Peptona de caseina Nitrato potsico Manitol Rojo fenol Agar pH 7,6 Procedimiento 1. Inocular por picadura un tubo de medio semislido con cada uno de los distintos microorganismos aislados. 10 g/l 1 g/l 7,5 g/l 0,04 g/l 3,5 g/l

2. 3.

Incubar 24 horas a 37C. Observar la zona de crecimiento del microorganismo y si ha habido cambio en la coloracin del medio.

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Resultado: El test de la movilidad se hace mirando el desplazamiento del microorganismo. Si el crecimiento se limita a la zona de la picadura, el microorganismo no es mvil. Si el crecimiento se produce por todo el medio, el microorganismo es mvil. Gneros Escherichia Shigella Salmonella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Serratia Proteus Yersinia Gas + + + + + + + SH2 + + + Lactosa + + + + + Manita-Movilidad + + + + + + + +

2.5. Batera de pruebas API20E La batera de pruebas API20E es un sistema de identificacin rpida para enterobacterias y otras bacterias Gram(-). Bsicamente consta de 20 tests bioqumicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rpido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioqumica distinta (ver tabla "sumario de los resultados con API 20E "). Los microtubos se inoculan con una suspensin de microorganismos, en agua o solucin salina, que rehidrata los medios. Las tiras se incuban a 37C y por efecto del metabolismo bacteriano se van a producir cambios de color espontneos o bien al aadir reactivos. La lectura de las reacciones se hace mediante comparacin con una tabla de lectura donde se indica si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada reaccin segn el color aparecido. Procedimiento 1. Preparacin de inculo. Tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y resuspenderla homogneamente en 5 ml de solucin salina (1% de ClNa) o 5 ml de agua estril. Inoculacin de los pocillos. Cada pocillo tiene un tubo y una cpula (ver dibujo). Llenar el tubo y la cpula de los pocillos | CIT | , | VP |, | GEL | con la suspensin de bacterias. Llenar los tubos, no la cpula, de los dems pocillos. Llenar con parafina las cpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener anaerobiosis.

2. 3. 4. 5.

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6. 7.

Poner la tira en la cmara de incubacin. Previamente poner agua en los alveolos de la cmara para proporcionar una atmsfera hmeda durante la incubacin. Incubar a 37C durante 24 h.

Interpretacin de los resultados

La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparacin de los colores de cada pocillo con los de la tabla de lectura. Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios: Si la glucosa es positiva y/o 3 o ms tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos: VP: Aadir una gota de KOH 40 % y una gota de -naftol 6% y esperar 10 minutos. Positivo= color rojo o rosa fuerte. TDA: Aadir una gota de Cl3Fe 10 %. Positivo=color marrn oscuro. IND: Aadir una gota de reativo de Kovacs. Positivo= aparece un anillo rojo en los dos primeros minutos de la reaccin. Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2, no hay que aadir reactivos. Cuando esto ocurre se hacen otros tipos de API como el API OF, el API M o el API 10S para ver determinados metabolismos especiales.

Identificacin: del conjunto de reacciones se obtiene un perfil numrico. Los pocillos

estn separados en grupos de tres. En total hay 7 tripletes (el test nmero 21 corresponde al test de la oxidasa). A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4 segn corresponda: 1. 2. Si la reaccin es negativa 0 Si la reaccin es positiva. 1 (primer pocillo de un triplete) 2 (segundo pocillo de un triplete) 4 (tercer pocillo de un triplete) Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un cdigo de 7 cifras. Con este cdigo se busca en la tabla de identificacin la especie de que se trata.

3. 4.

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