UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS BIOQUMICAS

EVALUACIN FINAL CURSO DE MTODOS

COORDINADOR DEL CURSO: DR. ROBERTO STOCK

ALUMNA: BLANCA RAMOS CERRILLO

TEMA:HIBRIDACIN in situ

NDICE I. Introduccin II. Breve historia III. Pasos y consideraciones de la hibridacin in situ IV. Preparacin de la sonda a) Diseo de sondas b) Tipo de sonda y mtodo de sntesis c) Eleccin de la sonda d) Tamao de la sonda e) Estabilidad de la sonda f) Sondas de doble cadena contra las de cadena sencilla V. Marcaje a) (3H) Tritio b) 35S c) 32P d) 33P e) Marcaje con digoxigenina f) Marcaje con biotina g) Marcaje fluorescente de cidos nuclicos h) Mtodos de marcaje para: i) DNA ii) RNA iii) Oligonucletidos VI. Preparacin de tejidos a) Fijacin b) Tejido embebido y su seccionamiento VII. Tratamiento de la laminilla VIII. Pretratamiento del tejido a) Tratamiento con solventes orgnicos b) Tratamiento con proteasas para facilitar la accesibilidad al RNA de inters c) Inactivacin endgena enzimtica d) Tratamiento con RNasas e) Tratamiento con HCL f) Tratamiento con detergentes 1 1 2 4 5 5 6 6 7 7 7 7 8 8 8 8 9 11 12 13 13 14 14 15 15 16 16 16 17 17 17 17

g) Impedimento de enlaces h) Pre-hibridacin i) Blancos del DNA IX. Pre-hibridacin y desnaturalizacin de la sonda y su blanco X. Hibridacin a) Largo de la sonda b) Composicin de la sonda c) Identidad d) Composicin de la solucin de lavados de la hibridacin e) Desnaturalizacin del DNA f) pH g) Temperatura XI. Lavados post-hibridacin XII. Deteccin a) Sondas radioactivas i) Grados de la emulsin ii) Espesor de la emulsin iii) Almacenamiento y vida media de la emulsin iv) Condiciones de exposicin v) Tiempo de exposicin vi) Condiciones para revelarla b) Sondas marcadas con haptenos XIII. Tcnicas de doble tincin XIV. Controles a) Hibridacin cruzada con secuencias de cidos nuclicos inespecficos b) Enlaces inespecficos c) Generacin inespecfica de la seal d) Ruido de fondo sobre tejidos especficos e) Ruido de fondo de sondas marcadas con haptenos XV. Fotografa XVI. Microscopa a) De campo claro b) De campo oscuro c) De contraste de fases d) Microscopa de contraste de reflexin e) De fluorescencia

17 17 17 18 18 20 20 20 20 21 21 21 23 23 23 24 24 24 24 24 24 24 25 26 26 26 27 27 27 28 28 28 29 29 29 29

f) Imgenes digitales g) Microscopa electrnica h) Flujo citomtrico XVII. Algunas otra tcnicas: PRINS a) Principios y mtodos de in situ PCR b) Amplificacin in situ c) Deteccin de productos de PCR en la clula d) Eficiencia de PCR in situ e) PCR in situ tiene una gran nmero de aplicaciones en diagnstico f) Controles para PCR in situ XIX. Comparacin de las tcnicas de hibridacin in situ

29 29 29 30 30 30 30 31 31 32 34

Abreviaturas A AP BCIP Bio BrdU C cDNA DAB DAPI DEPC DIG DMSO DNasa dsDNA DTT EDTA FISH FITC FLU G mRNA NTB PBS PCR PFA RNasa snRNA snoRNA ssDNA STS T TBE TBS TE TEMED TESPA Tm Tr tRNA U UV

Adenina Fosfatasa alcalina 5-bromo-4cloro-3-indolil fosfato biotina 5-bromo-4-cloro-3-indolid fosfato citosina DNA complementario diaminobenzidina 4,6-diamino-2-fenilindole dietilpirocarbonato digoxigenina dimetilsufxido deoxiribonucleasa doble cadena de DNA ditiotreitol cido etilenoadiaminotretactico fluorescence in situ hybridization Fluorescencia in situ Fluorescena Guanina mRNA 4-nitroblue-tretrazolium chloride buffer fosfato salino reaccin en cadena de la polimerasa paraformaldhedo ribonucleasa small nuclear RNA small nucleolar RNA cadena sencilla de DNA sitio de pegado de la secuencia timina tris-borato-EDTA tris buffer salino tris-EDTA tetrametilenediamina 3-aminopropiltrietoxisilina Temperatura de fusin Temperatura de reasociain RNA de transferencia uracilo luz ultravioleta

ndice de tablas y figuras Pg. Figura 1. Principios de la hibridacin in situ Figura 2. Diagrama de flujo de la hibridacin in situ Figura 3. Estructura qumica de la digoxigenina Figura 4. Estructura qumica de la biotina Tabla 1. Ventajas y desventajas de sistemas de marcaje Figura 5. Estructura qumica de la fluorescena Tabla 2. Ventajas y desventajas entre la sondas de hibridacin Tabla 3. Aplicaciones de la hibridacin in situ Tabla 4. Controles requeridos para experimentos de hibridacin I. Introduccin. Hibridacin in situ es una tcnica que detecta secuencias de cidos nucleicos en clulas, cromosomas o tejidos preservados. La deteccin in situ provee una visualizacin directa de la localizacin espacial de secuencias especficas que es crucial para dilucidar la organizacin y funcin gnica, por lo que el mtodo de hibridacin in situ se ha convertido en una tcnica importante en diversos campos, incluyendo diagnstico de rearreglos cromosomales, deteccin de infecciones virales y anlisis de la funcin gnica durante el desarrollo embrionario. La hibridacin in situ toma como fundamento la complementaridad de los cidos nuclicos, la cual puede ser DNA y/o RNA, a travs de puentes de hidrgeno formados entre las bases: adeninatimina (DNA) o uracilo (RNA) y citosina-guanina (DNA y RNA). Este apareamiento da lugar a una doble cadena en la cual una cadena, tiene la orientacin opuesta a la otra con respecto al esqueleto azcar-fosfato. La secuencia es leda de 5' a 3'. Secuencia DNA RNA 5' TGATCCGTTA3' 5'UGAUCCGUUA3' 3' ACTAGGCAAT5' Transcripcin 1 3 8 9 11 12 20 32 33

Figura 1. Principios de la hibridacin in situ. La relacin entre la doble cadena de DNA y su transcrito a RNA. El DNA genmico consiste de dos cadenas complementarias, A aparea con T y G con C en orientacin opuesta (5' a 3' y 3' a 5'). La transcripcin usa la cadena lder como templado y genera una secuencia idntica de RNA.

II. Breve historia La tcnica fue desarrollada en 1969 por Gall y Pardue e independientemente por Jonh et al., en el mismo ao. Gall y colaboradores describieron una tcnica que formaba hbridos moleculares entre RNA y DNA. La tcnica se llev a cabo en ovocitos de Xenopus laevis, hibridando rRNA con rDNA extracromosomal. Detectaron la localizacin diferencial en las clulas, de los hbridos de cidos nuclicos ha distintos estados. En ese momento la nica forma de marcaje eran los radioistopos, por lo que se us tritio para el experimento y la forma de deteccin fue por autoradiografa. Demostraron que en ciertas partes como tejido conectivo, la tcnica no era suficientemente sensible para mostrar las cantidades pequeas de rDNA en un genoma. Esto lo llevaron a cabo exponiendo las preparaciones por periodos ms all de dos meses. Evaluaron variables de la tcnica que afectan el rendimiento de la hibridacin, hacindo hincapi en un paso fundamental que se debe llevar a cabo para realizar la tcnica: la desnaturalizacin. Plantearon que el hbrido puede reabsorberse en el soporte que utilizaron (agar) y esto puede fungir como impedimento para que se lleve a cabo la reaccin. Finalmente propusieron mejorar la tcnica, pese a las limitaciones

de ese momento, incrementando el rendimiento con el uso de RNA sintetizado in vitro, es decir preparndolo enzimticamente, usando como templado el rDNA satlite de Xenopus. Adems el clonaje molecular no era posible en ese tiempo y la hibridacin in situ se restringi a aquellas secuencias que pudieran ser purificadas y aisladas por mtodos bioqumicos y resolver problemas como localizacin citolgica del DNA. Vale la pena resaltar que estos experimentos arrojaron informacin valiosa que contribuy a perfeccionar la tcnica y poderla aplicar en varios campos. El clonaje molecular de cidos nucleicos y el mejoramiento de las tcnicas de marcaje radioactivo han cambiado el panorama dramticamente. Por ejemplo Harper et al., en 1981 detect en cromosomas metafsicos el gen de la insulina. El mtodo de deteccin fue la autorradiografa. En 1985 Coghlan sintetiz oligonucletidos marcados radioactivamente para deteccin. Este mismo investigador en 1986 detect citolgicamente un bajo nmero de copias de mRNAs. La alta sensibilidad que provee la prueba (de 20 a 50 copias de secuencias blanco/clula), as como el rango tan grande de aplicaciones di pie a que muchos laboratorios adoptaran la tcnica; aunque uno de los principales

problemas que enfrentaba la hibridacin in situ era el tipo de marcaje (radioactivo) y el tiempo requerido para la deteccin (autorradiografa). Con el tiempo sto fue cambiando, desarrollando otro tipo de marcaje de los cidos nucleicos dejando de lado al mayor impedimento para la aplicacin general de la hibridacin in situ, lo cual abri nuevas oportunidades para emplear distintos marcajes en un experimento. La estrategia actual es utilizar un sistema de deteccin con anticuerpos aumentando la accesibilidad de la prueba. III. Pasos y consideraciones para la hibridacin in situ. La tcnica involucra: a) Generacin de cidos nucleicos marcados para una deteccin subsecuente. b) Fijacin de tejidos (seccionados), preparacin de cromosomas. c) Preparacin del tejido para incrementar el acceso del cido nucleico marcado. d) Hibridacin de la sonda marcada en cromosomas o tejidos. e) Lavados selectivos que remuevan las sondas que no hibridan.

f) Deteccin de la sonda marcada, revelando la localizacin celular de los cidos nucleicos.

Preparacin de laminillas - tratamiento con gelatina o poli-L-lisina -siliconizacin

Fijacin del material en la laminilla - por precipitacin (etanol) Por entrecruzamiento (formaldhedo)

Pretratamiento del tejido (opcional) a) tratamientos que previenen el ruido Inactivacin endgena de la enzima Tratamiento con RNasas b) Permeabilizacin cidos diludos Detergente/alcohol Proteasas Sonda a) Eleccin de la sonda ds: DNA, cDNA ss: RNA, oligonucletidos ss-DNA b) Preparacin de la sonda Aislamiento de fragmentos de DNA (opcional) cDNA: clonaje RNA: clonaje y transcripcin en vectores Oligonucletidos: sntesis qumica c) Marcaje de la sonda Ds DNA: random primed, nick translation, PCR RNA: transcripcin in vitro, RT-PCR Oligonucletidos marcados

Prehibridacin (opcional) Incubacin de la muestra con una solucin pre-hibridacin, a la misma temperatura que la hibridacin Desnaturalizacin de la sonda y su Blanco pH o calor Desnaturalizqacin simultnea o separada de la sonda y su blanco (si es doble cadena)

Hibridacin Componentes de la solucin cidos nuclicos heterlogos Fosfato de sodio, EDTA, SDS, sales Formamida Dextrn sulfato

Pasos post-hibridacin Tratamiento con nucleasas (opcional) Lavados astringentes

Determinacin de las condiciones de hibridacin Determinacin de la temperatura de hibridacin, pH, uso de formamida, concentracin de sales Composicin de la solucin de hibridacin Concentracin de la sonda

Microscopa de fluorescencia por sondas directamente marcadas con un fluorocromo

Deteccin inmunolgica Bloqueo Incubacin con anticuerpos Micrsocopa de fluorescencia o sustratos colorimtricos Montaje Micrsocopa, anlisis de resultados Evaluacin

Determinacin de la especificidad en la hibridacin (controles) Tratamiento con nucleasas Uso de sondas mltiples Uso de vectores o cidos nulceicos heterlogos

Figura 2. Diagrama de flujo de la hibridacin in situ.

Este mtodo puede ser combinado con PCR para amplificar las secuencias de pegado y aumentar la deteccin de la seal. Un aspecto crtico en ste mtodo es que los cidos nucleicos que estn retenidos in situ no deben de ser degradados por nucleasas, para que sea posible la hibridacin de la sonda. Actualmente existen varias alternativas para elegir el tipo de sonda y los mtodos de marcaje y deteccin.

Las alternativas mayormente usadas son: a) Sondas de RNA, sondas de DNA (cadena doble o sencillo) u oligonucletidos b) Marcas radioactivas o haptenos c) Marcajes directos e indirectos La deteccin del mtodo depende de lo que se requiera: a) Sensibilidad. Depende del fcil acceso que tenga la sonda marcada, la cantidad y tipo de marca includa en la sonda y el mtodo de deteccin. b) Resolucin. La resolucin de la seal puede variar de sitios especficos en una clula, lo cual depende de la sonda marcada y del mtodo de deteccin. c) Especificidad. La especificidad de la seal depende de la selectividad del lavado y de secuencias similares que interfieran en el pegado de la sonda. d) Anlisis de secciones celulares o de tejidos montados en laminillas o secciones de tejidos que se encuentren en solucin, tejidos enteros o embriones. e) Deteccin mltiple de genes o productos gnicos. La relacin fsica entre genes o regiones cromosomales pueden ser visualizadas por el uso de distintas marcas fluorescentes para la deteccin simultnea de distintos productos gnicos en una clula o tejido. f) Programas computacionales. Estos pueden ayudar a la visualizacin de modelos espaciales de transcritos en un tejido o embrin. Se pueden llevar a cabo modelos tridimensionales. g) Conveniencia y seguridad. Las marcas no radioactivas son ms estables, seguras y rpidas. IV. Preparacin de la sonda. Para sondas de cadena sencilla, se debe usar la secuencia reversa complementaria. Cuando las sondas son sintetizadas por transcripcin, involucra generar mRNA del gen endgeno. Cuando se disean los oligos marcados, es importante recordar que la secuencia antisentido es la hebra complementaria reversa de la cadena lder y debe ser leda de 5 a 3.

En general es preferible usar sondas especficas, ya que esto garantiza una buena hibridacin. Existen situaciones en las cuales esto no puede llevarse a cabo, por ejemplo, si los genes todava no estn clonados de las especies

usadas para la hibridacin o si la secuenica gnica es muy similar entre especies. Esto puede favorecer una hibridacin entrecruzada. Para evitar sto, se requiere una alta selectividad que reduzca la presencia de bases mal apareadas, aumentando de esta manera la especificidad. Si los modelos de expresin son los mismos, como se pueden ver con una sonda homloga, es un experimento alentador, aunque no prueba la especificidad. sto puede ser probado por un Northern o un Southern-blot. La hibridacin entrecruzada provee informacin preliminar muy valiosa. a) El diseo de sondas se resume en los siguientes puntos: i) La hibridacin entrecruzada utiliza sondas largas (>100 pb) usadas bajo condiciones selectivas especialmente despus de la digestin con nucleasas, ya que una sonda adems de homloga, debe ser lo suficientemente amplia para llevar a cabo la hibridacin. ii) Para sondas pequeas (oligonucletidos de 20-30 pb) es muy probable que algn gen distinto al de inters tenga una secuencia idntica. Alternativamente se puede hacer un screening y ste puede ser realizado por bsqueda de secuencias en bases de datos. iii) Los mRNA poseen las secuencias poli(T) y poli(U), al transcribirse a cDNA se evita que la sonda no incluya esta cola, porque secuencias largas, ricas en GC dan una gran estabilidad a la sonda por los triples enlaces que se forman entre estas bases. Se necesitan dos elecciones ms para la preparacin de la sonda: el tipo de cidos nucleicos y la marca que se incorpora en la sonda. Algunos mtodos alternativos estn disponibles para la sntesis de la sonda. b) Tipo de sonda y mtodo de sntesis. Distintos tipos de sondas de cidos nucleicos pueden ser utilizadas para la hibridacin in situ: i) Sondas de DNA doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando tcnicas como nick translation, random priming o PCR, en las cuales el nucletido marcado es incorporado. PCR y random priming proporcionan una buena actividad especfica. Estas sondas pueden ser desnaturalizadas antes de usar. Cuando se usan para detectar una cadena simple como mRNA, estas son menos sensibles debido a que la concentracin de la sonda marcada es reducida. ii) Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas utilizando primer extension en templados de cadena simple o por PCR con un nucletido marcado. ste ltimo es el ms usado porque es ms fcil de llevar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad de material. El PCR permite una gran flexibilidad en la eleccin de las secuencias marcadas por el uso de primers. Estas marcas han sido ampliamente usadas. iii) Oligonucletidos (entre 20 y 40 bases). Son marcados incorporando oligonucletidos modificados durante la sntesis qumica o adicionando una cola marcada. Una de las desventajas es que algunos oligonucletidos marcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye.

iv) Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso de una RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de la sonda es clonada en un vector que flanquear dos sitios distintos de iniciacin. La cadena de RNA antisentido (sonda) es sintetizada en direccin opuesta al gen endgeno. Se recomienda linearizar la sonda de RNA con enzimas que dejen el extremo 5 cohesivo, por que se ha reportado, que el extremo 3 romo promueve la sntesis de transcritos anormales. c) Eleccin de la sonda. Las sondas largas de cadena simple (RNA o DNA) proporcionan una alta sensibilidad en la deteccin de cadena sencilla. Los oligonucletidos son muy sensibles y la seal puede ser incrementada por el uso de un cocktail de sondas que flanquearn en regiones distintas. Para estudios de mRNAs estrechamente relacionados, las sondas especficas, pueden ser obtenidas por sntesis de oligonucletidos. Se disean primers que sern usados para la amplificacin del fragmento deseado de DNA en el PCR. Estos fragmentos pueden ser clonados y usados para sintetizar cadenas dobles o sencillas de DNA o RNA. Alternativamente, para el caso de sondas de RNA, pueden ser marcadas directamente sin clonacin incluyendo el primer marcado en el sitio de iniciacin de la RNA polimerasa. Finalmente las sondas de DNA de doble cadena son recomendadas para blancos de doble cadena y esto puede ser suficientemente sensible para detectar abundancia de cadena sencilla. d) Tamao de la sonda. Las sondas largas pueden emitir una seal ms fuerte debido a que incorporan mayor nmero de nucletidos marcados dentro de ella. Sin embargo, las sondas que son tan largas dan seales dbiles, debido a que la sonda penetra menos eficientemente en el tejido. La mejor estrategia es usar una secuencia larga como templado para la sntesis de la sonda pero asegurar que la sonda generada es lo suficientemente pequea para poder penetrar . Muchos procedimientos estn basados en que la sonda de 50-150 bases porque emiten seales ptimas para la hibridacin en secciones de ciertos tejidos (Cox, 1984.). Se ha encontrado que las sondas de RNA que miden por arriba de 1 kb proveen seales ptimas para la hibridacin in situ, en embriones fijados en paraformaldhedo. La penetracin est influenciada por el tamao de la sonda aunque tambin depende de la naturaleza del tejido, de la forma de fijacin y si el pretratamiento ha sido realizado para remover las protenas celulares. El tamao de la sonda puede ser controlado durante la reaccin de sntesis: i) Sondas de DNA, sintetizadas por nick translation, el largo est determinado por la cantidad de DNasa en la reaccin. ii) Sondas marcadas por random priming el tamao est determinado por la concentracin del primer.

iii) Primers que puedan ser elegidos para deteminar el tamao de la sonda sintetizada por PCR. iv) Sondas largas de DNA pueden ser cortadas parcialmente por incubacin a altas temperaturas. v) Sondas largas de RNA son parcialmente cortadas por hidrlisis alcalina limitada. Si el tamao de la sonda es cortada por hidrlisis hay que revisar el tamao de la sonda, porque si sta es muy pequea, sta no hibridar bajo condiciones selectivas standard, dando una baja seal. e) Estabilidad de la sonda y la interaccin con su blanco. En experimentos de hibridacin los puentes entra la sonda y la secuencia blanco juega un rol importante. El largo decrementa la estabilidad en el siguiente orden RNA-RNA, DNA-RNA, DNA-DNA (Wetmur et al., 1986). La estabilidad de los hbridos est influenciada por las condiciones de hibridacin, por la concentracin de formamida, sales y la temperatura. f) Sondas de doble cadena contra cadena sencilla. Un nmero de reacciones competentes ocurren durante la hibridacin in situ con sondas de doble cadena. Las sondas de cadena sencilla proveen las siguientes ventajas: i) La sonda no se agota porque no se autoliga. ii) No son cadenas largas porque deben penetrar en la seccin de tejido o en los cromosomas. Con DNA-DNA la renaturalizacin in situ de secuencias blanco se lleva a cabo eficientemente porque los hbridos tienen una estabilidad trmica similar. La renaturalizacin in situ de DNA puede ser impedida por el uso de sondas de RNA de cadena sencilla. Los hbridos DNA-RNA son ms estables trmicamente que los hbridos DNA-DNA. Las condiciones de hibridacin pueden ser diseadas de tal manera que la formacin del hbrido DNA-DNA no sea favorecido, pero el hbrido DNA-RNA s. V. MARCAJE Existen dos alternativas para que el marcaje sea incorporado dentro de la sonda: el marcaje radioactivo que es detectado por autorradiografa, o por haptenos (no radioactivo) el cual es detectado directa o indirectamente por inmunocitoqumica. Isotpicos Sistemas No isotpicos no radioactivos Indirectos Los sistemas isotpicos ofrecen una alta sensibilidad, particularmente con tritio, as como alta resolucin. Por otro lado el empleo de radiositopos radioactividad directos

requieren licencia especial. El mtodo de deteccin (autorradiografa) requiere un tiempo de exposicin de semanas. Algunos istopos han sido usado para marcajes radiocativos en la hibridacin in situ, que difieren en cuanto a la resolucin de la seal, la velocidad en obtencin de resultados y la estabilidad de la sonda. a) 3H - proporciona una seal a nivel subcelular pero requiere largas exposiciones autorradiogrficas. b) 35S proporciona resolucin de un dimetro celular, con tiempos de exposicin de una semana. Agentes reductores como el ditiotreitol (DTT) pueden ser includos en la solucin que contenga 35S para proteger al azufre de la oxidacin. La vida media de este istopo es de 87 das y la marca debe ser usada en un mes aproximadamente. c) 32P da una resolucin menor que el 35S y adems proporciona una baja eficiencia en la autorradiografa, ofrece una pequea ventaja en cuanto a la velocidad de obtencin de resultados. Posee una vida media de 14 das. d) 33P da una resolucin similar a 35S, pero ste tiene una vida media ms corta (25 das) y el costo es mayor. Con el uso de sondas radioactivas es posible hacer un mtodo cuantitativo. Existen dos tipos de sistemas no isotpicos para la prueba de hibridacin: directo e indirecto. En el primero, la molcula detectable (reportera) es enlazada directamente al cido nuclico y este hbrido puede ser visualizado en el microscpio inmediatamente despus de la reaccin de hibridacin. El paso limitante en ste mtodo es que el hbrido subsista a las condiciones de lavado. Lo ms importante, adems, es que la molcula reportera no interfiera con la hibridacin. El marcaje con un fluorocromo en pruebas de RNA desarrollada por Bauman et al., 1980, 1984, y el marcaje directo de cidos nucleicos con enzimas, descrito por Renz y Kurz, 1984, siguen este criterio. Los mtodos indirectos requieren una marca que contenga la molcula reportera, introducida qumica o enzimticamente, que pueda ser detectada por afinidad citoqumica. En este mtodo al igual que el anterior, el marcaje no debe interferir con la hibridacin, ya que la molcula reportera debe estar accesible a los anticuerpos que la detecten. Se han descrito un sin nmero de modificaciones a haptenos (Langer et al., 1981) y uno de los sistemas ms populares es el sistema DIG (digoxigenina) el cual ser descrito posteriormente. Tiempo atrs se decribi la sntesis qumica de oligonucletidos conteniendo grupos funcionales (grupos sulfhidrilos, aminas primarias alifticas). Con esto se pudo hacer reaccionar haptenos, fluorocromos o enzimas que producen un marcaje estable, el cual se utiliz para la hibridacin in situ (Agrawal et al., 1986).

e) Marcaje con digoxigenina (DIG) El mtodo de marcaje con DIG est basado en un esteroide aislado de las plantas Digitalis purpurea y Digitalis lanata. Las hojas y flores de estas plantas son la nica fuente natural de digoxigenina.
O O CH 3 OH

CH3 O HN O O P O O O P O O O P O R2 R1 O O O N N H O O H N O H

H OH

Figura 3. Digoxigenina-UTP/dUTP/DDUTP, alcali-estable. Digoxigenina-UTP (R1=OH, R2=OH). Digoxigenina-dUTP (R1=OH, R2=H) y Digoxigenina-ddUTP (R1=H, R2=H).

La digoxigenina se enlaza en la posicin C5 de la uridina mediante un brazo que contiene 11 tomos de carbono. Los nucletidos marcados con DIG pueden ser incorporados a las sondas de cidos nucleicos por DNA polimerasas (E. coli DNA polimerasa I, T4 DNA polimerasa, T7 DNA polimerasa, reverso transcritptasa y Taq DNA polimerasa), al igual que RNA polimerasas (SP6, T3 O T7 RNA polimerasa) y transferencia terminal. Los cidos nucleicos pueden ser marcados qumicamente con DIG-NHS ester o con DIG Chem-Link. Las sondas DIG-marcadas pueden ser detectadas con una alta especificidad por anticuerpos anti-digoxigenina (Anti-DIG) que son conjugados a fosfatasa alcalina, peroxidasa, fluorescena, rodamina u oro coloidal. Alternativamente, anticuerpos anti-digoxigenina primarios y secundarios pueden ser usados. La sensibilidad de la deteccin depende del mtodo usado para visualizar los anticuerpos anti-DIG conjugados. Cuando un anti-DIG conjugado a fosfatasa alcalina es visualizado por colorimetra (NTB y BCIP o 5 bromo, 4 cloro, 3indolidfosfato nitro azul) o sustraros fluorescentes (HNPP), la sensibilidad de la deteccin es aproximadamente de 0.1 pg. Las mezclas marcada contenidas en los kits de marcaje con DIG relacionan a la uridina marcada con DIG a dTTP la cual produce una marca de hibridacin altamente sensible. Esta relacin produce una incorporacin de 20 a 25 nucletidos marcados con DIG al DNA. f) Marcaje con biotina El marcaje de cidos nucleicos con biotina-dUTP (Figura 4) fue desarrollado por David Ward y colaboradores en la Universidad de Yale (Langer et al., 1981). Recientemente se han sintetizado otros nucletidos biotinilados como adenosina biotinilado y citosn-trifosfatos (Gebeyehu et al., 1987). Tambin se han implementado procedimientos fotoqumicos al igual que un nmero de

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mtodos de biotinilacin qumica han sido descritos (Gillam and Tener, 1986; Reisfeld et al., 1987; Viscidi et al., 1986).
O HN H NH H O NH O NH O O O P O O O P O O O NH O P O O N O NH

HO

Figura 4. Estructura qumica de la biotina-dUTP.

En principio la biotina puede ser detectada en la misma longitud de onda que la digoxigenina, dependiendo del fluorforo acoplado a estreptavidina. La estreptavidina o avidina es ms frecuentemente usada porque stas molculas tienen una alta capacidad de enlace con la biotina. La avidina (proveniente de la clara de huevo) es una glicoprotena de 68 kDa con una constante de asociacin de 10-15 M a 25 C. Las sondas marcadas con haptenos tienen varias ventajas, incluyendo seguridad, alta estabilidad, obtencin rpida de resultados y resolucin. Adems la hibridacin in situ puede ser realizada en un soporte. Los mtodos ms sensibles involucran incorporacin de nucletidos modificados que tienen un grupo hapteno que es detectado por un anticuerpo especfico. Siguiendo la hibridacin, el tejido es incubado con haptenos enlazando anticuerpos acoplados a una enzima y entonces la seal es producida por colorimetra. El rango de haptenos tiene un uso limitado por la disponibilidad comercial. El marcaje fluorescente de la sonda o de anticuerpos anti-haptenos, ofrece la ventaja de usar etiquetas fluorescentes distintas simultneamente, detectando diferentes secuencias. Esta estrategia es usada generalmente para la hibridacin en cromosomas y es menos recurrente para la deteccin de mRNA por la baja sensibilidad. Una nueva alternativa que se ofrece es el uso de anticuepos acoplados a oro coloidal usados para la deteccin por microscopia electrnica. La eleccin de la marca depende de los requerimientos para la sensibilidad y resolucin de la seal. Las sondas marcadas con 35S son ms sensibles que las sondas marcadas con haptenos, y pueden ser elegidas para la deteccin de transcritos no abundantes. Si la resolucin a nivel celular y/o visualizacin tridimensional de la expresin gnica es requerida, entonces el mtodo ideal

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es el marcaje con haptenos. La seguridad es una consideracin importante para la eleccin del mtodo. En la tabla 1 se muestran las ventajas y desventajas que tiene cada uno de los sistemas: Tabla 1. Ventajas y desventajas de sistemas istipicos y no isotpicos
VENTAJAS DESVENTAJAS Equipo para uso de radioactividad, tiempo de exposicin variable y la resolucin es dependiente de marcaje. Los radioisotopos tienen una vida media relativamente corta. Se deben de tener estrictos controles dentro de la prueba. Con frecuencia variabilidad en la eficiencia de la prueba.

Isotpicos 35 3 33 (Marcaje con S, H, P 32 y P)

Alta sensibilidad, fcil deteccin, eficiencia en el marcaje de la sonda que puede ser estimado rpidamente. Puede ser usada para cuantificacin por conteo de granos de 35 plata ( S).

No isotpicas (Biotina, digoxigenina, FITC, dinitrofenil, marcaje con fosfatasa alcalina o peroxidasa)

Buena sensibilidad, exposicin no radiocativa, larga vida media de la sonda, reproducibilidad, buena resolucn celular y morfologa. Protocolos accesibles. Permanente retencin del color.

Dificultad en deteccin de secuencias no repetitivas. Problemas con ruido de fondo en tejidos ricos de la molcula marcada (ej. biotina). Pasos adicionales para la deteccin. Dificultades en la cuantificacin exacta de la molcula marcada.

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g) Marcaje Fluorescente de cidos nucleicos Los nucletidos marcados con fluorescena (Figura 5) son una alternativa de los marcajes radioactivos. Los anlogos de nucletidos marcados con fluorescena pueden ser usados como sistemas directos e indirectos de la hibridacin (Dirk et al., 1991; Wiegant et al., 1991). La fluorescena dUTP/UTP/ddUTP pueden ser incorporados enzimticamente a los cidos nucleicos de acuerdo a tcnicas standard. El marcaje con fluorescena es un marcaje directo que no requiere deteccin inmunocitoqumica por lo que es necesario que haya un mnimo ruido de fondo. En general las desventajas de los mtodos directos es que son menos sensibles que los mtodos indirectos descritos anteriormente. Alternativamente, los nucletidos marcados con fluorescena pueden ser detectados con un anticuerpo conjugado anti-fluorescena o con un anticuerpo no conjugado o con un anticuerpo secundario contra fluorescena. Otros nucletidos marcados con fluorocromos, como tetrametil-rodamina-5dUTP que emite en rojo estn disponibles actualmente.
O HN O O P O O O P O O O O P O R2 R1 O O C OH N O N H O H N O

X 4 Li

HO

Figura 5. Estructura qumica de la fluorescena dUTP

h) Mtodos de marcaje para: i) DNA. Las sondas preparadas por marcaje random primed son preferenciales para aplicaciones de blot por la alta tasa de incorporacin de nucletidos y la alta tasa de produccin de sondas marcadas. En la reaccin de marcaje por random primed, el templado de DNA es linearizado, desnaturalizado y un primer es incorporado. Inicia en el extremo 3-OH del primer, por sntesis de Klenow. Se sintetiza una molcula de DNA a lo largo del sustrato de cadena sencilla. El tamao de la sonda es cerca de 200-1000 pb con la ayuda de reactivos premezclados y marcados (como DIG, biotina o fluorescena) la reaccin de random primed puede producir de 30-70 ng (por 10 ng de templado y una hora de incubacin) de 2.10-2.65 g (por 3 g de templado y 20 horas de incubacin) de una sonda de DNA no radioactiva. En la reaccin de nick translation, el templado de DNA puede ser superenrrollado o linearizado. Despus el DNA es cortado con DNasa I,

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comienza la actividad de la exonucleasa de DNA-polimerasa I que va de 5 a 3 y se extiende desde la muesca hasta la siguiente muesca (nick-gap); entonces la polimerasa reemplaza los nucletidos escindidos con nucletidos marcados. La reaccin produce ptimos marcajes despus de 60 a 90 minutos. El tamao de la sonda despus de la reaccin debe ser cerca de 200 a 500 pb. Las sondas pueden ser preparadas por PCR. En ste, dos primers hibridan en los extremos del DNA y flanquean secuencias especficas, entonces una polimerasa termoestable (como la Taq polimerasa) elonga a los dos primers. Una serie repetitiva de ciclos (desnaturalizacin, anclaje y extensin del primer) resulta en una acumulacin exponencial de copias de la secuencia (cerca de millones de copias en 20 ciclos). La incorporacin de nucletidos marcados durante el PCR puede producir grandes cantidades de sonda marcada.Eel largo de la sonda amplificada est definida por el extremo 5 de los primers para el PCR. El PCR permite una fcil produccin de sondas con tamao ptimo. Los tres mtodos de marcaje de DNA permiten una gran flexibilidad considerando el largo de los fragmentos marcados. En las reacciones de nick translation el cambio en la concentracin de DNasa altera la longitud del fragmento, en cambio la reaccin de random primed es afectada por la concentracin del primer y para el caso de PCR la secuencia de los primers controlan el tamao del fragmento. En los tres casos se produce una buena cantidad de sondas marcadas, muchas de las cuales tienen regiones complementarias sobrelapadas. ii) RNA. Las sondas de RNA son generadas por transcripcin in vitro de un templado linearizado. En este caso un promotor para la RNA polimerasa puede estar en el vector de DNA, SP6, T3 o T7 RNA polimerasa y son comnmente usadas para la sntesis de la complementaria de RNA al DNA sustrato. El transcrito sintetizado es una copia exacta de la secuencia del promotor al sitio de restriccin. El tamao de la sonda puede ser ajustado mediante los sitios de restriccin y de esta manera tener un control en el tamao de todas las sonda de RNA. La cantidad de RNA marcado es cerca de 10 g por 1g de DNA. iii) Oligonucletidos. Oligonucletidos sintticos tienen algunas ventajas. Son sintetizados automticamente, son pequeos y de cadena sencilla. Por su pequeo tamao poseen una gran capacidad de penetracin, la cual es considerada como uno de los factores ms importantes de la hibridacin in situ. Por otro lado el tamao del oligo puede ser una desventaja, porque usualmente flanquean menos blancos que las sondas de cDNA convencional. Recientes estudios han sugerido que la propiedad de penetracin de la sonda compensa el nmero de blancos que quedan sin flanquear. Una de las

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mayores ventajas que tiene este tipo de marcaje es que la cadena sencilla excluye la posibilidad de renaturalizacin. Los oligonucletidos pueden ser marcados directamente con un fluorocromo, con enzimas o con haptenos como biotina, o DIG, las cuales son visualizadas por afinidad citoqumica despus de la hibridacin. Algunas marcas pueden ser seguidas qumica o enzimticamente. El primer enfoque fue qumico utilizando oligos sintticos los cuales tenan aminas reactivas o grupos tioles, adicionados en el paso final de la sntesis automtica. Despus de la purificacin, el oligonucletido reactivo es modificado con un hapteno. Ejemplo: DIG-NHS o con molculas reporteras. La segunda aproximacin qumica fue probar DIG o biotina y ver que no formaba una unin de tipo covalente coordinado. Los protocolos enzimticos utilizan deoxinucleotidil transferasa terminal, marcando enzimticamente oligos sintticos en el extremo 3. Algunos mtodos son ventajosos en cuanto a la produccin de sondas a pequea escala porque no requiere la sntesis y derivatizacin de oligos. VI. PREPARACIN DEL TEJIDO El procedimiento para preparar tejidos est determinado por la naturaleza del mismo y los requerimientos especficos del experimento. Las clulas en cultivo de tejidos pueden ser crecidas directamente en soportes, en los cuales sern fijadas para posteriormente seccionarlos. Los puntos importantes para llevar a cabo la fijacin del tejido son: el mtodo de incrustacin y evaluar el material de la superficie de pegado. a) Fijacin. Para preservar morfolgicamente el material biolgico debe ser fijado. La fijacin es un paso crtico para obtener buenos resultados. Desde el punto de vista qumico existen limitaciones en el tipo de fijacin: i) Los grupos funcionales involucrados en el aparemiento de las bases estn protegidos por la estructura de DNA. ii) El RNA es poco reactivo con agentes entrecruzantes iii) La reaccin es reversible con formaldhedo Para fijar cromosomas metafsicos, sta se hace con metanol/cido actico. Para tejidos embebidos en parafina se usa la fijacin con formalina. Para secciones de tejido congelado (criostato) son fijadas con formaldhedo 4% por 30 minutos o con solucin Bovin Fix que ha dado resultados satisfactorios, al igual que la fijacin por vapor de paraformaldhedo. Las fijaciones entrecruzadas, como por aldhedos, proporcionan facilidad en el acceso y retencin de RNA que precipita en el fijado. Las condiciones para la fijacin son un fuerte compromiso. Fijaciones fuertes permiten una buena preservacin de la morfologa celular, pero el incremento en el entrecruzamiento baja la accesibilidad al blanco. Lo comnmente usado es

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4% paraformaldhedo, 4% formaldhedo o 1% glutaraldhedo, obteniendo una mayor tasa de entrecruzamiento. La solucin de para formaldhedo puede preparase fresca o puede ser refrigerada a 4C por dos semanas. El almacenaje prolongado favorece la formacin de cido frmico, resultando en una fijacin inadecuada. La fijacin es llevada a cabo usualmente entre 0-4 C inhibiendo de esta manera las endonucleasas endgenas. El tiempo de fijacin depende del tamao de la muestra; para clulas aisladas, 20 minutos es suficiente, para tejidos de de hasta 1 mm de grosor, 2-3 horas son suficientes; para tejidos de hasta 0.5 cms, toda la noche es suficiente; para tejidos de mayor tamao es necesaria la perfusin. La fijacin prolongada (3 4 das) disminuye la intensidad de la seal. Debe ser notado que las secuencias blanco de DNA y RNA estn rodeadas de protenas y que existe una interaccin entre stos que enmascaran los blancos buscados. Por otro lado el procedimiento de permeabilizacin es requerido. Desafortunadamente un protocoo general de fijacin que pueda ser usado para todos los sustratos no ha sido descrito. La fijacin y el pretratamiento de tejidos debe ser optimizado para distintas aplicaciones. b) Tejidos embebidos y su seccionamiento. El seccionamiento de los tejidos puede ser realizado en un criostato o embeber la muestra en una matriz para despus cortarla con un microtomo. Excelentes resultados se han obtenido seccionando la muestra con el criostato y la ventaja de ste mtodo es que permite la posibilidad de fijar despus de seccionar. El seccionamiento de tejidos embebidos, tiene algunas ventajas, incluyendo una buena preservacin en la morfologa del tejido, al igual que los cortes finos de las secciones favorecen la orientacin correcta y se pueden obtener rodajas seriadas al cortarlo. La parafina es el medio ms popular para embeber tejidos, pudiendo obtener cortes menores a 1 m. Posteriormente la parafina puede ser disuelta totalmente del tejido antes de la hibridacin, empleando xileno e hidratando gradualmente con alcohol. Las secciones muy delgadas tienen la desventaja de que emiten poca seal. El grosor de las secciones usada commnete es de 6-10 m. sto hace posible que las secciones puedan ser montadas en laminillas e hibridarlas en solucin. Los tejidos embebidos en plstico permiten cortar secciones delgadas como lo requiera la microscopa electrnica. Los tejidos se congelan en nitrgeno lquido y se mantienen a -80C, pueden ser seccionados desde 5 m y fijados en acetona fra o 95% etanol por 30 minutos antes de la hibridacin. Este mtodo no es el ms recomendable para la hibridacin in situ porque la morfologa de los tejidos no se conserva. Todos las secciones deben ser puestas en laminillas de vidrio cubiertas con poli-L-lisina, con el fin de que la muestra tenga una adherencia adecuada y no se desprenda durante el procesamiento. De sto de hablar ms ampliamente en la sigueinte seccin. Para hibridacin in situ de RNA se deben utilizar guantes estriles al momento de cortar los bloques y cada vez que se haga un nuevo corte se

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debe de cambiar la navaja por una nueva con el fin de reducir la contaminacin por RNAsas. VII. TRATAMIENTO DE LA LAMINILLA. Las laminillas se tratan para que tengan la capacidad de adherir las clulas o tejidos y puedan ser retenidos durante los pasos subsecuentes de la hibridacin in situ. Existen mtodos distintos incluyendo el uso de cromo-alum gelatina, poli-L-lisina o aminopropiltrietoxisilina (TESPA). Se ha encontrado que este compuesto proporciona una fuerte adherencia. Alternativamente las laminillas se venden cargadas positivamente dando una buena adherencia. VIII. PRE-TRATAMIENTO DEL TEJIDO. Antes dela hibridacin, el tejido debe tener un pretratamiento para que incremente la eficiencia de la hibridacin y minimice los pegados inespecficos: a) Los tejidos o secciones son usualmente tratadas con solventes orgnicos (etanol o metanol) para permeabilizar las clulas removiendo las membranas lipdicas. Los tejidos que estn embebidos en cuelquier polmero, es necesario removerlo antes de la hibridacin. b) Tratamiento con proteasas para facilitar la accesabilidad al RNA de inters. La digestin con proteasas es un paso crtico; una digestin insuficiente o la sobredigestin puede afectar sustancialmente la intensidad de la seal as como la morfologa. La digestin es seguida de una refijacin, de lo contrario la desintegracin del tejido ocurrir. El tratamiento con proteasas mejora la seal obtenida de una sonda mayor a 100 pb (Wilkinson, 1999). El tiempo ptimo de tratamiento con proteasas debe ser determinado, ya que difiere entre distintos tejidos. Un problema de procesamiento de un ebrin entero es que las proteasas no penetran hasta los tejidos internos y por tanto la digestin es menos eficiente que en la superficie. Una alternativa a este problema es tratar al tejido con una mezcla de detergentes. Esto es ms fcil de controlar pero es menos efectivo que el tratamiento con proteasas. Las proteasas ms utilizadas hoy en da para desenmascarar al mRNA blanco son la proteinasa K, pepsina, tripsina, pronasa E y colagenasas. Generalmente un procedimiento bueno es digerir las secciones despaarafinadas por 15 a 30 minutos a 37 C en 10 g/ml de proteinasa K en 50 mM Tris/HCl, pH 7.5. El tiempo de digestin depende del tipo de tejido. La concentracin de la enzima y la duracin de la digestin debe ser ajustado empricamente, dependiendo del tipo de tejido y duracin de la fijacin. El control de la temperatura es una consideracin importante. El reducir la temperatura de digestin inadvertidamente e incrementa el ruido de fondo y presenta variacin dentro y entre especmenes. La digestin se puede llevar

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a cabo en un bao a 37C adicionandole la cantidad requerida de enzima, para posteriormente sumergir la laminilla donde esta fijada la muestra. El introducir la laminilla en la solucin de digestin baja la temperatura del bao, entonces se tiene que esperar hasta que ste alcance 37 C y a partir de ese momento se empieza a contar el tiempo de digestin. El proceso de digestin se para lavando la laminilla en una solucin salina, la cual puede ser Trisbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl). Se ha demsotrado que el uso de la pepsina ha dado excelentes resultados con secciones de tejidos embebidos en parafna y fijados con formalina. La digestin con pepsina involucra la incubacin de las preparaciones 30 minutos a 37C en 200 mM HCl conteniendo 500 g/ml de pepsina. La digestin puede pararse lavando las laminillas con Tris buffer salino (TBS) o buffer fosfato salino (PBS) a pH 7.5. El desenmascaramiento enzimtico no es adecuado si se requiere una alta sensibilidad, como por ejemplo una deteccin de una copia simple del virus del papiloma 16 (HPV). Algunas otras hidrolasas como la colagenasa y la dispasa pueden ser utilizadas si por ejemplo las preparaciones son de tejido conectivo o hgado pero stas dan un alto ruido de fondo. Tambin se han utilizado ciclos de congelamiento y descongelamiento para mejorar la penetracin de la sonda en el tejido. Algunos otros pre-tratamientos son: c) Inactivacin endgena enzimtica. Cuando hay una enzima es usada como marca, la actividad enzimtica endgena puede ser inactivada. Ejemplo, para el caso de peroxidasa la muestra es tratada con 1% perxido de hidrgeno en metanol por 30 minutos. Para la fosfatasa alcalina, el levamisol puede adicionarse a la solucin sustrato anque esto no es necesario ya que la actividad residual de la fosfatasa alcalina se pierde durante la hibridacin. d) Tratamiento con RNAsas. Sirve para remover RNA endgeno y puede mejorar la seal en hbridos DNA-DNA. Este tratamiento puede ser usado como control en hibridaciones de mRNA. Se lleva a cabo incubando la preparacin con RNAsa (100 g/ml) en 2X SSC a 37C por 1 hora. (SSC=150 mM NaCl, 15 mM citrato de sodio pH 7.4). e) Tratamiento con HCl. En algunos protocolos se trata la muestra de 20 a 30 minutos con 200 mM HCl. La accin precisa que provoca el cido es desconocida pero la extraccin de protenas y la hidrlisis parcial de las secuencias blanco puede contribuir a un mejoramiento en la seal. f) Tratamiento con detergentes. Las preparaciones pueden ser pretratadas con tritn X-100, SDS u otro detergente si los componentes de la membrana lipdica no han sido extrados por otros procedimientos como fijacin, deshidratacin, incrustacin e inactivacin endgena de la enzima.

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g) Se pueden evitar enlaces de sondas no especficas con grupos amino cargados positivamente por acetilacin de estos residuos con cido actico anhidro o trietanolamina. h) Para llevar a cabo la hibridacin de tejidos enteros se tiene que hacer una prehibridacin. sta contiene todos los componentes de la hibridacin excepto la sonda y el dextrn sulfato. Esto se hace con el fin de bloquear sitios de enlace no especficos. Para secciones tisulares, la deshidratacin es realizada gradualemnte (70, 80, 95 y 100%) y la sonda es absorbida. Se han encontrado que los pasos de prehibridacin no son necesarios para secciones tisulares. El problema que genera la prehibridacin es que diluye la sonda, decrementando la seal. i) Para los blancos de DNA de doble cadena, se desnaturaliza con calor. Lo anterior es esencial para evitar la degradacin de los cidos nuclicos blancos por nucleasas durante los pasos de pre-hibridacin. Esto es especialmente importante si el RNA es el blanco ya que estas molculas tienen una alta susceptibilidad a la degradacin por ribonucleasas. Las ribonucleasas deben ser inactivadas por tratamientos con DEPC, trabajando con soluciones autoclaveadas y tomando precauciones que el tejido no se contamine con RNasas. IX.PRE-HIBRIDACIN. Desnaturalizacin de la sonda y su blanco. Para la hibridacin in situ el DNA cromosomal y el DNA blanco deben ser desnaturalizados. En general algunos tratamientos pueden causar la prdida de morfologa por lo que se debe de llegar al compromiso entre la sonda de hibridacin y la morfologa. Las desnaturalizaciones alcalinas han sido usadas tradicionalmente. La desnaturalizacin por calor ha llegado a ser popular, por su simplicidad experimental y por eficacia. La variacin, tiempo y temperatura debe ser evaluada encontrando las mejores condiciones para desnaturalizacin. Para la desnaturalizacin por calor, la sonda y el DNA cromosomal blanco puede ser desnaturalizado simultneamente. Para llevar a cabo esto, se pone la sonda en la laminillas y recubre. Sube la temperatura a 80 C por dos minutos y despus se enfra a 37C. Para tejidos seccionados, si es necesario, se extiende el tiempo de desnaturalizacin a 10 minutos. Para la hibridacin competitiva, la sonda marcada compite con el DNA no marcado. Para desnaturalizar se sube la temperatura (hasta 80C), una vez que el DNA cromosmico se ha desnaturalizado, se baja la temperatura, para que se lleve a cabo la competencia.

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X. HIBRIDACIN. La hibridacin se realiza bajo condiciones ptimas que permiten la renaturalizacin de la sonda al cido nucleico (blanco) en el tejido. El tejido es lavado para remover las sondas que no se hibridaron. La hibridacin depende de la capacidad que el DNA desnaturalizado tenga para renaturalizarse con la cadena complementaria justo por debajo de su Tm (temperatura de fusin). La Tm es la temperatura a la cual la mitad del DNA est presente en cadena sencilla (forma denaturalizada). La Tm puede ser calculada midiendo la absorcin a 260 nm. La estabilidad del DNA es dependiente del contenido de GC. Mientras el DNA tenga mayor contenido de GC, la Tm ser ms alta. La Tm est influenciada por varios factores: a) Naturaleza de la sonda y sus blancos. Los hbridos RNA-RNA son ms estables que RNA:DNA que a su vez son ms estables que los hbridos DNA:DNA. Cada tipo de sonda posee distintas ventajas y desventajas, las cuales requieren consideraciones para hacer una buena prueba de hibridacin in situ. Por ejemplo, las sondas de oligonucletidos tienen baja especificidad, aunque pueden ser los nicas que detectan el cambio en una base. Este tipo de sondas son poco sensibles ya que poseen pequeo tamao, y al ser incorporadas al blanco la estabilidad del hbrido disminuye. La sonda de doble cadena de DNA se sintetiza de manera ms sencilla y es ms resistente a la degradacin, pero puede ser de las menos sensibles por las renaturalizaciones que ocurren con las sondas marcadas . En general las sondas de DNA o RNA deben ser menores a 400 pb, para facilitar la penetracin al tejido. Oligonucletidos pequeos (15 a 40 nucletidos) pueden ser usados como sondas pero es difcil amplificar la seal. Los oligonucletidos poseen problemas adicionales desde un punto de vista cintico, porque algunas bases estn comprometidas a puentes de hidrgeno para estabilizar al hbrido por lo que los oligos pueden ser fcilmente disociados durante el proceso. Ambas reacciones de acomplamiento enzimtico y directo pueden ser usadas para marcar oligos. En general los oligos pequeos son marcados por tailing 3 con unas series de bases: biotina, DIG o 2,4 dinitrofenil. ste ltimo provee de muy buena seal. Las sondas deben unir regiones nicas en el DNA o RNA blanco. Algunos programas computacionels como Oligo 5.0 (Molecular Biology Insights, Inc. Cascade Co.) son muy tiles para identificar regiones probables de pegado en una secuencia dada. El largo de la sonda puede influenciar la calidad de los resultados. Sondas largas ofrecen la ventaja de incrementar la amplificacin de la seal porque de un gran nmero de nucletidos marcados y bajas tasas de disociacin debido a un extenso nmero de residuos comprometidos a formar puentes de hidrgeno.

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Tabla 2. Ventajas y desventajas entre las sondas que se pueden utilizar para la hibridacin in situ
Sondas Ventajas Desventajas
Necesitan secuencias subclonadas en un vector requiriendo biologa molecular; puede renaturalizarse ella misma bajando la eficacia de pegado despus de la desnaturalizacin. Solamente una cadena (antisentido) esta disponible para la hibridacin a mRNA. Problemas en la penetracin de sondas muy largas al tejido; el vector de la secuencia puede producir hibridacin no especfica Susceptibilidad a la degradacin por contaminates (RNasas), por tanto se requieren medidas para minimizar este tipo de problemas. Pegados muy fuertes con respecto a las sondas de doble cadena de DNA, incrementa el ruido de fondo; las sondas muy largas presentan problemas de penetracin al tejido Baja sensibilidad en la deteccin debido a su alta especificidad. Los hbridos son menos estables debido al tamao pequeo, por tanto los lavados muy astringentes decrementan la intensidad de la seal

ds cDNA (DNA doble cadena complementaria)

Estables, marcadas fcilmente por random priming, nick translation o PCR; alta actividad especfica, buena deteccin por una gran nmero de marcas incorporadas

ss RNA (cadena sencilla de RNA)

Cadena sencilla, alta actividad especfica, sintetizada fcilmente y marcada por transcripcin in vitro. Gran estabilidad de hbridos RNA:RNA, alta especificidad en la hibridacin, los lavados pueden ser muy astringentes. El antisentido entero es aprovechado para formar hbridos Largas, definidas, cadena sencilla, sintetizada fcil y rpidamente; excelente rendimiento en cuanto a penetracin; capacidad para diferenciar secuencias muy parecidas

Sondas de oligonucletidos

a) Largo de la sonda. Las sondas largas forman hbridos ms estables como ya se habl anteriormente. b) La composicin de la sonda. Dos puentes de hidrgeno en cada par de bases A:T/U, y tres puentes de hidrgeno en cada par de base G:C. por lo tanto, el alto contenido de GC propicia una Tm alta.

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c) Identidad. La identidad de la secuencia entre la sonda y el blanco. Si la sonda es divergente es la secuencia de pegado, esto formar hbridos menos estables que las sondas homlogas. El efecto en la Tm es mayor para sondas pequeas. d) Composicin de la solucin de lavados de la hibridacin. Altas concentraciones de cationes monovalentes, como iones de sodio, incrementa la estabilidad de los hbridos. Los cationes monovalentes interactan electrostticamente con los grupos fosfaos de los cidos nucleicos. La repulsin electrosttica entre las dos cadenas del duplex disminuye con una alta concentracin de sal. Bajas concentraciones de sales afectan la Tm al igual que la tasa de renaturalizacin. La concentracin de iones de sodio por arriba de 0.4 M afectan ligeramente la tasa de renaturalizacin y la Tm. e) Desnaturalizacin del DNA. El DNA se desnaturaliza entre 90-100C en 0.1-0.2M NaCl. Para la hibridacin in situ implica que la preparacin microscpica puede ser hibridada a 65-75C por periodos prolongados. Esto puede deteriorar la morfologa. Afortunadamente los solventes orgnicos reducen la estabilidad trmica de la doble cadena, por lo que la hibridacin puede ser realizada a bajas temperaturas en presencia de formamida. La formamida ha sido por aos el solvente orgnico por excelencia. sta reduce la Tm de los duplex DNA-DNA y DNA-RNA 0.6-0.72C por porcentaje de formamida; tambin reduce el ruido de fondo en la hibridacin. La hibridacin puede realizarse entre 30-40C con 50% formamida presente en la mezcla de hibridacin. La tasa de renaturalizacin decrementa en presencia de formamida. La Tm del hbrido en presencia de formamida puede ser calculada de acuerdo a la siguiente ecuacin: Para 0.01-0.2M NaCl Tm=16.6 log M + 0.41 (GC) + 81.5-0.72 (% de formamida) Para concentraciones de NaCl por encima de 0.4M Tm= 81.5 + 0.41 (GC) 0.72 (% de formamida) Para obtener un mayor incremento en la hibridacin in situ para rDNA se utiliza 70% de formamida a 37C. Durante el proceso de hibridacin, grandes cantidades de DNA pueden perderse (Raap et al., 1986). f) pH. Desde un rango de 5-9 la tasa de renaturalizacin es independiente de pH.

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g) Temperatura. La tasa mxima de renaturalizacin de DNA es a 25C. Se puede llevar a cabo en el rango que va desde 16C hasta 32C por debajo de la Tm. Para los experimentos de hibridacin, se han desarrollado frmulas para predecir la Tm. Todo esto es aplicable a hbridos en solucin, donde los hbridos formados por el entrecruzamiento de los cidos nuclicos presentes en el tejido son menos estables, presumiblemente porque los impedimentos estricos no permiten la renaturalizacin de la sonda en toda su extensin. Los hbridos RNA:RNA formados durante la hibridacin in situ tienen una Tm cerca de 5C menos que los hbridos formados en solucin. (a) Hbridos DNA:DNA (sondas de DNA con ms de 22 bases):
Tm=81.5+16.6 log(molaridad de cationes monovalentes)+41(fracciones G+C)-500 largo de la sonda en bases-0.62 (% de formamida)

(b) Para deoxioligonucletidos entre 14 y 20 pares de bases, bajo condiciones standard (0.9 M NaCl), es usada para estimar la temperatura de hibridacin. sta se lleva acabo entre 10 y 15C por debajo de la Tm calculada:
Tm=4(suma de G+C) + 2 (suma de A+T)

(c) RNA:RNA. Para las osndas de RNA:RNA la siguiente frmula ha sido usada para calcular la Tm
Tm= 79.8+18.5log(molaridad de cationes monovalentes)+58.4(fracciones G+C)+41.8 (fracciones G+C)2-820 (largo de las sondas en bses)-0.35(% de formamida)

Para RNA:DNA, el ltimo trmino es reemplazado por 0.5% ede formamida. La cintica de la hibridacin in situ no es an bien conocida, especialmente porque esta influenciada por la accesibilidad de la sonda, tambin depende del entrecruzamiento en el tejido, el tamao de la sonda y para el mRNA, las posibles estructuras secundarias. Los siguentes factores son importantes: (a) Concentracin de la sonda. La alta concentracin de la sonda asegura una tasa alta de renaturalizacin, que por otro lado incrementa el ruido de fondo. La concentracin ideal de la sonda y la tasa de hibridacin se pueden incremenatr utilizando un agente como el dextrn sulfato.

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(b) Dextrn sulfato (5 al 10%). En soluciones acuosas el dextrn sulfato est fuertemente hidratado. Esto resulta en un incremento en la concentracin relativa de la sonda porque el agua interacta con el dextrn sulfato, aumentando la tasa de hibridacin. El dextrn sulfato incrementa tambin la viscosidad de la solucin de hibridacin, por eso decrementan la tasa a la cual la sonda pueda difundirse hacia su secuencia blanco. (c) Selectividad de la hibridacin. Durante la hibridacin se forman dplexes entre bases correctamente apareadas y con menos frecuencia con otras bases que no corresponden a su complementaria. Esto puede ser manipulado por la selectividad de la hibridacin in situ. Para remover el ruido de fondo asociado de hbridos no especficos se somete a lavados con una solucin con baja concentracin de sal. La baja concentracin de sal y la alta temperatura inducen una alta selectividad en el lavado, ya que esto desestabiliza el dplex. Las fuerzas repulsivas de los enlaces fosfodister cargados negativamente estn expuestos, por lo que si no hay suficiente concentracin de sales, no tendr la capacidad de neutralizar las cargas y por tanto habr una alta selectividad. nicamente las bases correctamente aparaeadas podrn contender con las fuerzas repulsivas. (d) Bases mal apareadas. Resultan en la reduccin tanto de la tasa de hibridacin como en la estabailidad trmica del dplex resultante. Para tener una fuerte discriminacin entre secuencias de DNA cercanamente relacionadas, se hibrida bajo condiciones astringentes. En promedio la Tm decrementa cerca de 1C por base mal apareada en sondas largas. El mal apareamiento de las bases en oligonucletidos influencian fuertemente la estabilidad del hbrido. (e) El tamao de la sonda. La tasa de renaturalizacin del DNA en solucin es proporcional a la raza cuadrada del tamao del fragmento (cadena sencilla). La tasa de mxima hibridacin es obtenida con sondas largas. La siguiente frmula relaciona a fragmentos cortos y largos con el cambio en la Tm (cadena doble): El cambio en la Tm * n = 500 Donde n=nucletidos. XI. LAVADOS POST-HIBRIDACIN. Los lavados de las muestras hbridadas se llevan a cabo para remover sondas no especficas. Los requerimientos crticos son: usar las condiciones apropiadas de selectividad para remover nicamente las sondas inespecficas. La astringencia (moderada a alta se lleva a cabo en los lavados post-hibridacin (subiendo la temperatura por debajo de la Tm). sto es

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importante saberlo porque sondas pequeas o sondas ricas en AT tendrn poca seal si se lavan con una alta astringencia. Para los sondas de RNA, los lavados pueden llevarse a cabo con ribonucleasas, degradando todas las cadenas sencillas, dejando nicamente los hbridos de doble cadena, aumentando la especificidad y bajando el ruido de fondo. Para remover las sondas que hayan hibridando con secuencias heterlogas, es necesario aplicar un lavado altamente selectivo que asegure que la seal que estamos percibiendo es de secuencias homlogas. XII. DETECCIN. El paso final de la hibridacin in situ es la deteccin de la sonda marcada en el tejido. El mtodo para sto depende del tipo de marcaje que ha sido incorporada en la sonda. a) Sondas radioactivas. Para las sonda radioactivas marcadas con 35S se puede obtener una baja resolucin en la seal, poniendo la laminilla de hibridacin encima de un film de rayos-X durante toda la noche. Esto puede ser til para obtener rpidos resultados, cuando se conocen las ptimas condiciones, pero la resolucin es tan baja que no puede ser til para otros propsitos. Una mejor resolucin es obtenida sumergiendo la laminilla de una emulsin, la cual es secada y expuesta a 4C. Algunos factores afectan la calidad de los resultados obtenidos por este mtodo: i) El grado de emulsin. Los grados altos son ms sensibles pero dan una resolucin muy pobre en la seal. ii) El espesor de la emulsin. Para 35S, una capa fina de emulsin proporciona una buena seal pero baja rresolucin. iii) Almacenamiento y vida media de la emulsin. La emulsin puede ser aislada de radiacin para evitar un alto rudio de fondo por granos de plata. Adems los granos de plata son generados por un mal manejo (estrs mecnico) por lo que la emulsin debe ser tratada sin moviemientos bruscos. El secado de las laminillas no debe ser muy rpido. iv) Condiciones de exposicin. La temperatura y las condiciones de humedad afectan la eficiencia de la autorradiografa. v) Tiempo de exposicin. Se debe evitar la sobreexposicin ya que sto causa una reduccin en la seal radioactiva. vi) Condiciones para revelarla. El uso de altas temperaturas, agitacin de las laminillas o un tiempo largo para desarrollar grandes campos de granos de plata, ocasiona una baja resolucin.

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Despus el tejido es teido, usualmente con una tincin nuclear como azul de toluidinda. Altas densidades de granos de plata pueden ser observados bajo microscopa de campo claro o en un microsopio de luz, pero la visualizacin ms sensible pere detectar los granos de plata es usar la iluminacin de campo oscuro. Un problema con sto es que el tejido est teido y puede ser difcil correlacionar la seal con clulas especficas. Por eso es que se sobrepone la seal del tejido, tomando una doble exposicin fotogrfica, en el canal rojo, de los granos de plata bajo campo oscuro, encima de una imagen de campo claro. b) Sonda marcadas con haptenos. La localizacin de sondas marcadas con haptenos pueden ser visualizadas por microscopa de fluorescencia, si la sonda es marcada con un fluorforo o indirectamente con un anticuerpo conjugado. Estas tcnicas funcionan muy bien para hibridacin in situ cromosomal y ofrecen un gran flexibilidad para detecciones simultneas de secuencias mltiples, pero slo son suficientemetene sensibles para la deteccin de mRNAs abundantes. Un mtodo ms sensibles es amplificar la seal usando una enzima acoplada a un anticuerpo o una protena por la cual el sustrato cromognico est disponible para generar un producto insoluble colorido. Los anticuerpos mayormente usados son anti-DIG o anti fluorescena conjugados a fosfatasa alcalina (AP), usando NTB-BCIP como sustrato. La alta estabilidad de esta enzima permite amplificar la seal. Una variedad de otros sustratos estn disponibles, deteniendo productos coloridos: rojo, magenta, verde fluorescente, pero estos son menos sensibles que NTB/BCIP. La -galactosidasa es una enzima estable y con X-gal como sustrato es comnmente usada adems del conjugado a estreptavidina. La peroxidasa de rbano es menos estable y puede ser usada para pequeas reacciones cromognicas. Antes de la incubacin con diluciones de anticuerpos conjugados antihaptenos, los tejidos a hibridar son princubados con una solucin que contiene detergentes y otros agentes que bloquean el pegado indespecfico del anicuerpo. El tejido es entonces incubado con el anticuerpo a una ptima concentracin; si el anticuerpo est muy diludo la seal se perder, pero si est en exceso causar un alto ruido de fondo. Lavados extensivos con buffer que contiene detergentes, como 0.1% de Tritn X-100, es entonces llevado a cabo para remover anticuerpos no unidos. Las altas concentraciones de detergentes pueden causar una baja en las interacciones especficas de anticuerpos, y por tanto decrementa fuertemente la seal. Finalmente la reaccin cromognica es llevada a cabo equilibrando el tejido con el sustrato cromognico que es convertido por la enzima en un producto colorido insoluble. Es importante saber que no hay algunas enzimas endgenas que pueden generar el producto. Para el caso de la fosfatasa alcalina, la levamisola puede ser includa en la reaccin ya que esta inhibe otras

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fosfatasas distinta a la fosfatasa alcalina conjugada al anticuerpo. En muchos tejidos sto no es necesario, pero en otros casos, pueden existir fosafatasas endgenas que no son afectadas por este inhibidor; entonces estas pueden ser inactivadas por calor o por tratamiento con cido antes de la incubacin con un anti-hapteno. Si la peroxidasa es usada para la reaccin cromognica, la peroxidasa endgena debe ser inactivada, preincubando con perxido de hidrgeno. Por otro lado altas temperaturas son usadas durante la hibridacin y los lavados inactivan las peroxidasas endgenas y muchas fosfatasas. Algunos protocolos incluyen una incubacin con H2O2. XIII. TCNICAS DE DOBLE TINCIN La deteccin mltiple de secuencias gnicas en cromosomas es invaluable para el anlisis de su organizacin fsica y esto puede ser llevada a cabo por uso de anticuerpos anti-haptenos anclados a diferentes fluorocromos. La deteccin de algunos productos gnicos es til para relacionar la expresin de un gene particular en un tipo celular o dominios espaciales marcados por la expresin de un gen. La hibridacin in situ puede ser combinada usando sondas radioactivas con otro mtodo de deteccin, pero una detccin mltiple puede ser realizada por sondas marcadas con diferentes haptenos que son detectados con anticuepos conjugados a enzimas. Dos enzimas distintas pueden ser usadas para las reacciones cromognicas, pero debido a la alta estabilidad de la fosfatasa alcalina, el mtodo comunmente usado es la deteccin de la sonda con un anticuerpoperoxidasas usando sustratos que permitan diferenciar los productos coloridos. Alternativamente la hibridacin in situ puede ser combinada con inmunohistoqumica para detectar protenas especficas u otros antgenos. La deteccin de un producto gnico no puede comprometer la deteccin subsecuente del otro. Una limitacin de stos mtodos es que solamente es posible detectar seal bajo condiciones ptimas. Los principales problemas son que un color puede fcilmente enmascarar a otro y/o el producto formado no permite el acceso de otro reactivo. Adems, muchos de los sustratos disponibles son menos sensibles o dan mayores tinciones inespecficas que el NTB/BCIP. Una posibilidad es usar fluorocromos conjugados a anticuerpos si son lo suficientemente sensibles. Estas limitaciones se resolvern con el desarrollo de sustratos y nuevas enzimas y/o desarrollando fluorocromos ms intensos y sensibles. En el futuro, sto ser posible, generando cidos nuclicos modificados que permitan la deteccin espectroscpica de hbridos en tejidos vivos. La hibridacin in situ puede ser sombinada con tcnicas que revelan aspectos de fisiologa celular as como la organizacin y la deteccin de un linaje celular. Tambin se puede detectar la proliferacin celular por la incorporacin in vivo de 5-bromodeoxiuridina dentro del DNA. El diseo de algunos protocolos estn en funcin de la deteccin, por ejemplo si la

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deteccin de un linaje celular con molculas fluorescentes que se intercalan en la membrana lipdica, la fotoconversin de esta seal en una tincin permanente tiene que realizarse antes de la hibridacin in situ. XIV. CONTROLES La seal puede surgir no slo de los sitios de hibridacin de la sonda sino tambin de otros lugares. Es importante que los controles apropiados estn presentes para evaluar la especificidad de la seal. Los siguientes puntos son posibles causas de seales inespecficas: a) Hibridacin cruzada con secuencias de cidos nuclicos inespecficas i) Se deben de tomar precauciones en el diseo de la sonda para minimizar la posibilidad de una hibridacin con secuencias relacionadas. Evaluar si el mismo patrn es observado usando sondas con regiones distintas del trnscrito. ii) Si se est usando una selectividad moderada, la posibilidad de que la hibridacin cruzaada ocurra en estas condiciones puede ser evaluada observando si el mismo patrn de expresin es detectado con una mayor astringencia o si se usa una sonda de RNA despus de un tratamiento con RNasa post-hibridacin. iii) Averiguar si la sonda no hibrida inespecficamente bajo las condiciones selectivas adoptadas en el protocolo. Esto puede ser probado con un Southern-blot o Northern-blot. b. Enlaces inespecficos de la sonda. i) Un control usulamente usado para la hibridacin especfica del mRNA es usar una cadena sencilla sentido inespecfica al RNA blanco. Una alternativa vlida es usar una sonda de expresin gnica distinta y en el caso de oligonucletidos usar una secuencia tipo scrambled como sonda. ii) Un tratamiento pre-hibridacin del tejido con RNasa el cual remover el RNA blanco. Si la seal es an generada, entonces es probable que la sonda se est pegando a otros componentess celulares. Este control es conveniente para las sondas de DNA, pero si la sonda es de RNA debe de tomarse en cuenta que las RNasas no degraden la sonda iii) La inclusin de un exceso de sonda no marcada que decrementar drsticamente la seal especfica, pero si el efecto es mnimo, seguramente existe un enlace no especfico entre la sonda y otros componentes celulares. iv) Si la seal es generada despus de omitir la sonda puede ser debido a los enlaces inespecficos de los agentes de deteccin. c. Generacin inespecfica de la seal. i) Para sondas radioactivas la seal puede ser generada debido al estrs mecnico o quimiografa de la emulsin fotogrfica. La seal an estar presente despus de omitir la sonda.

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ii) Para sondas marcadas con haptenos detectados con anticuerpos conjugados a enzimas, la seal puede ser generada por enzimas endgenas. Esto puede evaluarse por controles en los cuales la sonda y el anticuerpo no estn presentes. Aqu son listados algunos artefactos ms comnes y sus posibles soluciones. a) Ruido de fondo sobre la laminilla (sondas radiactivas). ste es el ms frecuente debido a la emulsin. Evaluar la emulsin sumergiendo una laminilla blanca. Un ruido de fondo muy alto, puede aparecer en las orillas de la laminilla debido al secado muy rpido de la sonda durante la hibridacin, evitando tener secciones de tejido cerca de las orillas de la lmina. b) Ruido de fondo en los lmittes del tejido (sondas radioactivas). Granos de plata pueden ser detectados alrededor del tejido por estrs menico durante el secado. El secado de la emulsin debe ser muy lento reemplazandol por un plato fresco. c) Ruido de fondo uniforme sobre el tejido. ste es el mayormente causado por enlaces no especficos de la sonda, el cual puede ser debido a: i) Para sondas de RNA, la secuencia del plsmido ha sido transcrita. ii) La sonda es muy larga o muy pequea. iii) La concentracin de la sonda es muy alta (o tan pequea que el ruido de fondo llega a ser un factor imitante despus de una larga exposicin (reaccin colorimtrica). iv) La baja selectividad de los lavados en la hibridacin v) Si la digestin post-hibridacin con ribonucleasas est actuando sobre la sonda de RNA. vi) La sonda es enlazada a un componente celular. Esto amerita evaluar una regin distnta en el mismo gene. Se evita usar sondas que sean ricas en GC. d) Ruido de fondo sobre tejidos especficos. Ciertos tejidos parecen favorecere ms el pegado de la sonda que otros. Tratando diferente a la sonda o ajustando la concentracin, la hibridacin y/o las condiciones de lavado puede ayudar. e) Ruido de fondo con sondas marcadas con haptenos. Puede ser debido a: i) Alta concentracin del anticuerpo anti-haptenos. ii) Bloqueo insuficiente de sitios de pegado inespecfico antes de la hibridacin. Condiciones muy astringentes en los lavados al igual que en las de bloqueo. iii) Presencia de enzimas endgenas que pueden catalizar la seal de detccin. El uso de inhibidores a una alta temperatura o con cidos pueden ser usados para inactivar ciertas enzimas endgenas.

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iv) Sondas marcadas con biotina, la presencia de haptenos endgenos en el tejido, pueden causar un alto ruido de fondo. v) Durante la hibridacin, la sonda y el anticuerpo pueden quedarse atrapados en cavidades del tejido lo cual ocasiona un ruido de fondo, para solucionar este problema, se tratan de evitar la formacin de estas cavidades usando frceps o agujas para acomodar el tejido antes de la hibridacin. f) La baja seal puede ser debida a: i) Degradacin del blanco. La contaminacin con nucleasas puede ser evitada en las soluciones y recipientes usados para la pre-hibridacin y los tejidos pueden ser fijados fcilmente. ii) La fijacin del tejido y/o el tratamiento con proteasas no es ptimo. iii) Baja eficiencia en el marcaje de la sonda. Checar si sto no es un problema de los nucletidos marcados y que la concentracin sea correcta en la reaccin de marcaje. iv) El tamao de la sonda (muy larga o muy corta) v) La baja concentracin de la sonda vi) La alta selectividad de los lavados en la hibridacin vii) Una abundancia baja del blanco. Los factores limitantes sern sensibles al mtodo y al ruido inespecfico. Si es posible es recomendable una sonda larga. XV. FOTOGRAFA La fotografa de los datos de hibridacin in situ es un paso crucial para obtener un buen registro de los datos. Las fotografas de baja calidad pueden ser tomadas usando un microscopipo de diseccin, pero un microscopio compuesto es requerido para las fotos de buena calidad. Es fundamental tener un microscopio equipado con los filtros y lentes apropiados: por ejemplo, contraste diferencial (DIC, Nomarski) de se desea visualizar clulas sin tincin, iluminacin epifluorescente para visualizar los granos de plata. Las secciones de tejidos son montadas en glicerol al 70% y algunas veces sto puede ser til para disectar parcialmente al tejido y la seal es visualizada fcilmente. La pelcula correcta debe ser usada. Para microscopa de campo claro y oscuro, pelculas de alta resolucin ASA de 64 o 100 son usadas. Para imagenes de baja intensidad fluorescente es preferible usar pelculas ms sensibles. Las fotografas blanco y negro son tomadas usando pelculas negativas. Para fotografas de color es mejor usar slide film ya que estas pueden ser usadas directamente para presentaciones y es fcil obtener el balance de color correcto. Es muy importante conocer como se usa el microscopio correctamente y como tomar fotografas con la exposicin correcta en la cual la muestra es correctamente orientada, enmarcada y enfocada. Las imgenes pueden ser registradas directamente del microscopio o por scaning de la fotografa, y esto aumenta y realza la generacin de figuras.

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XVI. MICROSCOPA a) De campo claro. Las imgenes son obtenidas por transmisin directa de luz a travs de la muestra. La evaluacin de los resultados de hibridacin in situ por microscopa de campo claro es preferida para muchas aplicaciones rutinarias porque las preparaciones son permanentes. Por otro lado la sensibilidad demandada para muchas aplicaciones requiere de microscopa ms sosfiticada (ejemplo: localizacin de una copia de un gen, requiere el deteccin de atogramos de DNA). b) De campo oscuro. La luz dispersa entra a los lentes del microscopio, por tanto el material aparece como un objeto iluminado en un fondo negro. Esta microscopa es extensivamente usada para experimentos radioactivos porque el campo puede ser examinado a una magnificacin baja. La distribucin de los granos de plata pueden ser vistos con un gran contraste. Este tipo de microscopa es usada rara vez para localizar productos con marcaje radioactivo. c) De contraste de fases. Explota los efectos de la interfase producida cuando dos sets de onda se combinan. ste es el caso cuando la luz pasa a travs de una parte delgada o densa de la clula (como el ncleo) y es retrasda. En consecuenia su fase es cambiada relativamente a la luz que pasa por una regin adyacente (delgada) del citoplasma. La microscopa de contraste de fases es usada para deteccin enzimtica. d) Microscopa de contraste de reflexin. Es similar a la de contraste de fases. Esta tcnica mide el cambio de la longitud de onda de la luz reflejada de la muestra que de la luz emitida directamente. Bonnet hizo la observacin que con microscopa de contraste de reflexin, el producto DAB/peroxidasa produca reflexiones brillantes cuando las cantidades eran extremadamente baja. Esta propiedad hizo que esta microscopa se conviertiera en el medio para detectar una copia simple del gen sin radiactividad. Estudios de la formacin de imgenes DAB en esta microscopa han demostrado que producen mejores resultados en objetos delgados. e) De fluorescencia. Contiene una lmpara para excitar fluorforo y un filtro especial, el cual transmite un alto porcentaje de luz emitida por el fluorforo. La microscopia de fluorescencia es de gran utilidad para la hibridacin in situ no radioactiva; sta es altamente sensible. Adems sta puede ser usada para excitar tres inmunofluorforos diferentes con espectros de emisin separados (lo cual permite una deteccin mltiple). Tambin el uso de sistemas altamente sensibles facilita la cuantificacin de la seal. f) Imgenes digitales. Puede detectar seales que no pueden ser vistas con microscopa covencional. La tecnologa de procesamiento de imgenes provee de un mejoramieto dn la deteccin de la seal como medida de datos cuantificados. El sistema ms sensible hoy en da es la cmara CCD (Charge Coupled Device), que detecta fotones con una alta eficacia sobre un rango de amplio espectro de longitud de onda. Si se quieren ver imgenes en dos

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dimensiones, ste es el instrumento ideal. Para anlisis en tres dimensiones la microspia confocal es una alternativa. g) Microscopa electrnica. La resolucin de este tipo de microscopa resalta cuando los electrones en lugar de luz son usados, teniendo cortas longitudes de onda (0.004 nm). El poder de resolucin de los microscopios electrnicos ms modernos es de 0.01 nm. La resolucin de la microscopia electrnica es de 0.1 nm resuelve las estructuras finas de la clula. h) Flujo citomtrico. La velocidad donde la cual la fluorescencia de clulas individuales puede ser medido con un flujo citomtrico lo cual tiene muchas ventajas para la cuantificacin de la seal en la hibridacin in situ. XVII. ALGUNAS OTRAS TCNICAS: PRINS Es la tcnica de marcaje de DNA con un primed in situ. Consiste en usar oligonucletidos pequeos (18-22) e hibridarlos con las secuencias de inters. El oligo es renaturalizado al DNA celular. La reaccin se lleva a cabo por la incorporacin de precursores dUTP marcados con biotina o digoxigenina, usando una DNA polimerasa termoestable. Una base mal aperadad emite el blanco y la sonda produce un hbrido menos estable a nivel trmico. Adems si el nucletido esta localizado en extremo 3, no permitir ninguna enlongacin por la DNA polimerasa. a) Principios y mtodos de in situ PCR Los protocolos experimentales de esta tcnica comparten varios pasos de la hibridacin in situ, como fijacin de la muestra, permeabilizacin durante la preparacin de la muestra. i) Preparacin de la muestra. Para preservar la morfologa y permitir el acceso de los componentes del PCR en la clula, las muestras necesitan ser fijadas y permeabilizadas. Para fijar la muestra se sumerge en paraformaldhedo y formaldhedo con etanol y cido actico. Los pasos de fijacin son una varible crtica que determinan a PRINS. Las muestra que estn embebidas en parafina poseen ciertos incovenientes como impedimentos para accesar los componentes del PCR al DNA nuclear (o cDNA citoplsmico) y tambin en la preservacin de DNA o RNA. La digestin con proteasas en los tejidos, despus de la fijacin contribuye a un buen PRINS, removiendo el DNA unido a protenas, hacindo huecos en las membranas del ncleo y citoplasma. La sobre sobredigestin y la digestin ineficiente pueden dar falsos positivos o negativos. Basagra et al., han sugerido una estrategia para determinar la duracin ptima de la proteolisis de distintas muestras que involucran la evaluacin por contraste de fases. b) Amplificacin in situ. Puede llevarse acabo con clulas o tejidos fijados en solucin. En el caso de muestras en suspensin las clulas son recuperadas por centrifugacin, despus del PCR. Para el caso de las muestras en laminillas el material celular y los compnentes del PCR son

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mezclados y algunas medidas son tomadas para evitar la evaporacin. Una ventaja de las clulas en suspensin es que pueden ser lisadasy analizadas por electroforesis o Southern-blot y de esta manera comprobar si se llev a cabo el PCR. Las clulas fijadas parecen funcionar como sacos de amplificacin con membranas semipermeables que permitan al primer, a los dNTPs y a la DNA polimerasa pasar a travs del ncleo y citoplasma. En algunos casos la difusin es insuficiente y esto afecta la deteccin. Un problema recurrente con PRINS ha sido la inconsistencia de los resultados, lo cual podra deberse a las variables mecnicas (aparatos) o biolgicas. c) Deteccin de productos de PCR en la clula. La visualizacin de productos de PCR intracelulares son detectados por sondas marcadas (PCR in situ indirecto) o a travs de deteccin inmunohistoqumica de nucletidos marcados (ej. Digoxigenina-1-dUTP, fluorescena-dUTP) que han sido incorporados en los prductos de PCR durante los ciclos trmicos. PCR in situ directo suele resultar en falsos positivos, especialmente cuando se trabaja con secciones de tejido. Los falsos positivos resultan de incorporacin de oligonucletidos marcados no especficos en fragmentos de DNA. Estos artefactos exhiben seales nucleares y son evidentes en clulas apoptticas, donde la fragmentacin del DNA es una caracterstica clave. La fijacin puede incrementar el nmero de muescas (nicks) en la cadena doble o sencilla. Los artefactos en la tcnica, pueden ser reducidos por una exonucleasa o reparando nicks de DNA con una T4 DNA ligasa o usando ciclos con sondas no marcadas. sto no elimina a los falsos positivos pero es suficiente para llevar a cabo una deteccin especfica. Los mtodos indirectos usando sondas que reconocen secuencias amplificadas proveen unas mxima especificidad en la deteccin de productos de PCR intacelulares. Las sondas largas completas o sondas genmicas son usadas para incrementar el nmero de molculas reporteras y tener una buena seal. La naturaleza de los sistemas reporteros pueden influenciar la calidad en los experimentos de hibridacin in situ. Las sondas radioactivas ofrecen una alta estabilidad, aunque tambin tienen sus desventajas como el costo, etc. los sistemas colorimtricos basados en fosfatasa alcalina o peroxidasa resultan en una seal pobre lo cual aparenta una baja eficiencia de la tcnica. Los sistemas de deteccin basados en la fluorescenca han sido utilizados, pero stos no son muy recomendables para esta tcnica porque no se preserva del todo la morfologa del tejido. d) Eficiencia de PCR in situ. Muchos factores contribuyen a que la eficiencia sea baja en la amplificacin, incluyendo ciertos efectos deletreos de la fijacin con aldhedo. Para maximizar la eficiencia de los pasos de PCR, varios grupos han determinado empiricamente la temperatura de renaturalizacin, tiempos de extensin que son requeridos generalmente para relacionar las temperaturas imprecisas, etc. El incremento en la concentracin de DNA polimerasa y iones de magnesio son requeridas por

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los efectos absortivos de las laminillas o por las enzimas contaminantes que eluyen de los tejidos o superficies de las laminillas. e) PCR in situ tiene un gran nmero de aplicaciones en diagnstico. Algunos grupos han reportado que esta tcnica es excelente para detectar copias de secuencias de cidos nuclicos en clulas y para detectar pocas copias de DNA o RNA en secciones de tejido. Muchos de los estudios se han enfocado en la deteccin viral o proviral de secuencias de cidos nuclicos. Adems PCR in situ ha sido aplicado en estudios de secuencias de DNA endgeno, incluyendo copias de genes, rearreglos de genes y translocaciones cromosomales y para mapear un bajo nmero de copias en los cromosomas metafsicos. Recientemente se ha reportado la deteccin de un bajo nmero de copias de mRNA y RNA virales. En la tabla 3 se muestran las aplicaciones de la tcnica PCR in situ. Tabla 3. Aplicaciones de la hibridacin in situ
DNA/RNA extrao Blanco DNA lentivirus DNACitomegalovirus DNA Papilloma virus humano DNA Virus de inmunodeficiencia humana (HIV) DNA Virus de tumores mamarios de ratn (MMTV) RNA virus de hepatitis C (HCV) DNA virus de hepatitis B (HBV) DNA virus de herpes simplex (HSV) DNA virus JC DNA Virus humano T-linfotrpico (HTVL) DNA virus de inmunodeficiencia en simios (SIV) DNA Pneumocystis carinni DNA Mycobacterium tuberculosis Mutaciones fibrosis qustica Rearreglos de genes Translocaciones cromosomales Mapeo de cromosomas mRNA lipoxigenasa-12 mRNA metaloproteinasa mRNA Factor neural de crecimiento (NGF) Receptor de cator de crecimiento epidrmico mRNA (EGFR) mRNA granzima, mRNA perforina mRNA Factor de crecimiento tipo insulina (IGF).

DNA endgeno

mRNA endgeno

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f) Controles para PCR in situ. Para la interpretacin correcta de los resultados, es necesario incluir controles. Estos deben ser cuntitativos y culaitativos, as como el uso de controles internos de la muestra. Controles espcficos para PCR in situ deben ser includos en cada experimento: i) Omisin de la DNA polimerasa de la reaccin de PCR para detectar pegados no especficos de la sonda y/o anticuerpos. ii) Omisin de primers para detectar artefactos relacionados con la reparacin del DNA en experimentos directos RT-PCR in situ iii) Pretratamiento de muestras con RNasas y la omisin de la reverso transcriptasa en experimentos que detecten secuencias de mRNA. En la tabla 4, se mencionan los controles para los experimentos de PCR in situ. Tabla 4. Controles requeridos para experimentos de PCR in situ.
Mtodo General Controles Uso de muestras control positivas y negativas. Muestras a evaluar quitando DNA/RNA. Amplificacin de secuencias de DNA endgeno. Omisin del anticuepo primario en deteccin inmunohistoqumica. Lisis celular despus de PCR in situ y anlisis de productos de PCR por electroforesis en gel, Southern-blot y secuenciacin. Omisin de DNA polimerasa Uso se sondas irrelevantes para la hibridacin in situ. Uso se sondas irrelevantes para la hibridacin in situ Propuesta Control para especificidad y sensibilidad del mtodo usado. Deteccin de falsos positivos, control para la sensibilidad. Deteccin de falsos negativos, controles para DNA/RNA. Deteccin de actividad enzimtica endgena. Control en la especificidad de productos de PCR Control para la especificidad de la hibridacin in situ. Deteccin de sondas no especficas y pegado de anticuerpos. Deteccin de artefactos relacionados con el mal apareamiento del DNA y amplificacin del DNA endgeno. Deteccin de sondas no especficas y pegado de anticuerpos.

Clulas en suspensin

PCR in situ indirecto

PCR in situ directo

Omisin de primers.

Omisin de DNA polimerasa.

PCR in situ cuantitativo

PCR in situ en mezclas celulares como controles Control de especificidad y positivos y negativos en sensibilidad del mtodo distintas proporciones. Identificacin de distintos tipos usado. celulares por inmunohistoqumica.

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XIX. COMPARACIN DE LAS TCNICAS DE HIBRIDACIN in situ En seguida se comparan las tcnicas de la deteccin in situ de DNA intracelulares y mRNA. Hibridacin in situ Descripcin: Hibridacin de una sonda intracelular marcada de DNA o RNA Aplicaciones: Localizacin de DNA y mRNA endgenos o DNA/RNA forneos en clulas (embebidas en parafina, criosecciones, preparaciones celulares y cromosomales) Ventajas: buena preservacin morfolgica, alta especificidad, aplicaciones a DNA o RNA, bajos costos en instrumentos e isotrmico. Desventajas: baja sensibilidad. PCR in situ Descripcin: Amplificacin intracelular de PCR y deteccin de secuencias por hibridacin de una sonda marcada o deteccin inmunohistoqumica de nucletidos marcados. Aplicaciones: localizacin de genes alterados y DNA extrao a la clula (embebidas en parafina, criosecciones, preparaciones celulares y cromosomales). Ventajas: alta sensibilidad, disponibilidad para deteccin de un bajo nmero de copias. Desventajas: requieren ciclos trmicos que requieren aparatos costosos, reproducibilidad variable en los resultados, destruccin y prdida de tejidos, cuantificacin pobre, generalmente requiere de HIS. RT-PCR in situ Descripcin: cDNA o RT de mRNA seguido por deteccin y amplificacin por PCR intracelular. Aplicaciones: localizacin de mRNA especfico o RNA virales en clulas (parafina o criseccin o preparaciones celulares). Ventajas: alta sensibilidad, deteccin de nmero bajo de copias de mensajeros. Capacidad para obtener resultados exactos por deteccin de nucletidos marcados. Desventajas: requiere de ciclos trmicos con instrumentos apropiados, reproducibilidad variable, destruccin y prdida de tejidos, cuantificacin pobre. PRINS Descripcin: Renaturalizacin del DNA con oligonucletidos marcados (oligonucleotie primed in situ). Aplicaciones: identificacin de cromosomas, mapeo de secuencias de DNA metafsicos y ncleos interfase, localizacin de DNA cromosomal en clulas. Ventajas:rpido, sensible, no radioactivo e isotrmico.

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Desventajas: bases mal apareadas, dependientes de la especificidad del primer incorporado. El DNA daado puede dar seales falsas-positivas Reverso transcripcin in situ Descripcin: sntesis de cDNA marcado en una clula usando el sistema de RT. Aplicaciones: identificacin y localizacin celular de mRNA especficos dentro de la clula. Ventajas: procedimiento isotrmico con alta sensibilidad. Desventajas: incorporacin de bases marcadas mal apareadas, pero esto es menor que con tcnicas dependientes de DNA polimerasa. RT PRINS Descripcin: similar a la anterior. In situ 3SR Descripcin: self-sustained sequence replication: amplificacin isotrmica de mRNA por cDNA usando tres enzimas simultneamente (reverso transcriptasa con la actividad DNA polimerasa, RNasa y RNA polimerasa) seguida por hibridacin in situ con sondas marcadas. Usos: identificacin y localizacin celular de mRNA/cDNA especficos en clulas (parafina, criosecciones). Ventajas: isotrmico, alta sensibilidad. Desventajas: altamente complejo, los primers requieren un promotor de RNA en el extremo 5, amplificacin seguida de hibridacin in situ.

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