EL SISTEMA INMUNE

El sistema inmune es el responsable de que no nos enfermemos. Muchas veces, sin embargo, no gana el combate contra el agente agresor y necesita colaboracin extra. Por ejemplo, en el caso de las infecciones por HIV se necesita administrar un agente antiviral para que el individuo no muera por la infeccin. A veces no se elimina el patgeno, como en la enfermedad de chagas, pero se puede controlar y evitar que se disemine. El sistema inmune es el responsable de que, a pesar de vivir en un ambiente plagado de agentes potencialmente patgenos, slo en ocasiones desarrollemos procesos infecciosos evidentes desde el punto de vista mdico. El sistema inmune reconoce como propio los componentes de nuestro organismo, porque se desencadenaran reacciones inmunolgicas todo el tiempo. La vacunacin permite que el sistema inmune adquiera experiencia en combatir un patgeno sin ocasionarle daos al individuo. Se logra entonces, en ese momento, un estado que se denomina inmunidad, sinnimo de la resistencia resultante entre las fuerzas que pone el agente agresor para enfermarnos y las fuerzas que ponemos nosotros para combatirlo. Tambin es importante que no ataque al propio organismo. REACCIN DEL HOSPEDADOR RESPUESTA INMUNE

AGENTE AGRESOR

Inmungeno: cualquier sustancia que es capaz de generar una respuesta inmune y reaccionar con los productos de esa respuesta.

TIPOS DE INMUNIDAD NATURAL: Es la que se posee desde el nacimiento, influida por factores genticos y raciales, la edad, factores hormonales y presencia de Ac naturales. (Por ejemplo: isoaglutininas Ac naturales contra ciertas molculas de los GR). ADQUIRIDA: Puede ser: Activa: el hombre genera sus propios anticuerpos. (Primero se enferma y luego se cura memoria). Puede ser espontnea como las infecciones, o artificial como las vacunas en las que se introducen Ag a propsito para generar Ac. Pasiva: espontnea (Ig materna que atraviesan placenta, IgA por amamantamiento) o artificial (introduccin de -globulinas que son Ac ya formados en otra especie, antitetnica). Adoptiva: artificial, se transfieren clulas y no Ac (transferencia de clulas inmunocompetentes). INMUNIDAD LOCAL: mediada por IgA secretora, muy abundante en mucosas.

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AGENTES POTENCIALMENTE PATGENOS Las bacterias y los parsitos pueden ser intra o extracelulares, los virus tienen distinta forma de accin. Para cada uno de los patgenos el sistema inmune ha desarrollado mecanismos de defensa, cada mecanismo es distinto segn de que patgeno se trate.

BARRERAS DE DEFENSA Hay distintos tipos de mecanismos contra agentes agresores: Barreras fsicas (piel y mucosas). Contiene clulas que elaboran sustancias microbicidas o bacteriostticas y mediadores de la inflamacin. Mecanismos innatos o inespecficos (fagocitos, complemento, clulas NK). Son los primeros que actan y de manera rpida, si no logran eliminar el agente actan los mecanismos adaptativos. Mecanismos adaptativos o especficos. Son ms lentos porque los linfocitos necesitan proliferar.

COMPONENTES DE LA RESPUESTA INNATA O INESPECFICA Clulas fagocticas (neutrfilos, macrfagos) Natural Killer (NK) Mastocitos Clulas dendrticas (Cd) Clulas endoteliales Sistemas moleculares: sistema complemento, fibrinoltico, de las quininas y de la coagulacin. El complemento, en mecanismos innatos, se activa por la va alterna y por la va de las lectinas (vas independientes de Ac). El reconocimiento del agente extrao se hace a travs de receptores que contienen los macrfagos, neutrfilos y NK en sus membranas que reconocen ciertos motivos particulares presentes en los patgenos llamados PAMPs (patrones moleculares asociados a patgenos). Los PAMPs no se encuentran en nuestras clulas. Cada tipo celular tiene distintos receptores. Hay receptores que reconocen residuos de manosa, lpidos, etc. Receptores Toll (TRL: Toll Like Receptors) reconocen distintas molculas en los distintos patgenos, pueden reconocer DNA, lipopolisacridos de las membranas bacterianas, etc. Una vez que los macrfagos reconocen al patgeno lo eliminan por fagocitosis, los neutrfilos tambin fagocitan o pueden liberar el contenido de sus granulaciones. Los mecanismos innatos si no logran eliminar el agente agresor retardan la diseminacin de la infeccin convocando a las clulas de la respuesta adaptativa (LB y LT): LB: diferenciacin a plasmocito, produccin de anticuerpos.

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LT: distintos perfiles fenotpicos permiten distintas funciones de acuerdo al marcador molecular que tengan en su membrana. CD4+: Th1: activan macrfagos, activan y expanden CD8+. Th2: colaboran con los LB. Tr: regulacin de la respuesta inmune para que no sea excesiva. + CD8 : lisan clulas infectadas por virus (LT citotxicos).

TH1 y TH2 se diferencian por las citoquinas que producen. TH1 actan principalmente cuando el patgeno que ingresa es intracelular. TH2 actan frente a patgenos extracelulares. La presencia de IL-12 y citoquinas relacionadas promueve la diferenciacin de los LTCD4+ en un perfil Th1,mientras que la presencia de IL-4 conduce a la diferenciacin de los LTCD4+ en un perfilTh2. Qu ocurre cuando se produce un foco infeccioso? Las bacterias son reconocidas por los receptores de los macrfagos. Se activa el complemento (C). El complemento es un sistema proteico de activacin en cascada que tiene tres vas de activacin: Va clsica: depende de que haya anticuerpos y se activa con complejos Ag-Ac. Va alterna Acta en los mecanismos innatos porque no necesitan Ac. Va de las lectinas Cuando el complemento se activa produce una serie de sustancias o de protenas. Algunas van a tener la capacidad de opsonizar, son opsoninas que recubren al patgeno (que tiene receptores para ellas) y facilitan la fagocitosis por parte del macrfago. Otras molculas del complemento como C3a y C5a anafilotoxinas y tienen la capacidad de atraer otras molculas. Cuando se genera el proceso de inflamacin, las molculas liberadas permiten que los neutrfilos que estn circulando atraviesen los vasos, vayan al sitio de infeccin y comiencen su accin.

MECANISMOS ADAPTATIVOS O ESPECFICA Las clulas que participan en los mecanismos adaptativos son los linfocitos B (LB) y linfocitos T (LT), tambin tienen receptores para reconocer patgenos. El receptor con el cual los LB reconocen patgenos es una inmunoglobulina (Ig) de membrana. Todas las Ig estn formadas por dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas unidas por puentes disulfuro. La Ig est anclada en membrana, pero la porcin transmembrana es muy cortita, entonces necesita de otras molculas que le ayuden a transmitir las seales al interior de las clulas. El receptor T est constituido por dos cadenas. Se asocia en los LTCD4+ a la molcula CD4 y en los LTCD8+ a la molcula CD8. El LT necesita que el Ag le sea presentado por otra clula, esto quiere decir que el LT reconoce pequeos pptidos de un Ag que haya sido procesado previamente por otra clula.

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Las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) son las encargadas de presentarle los pptidos a los LT. El CMH son molculas de membrana que se expresan en todas las clulas, fueron descubiertas por primera vez en los leucocitos, por eso tambin se las llama HLA (antgeno leucocitario). Los MHC clase I estn en todas las clulas del organismo, menos en los eritrocitos. Presentan pptidos a los LTCD8+ citotxicos. Las clulas que las contienen participan en la presentacin de todos los Ag que provengan del interior celular. Los MHC clase II estn en algunas clulas, en particular en los LB, macrfagos y clulas dendrticas. Estas clulas se las llaman clulas presentadoras de antgenos (CPA) profesionales, porque son las nicas que pueden presentarle Ag a los LTh CD4+. Presentan Ag que provengan del exterior celular, esto implica que los LB, macrfagos y clulas dendrticas tienen que haber captado esos Ag, degradado y presentado en membrana. Una vez que el linfocito reconoce el Ag se activa y comienza a proliferar, esa proliferacin se denomina expansin clonal, va a haber un montn de linfocitos que se originan a partir de uno que van a tener capacidad para reconocer al mismo Ag. En toda respuesta adaptativa hay una fase de reconocimiento, una fase de activacin, luego una fase de proliferacin y por ltimo una diferenciacin a clula efectora. Las clulas de la respuesta innata reconocen, se activan y ejercen su funcin, no necesitan proliferar como los linfocitos. LT y LB se originan en la mdula sea. Una vez que salen de la mdula sea ya van a estar comprometidos a ser o T o B. El proceso de maduracin de los LT se realiza en el timo y el de los LB ocurre enteramente en la mdula sea (en algunas otras especies animales los LB terminan de madurar en la bolsa de Fabricius). En base al marcador molecular que expresen en su membrana los LT pueden ser de dos tipos:

CD4

CD8

LTh1 (median la activacin de los macrfagos y contrubuyen adems a la activacin y expansin de los LTCD8+ citotxicos) LTh2 (colaboran con los LB y permiten su correcta LT reguladores activacin, expansin y diferenciacin a plasmocitos productores de Ac. Tambin participan en la inmunidad antiparasitaria en los tejidos perifricos al inducir la activacin de los eosinfilos, basfilos y mastocitos. LT citotxicos

LT helpers

Las poblaciones de los LB son responsables de producir los Ac naturales: LB1: se encuentran en la cavidad peritoneal, producen IgM, se autorrenuevan. LB2: producen cinco tipos de Ac: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD . BZM: se encuentran en la zona marginal del bazo, se autorrenuevan, solamente producen IgM, actan cuando hay un patgeno que ingresa por sangre.

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COMUNICACIN ENTRE CLULAS DEL SISTEMA INMUNE La comunicacin intracelular puede ser a travs de: CITOQUINAS: protenas pequeas, pueden tener efecto local (autcrino) o actuar sobre clulas ms alejadas (parcrino). Se producen de novo cuando la clula se activa, tienen una vida media limitada y estimulan clulas que tienen receptores para ellas. Redundancia: varias citoquinas pueden tener el mismo efecto, por lo tanto si una falla otra la puede reemplazar. Las citoquinas van a recibir distinto nombre segn la clula que las produzca. Los leucocitos producen citoquinas llamadas interleuquinas que regulan la proliferacin y diferenciacin celular. QUEMOQUINAS: son protenas pequeas que participan en la conduccin de los leucocitos (neutrfilos) a los sitios en los que se necesitan (de infeccin). Son agentes quimiotcticos. MOLCULAS DE ADHESIN: se expresan en la membrana, de forma constitutiva o por activacin. Determinan la migracin y salida del vaso sanguneo de los neutrfilos. - Selectinas: L-selectinas (leucocitos), P-selectinas (plaquetas), E-selectinas (clulas endoteliales). - Integrinas. - Molculas de la superfamilia de las Igs. - Sialomucinas. - Cadherinas. Una vez que los linfocitos reconocen al antgeno empiezan a proliferar, hay una expansin clonal: muchos linfocitos se originan a partir de uno y responden al mismo antgeno. RECONOCIMIENTO ACTIVACIN PROLIFERACIN DIFERENCIACIN A CLULA EFECTORA

Esto no ocurre en la respuesta innata, no necesitan proliferar. De los linfocitos que proliferan, algunos se mantienen como clulas de memoria: viven ms tiempo y actan cuando un antgeno ingresa por segunda vez, entonces se genera una respuesta ms rpida y ms eficaz. Entrada de Ag por primera vez respuesta primaria. Entrada de Ag por segunda vez respuestas secundarias mediada por linfocitos de memoria. Respuesta ms rpida y eficaz. (Esto es lo que se busca con la vacunacin).

ORIGEN DE LAS CLULAS DEL SISTEMA INMUNE Si bien las clulas del sistema inmune son muy diferentes y cumplen distintas funciones, todas tienen un origen comn que va variando a lo largo del desarrollo del individuo.

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Cuando se forma el embrin, en los primeros das, las clulas son producidas por el saco vitelino. Despus, el hgado y el bazo fetal, adquieren la funcin de producir clulas, hasta que se desarrolla la mdula sea y toma la posta en la produccin de clulas hematopoyticas. En el adulto la produccin de clulas ocurre en la mdula sea del esternn, costillas, huesos largos, etc. La clula troncal hematopoytica es el progenitor comn que va a dar origen a los distintos linajes celulares.

CLULAS HEMATOPOYTICAS MACRFAGOS: se originan a partir de los monocitos circulantes y se diferencian a macrfagos cuando se establecen en los tejidos. Reciben distintos nombres de acuerdo al tejido en el que se encuentren: -Hgado clulas de Kupffer. -SNC clulas de la microgla. -Hueso osteoclastos. Son clulas presentadoras de antgenos profesionales (APC). Tienen la capacidad de fagocitar agentes extraos que reconocen por sus receptores, procesarlos, degradarlos y presentarlos en MHC de clase II en la membrana. Producen citoquinas importantes en la respuesta inflamatoria. Tambin producen IL-1, IL-6, TNF- que son citoquinas proinflamatorias. Producen tambin citoquinas antinflamatorias para regular la respuesta. NEUTRFILOS: se originan en la mdula sea, necesitan entre 5 y 7 das para transformarse en maduros, no pueden volver a la circulacin (recircular). Representan el 90% de los granulocitos. Ejercen su accin a travs del reconocimiento de patgenos, fagocitosis y mecanismos citotxicos (dependientes e independientes del oxgeno). Producen mediadores de la inflamacin (prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos) y citoquinas (IL-1, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-). Sus granulaciones se tien con colorantes neutros. Neutrofilia es el aumento de neutrfilos en sangre, lo que es un indicio de inflamacin. CLULAS DENDRTICAS: nexo entre inmunidad adaptativa e inespecfica. Activan linfocitos T vrgenes. Son clulas presentadoras profesionales, contienen MHC de clase II. Tienen un aspecto estrellado. Reciben diferentes nombres de acuerdo al lugar donde se encuentran (piel Langerhans). Se encuentran en dos estadios: -Inmaduros presentan una fagocitosis activa -Maduro luego de su maduracin disminuye su actividad de fagocitosis pero aumenta la capacidad de presentacin de Ag. CLULAS NK: de origen linfoide, poseen receptores para IL-12, IL-2 y TNF-. Las clulas NK participan en la inmunidad antiviral. Presentan en la superficie celular molculas de histocompatibilidad de clase I. Funciones: - Cistlisis: a travs de sus grnulos que contienen perforina y granzimas. - Produccin de IFN-, TNF-, GM-CSF e IL-3. Mecanismo de accin: Anticuerpo dependiente (adaptativa): receptor para Fc

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Anticuerpo independiente (innata): MHC clase I: disminuye la expresin de MHC clase I en clulas infectadas por virus, as, las NK las detecta y las destruye. CLULAS NKT: son LT. Reconocen Ag lipdicos presentados por las molculas CD1D. LB1: cavidad peritonealIgM se autorrenuevan Ac naturales. LB2: producen Ac: IgG, IgA, IgM, IgE, IgD. LBZM: zona marginal del bazo. Se autorrenuevan. Producen IgM. Actan cuando el patgeno ingresa por sangre.

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ORGANOS LINFOIDES

La inmunidad innata es el primer mecanismo que se desencadena cuando ingresa un antgeno, y generalmente acta de la misma manera ante una segunda entrada de ese mismo antgeno. Los mecanismos de inmunidad adaptativa estn mediados por los LT y los LB. Los LB producen Ac y los LT producen citoquinas. Entonces, un animal frente a un antgeno genera tanto clulas especficas como molculas. Las clulas seran los LT y las molculas los Ac. Para un estudio ms simple se dice que la inmunidad humoral es la que est mediada por Ac y la inmunidad celular es la que est mediada por LT, aunque estn muy relacionadas una con otra. Las diferentes clulas del sistema inmune estn comunicadas entre si por la liberacin de citoquinas y molculas de adhesin. Estas clulas se van a organizar en los rganos linfoides.

ORGANOS LINFOIDES De acuerdo a su funcin se pueden clasificar en: rganos linfoides primarios o centrales que son los lugares donde se van a generar las clulas del sistema inmune. Estos rganos son: mdula sea, timo y bazo (en perodo fetal). rganos linfoides secundarios o perifricos son el bazo, los ganglios linfticos y todo tejido linfoide asociado a mucosas. En stos se produce el encuentro entre los linfocitos y el antgeno. rganos primarios Se generan y maduran las clulas del sistema inmune LT y LB rganos secundarios Se encuentran los LT y los LB con los Ag, y donde tienen un microambiente adecuado para montar una respuesta inmune.

En el humano, los LB se agrupan y maduran en la MDULA SEA. Todo el proceso de maduracin de los LB se denomina ONTOGENIA B. Durante este proceso los LB van a ir expresando en su membrana diferentes molculas, y van a ir ordenando los genes que codifican para el receptor B. En la mdula sea tambin sufren el proceso de TOLERANCIA CENTRAL: los LB que sean capaces de reconocer Ag propios van a ser eliminados (sus receptores reconocen Ag del propio organismo). Si algn linfocito B se escapa de este proceso, en el bazo se va a producir otro proceso que se denomina TOLERANCIA PERIFRICA que va a eliminar a los LB autorreactivos que se pueden haber escapado del primer punto de control. Para los LT, en cambio, el sitio de maduracin donde terminan de transformarse en linfocitos competentes es el TIMO. El timo es un rgano que est ubicado por detrs del esternn, es bilobulado y aumenta mucho de tamao desde el nacimiento hasta la pubertad. Luego de la pubertad el timo comienza a involucionar. Se cree que esta involucin se produce porque las clulas del timo carecen de ciertas enzimas del metabolismo de las hormonas esteroidales. Estas hormonas esteroidales que se generan en gran cantidad durante la adolescencia, son txicas para las clulas del timo. Sin

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embargo, los linfocitos que llegaron al timo alcanzan a ser suficientes para montar cualquier respuesta inmune a lo largo de toda la vida del individuo. El timo tiene un sitio entre la corteza y la mdula en donde se va a producir un mecanismo de seleccin positiva y otro, luego de la mdula, donde se va a producir la seleccin negativa. Esto va a permitir que salgan LT y que no reconozcan Ag propios. La maduracin de los LT se denomina ONTOGENIA T, durante la cual los LT van a ir expresando distintas molculas en su membrana. Estos seran los rganos primarios o centrales. Luego tenemos rganos secundarios o perifricos. El BAZO est ubicado en la regin abdominal, tiene una regin que se denomina pulpa roja y es el lugar donde se eliminan los eritrocitos deteriorados. Tiene una zona de pulpa blanca donde predominan los linfocitos tanto T como B. El bazo es un rgano muy importante y es el primero que acta cuando el Ag ingresa por va sangunea. En el bazo no hay circulacin linftica, solamente sangunea, y los linfocitos entran y salen por la misma va. Los GANGLIOS LINFTICOS estn ubicados a lo largo de todo el organismo, cerca de los vasos sanguneos ms importantes del cuerpo, donde se forman las cadenas de ganglios linfticos. Los ganglios tienen estructura ovoide y poseen tambin una zona cortical y una medular. Algunas zonas son especficas del los LT y otras son propias de los LB. En los ganglios es donde se produce el encuentro entre los LT y los LB, para que el LB se transforme luego en productor de anticuerpos. El ganglio es un rgano que tiene circulacin linftica y sangunea. Los linfocitos van a entrar al ganglio por va sangunea, los Ag van a provenir de distintas partes del cuerpo, por va linftica entran al ganglio y se encuentran con los LT. Se le presentan los Ag a los LT, estos reconocen al Ag y comienzan a proliferar y van a poder contactarse con los LB. Los LB se van a diferenciar a plasmocitos y van a producir Ac. Las mucosas son sitios muy importantes para el ingreso de Ag. Para controlar todos aquellos Ag que puedan ingresar hay TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A LAS MUCOSAS. Hay algunos tejidos asociados a la mucosa nasofaringea, a los ganglios mesentricos, a todo el tracto gastrointestinal. Este tejido linfoide puede ser diferenciado en dos componentes: sitios inductores, donde se van a generar las clulas especficas, y los sitios efectores, que son donde van a ir a actuar esas clulas especficas. Para que un linfocito pueda ir a un determinado lugar necesita expresar un determinado receptor para quemoquinas.

DIFERENCIAS ENTRE INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA La inmunidad innata acta desde el inicio del proceso infeccioso, mientras que la inmunidad adaptativa requiere varios das para generar sus mecanismo efectores. Difieren en las estrategias empleadas en el reconocimiento de microorganismos y sus productos. La inmunidad innata reconoce patrones moleculares asociados con patgenos (PAMPs) mediante receptores de reconocimiento de patrones (RRP), mientras que la inmunidad adaptativa reconoce epitopes antignicos mediante receptores especficos distribuidos clonalmente en clulas B y T. La actividad de la inmunidad adaptativa conduce a la expansin de los clones reactivos y al desarrollo de la memoria inmuntaria, procesos que no se observan en la inmunidad innata.

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PIEL Y MUCOSAS: PRIMERA LNEA DE DEFENSA CONTRA LA AGRESIN

COMPONENTES DE LA INMUNIDAD INNATA LA PIEL El ser humano posee entre 1,5 y 2 m2 de piel. Est constituida por distintas capas, la ms externa es la epidermis, la media es la dermis y la ms profunda la hipodermis (tejido graso subcutneo). En la epidermis se distinguen distintos tipos celulares importantes para la inmunidad innata, entre ellos los queratinocitos. Los queratinocitos producen queratina la cual le da cierta dureza a la piel, la hace impermeable, la protege de los agentes fsicos y qumicos. Los queratinocitos se recambian constantemente cada 30 das y as se eliminan a los microorganismos que puedan haber quedado ah, encima de ellos. Adems de la funcin de barrera, los quertinocitos producen citoquinas y algunas quemoquinas. En algunos casos de dermatitis hay una excesiva actividad de los queratinocitos y los fenmenos que se observan se deben a esa gran cantidad de quemoquinas que producen. Otras clulas importantes presentes en la epidermis son las clulas de Langerhans, estas son clulas dendrticas que son muy importantes como clulas presentadoras de Ag, y son el nexo entre la inmunidad innata y la adaptativa. Tienen una gran capacidad endoctica, tienen muchos receptores para los distintos componentes de los agentes patgenos: para el lipopolisacarido bacteriano, flagelina, DNA y RNA viral, y tambin tiene receptores para citoquinas: IL-1 y TNF-. Si bien no son muy abundantes, las clulas de Langerhans tienen unas prolongaciones muy largas que aumentan la extensin de la superficie que abarcan. LAS MUCOSAS Tenemos 400 m2 de mucosas. Tienen la caracterstica de la continuidad epitelial, no solo se debe a las uniones que hay entre las clulas, sino a la unin que existe entre esas clulas y la matriz extracelular. Esa unin es fundamental para evitar el ingreso de microorganismos. Adems de la continuidad epitelial, est la secrecin de moco. Existen alrededor de 8 familias de mucinas diferentes. El moco se secreta de forma continua, se recambia muy rpidamente cada minuto. Tiene una permeabilidad selectiva, permite el pasaje de gases y de nutrientes y evita el pasaje de los microorganismos con sus toxinas. Tiene capacidad de adherirse a las clulas del epitelio de las mucosas, impidiendo la adherencia de microorganismos. Adems producen muchas sustancias con actividad microbicida, por ejemplo la lactoferrina tiene la capacidad de secuestrar el hierro, el cual es importante para el crecimiento de los microorganismos; la lisozima, que produce la alteracin de la permeabilidad de las paredes de los microorganismos, lo mismo que las defensinas; las aglutininas que bloquean ciertos receptores de los microorganismos impidiendo que se unan a las clulas y de esa manera logren penetrarlas. Adems de estas sustancias, muchos epitelios mucosales producen IgA secretora, que es un tipo particular de anticuerpo. Tambin producen muchas citoquinas y quemoquinas. El espesor del moco es diferente en los distintos tipos de epitelios. Es mucho menor en el epitelio respiratorio (aprox. 2 m), en el epitelio digestivo es mucho mayor (aprox.

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100 m). El moco, junto con los microorganismos que pueden haber quedado adheridos se elimina en el tracto respiratorio a travs de las cilias que poseen las clulas. En el tracto digestivo contribuyen los movimientos peristlticos. Otro mecanismo de defensa a nivel del tracto digestivo es la acidz del jugo gstrico, que elimina cualquier microorganismo que pueda haber sido deglutido.

INFLAMACIN Cuando todas estas primeras barreras de defensa son vencidas e ingresa un microorganismo, se produce entonces el fenmeno de INFLAMACIN. El objetivo de este fenmeno es facilitar el acceso de las clulas del sistema inmune al lugar de ingreso de un agente agresor. En la inflamacin se van a producir cuatro signos caractersticos que son DOLOR, CALOR, RUBOR y TUMOR. Cuando se produce este fenmeno hay vasodilatacin de los capilares y aumento del flujo sanguneo, esto conduce al calor y al rubor. Cuando se produce esa vasodilatacin sale lquido de los capilares y se produce el edema o tumor. Este edema puede generar compresin de los nervios y producir dolor. En la inflamacin participan numerosos sistemas y tambin numerosas clulas. Dentro de los sistemas moleculares que van a participar es sumamente importante el sistema del complemento. El SISTEMA DEL COMPLEMENTO es un sistema de activacin en cascada que va a generar distintos componentes, algunos de sus componentes participan en el proceso inflamatorio. Por ejemplo, C3a y C5a son anafilotoxinas, pueden inducir la liberacin de grnulos de basfilos y mastocitos. C5a tiene actividad quimioatractante de neutrfilos. C3b tiene capacidad de opsonizacin (recubrimiento del patgeno con distintas molculas para facilitar la fagocitosis). Luego est el SISTEMA DE LAS QUININAS, que va a producir bradiquinas en un sistema de activacin en cascada, la cual participa en la alteracin de la permeabilidad capilar. El SISTEMA FIBRINOLTICO y otros mediadores qumicos, como las prostaglandinas, leucotrienos, xido ntrico e histamina tambin participan en la respuesta inflamatoria. En la eliminacin de NO participan dos enzimas, una constitutiva y una inducible, y el NO produce aumento de la permeabilidad capilar. La histamina tambin tiene el mismo efecto. Dentro de las CITOQUINAS son muy importantes TNF-, IL-1 e IL-6, las cuales estimulan el aumento de la temperatura corporal porque actan a nivel del hipotlamo. Este aumento de la temperatura corporal reduce el crecimiento de los microorganismos y favorece las reacciones inmunolgicas. Dentro de las QUEMOQUINAS la IL-8 es muy importante porque favorece el pasaje de los neutrfilos desde los vasos sanguneos hasta los tejidos infectados (CXCL8 = IL8). Dentro de los COMPONENTES CELULARES estn: - Las clulas de primera lnea: neutrfilos, eosinfilos, basfilos, mastocitos y clulas NK. Algunas de estas clulas van a producir liberacin de sus grnulos, otras son fagocticas (neutrfilos), otras van a destruir directamente a las clulas infectadas (clulas NK). - Las clulas de segunda lnea son clulas que adems de fagocitar pueden presentar antgenos (macrfagos y clulas dendrticas).

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NEUTRFILOS Los neutrfilos destruyen los agentes patgenos por mecanismos dependientes del O2 o independientes del O2. Adems de fagocitar producen muchas citoquinas, de las cuales las ms importantes son IL-12 y el TNF-. Luego de la fagocitosis pueden liberar el contenido de sus grnulos y causar dao tisular. MACRFAGOS Otras clulas que son claves en el proceso de inflamacin son los macrfagos. Estos adems de tener receptores para reconocer a los patgenos, producen muchsimas citoquinas: citoquinas inflamatorias (IL-1, IL-6 y TNF-) y citoquinas antinflamatorias (IL-10 y TGF-) para controlar y regular y as evitar excesos.

REACCIN DE FASE AGUDA A pocas horas de haberse iniciado el proceso infeccioso, sobre todo en los de naturaleza bacteriana, los macrfagos incrementan de menera notable la produccin de IL-1, IL-6 y TNF- en respuesta a su estimulacin por PAMPs, citoquinas o componentes del complemento. Estas tres citoquinas median un conjunto de actividades tendientes al desarrollo de un cuadro inflamatorio agudo local y sistmico, denominado reaccin de fase aguda, que intenta resolver el proceso infeccioso con la eliminacin de su agente causal. Las acciones inflamatorias locales mediadas por IL-1, IL-6 y TNF- se ejercen sobre las diferentes poblaciones celulares en el entorno inmediato del foco infeccioso. Las acciones inflamatorias sistmicas mediadas por IL-1, IL-6 y TNF- se ejercen a tres niveles diferentes: A) A nivel heptico van a producir la sntesis de las protenas de FASE AGUDA. Estas protenas tienen como funcin proteger al organismo de las acciones nocivas. Otras tienen funcin estimuladora de algunas vas de eliminacin de patgenos, por ejemplo, la protena C reactiva, que estimula la activacin del complemento. Las protenas de fase aguda median mecanismos antimicrobianos poderosos, y por otra parte, protegen al husped de las posibles acciones perjudiciales asociadas con el desarrollo de las reacciones inflamatorias. B) A nivel del hipotlamo estas citoquinas producen el aumento de la temperatura corporal (se conocen como pirgenos endgenos). El aumento de la temperatura corporal tambin puede producirse por componentes bacterianos (pirgenos externos). C) A nivel de la mdula sea aumentando la produccin de pirgenos endgenos (neutrofilia). Todos estos mecanismos se generan para que vallan mayor cantidad de clulas al sitio de infeccin. La reaccin de fase aguda aumenta la resistencia del husped, disminuye la lesin tisular y favorece la reparacin y resolucin de la lesin.

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La respuesta inflamatoria se acompaa por cambios en el flujo sanguneo local y en la permeabilidad vascular, que producen los signos clsicos de la inflamacin: tumor, rubor, clor y dolor. Los cambios vasculares permiten, adems, que leucocitos circulantes se extravasen a los sitios de infeccin, destruyan a los patgenos, limpien los restos celulares y comience el proceso de reparacin tisular. El incremento de la permeabilidad vascular, producto de la contraccin que sufren las clulas endoteliales de las vnulas poscapilares en respuesta a mediadores como la histamina, produce un escape del lquido del vaso al tejido subyacente. Esto provoca hemoconcentracin, lo que enlentece el flujo sanguneo y en consecuencia, los leucocitos, que normalmente circulan en la corriente central del flujo sanguneo laminar, se marginan y pueden contactarse con el endotelio, facilitando su posterior extravasacin. El proceso de extravasacin leucocitaria involucra la accin coordinada de molculas de adhesin y quimioatractantes. Las molculas de adhesin constituyen un conjunto de molculas presentes en la superficie celular que median las interacciones clula-clula y clula-matriz extracelular. Existen cinco familias de molculas de adhesin: -selectinas (L-selectinas, P-selectinas y E-selectinas de los leucocitos, plaquetas y endotelio respectivamente): reconocen carbohidratos sobre glucoprotenas de la superficie celular. -integrinas:cumplen un papel crtico en la extravasacin leucocitaria. -molculas de adhesin que por su estructura se incluyen dentro de la superfamilia de las Ig: su expresin puede ser constitutiva o inducible. Por ejemplo ICAM-1 y VCAM-1 se expresan enniveles muy bajos en la mayoria de los lechos vasculares. Su expresin es mucho mayor en el endotelio de vasos que irrigan tejidos infectados o inflamados por la accin de citoquinas inflamatorias producidas localmente. -cadherinas: son molculas responsables de mantener la integridad estructural de los tejidos. Estas molculas se expresan como dmeros y establecen interacciones con otros dmeros de cadherinas expresados en clulas vecinas (ejemplo cadherinas expresadas en las clulas de Langerhans que se unen a cadherinas de los queratinocitos, y cuando la clula dendrtica reconoce algn Ag deja de expresar estas cadherinas para poder dirigirse a los ganglos linfticos y presentarle el Ag a un LT). -sialomucinas.

ADHESIN Y PASAJE DE LOS NEUTRFILOS AL SITIO DE INFECCIN Los neutrfilos para pasar de los vasos sanguneos hacia los tejidos siguen un proceso de cuatro etapas. Va a estar mediado por molculas de adhesin que tienen tanto los neutrfilos como las clulas endoteliales. 1o PASO: RODAMIENTO. Los neutrfilos van como rodando por las clulas endoteliales. Las principales molculas que intervienen son las selectinas. En este caso la unin que se produce entre el neutrfilo y la clula endotelial es dbil. Se unen y se separan. 2o PASO: ADHERENCIA ESTABLE. En este caso intervienen las molculas de adhesin integrinas.

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3o PASO: DIAPDESIS. Consiste en el pasaje del neutrfilo entre dos clulas endoteliales. En este caso tambin intervienen las integrinas y otra molcula que es la CD31. Una vez que pas el neutrfilo libera proteasas que van a degradar la membrana basal. 4o PASO: MIGRACIN. Se produce gracias a un gradiente de quemoquinas. Una quemoquina importante en este caso es la IL-8. En la inflamacin haba una vasodilatacin capilar, una disminucin del flujo sanguneo, y al enlentecerse todo el flujo, los neutrfilos que estaban circulando por el torrente empiezan a bajar y a acercarse cada vez ms a las clulas endoteliales y as iniciar el paso 1.

CLULAS NK Las CLULAS NK actan en la inmunidad mediata, destruyendo clulas infectadas por virus. Las clulas infectadas por virus expresan menor cantidad de molculas de histocompatibilidad de clase I, y estas clulas NK detectan estas diferencias de produccin. Las clulas NK tienen un receptor, el NKG2D, que reconocen los Mic a y Mic b, que pertenecen al CMH, y estas molculas se expresan de forma constitutiva en intestino y aumentan mucho en condiciones de estrs. Cuando estas clulas NK se unen a estas molculas se activan. En la infeccin por virus se producen unos mecanismos innatos con la produccin del interfern de tipo I por parte de las clulas infectadas. Estos dos interferones INT- e INT-, inhiben la replicacin viral, y adems estimulan la actividad de las clulas NK. Todas las clulas tienen capacidad de producir interferones.

INMUNIDAD MEDIADA POR LINFOCITOS T Un linfocito T que no haya impactado con un Ag se denomina virgen o naive. Los LT se originan en la mdula sea, terminan de madurar en el timo y cuando salen del timo son linfocitos vrgenes. Estos tienen en su membrana un receptor T y pueden tener una molcula CD4 o una molcula CD8. Los que tienen la molcula CD4 se llaman helpers y los que tienen la molcula CD8 se llaman citotxicos. Los linfocitos que salen del timo van a parar a un ganglio y ah se encuentran con una clula dendrtica que lleg desde un tejido perifrico cargada con algn Ag. Esta clula dendrtica le va a mostrar al LT ese Ag. Si se trata de un LT CD4+, se lo va a presentar en el contexto de la molcula de histocompatibilidad de clase II. Esto no es suficiente para que el linfocito se active, necesita una seal ms que va a estar dada por una molcula co-estimulatoria, la CD28 y la CD80 y CD86 de la clula dendrtica. Con esas dos seales el linfocito se activa y empieza a proliferar. Se transforma as en efector. Los LT helpers pueden ser de dos tipos: LTh1 y LTh2. Esta diferenciacin se produce por accin de distintas citoquinas. Las que favorecen la diferenciacin a LTh1 son INF- y la IL-12; las que favorecen los LTh2 es la IL-4. Los dos LTh se diferencian en las funciones y en el patrn de citoquinas que producen. Los LTh1 median respuestas contra microorganismos intracelulares, van a favorecer la fagocitosis, van a estimular a los macrfagos. Los LTh2 colaboran con los LB y ayudan a producir anticuerpos.

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Las citoquinas que producen uno u otro se inhiben mutuamente. El LTh1 secreta principalmente INF-, que activa neutrfilos, macrfagos, clulas NK y a su vez inhibe la proliferacin de LTh2. Los LTh2 producen IL-10, TGF- que inhiben a los LTh1. De todos modos siempre se generan los dos tipos de respuesta, pero va a predominar una u otra, de acuerdo a que los patgenos sean intracelulares o extracelulares. Si bien los LT se diferencian en el ganglio, los LTh1 van a dirigirse a tejidos perifricos que es donde tienen que efectuar su funcin. Los LTh2 se quedan en el ganglio, porque en el ganglio estn los LB con los que van a colaborar. Tambin se producen unos LT de memoria. Algunos van a ser LTm centrales (LTmc) y otros LTm perifricos (LTmp). Estos linfocitos se diferencian en receptores que tengan para quemoquinas. Esto le permite a los LTmc volver a un ganglio linftico para ver si encuentra algn Ag, mientras que los LTmp no pueden volver. Estos son fenmenos de recirculacin de los linfocitos que permiten a un linfocito que no encontr a su Ag en el ganglio, volver a salir y hacer todo el circuito sanguneo. Por otro lado estn los LT citotxicos CD8+. Reconocen Ag presentados por molculas del CMH de clase I y actan cuando hay clulas infectadas por virus. El mecanismo de accin puede ser por liberacin del contenido de sus grnulos que contienen la enzima perforina, o pueden actuar a travs del sistema FADD + ligando induciendo la apoptosis de la clula infectada. Para activarse necesitan mayores seales que los LTh. Los LT CD8+ se van a activar en el ganglio y despus van a ir a los tejidos donde van a ejercer su accin. Para que un LT se active necesita que el Ag se lo presente una clula dendrtica, porque necesitan seales co-estimulatorias de mayor intensidad. Los linfocitos efectores no necesitan seales tan fuertes y se pueden activar por macrfagos. Hay una poblacin de LT que se denominan LT reguladores (LTr). Los LTr se conocan antes como LT supresores. Hay dos tipos de LTr, unos que se originan como tales en la mdula sea y en el timo (LTr naturales), y otros que se inducen ante la presencia de determinados Ag (LTr inducibles). Estos linfocitos varan en las molculas que expresan en sus membranas. Los LT reconocen pptidos pequeos y los reconocen en el contexto de las molculas del CMH de clase I o II, los citotxicos de clase I y los helpers de clase II. Th1 Th2 Tr

LT

CD4+ CD8+

INMUNIDAD MEDIADA POR LINFOCITOS B Hay tres clases de linfocitos B. Los LB1 son muy poco abundantes en sangre, pero son los mayoritarios en las cavidades peritoneal y pleural. Pueden proliferar sin necesidad de estar en contacto con el Ag. Producen Ac contra distintos componentes bacterianos,

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y el principal Ac que producen es de tipo IgM. Estos son los Ac naturales del organismo. Estos LB reconocen un Ag bacteriano a travs del receptor B que es una inmunoglobulina con otras molculas asociadas. Este linfocito se transforma directamente en plasmocito y produce Ac IgM. Esos Ac se van a ir a fijar a la bacteria que tena los Ag que le dieron origen. Los LB de la zona marginal del bazo (LBZM), son los primeros que actan contra antgenos que llegan por va sangunea. Estos linfocitos pueden proliferar sin la necesidad de la presencia de Ag y tambin producen Ac de tipo IgM. Es la principal defensa contra bacterias que ingresan por sangre. La poblacin mayoritaria de LB son los LB2. Constituyen el 90% de los linfocitos que estn en sangre perifrica y necesitan de la colaboracin de los LTh2 para producir Ac. Por ejemplo, el LB2 tiene capacidad de fagocitar y degradar agentes patgenos. El LB fagocita al virus, lo internaliza, lo degrada y presenta pedacitos de este virus en las molculas del CMH de clase II. As interacta con un LTh2, el cual lo reconoce, no necesariamente por la misma regin antignica que reconoce el LB2, luego el LTh2 produce citoquinas y con ellas el LB2 se transforma en un plasmocito productor de Ac.

FUNCIN EFECTORA DE LOS ANTICUERPOS Los Ac estn constituidos por dos cadenas H y dos cadenas L. Las cadenas H son centrales y las ms pesadas, y las L son perifricas y las ms livianas. Existen cinco clases de Ac: G, A, M, D y E. La Ig G se va a producir despus de que los linfocitos sufren un proceso dentro del ganglio linftico llamado HIPERMUTACIN SOMTICA y SWITCH de Ig; les va a permitir cambiar de IgM, que es la primera Ig que se producir, a IgG. Esto se produce en lo que se llama centro germinativo. Los Ac tienen una funcin que est dada por una porcin que se llama Fab y es el sitio de unin a los Ag. Aqu la porcin que especficamente se une al Ag se llama paratope. El paratope se va a unir a una parte en particular del Ag que se llama epitope. Estas regiones de las Ig son muy variables. Esta variabilidad les permite reconocer los diferentes Ag. El receptor que tiene el LB es una IgM. Otra parte del Ac que tiene importantes funciones es el Fc (regin constante). Est formada por las dos cadenas pesadas. Hay muchas clulas que tienen receptores para los fragmentos Fc, como los macrfagos. Si hay un microorganismo que est recubierto por Ac y este Ac por el Fc se une al macrfago, el macrfago lo va a fagocitar ms fcilmente. Porcin Fab reconoce al Ag por una parte de la cadena H y una parte de la cadena L. Porcin Fc indica qu se va a hacer con el Ag unido.

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Entre sus funciones se pueden mencionar: Sirven para reconocer al Ag en estado nativo, como la Ig de superficie de los LB (receptor antignico), es decir, reconoce Ag sin procesar. Pueden activar el complemento, neutralizar a los patgenos y opsonizarlos. Sirven para participar de un mecanismo de citotoxicidad anticuerpo dependiente. Participan en los procesos inflamatorios. Son los que dan inmunidad a las mucosas (IgA). Dan inmunidad prenatal y neonatal (Ig G, la nica que puede atravesar placenta, e IgA). Los linfocitos T vrgenes van a ir a los rganos linfticos secundarios a travs de la sangre. Los Ag van a venir por la linfa hasta los ganglios linfticos. Ah se van a encontrar, se va a producir la presentacin, la proliferacin, la diferenciacin y despus los linfocitos van a poder volver a la sangre a travs del conducto torcico, saliendo de los ganglios linfticos. Los linfocitos T vrgenes se unen a las molculas L-selectina del endotelio vascular. En los ganglios linfticos, en el rea paracortical, se expresan unas quemoquinas: CCL19 y la CCL21. Los linfocitos T vrgenes tienen un receptor que es el CCR virgen, el cual reconoce a estas quemoquinas y as los linfocitos vrgenes pueden dirigirse hacia el rea paracortical. Cuando se producen los fenmenos inflamatorios, las citoquinas que se liberan estimulan la produccin de estas quemoquinas. Las clulas dendrticas que han captado algn Ag expresan tambin este receptor y pueden dirigirse hasta los ganglios. Por ello en ese lugar se va a producir el encuentro entre la clula dendrtica con el LT. El LT virgen reconoce al Ag o no. Si hay reconocimiento, el LT se activa y pasa hacia el folculo linfoideo. Si no lo reconoce el LT sale del ganglio y pasa a circulacin. Esta recirculacin del linfocito permite que no se acumule un exceso de clulas en el ganglio y adems que tengan la posibilidad de encontrar otros Ag. (Los linfocitos T cuando se activan van a poder generar linfocitos de memoria (LTm). Estos linfocitos pueden ser centrales y otros perifricos. Los LTm perifricos (LTmp) no van a poder expresar ms el receptor, por lo que no van a poder volver al ganglio. En cambio los LTm centrales (LTmc) van a seguir expresando este receptor, parecindose ms a los vrgenes y por eso van a poder volver al ganglio). Algo parecido ocurre con los LB. Los LB tienen otras quemoquinas que participan en su migracin. Los LB vrgenes que circulan por sangre van a salir por las clulas del endotelio alto de las vnulas del rea paracortical del ganglio linftico. Las clulas endoteliales de estas vnulas expresan quemoquinas que no expresan las clulas endoteliales de otros vasos. Los LB reconocen a las quemoquinas CXCL13 que se encuentran en el folculo linfoideo y salen del vaso ( por el receptor CXCR5 que tienen en su membrana que reconoce a CXCL13). El LB que viene por sangre se fija a las paredes del vaso por quemoquinas que este tiene y que otros vasos no poseen. Los LB son atraidos hacia el folculo linfoideo por medio de quemoquinas CXCL13 que reconocen por medio de receptores CXCR5 de sus superficie, y migran hacia l. - 17 -

Cuando el LB virgen encuentra un Ag, disminuye la expresin de estos receptores CXCR5 y comienza a producir una mayor cantidad de receptores CCR7 para poder acercarse a los lugares donde estn los LTh . All se encuentran con los LTh que se han encontrado con el Ag, se produce la cooperacin T-B, se forma el foco primario que es donde hay proliferacin de LB, algunos van a transformarse en clulas plasmticas y van a producir Ac del tipo IgM, y otros van a formar el centro germinal donde van a seguir proliferando, se va a producir el switch y los linfocitos del centro germinal van a empezar a producir IgG, y se van a transformar en linfocitos de memoria. Los linfocitos que van a generarse en tejidos asociados a mucosas van a poder dirigirse a distintos lugares de acuerdo a los receptores de quemoquinas que tengan y del quemoquinas que se generan. Por ejemplo en LB que se gener en la mdula sea va a poder ir al tracto respiratorio, al urogenital, a las glndulas salivales, dependiendo de qu receptores para quemoquinas expresa y qu quemoquinas esta expresando el tejido. Todo esto se denomina TRFICO LINFOCITARIO, y los receptores que le permiten a los linfocitos hacer el viaje se denominan receptores de Homing. Trfico de linfocitos vrgenes Cada linfocito T o B vrgen debe poder llevar a cabo la tarea de encontrar y contactarse con su Ag especfico, en el momento en que ste ingrese en el organismo, cualquiera sea la va a travs de la cual acceda. De no existir mecanismos especializados de migracin, la probabilidad de que estos linfocitos encuentren a su Ag sera casi nula. Los linfocitos no ocupan posiciones estticas, sino que recirculan segn patrones de trfico definidos, que incrementan marcadamente la probabilidad de encuentro con sus Ag especficos. Los linfocitos nativos, una vez maduros, pasan a la circulacin sangunea, para luego extravasarse en los organos linfticos secundarios (OLS). Estos rganos incluyen, entre otros, ganglios linfticos, bazo, placas de Peyer del intestino, amigdalas y adenoides. Si no encuentran a su Ag especfico en estos rganos, los linfocitos retornan a la circulacin sangunea a travs de los vasos linfticos eferentes y el conducto torcico. En menos de media hora, volvern a extravasarse en un nuevo OLS, para recomenzar la bsqueda de su Ag especfico. Esta ruta migratoria favorece el encuentro entre linfocitos y Ag, dado que, las clulas dendrticas capturan Ag en los tejidos perifricos y los transportan a los OLS drenantes para presentarlos a los LT. Del mismo modo, el drenaje lnftico, incrementado como consecuencia de la inflamacin que acompaa a los procesos infecciosos, asegura el transporte de Ag al OLS drenante. Ello permite su reconocimieto por los LB especficos que se hayan extravasado en ese rgano. Ante seales coestimulatorias apropiadas, los LT y LB que encuentren a su Ag especfico se activarn, sufrirn expansin clonal y despus de unos das adquirirn funciones efectoras particulares y patrones de migracin caractersticos. As los LT que se diferencien a perfil LTh1 abandonan el OLS a travs del linftico eferente y por el conducto torcico pasan a la circulacin, para luego extravasarse en los tejidos perifricos inflamatorios. Los que se diferencian a LTh2 puden colaborar con los LB, una vez que estos han reconocido ya a su Ag especfico, o bien, abandonan el OLS a travs del linftico eferente, acceden a la circulacin y se extravasan en la periferia para participar en la respuesta inmune antiparasitaria o en fenmenos de alergia. La mayoria de los LT que han proliferado en respuesta al Ag mueren una vez eliminado ste. No obstante una pequea proporcin permanece como clulas de memoria para proporcionar proteccin duradera. - 18 -

Dos poblaciones de clulas T de memoria patrullan los distintos rganos para montar respuestas inmunes rpidas ante el reingreso del Ag. Las clulas T de memoria centrales inmunovigilan los rganos linfticos secundarios, mientras que las clulas T de memoria efectoras custodian los tejidos perifricos. Los LB que son activados por su Ag especfico en los OLS dan origen a plasmoblastos (precursores de clulas plasmticas) y clulas B de memoria. Los plasmoblastos pueden diferenciarse localmente en clulas plasmticas, que permanecen en los OLS o pueden abandonar el OLS a travs del linftico eferente y por el conducto torcico ingresar en el torrente sanguneo para poblar sitios distantes, como la mdula sea, la piel y las mucosas. Las clulas B de memoria tambin sufrirn recirculacin entre la sangre, el OLS y la linfa. Homing y activacin de linfocitos vrgenes en el ganglio linftico Los LB2 y los LT vrgenes se extravasan en el HEV (vnulas del endotelio alto) de gnglios linfticos merced a la expresin de CCR7 y L-selectina. Dado que los LB2 expresan tambin CXCR5, son reclutados a folculos linfoides por la quemoquina CXCL13. El reconocimiento del Ag incrementa su expresin de CCR7, lo que conduce a estas clulas a migrar hacia el rea T en respuesta a CCL19 y CCl21. Los LT que son activados por el Ag en el rea T neoexpresan CXCR5, el cual los conduce hacia el folculo. En el borde del folculo tiene lugar un primer evento de colaboracin T-B, cuyo producto es un foco primario de proliferacin. Algunas de las clulas all generadas migran a los cordones medulares donde se diferencian a plasmocitos mientras otras migran al folculo donde fundan el centro germinal.

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ANTGENOS

CARACTERSTICAS GENERALES La inmunogenicidad es la capacidad que tiene una sustancia de generar una respuesta inmune y tambin de interactuar con los productos de ella. La antigenicidad se refiere solamente a la capacidad de interacciones con los productos de una respuesta inmune, los productos de la inmunidad humoral y los productos de la inmunidad celular. Los productos de la inmunidad humoral son los Ac y los productos de la inmunidad celular van a ser los LT sensibles. Inmungeno: sustancia que introducida en un vertebrado adulto inmunolgicamente maduro es capaz de generar una respuesta inmune y posterirmente raccionar con el producto de la misma. El inmungeno siempre es antgeno. El antgeno no siempre es inmungeno. La alergenicidad es la capacidad de producir algn tipo de respuesta alrgica humoral o celular. La tolerogenicidad es la capacidad de una sustancia de inducir tolerancia. Muchas protenas de la dieta son extraas para el organismo e inducen tolerancia, es decir, hay mecanismos del sistema inmune que permiten ignorarlas. Dentro de los Ag, hay un grupo muy particular de molculas que se llaman haptenos. Son grupos qumicos definidos, orgnicos: dinitrofenol, trinitrofenol, todos compuestos a base de anillos aromticos. Los haptenos no generan respuesta inmune, pero si son antignicos porque pueden interactuar con los Ac preformados. Un hapteno se transforma en inmunognico si se lo une a una protena carrier o transportadora. En ese contexto el hapteno puede ser inmunognico. Cualquier protena inmunognica puede ser transportadora, como la seroalbumina humana (SAH) o seroalbumina bobina (SAB), a la cual se le puede adosar qumicamente el hapteno. Un conejo inmunizado va a generar Ac tanto para el carrier como para el hapteno. Si el hapteno lo unimos a una protena diferente, los Ac generados contra el primer carrier no interactan con el segundo, porque es una molcula distinta. Para la deteccin de Ac no puedo usar el mismo carrier.
Inmunizacin Buscamos los Ac: Cambio de soporte

Antgeno: sustancia capaz de reaccionar con el producto de la respuesta inmune in vitro (en el laboratorio). Puede generar una respuesta inmune.

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Es necesario siempre hacer un cambio de soporte o de carrier cuando se evala si se produjeron Ac contra el hapteno. Se evita as la deteccin de Ac anti-carrier.

Hapteno: sustancia de bajo PM que no induce respuesta inmunitaria, pero puede adquirir inmunogenicidad al unirse covalentemente a una protena de mayor peso molecular (carrier).

ALGUNAS DEFINICIONES DETERMINANTE ANTIGNICO: El determinante antignico es una zona de la molcula de los Ag. Puede haber ms de un determinante antignico en una molcula, y pueden ser todos iguales o todos distintos. Pero puede haber un nico determinante antignico en una molcula. Es una zona restringida de la molcula antignica que determina la especificidad. EPITOPE / PARATOPE: El epitope pertenece al determinante antignico, pero es un rea ms restringida. El epitope siempre est definido si existe un paratope para l. El paratope es el rea del Ac que va a reconocer el epitope. En un mismo determinante antignico puede haber varios epitopes que se superponen. A veces el determinante antignico tiene un solo epitope. En una protena, un epitope puede estar restringido a 5 o 6 residuos aminoacdicos. En un hidrato de carbono, en 5 o 6 unidades de glucosa, etc. Esos 5 o 6 aminocidos que van a determinar el epitope pueden ser continuos en la sustancia acdica de la estructura primaria de la protena: Epitopes continuos, secunciales o lineales. Los Epitopes discontinuos o conformacionales estn relacionados tambin pero en la estructura terciaria o cuaternaria de la molcula (estn cerca en la estructura tridimensional pero lejos en la secuencia lineal). VALENCIA FUNCIONAL: La valencia funcional se refiere a epitopes o determinantes antignicos que estn expuestos, se llaman funcionales porque son los que generan una respuesta inmune y provocan la sntesis de anticuerpos. VALENCIA TOTAL: La valencia total se refiere a los epitopes expuestos y ocultos. Hay muchos epitopes que por la estructura y plegamiento de la molcula no estn en la superficie. Si por alguna causa quedan expuestos tambin generaran una respuesta inmune. Ovoalbmina: 30 epitopes funcionales Bacilo tfico: 5,5 x 105 determinantes antignicos ANTGENOS HETERLOGOS: Son antgenos que se dan entre especies diferentes. ANTGENOS ISLOGOS: Son antgenos de una misma especie. ANTGENOS AUTLOGOS: Son antgenos propios del individuo. El sistema inmune tiene mecanismos para no reaccionar contra estos Ag, salvo en las enfermedades autoinmunes. En estos casos hay un desconocimiento de lo propio que

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provoca que se genere una respuesta inmune humoral o celular contra estos Ag autlogos. La respuesta inmune humoral posee Ac que reconocen a la protena nativa. Si la protena nativa se desnaturaliza, se procesa y se presenta a los LT se genera la respuesta inmune celular. Un Ag multivalente puede tener determinantes antignicos o epitopes diferentes o con todos los epitopes iguales. Un Ag multivalente con epitopes diferentes va a generar distintos tipos de Ac, cada uno de ellos para cada determinante antignico. Esta es una respuesta poliespecfica. En cambio en un Ag multivalente con todos los epitopes iguales, la respuesta va a ser monoepecfica. Un Ag monovalente tambin generar una respuesta monoespecfica.

RESPUESTA MONOESPECFICA

Antgenos multivalentes con epitopes todos iguales. Antgenos monovalentes. Antgeno multivalente con epitopes diferentes.

RESPUESTA POLIESPECFICA

Ag monoespecfico: posee todos los epitopes idnticos.

Ag poliespecfico: posee epitopes a repeticin pero no todos idnticos. Cada tipo de epitope genera un paratope distinto.

CARACTERSTICAS QUE DETERMINAN LA INMUNOGENICIDAD FACTORES DE LA MOLCULA La naturaleza de la molcula se refiere a si es una protena, o un hidrato de carbono, o un lpido, o un cido nucleico. Por excelencia las protenas son las que generan la mejor respuesta inmune. Los polisacridos tambin son inmunognicos aunque en menor cuanta. En cambio los lpidos y los cidos nucleicos son ms difciles como inmungenos, slo si forman parte de una estructura ms compleja. El DNA monohebra generalmente es ms inmunognico que la doble hebra. El problema de los cidos nucleicos es que generan Ac contra las bases y los azcares, por lo que pueden dar reacciones cruzadas con otros Ac que no fueron generados por ese DNA sino por otro. El carcter de no propio significa que la protena o el hidrato de carbono es extrao al sistema inmune. Que sea extrao quiere decir que el organismo lo desconoce, porque proviene de otro organismo alejado filogenticamente de nosotros.

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 Con respecto al tamao molecular, mientras mayor sea el tamao ms inmunognica ser la molcula. Pesos mayores a 10 KDa van a mermar la respuesta y protenas o azucares menores a 4 KDa ya no generan respuesta inmune. La heterogeneidad de la composicin qumica, se refiere a cun compleja es la molcula. Esta va a estar dada por las ramificaciones y plegamientos de las molculas. La configuracin ptica tambin influye, al igual que la rigidez de la molcula. Generalmente los anillos aromticos les confieren una rigidez a la molcula que las hace buenas inmungenas. Los cidos grasos, en cambio, tienen una cadena de hidrocarburos ms o menos larga que le confiere cierta inestabilidad a la molcula. La degradabilidad: las protenas estn compuestas por L-aminocidos, aunque hay sustancias en la naturaleza que son dextrgiras. Esas molculas son poco inmunognicas en vertebrados. Este hecho se debe a que no hay sistemas enzimticos capaces de degradarlos, y la degradacin de la molcula es una va importante para llegar a la inmunidad celular. Por lo tanto cuanto menor degradabilidad, menor inmunogenicidad.

OTROS FACTORES Otros factores que afectan a que una molcula sea ms o menos inmunognica es el genotipo del receptor. Hay unas molculas que son muy necesarias para el procesamiento y presentacin del Ag a los LT que se llaman molculas del COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (CMH). Estas molculas son el lugar donde se van a montar los pptidos para ser presentados a los LT. El receptor del LT (TCR) reconoce tanto al pptido como a la molcula del CMH. Esta es la seal para que el linfocito T se active. La expresin de las molculas del CMH va a depender mucho del genotipo del receptor de los linfocitos, TCR para los LT y BCR para LB, del genotipo de las molculas del CMH, y tambin de los genes que codifican para las IL, que van a orquestar toda la respuesta inmune. Las dosis y las vas de administracin (oral o parenteral) tambin son importantes. Las dosis altas y las dosis bajas generan tolerancia, que es una inactividad del sistema inmune. La concurrencia de antgenos se refiere a cuando hay ms de un Ag en un inculo. Esto es bueno cuando uno de los Ag acta como adyuvante de los otros. Lo ideal es inocular Ag por Ag para evitar interferencias negativas. En algunos casos la interferencia puede ser positiva y uno de los inmungenos potencia la respuesta inmune del otro, entonces de los utiliza como adyuvantes. Ejemplo: vacuna triple: Difteria, Bordetella pertusis y Ttanos. La Bordetella pertusis tiene una actividad adyuvante intrnseca. Esta vacuna tiene el toxoide de la Difteria, el toxoide del Ttanos y Bordetella pertusis, que acta como adyuvante de los otros dos, mejorando as la respuesta inmune. A veces la concurrencia de Ag es mala, sobre todo dependiendo de la dosis con que se inoculan cada uno de los componentes del inculo. Puede ser que se genere un fenmeno que se llama DOMINANCIA CLONAL, en el cual se va a activar predominantemente un solo clon con LB sobre el resto, con lo cual se van a tener - 23 -

muchos anticuerpos contra un solo Ag, el que domina, y muy pocos Ac contra los restantes Ag que componen el inculo. Esto es muy importante en las vacunas, donde se intenta que el nmero de inoculaciones disminuya. Por lo que empiezan a aparecer vacunas triples, cudruples, quntuples, que renen distintos inmungenos. En las vas de inoculacin se ha visto que la subcutnea tiene mejores resultados que la intraperitoneal, y muchos mejores de resultados que las intravenosas. Esto se debe a que en la inoculacin subcutnea, las clulas de Langerhans que son clulas dendrticas, toman el Ag y lo llevan al ganglio para presentarlo a los LT y a los LB. En la inoculacin intravenosa, el inculo va por sangre y termina en el bazo. Se usa mucho la va intramuscular (casi todas), y tambin se est buscando la va oral. Con ella se estimula el MALT (tejido linfoide asociado a mucosas). En un principio esto genera la produccin de un Ac en particular que protege las mucosas, pero despus termina produciendo IgG que son las ms importantes y son las que confieren inmunidad de por vida. Este es el ejemplo de la Sabin.

Modificadores de la inmunogenicidad: Dosis de inmungeno. Cocurrencia de Ag. Tipo de animal inmunizado (existen animales ideales para determinados Ag y viceversa) Adyuvantes.

ADYUVANTES Mejora la presentacin del Ag, a que acudan al lugar clulas inmunocompetentes. Por ejemplo: el adyuvante de Freud incompleto, que es una emulsin de aceite en agua, y el adyuvante de Freud completo es el que tiene el macerado de bacilos tuberculosos. El mecanismo de accin de la mayora de los adyuvantes puede ser centrado en el efecto de depsito, lo que favorece la liberacin retardada del Ag. Muy poco eficiente va a ser la respuesta inmune si el Ag se degrada rpidamente, por eso la va intravenosa para muchos de los Ag solubles es contraindicada, porque el catabolismo los elimina de la circulacin mucho antes de que lleguen a impactar con el sistema inmune. El efecto de depsito proporciona un lugar a partir del cual el Ag se libera lentamente. Esto produce estmulos a repeticin. Cuando se inyecta un adyuvante de tipo oleoso, en la zona de inoculacin se forma un granuloma, el cual es una estructura que forman los macrfagos al rodear al inculo y puede en un futuro llegar a producir un absceso, sobre todo si el adyuvante es completo. Va a ser un absceso estril porque no tiene el patgeno, pero provoca las mismas reacciones de tipo inflamatorias que van acompaadas por el acudimiento al lugar de macrfagos, clulas dendrticas, que toman el Ag y lo llevan al ganglio regional para ser procesado por los LT. Es una manera de asegurarse la eficiencia del sistema. Freud con MDP (muramildipptido), es el componente activo que se ha sido aislado de la pared de Micobacterium tuberculosis.

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El hidrxido de aluminio es otro de los adyuvantes que se usan y es uno de los pocos que pueden usarse en seres humanos, a veces acompaado con Burdetella pertusis atenuada. Otros enfoques de los adyuvantes: Las citoquinas: las IL participan desviando la respuesta inmune hacia humoral o celular. El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrfagos y la IL-2 se utilizan mucho para favorecer la respuesta LTh2, y la IL-12 para los LTh1. La respuesta por LTh2Ac (humoral), la respuesta por LTh1celular. Los liposomas tambin se usan (membranas fosfolipdicas con el Ag), favorecen el depsito y la liberacin lenta del Ag. Los ISCOMs (complejos inmuno estimuladores) se hacen con un surfactante, que van a formar micelas en las cuales uno puede introducir un Ag. As la liberacin del Ag es ms lenta y a pulsos. Hay vacunas de uso veterinario cuyo adyuvante se llama Qui A, es un derivado de la saponina.

Adyuvantes: son sustancias que incentivan la respuesta inmune de otras: hacen que inmungenos dbiles induzcan una respuesta inmune adecuada o convierten sustancias no inmunognicas en inmunognicas. Por si mismas no intervienen en la respuesta inmune. Algunos exaltan la inmunidad humoral y otros la inmunidad celular. La respuesta inmune se exacerba de modo que: Es ms rpida en el tiempo. Es ms prolongada. Existe produccin de distintos isotipos de Ig.

ALTERACIN DE LOS ANTGENOS Se puede hacer por adicin de anillos aromticos para favorecer la rigidez de la molcula, siempre y cuando la idea sea mejorar la inmunogenicidad de esa molcula y no se estn alterando los epitopes que interesan. Lo mismo ocurre cuando a los anticuerpos o a los antgenos se le adicionan marcas: fluorocromos, tomos radiactivos, enzimas, etc. La marca no debe alterar epitopes ni paratopes.

ANTGENOS TIMO-DEPENDIENTES Y TIMO-INDEPENDIENTES La colaboracin de las clulas T es importante para una buena respuesta inmune, con lo cual la mayora de las protenas antignicas y los haptenos unidos a carriers generan una respuesta de tipo T-dependiente. Existe una clase particular de Ag que no necesitan de los LT. Hay dos clases de antgenos T-independientes: los de clase I y los de clase II. Los de clase I son mitognicos, esto es, activan a los LB inespecficamente, produciendo una cantidad de clones indefinida de LB con muchas especificidades diferentes. Se tiene as una respuesta poliespecfica a partir de un solo Ag. No necesariamente entre los clones va a

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estar el que genera Ac especficos para ese Ag. Un ejemplo es el LPS que interacciona con receptores de la membrana que no son BCR, pero que terminan llevando a la activacin del LB. Los Ag T-independientes de tipo II generalmente son Ag con secuencias repetidas, entonces lo que hacen es entrecruzar los BCR. Esto lleva a la activacin del LB, y en este caso s es especfico porque entrecruzan los BCR que lo reconocieron. El ejemplo es el polisacrido del neumococo. Los Ag T-independientes se descubrieron en ratones nude, que tienen aplasia tmica (sin timo y sin LT) y an as respondan al polisacrido del neumococo. Los Ag T-independientes I generalmente llevan a una produccin de Ac IgM, que es el primer Ac que se genera y no necesita colaboracin T para secretarse. Mayoritariamente se produce IgM en los Ag T-independientes II, aunque se ha visto pequeas cantidades de IgG.
PROPIEDAD Respuesta de Ac en ausencia de LT Produccin de Ac en individuos congnitamente atmicos Activa LT Activacin de LB no Especficos Requiere epitopes Repetidos NO Ag T-DEPENDIENTES NO Ag T-INDEPENDIENTES I SI Ag T-INDEPENDIENTES II SI

NO SI NO

SI NO SI

SI NO NO SI, polisacarido del neumococo, flagelina polimerizada (Salmonella)

NO, LPS bacteria Brucella abortus

Ag T- dependientes: necesitan la colaboracin de los LT para inducir la respuesta inmune sobre los LB. Son moolculas complejas que poseen determinantes a repeticin y de todo tipo. Generan IgG e IgM. Ag T-independiente: inducen la respuesta inmune directamente sobre los LB. Poseen determinantes antignicos lineales. Generan respuesta inmune del tipo IgM. Se agrupan en dos categorias: -Tipo I: Son mitognicos de los LB, inducen respuesta policlonal de Ac, son activadores de macrfagos e inducen la produccin de IL, INF y PG. -Tipo II: Son polmeros de polisacridos que necesitan de factores solubles para inducir respuesta inmune. Favorecen la polimerizacin de los recptores antignicos de los LB (Ig de membrana) iniciando la transduccin de seales que llevan a la activacin de la clula.

ANTGENOS BACTERIANOS Las bacterias son cmulos de Ag.

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VENENOS ANIMALES Y VEGETALES Los venenos vegetales y animales generalmente se transforman en toxoides con el tratamiento con formol. La diferencia entre el toxoide y el veneno es la inactividad de la molcula del toxoide. Por ejemplo, el veneno de serpiente es neurotxico, el toxoide no es neurotxico, pero s genera respuesta inmune. (Este es el fundamento para la generacin de suero antiofdico).

ANTGENOS DE ESPECIE Y DE RGANOS Hay Ag que se encuentran en una especie y no en otra (Ag de especie). Los Ag de rganos (privilegiados) estn aislados del organismo y el propio sistema inmune no conoce (gnadas, ojos).

ANTGENOS COMPARTIDOS Los Ag compartidos son los que se encuentran en varias especies vertebradas o no y pueden estar muy dispersados en la naturaleza. Los Ag heterfilos son Ag que se encuentran en la mucosa del estmago de especies como porcinos, bovinos, en GR de carnero. Cuando se los descubri vieron que los GR de carnero se lisaban cuando se inyectaban con un suero obtenido de un conejo que fue inoculado con un rin de cobayo. Estos se denominaron ANTGENOS DE FORSSMAN. Estn en la superficie de los GR de carnero y en el rin de cobayo. Los GR de carnero son muy importantes para tcnicas serolgicas. En el sistema ABO hay tres genes que codifican para la adicin de azcares en la membrana de los GR. La nica diferencia que existe entre la sustancia A y la B es una N-acetilgalactosamina en el A y una galactosa en el B. El resto del esqueleto es el mismo para los tres Ag. El esqueleto no est codificado por el gen del sistema ABO, el gen A o B solo lleva a la adicin de un residuo sobre ese esqueleto. Hay 8 genotipos posibles pero solo 4 fenotipos: GENOTIPOS AA o Ai BB o Bi AB ii FENOTIPOS A B AB O

Repasando: Un hapteno se caracteriza por no generar una respuesta inmune por s mismo, pero s puede generarla si se une qumicamente con un carrier o protena transportadora. Para evaluar la respuesta anti-hapteno se debe cambiar el soporte. Esto es porque en la respuesta inmune se generan Ac tanto para el hapteno como para la protena carrier. Si se quiere evaluar si en verdad se produjeron Ac anti-hapteno debemos usar un carrier diferente para no estar obteniendo un falso positivo.

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Los antgenos T-dependientes necesitan de los linfocitos T para orquestar la respuesta inmune. Los antgenos T-independientes generan una respuesta inmune sin la colaboracin de los LT. Hay dos clases: los T-independientes I interactan con receptores distintos de los BCR, se unen a otros receptores que terminan igualmente activando al LB. Los Ac que se van a producir del LB no van a ser especficos contra el Ag T-independiente I, y como activa muchos clones de LB, se van a obtener muchos tipos de Ac, cada uno proveniente de un LB diferente, pero activado por el mismo Ag inespecfico. Los Ag T-independientes II s interactan con los BCR, son generalmente Ag con epitopes repetidos, como los polisacridos, que lo que hacen es entrecruzar los receptores y van a hacer que el LB se active. En este caso la especificidad va a ser contra el Ag T-independiente II, ya que el Ag se une a su receptor y hay un reconocimiento. En ambos casos, tanto para los del tipo I como para los del tipo II, los Ac que se producen son IgM.
Ag T-i I

Ag T-i II

BCR

LB

IgM

LB

Ac

no anti-Ag T-i I muchos tipos de Ac

Ac especficos para Ag T-i II

De los venenos vegetales y animales generalmente la toxina se inactiva con un tratamiento con formol para poder inocularla en un animal para poder obtener un suero anti-veneno.

MITGENOS Los mitgenos son sustancias que inducen la divisin de los LT y LB, inespecficamente, por lo que las especificidades de los Ac y las clulas que se generan van a ser variadas. Esto es porque se activan muchos clones de LB y muchos de LT, es una activacin poliepecfica. Ejemplo: concavalina A y fitohemaglutinina, son dos lectinas, son mitgenos de LT; el mitgeno de fitolaca (planta) activa LT y LB, el LPS es un mitgeno de los LB. No todos los mitgenos son antgenos T-independiente II (hay mitgenos que activan LT).

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SUPERANTGENOS Son activadores policlonales de LT, con lo cual algunos superantgenos son mitgenos. Pero el superantgeno tiene un mecanismo particular de estimular al LT. El mecanismo que lleva a la activacin del LT es por una unin lateral del superantgeno al complejo TCR-pptido-CMH clase II, con la salvedad que al superAg no le interesa el pptido presentado. El LT necesita que una clula le presente el pptido contra el cual es especfico el LT, sobre las molculas del CMH. El pptido proviene del Ag. Este pptido es el que le va dar especificidad a la clula que se activa. Se llegan a activar hasta el 20% de la poblacin de LT totales que circulan. La activacin de los LT puede llevar a la liberacin de muchas sustancias que pueden llevar a un shock y a la muerte. Cuando ocurre dentro de una respuesta inmune normal, es un mecanismo regulado. Este es el mecanismo que tiene el sndrome del shock txico del Stafilococus aureus.

LOS ANTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Se descubrieron con el rechazo de trasplantes e injertos. Analizando por qu un tejido era rechazado en un individuo de una misma especie fue como se lograron detectar por primera vez en la membrana de los linfocitos unas molculas. stas eran blanco del sistema inmune del aceptor del transplante. Se los vio por primera vez en la membrana de los linfocitos, por lo que se los llam HLA: Human Leukocyte Antigens. Despus de 50 aos de ser descubiertos se comprendi la verdadera funcin de las HLA, la cual es intervenir en el procesamiento y la presentacin de Ag a los LT, evento necesario para la activacin del LT. Se descubri que hay una gran variedad de molculas de HLA con gran homologa entre si pero que igualmente se podan subdividir. Las molculas del CMH de clase I y clase II son las que tienen que ver con el procesamiento y la presentacin del Ag. Los de clase III, algunos estn relacionados con la respuesta inmune y otras no. Este CMH est codificado por el cromosoma 6 humano, donde estn todos los loci para cada una de las molculas de clase I, II y III. El CMH clase I carga el pptido sobre dos de los dominios que tiene la molcula. En el CMH de clase II dos dominios de dos molculas diferentes contribuyen a cargar el pptido. CARACTERSTICAS DEL CMH Se le dice complejo porque abarca muchos genes y comparten ciertas caractersticas. Una de ellas es el poligenismo, es decir, hay genes para varias molculas HLA (varios genes para varias molculas). El polimorfismo del complejo se refiere a que en los distintos individuos no todas las HLA son iguales, esto es lo que termina con el rechazo de un transplante o injerto. La codominancia del complejo indica que se expresa tanto el haplotipo paterno como el haplotipo materno, entonces por cada molcula de HLA hay dos genes alelos que se expresan. El polimogenismo se refiere a que existen varios genes y molculas lase I y II dentro del CMH. Cada uno de estos genes a su vez son polimrficos, entonces la secuencia de

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genes, y por lo tanto, de protenas codificadas por ellos, difiere entre individuos y es responsable de la histocompatibilidad. La codominancia se debe a la expresin simultnea de genes paternos y maternos. MAPA GENTICO DEL BRAZO CORTO DEL CROMOSOMA 6 Entre los genes del CMH clase I y clase II estn los genes de clase III. Las principales HLA del humano son: HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DP HLA-DQ HLA-DR

CMH clase I

CMH clase II

Como expresamos tanto el haplotipo paterno como el materno, expresamos al menos 12 molculas de HLA diferentes expresadas en la membrana de las clulas. Con el tiempo se han ido secuenciando todas estas molculas del CMH. Al principio se haca por serologa. Usar un Ac es algo inespecfico para reconocer una molcula, ya que reconoce una partcula de la molcula, y puede darse que esa partcula est repetida en muchas molculas de HLA. En workshop internacionales cientficos se renen y presentan las secuencias de HLA que ellos han logrado aislar. La nomenclatura comienza con el nombre del complejo: HLA, despus el locus al cual pertenece, a continuacin se coloca un asterisco que indica que ha sido reconocida en un workshop o taller internacional, luego viene un nmero de cuatro dgitos de los cuales los dos primeros corresponden a la especificidad, que es la clase de HLA que se logr distinguir mediante Ac. Cada especificidad puede contener muchas HLA homlogas que por serologa no se podran distinguir, pero s por tcnicas del DAN recombinante, con lo cual se agregan lo dos ltimos dgitos para la variante. Ejemplo: HLA - A* - 0102 Los HLA-A, HLA-B y HLA-C tienen una sola cadena codificada en el complejo, y forman la molcula unindose a otra molcula codificada fuera del complejo. ESTRUCTURA DE LAS MOLCULAS DEL CMH CMH clase I: est compuesta por dos cadenas, una y una . La cadena no est codificada dentro del complejo y se la conoce como 2- microglobulina. Las cadenas tienen un PM=44 KDa y la cadena 2- microglobulina un PM=12 KDa. La cadena es muy polimorfa y la 2- microglobulina es la misma para todas las HLA clase I. La caracterstica ms importante es el plegamiento. Los dominios 1 y 2, que son los ms alejados de la membrana forman una hendidura o ranura producto del plegamiento de la molcula. El dominio 1 forma a travs de un plegamiento hlice- una de las paredes de esa ranura, el dominio 2 forma la otra pared de esa ranura. El piso de la ranura est formado por 8 lminas de plegamiento , 4 aportados por el dominio 1 y 4 aportados por el dominio 2. El dominio 3 es el que se une a 2- microglobulina no covalentemente, y es el ms conservado de los tres dominios . El polimorfismo va a estar ubicado en la ranura, que es el lugar donde va a estar el pptido. Hay 20 lugares crticos aportados por el

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dominio 1 y 2 que fundan la ranura y son determinantes de la especificidad de los pptidos que se van a presentar. CMH clase II: la estructura es bastante similar en cuanto a los plegamientos. Est formada por una cadena de 34 KDa y una cadena de 29 KDa. Las cadenas y , ambas, pertenecen al complejo. El dominio 1 es el que contribuye a la formacin de la ranura junto con el dominio 1. El dominio 2 y 2 aportan la base para los dominios 1 y 1. El plegamiento para formar la ranura es el mismo que para la clase I: lmina plegada para el piso y hlice para los costados. Lo que s es diferente es la forma de la ranura de los HLA clase I y clase II. En la clase II la ranura es ms abierta hacia los extremos.

Clase I

Clase II

Ranura cerrada hacia los extremos. La carga est limitada al tamao del pptido.

Ranura abierta hacia los extremos. El pptido se puede acomodar por los extremos.

Hay un grupo de HLA no clsicas (o lb). Hay codificados genes para la repuesta inmune, por ejemplo para las molculas MIC-A y MIC-B, que son ligandos para receptores que tienen las clulas NK, son receptores de citotoxicidad. Hay otras molculas dentro de las HLA-lb que se conocen como: HLA-F, HLA-G, HLA-E, HLAH o HFE. No interaccionan con el TCR. La HLA-H o HFE tiene que ver con el metabolismo del hierro. Los genes de clase III codifican para TNF- y TNF-, para factores del complemento, y hay enzimas, como la 21-hidroxilasa, que no tienen que ver con la respuesta inmune. En los genes de clase II, entre DO y DQ hay dos genes que codifican para unas molculas que no presentan pptidos: TAP, TAPASINA, LMP2, LMPZ, que son molculas que tienen que ver con la presentacin antignica.

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Tipos de Ag: Xenoantgenos o Ag heterlogos: son Ag que originan Ac en una especie distinta de la que ellos derivan. Dan lugar a inmunidad especfica isotpica. Aloantgenos o Ag islogos: son Ag que originan Ac en individuos de la misma especie pero genticamente distintos. Dan lugar a especificidad alotpica. Autoantgenos o Ag autlogos: se hallan presentes en todas las clulas del individuo pero no se producen Ac contra ellos ya que son reconocidos como propios. Ag heterfilos: son Ag similares presentes en varias especies diferentes (hongos, parsitos, bacterias, vertebrados, vegetales). Pueden reaccionar con Ac de otras especies. Ag rgano-especficos o secuestrados: son propios de un rgano, estn encerrados en l y no toman contacto con el sistema inmune. Si se liberan el organismo no los reconoce como propios. Ej: protenas del cristalino del ojo. Ag tumorales: son molculas especficas expresadas en la superficie de tumores las cuales pueden ser reconocidas por el sistema inmune. Pueden ser utilizados como blanco de Ac monoclonales en inmunoterapia. Superantgenos: son protenas capaces de estimular a los LT sin procesamiento y degradacin. Se unen a las molculas del CMH-II por una zona distinta a la normal. La respuesta inmune generada es menor. Ag de los GR humanos: los determinantes antignicos sobre los GR permite su divisin en grupos sanguneos. Ag de leucocitos (HLA): Los leucocitos poseen en sus membranas Ag que s estn presentes en otras clulas pero que no estn en los GR (Ag del CMH). Son importantes en la propagacin de la respuesta inmune.

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PROCESAMIENTO Y PRESENTACIN DE ANTGENOS

La inmunidad adaptativa humoral lleva a la produccin de Ac contra un patgeno que van a provocar la eliminacin del mismo, y la celular lleva a la activacin de LT, sensibilizados contra ese Ag en particular. Los dos procesos son necesarios en una respuesta inmune porque muchos de esos procesos se ven beneficiados con la ayuda de los LT. La manera que tienen los linfocitos de reconocer y de activarse es diferente en tanto sea un LT o un LB. El LB tiene, para reconocer al patgeno y desencadenar la respuesta inmune humoral, un receptor que se llama BCR. El BCR reconoce a la molcula nativa, al Ag de una molcula nativa. Para que un LT se active y genere la respuesta celular, tiene un TCR. El TCR tiene un modo diferente de ver al Ag patgeno. No reconoce la molcula nativa, sino pequeos pptidos de ella, pero no pptidos solubles en solucin. Los reconoce montados sobre las molculas del CMH. Los LT reconocen pptidos lineales derivados del antgeno y montados en molculas del CMH. Esto ltimo se logra a travs del procesamiento y presentacin del Ag.

CLULA PRESENTADORA DE ANTGENOS (CPA) Es la que procesa y presenta el Ag sobre las molculas del CMH a los LT. Esta es la nica manera que tiene el LT para activarse. Para poder llevar una protena nativa a pequeos pptidos se necesitan de la actividad de proteasas. Las CPA tienen proteasas. Se requiere que se unan los pptidos a las molculas del CMH a medida que se van sintetizando. Una vez que est cargado el pptido sobre el CMH debe expresarse en membrana. Todos estos eventos ocurren dentro de la CPA.
CMH TCR

CPA

LT

PPTIDO

TODAS LAS CLULAS CON NCLEOS PUEDEN SER CPA. Las CPA se las puede subdividir en profesionales o no profesionales. Las CPA PROFESIONALES son aquellas clulas nucleadas capaces de poder expresar las molculas del CMH de clase II. Son slo una pequea fraccin: Macrfagos Clulas dendrticas LB LT activados

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Todas las clulas del organismo son capaces de montar el pptido en molculas del CMH de clase I, salvo las anucleadas: GR. Son CPA NO PROFESIONALES y utilizan una va endgena.

PRESENTACIN POR MOLCULAS DEL CMH DE CLASE I (VA ENDGENA O BIOSINTTICA) Generalmente los pptidos provienen de protenas endgenas, del citosol de la clula. Estas protenas provienen de patgenos intracelulares como virus o cualquier patgeno cuya parte del ciclo celular pase por el citosol. Tambin provienen de protenas endgenas del citosol (hsp, histonas, pptidos lderes). Estos pptidos pueden encontrarse montados en molculas del CMH de clase I. Las protenas propias no deben generar respuesta inmune. EL PROTEASOMA Es una estructura compleja que se encuentra en el citosol de todas las clulas. Tiene un core (ncleo) y dos casquetes regulatorios. Es un complejo multimrico, pesa en conjunto 2000 KDa, los casquetes pesan 700 KDa cada uno y el ncleo, que es donde se encuentran las enzimas proteolticas, pesa 650 KDa. El ncleo est compuesto por cuatro anillos apilados de los cuales, los anillos centrales son los que tienen la actividad proteoltica. Son los anillos , los no tienen actividad proteoltica. La protena para poder entrar al proteosoma y ser degradada, debe ser reconocida por el proteosoma. Para ello la protena debe ser poliubiquitinada. Hay enzimas E1, E2 y E3 que se encargan de adosarle a la protena unidades de ubiquitina. La protena poliubiquitinada es reconocida por los casquetes regulatorios, pasa al core y es degradada a pptidos. Solamente el 10% de los pptidos que se generan tienen el tamao adecuado para montarse en las molculas del CMH de clase I. Ciertas subunidades del proteosoma (del core) pueden ser sustituidas por: -1 -5 -10 LMP2 LMP7 LMP10

INF-

Estas protenas estn codificadas dentro del CMH. Estas molculas LMP tienen actividad enzimtica ms eficiente para los pptidos que se cargaran en el CMH clase I. Es decir, se hace ms eficiente el proceso para generar pptidos con longitudes apropiadas para el CMH clase I. Al producirse el reemplazo la estructura pasa a llamarse INMUNOPROTEOSOMA. TRANSLOCADOR TAP Son las protenas encargadas de translocar los pptidos del tamao adecuado producidos por el proteosoma hacia el retculo endoplasmtico (RE). En el RE estn las molculas del CMH clase I. Las TAP pertenecen a la familia de transportadores ABC (ATP binding cassette), son protenas que unen ATP para poder realizar el pasaje del citosol al lumen del RE.

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EN EL INTERIOR DEL RE La calnexina es una chaperona, ayuda a un buen plegamiento de la protena, en este caso de la cadena del CMH clase I. La calnexina es una chaperona de membrana, est anclada a membrana y promueve tambin la unin de 2-microglobulina (2 m). Una vez unido el complejo 2-m, la calnexina se separa y se une la calreticulina al mismo. Esta es una chaperona soluble, ayuda al buen plegado del complejo 2-m. La calreticulina con la molcula del CMH clase I an no totalmente plegada forma un complejo con tapasina y con el translocador TAP. Tapasina se ubica entre TAP y el complejo, haciendo de puente de unin. El CMH clase I no est correctamente plegado hasta que se une el pptido. El pptido induce un cambio conformacional en la molcula. Entonces los pptidos que salen del proteosoma pasan por TAP y son cargados sobre el CMH clase I. Una vez unido el pptido se pliega correctamente el complejo, se desprende calreticulina, tapasina y TAP, y el CMH clase I pasa a Golgi y de Golgi a membrana. En la unin de los pptidos a los CMH clase I es muy importante la interaccin que ocurre en los extremos ya que esto estabiliza mucho la unin. Hay interacciones entre el pptido y residuos aminoacdicos de la ranura: los extremos N y C terminales del pptido se unen a residuos de aminocidos conservados en la ranura. PRESENTACIN CRUZADA En algunos casos pptidos de microorganimos o patgenos endocitados pueden pasar desde el endosoma al citosol, o bien, una protena exgena puede acceder al citosol, esto permite que Ag que penetraron a la clula por va exgena sean presentados a los LT citxicos por el CMH clase I. PPTIDOS QUE SE UNEN A LAS MOLCULAS DEL CMH DE CLASE I Las molculas del CMH-I unen pptidos compuestos por 8 a 12 residuos de aminocidos. Los extremos N y C terminales se unen a residuos de aminocidos conservados en la ranura: posiciones de anclaje definidas. Los pptidos presentados derivan de la degradacin de: protenas endgenas propias (histonas, hsp, secuencias lderes) o patgenos intracelulares.

PRESENTACIN POR MOLCULAS DEL CMH DE CLASE II (VA EXGENA O ENDOCTICA) Las CPA toman protenas del medio extracelular, las endocita y se forma as un endosoma temprano. El pasaje a endosoma tardo se caracteriza por la disminucin del pH para activar enzimas que van a degradar la protena fagocitada a sus pptidos. El endosoma tardo es el que se va a encontrar con el CMH clase II. La molcula del CMH clase II es sintetizado en el RE, donde ocurre el correcto plegado de la misma. Se sintetizan las cadenas y por separado, se pliegan por accin de las chaperonas con la particularidad de que participa un tercer componente llamado cadena invariante (li). La cadena invariante va a tapar el sitio de unin al pptido. Esto es porque en el lumen del RE van a estar los pptidos que se van a unir a las molculas del CMH de clase I. La protena li, adems, hace a veces de chaperona,

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de pptido lder que va a guiar a la molcula del CMH clase II hacia las vesculas que finalmente se van a unir con los endosomas tardos. Una vez producida la fusin del endosoma tardo con la vescula que trae la molcula del CMH clase II, esta nueva vescula va a contener las enzimas del endosoma, el pH bajo, y los pptidos junto con el CMH clase II con su li. Gracias a las catepsinas y al pH que hace que se activen esas catepsinas, la li va a ser clivada, pero no en su totalidad, queda un pequeo pptido en la ranura, llamado CLIP. La carga del pptido est mediada por dos componentes. La HLA-DM promueve la remocin del CLIP. Tiene sitios de alta afinidad que enseguida remueven al CLIP de la ranura y cargan un pptido. Si el pptido no tiene la afinidad suficiente es removido inmediatamente por DM y reemplazado por otro, y as hasta encontrar un pptido con la afinidad suficiente. A DM tambin se la conoce como protena editora. Luego la molcula del CMH clase II con su pptido es llevado a membrana La protena HLA-DO inhibe a DM. Ambas son dmeros con una cadena y otra . PPTIDOS QUE SE UNEN A LAS MOLCULAS DEL CMH DE CLASE II Las molculas del CMH-II unen pptidos compuestos por 8 a 30 residuos de aminocidos. Las posiciones de anclaje no estn claramente definidas. Los pptidos presentados derivan de la degradacin de: protenas propias que se expresan en membrana (receptores, CMH- I o II, etc.) o son secretadas (hormonas, albmina, etc.) o protenas extraas de patgenos extracelulares fagocitados o de patgenos que se alojan en compartimentos endosmicos.

PRESENTACIN POR MOLCULAS NO CLSICAS DEL CMH-I Las molculas del CMH clase I clsicas son HLA-A, HLA-B y HLA-C; las no clsicas tambin presentan Ag, pero son incapaces de interaccionar con el sistema inmune (HLA-E y HLA-G). Hay otras molculas que presentan Ag que son las CD1. Forman parte del complejo CMH Ib, CD1 junto con FcRn (receptor para Fc neonatal). Son molculas que estn asociadas a los CMH I, pero no estn en el mismo cromosoma. Su estructura es muy similar: una cadena de tres dominios que se unen a 2m y tienen la capacidad de formar una ranura que va a estar bastante tapada. Con esto la entrada va a estar bastante reducida. El interior de la ranura est tapizada por aminocidos hidrofbicos, esto la hace una molcula muy buena para fijar glucolpidos. La parte hidrofbica entra en la ranura y la parte polar queda hacia afuera. Presentacin de Ag mediada por CD1: Presenta glucopptidos, cosa que no hace ninguna otra molcula dl CMH. Presenta derivados de micobacterias y pptidos hidrfobos. Estos compuestos son reconocidos por los LT con el TCR, con TCR y por NKT.

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LAS INMUNOGLOBULINAS

PASOS PARA GENERAR UNA RESPUESTA INMUNE Ingresa un Ag, un agente extrao actan los mecanismos innatos. Los mecanismos innatos son inespecficos, inmediatos, no tienen memoria y siempre van a actuar igual ante entradas sucesivas del mismo Ag. Se produce la inflamacin. Participan muchas clulas, entre las cuales est el macrfago. Produce muchas cosas, entre ellas la IL-1, IL-6 y TNF-. Si no se elimina el Ag con todos estos mecanismos, comienzan a desarrollarse otros mecanismos que se llaman adaptativos o mecanismos especficos. Son un poco ms lentos porque tardan un poco ms en desarrollarse, son especficos y tienen memoria. Las clulas ms importantes en estos mecanismos son los LT y los LB. Estos dos linfocitos van a reconocer a esos Ag extraos. El LT reconoce solo pequeos pptidos del Ag, presentados por las CPA sobre las molculas del CMH. Una vez que el LT reconoce al Ag se va a activar, va a proliferar y va a comenzar a ejercer sus funciones efectivas. De aqu van a salir LT efectores y LTm. El LT tiene un receptor que se llama TCR. El LB tambin reconoce al Ag que entr pero lo reconoce solo y reconoce al Ag en forma nativa. Tiene tambin un receptor, el BCR. Dependiendo de cual es el Ag que entr, el linfocito va a diferenciarse a plasmocito y producir Igs (Ag T I), o va a precisar que lo ayude un LT (Ag T D) Algunos LT, en particular los LTh2, van a ayudar a los LB para que se diferencie a plasmocito y produzca los anticuerpos o inmunoglobulinas. Algunos LB van a ser LBm. Depende de qu Ag sea, se va a favorecer un mecanismo u otro. El estudio de las inmunoglobulinas comenz en el ao 1939. Un cientfico descubri que cuando inmunizaba un animal con un Ag, le sacaba sangre, aislaba el suero y haca una corrida electrofortica de ese suero, separando las protenas por la movilidad que tienen, encontr una fraccin que era la correspondiente a la fraccin , que estaba muy aumentada. Despus se dio cuenta de que si haca este mismo procedimiento a lo largo de las inmunizaciones, esta fraccin aumentaba ms. Entonces se le ocurri ver que pasaba si enfrentaba el suero de ese animal con el Ag que haba usado para inmunizarlo, e hizo una corrida electrofortica. Observ que esta fraccin estaba muy disminuida. Esto pas porque todos los Ac se haban pegado a sus Ag. Entonces dedujo que la actividad Ac se localizaba en esta fraccin. Es por esta razn que a los Ac se los denomina muchas veces gamaglobulinas. A los Ac le fueron dando distintos nombres de acuerdo a las reacciones que podan realizar in vitro. Por ejemplo, se llamaban precipitinas a los que precipitan un Ag soluble; se llamaban aglutininas cuando aglutinaban a los Ag particulados; se llam hemolisinas a los Ac anti-GR que producan la lisis de los GR cuando se agregaba el complemento. Es importante tener en cuenta que el Ac solo se fija o liga pero no pueden destruir por s solo una clula, necesita de otros mecanismos, en este caso el complemento. Despus vieron los investigadores que un mismo Ac puede tener varias funciones, es por esto que los trminos anteriores se dejaron de utilizar.

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Entonces las inmunoglobulinas o anticuerpos son toda una familia, porque son producidos por el mismo tipo celular. El plasmocito es el que produce el Ac, el cual deriva de un LB. Ac Ac Ac El plasmocito va a secretar a las Igs. El LB tiene como receptor, anclado en la membrana plasmtica para el Ag, a una Ig, entonces el LB produce Igs ancladas a membrana. LB
DIFERENCIACIN

PLASMOCITO

LB PLASMOCITO

Igs ancladas a membrana (BCR) Igs secretadas

Las inmunoglobulinas las podemos encontrar de dos formas: ancladas a la membrana del LB constituyendo su receptor antignico, o secretados en el medio por los plasmocitos. Las Igs tienen funcin anticuerpo. Todas las Igs que hay en un suero normal tienen una especificidad determinada, es decir, son capaces de reconocer un Ag determinado. Esta especificidad es desconocida para nosotros. Cuando inmunizamos con un Ag vamos a tener una mayor cantidad de inmunoglobulinas especficas para ese Ag que s conocemos. Todos nosotros tenemos Igs, cada una de esas Igs tiene su especificidad o sitio de reconocimiento para un Ag determinado. Todos los sueros obtenidos al inmunizar un animal son policlonales. Esto quiere decir, que como los Ag tienen muchos determinantes antignicos, cada uno de esos determinantes antignicos puede ser reconocido por un linfocito distinto, cada linfocito puede producir Ac, entonces vamos a tener muchos clones de linfocitos que se van a activar ante un mismo Ag. todos los antisueros utilizados comnmente y obtenidos en el laboratorio son policlonales.

ESTRUCTURA DE LAS INMUNOGLOBULINAS Las inmunoglobulinas estn constituidas por 4 cadenas. Las dos ms largas se denominan CADENAS PESADAS o CADENAS H. Estas cadenas son iguales entre si y estn unidas por puentes disulfuro. Las otras dos cadenas son las CADENAS L o CADENAS LIVIANAS, son iguales entre si y estn unidas a las cadenas H por puentes disulfuros. Hay distintos tipos de cadenas H que permite clasificar a las Igs en clases, y hay dos tipos de cadenas L: pueden ser o , pero siempre son iguales en la misma Ig, es decir, si una Ig tiene una cadena L de tipo , la otra tambin ser . Estas cadenas de inmunoglobulinas se organizan en dominios, que son estructuras constituidas por alrededor de 100 a 110 aminocidos y tienen una conformacin secundaria de estructura plegada o lmina-.

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Estos dominios no estn solamente en las molculas de Igs, sino en muchas otras molculas y todas ellas se denominan superfamilias de las Igs. Cuando los investigadores hicieron la secuenciacin de los dominios de las Igs vieron que cerca de la regin N-terminal, estos dominios tienen una mayor variabilidad. Se denominaron entonces dominios variables, VL para la cadena L y VH para la cadena H. Hacia el extremo C-terminal la composicin de aminocidos es ms constante, por lo que se llaman dominios constantes. Tenemos CL para la cadena L y para la cadena H hay tres dominios CH: CH1, CH2 y CH3. La IgM y la IgE tienen un cuarto dominio: CH4. El lugar por el cual la inmunoglobulina reconoce al Ag se ubica en la parte variable, que es el sitio de combinacin para el Ag. Va a estar formado por las partes variables de las cadenas pesadas y livianas. Cuando hicieron los estudios de secuencia descubrieron que dentro de las regiones variables hay zonas de alrededor de 10 aminocidos que varan mucho ms an, por lo que se las llam regiones hipervariables: CDR (regiones determinantes de complementariedad). Son los CDR los que se unen a los epitopes del Ag y se llaman por eso paratopes. Rodeando a las CDR hay zonas que son ms constantes y se denominan FR o secuencias marco. Son secuencias ms conservadas y ayudan a los CDR a la interaccin con el Ag. Con ellos los CDR se proyectan hacia el exterior. Todas las Igs, excepto la E y la M, tienen una regin rica en aminocidos Pro, que no tienen una estructura globular y es lo que le va a dar la sensibilidad a las Igs. Permite que los dos brazos puedan rotar y unirse a los Ag. Las inmunoglobulinas al ser protenas son antignicas tambin, es decir, que pueden actuar como Ag. Si se inoculan a un animal se van a obtener Acs. Esta antigenicidad est dada por la secuencia de aminocidos que tienen las Igs. Podemos distinguir entonces en esa secuencia tres tipos de variables: Variaciones isotpicas que estn en todas las Igs de una misma clase de todos los individuos de una misma especie. Estas variaciones son las que nos permiten clasificar a las Igs en cinco clases; estn en los dominios CH y nos permiten clasificarlos en: IgM, cuando la cadena H es de tipo ; IgG cuando la cadena H es de tipo ; IgA cuando la cadena H es de tipo ; IgE cuando es ; IgD cuando es . Entonces todas las IgM tienen las mismas cadenas H de tipo . Para la IgG a su vez, hay cuatro subtipos, y para IgA hay dos subtipos. Variaciones alotpicas que se encuentran en algunas inmunoglobulinas de algunos individuos de una misma especie. Estas variaciones alotpicas se conocen como marcadores genticos. Se denominan GM y KM. Las vamos a encontrar en la IgG (GM) y en las cadenas K (KM) Variaciones idiotpicas que son propias de cada Ig y estn relacionadas con la especificidad que tiene la Ig. Estn ubicadas en las regiones de mayor variabilidad. No siempre la variacin idiotpica coincide con el paratope. Todas estas variaciones contribuyen a la heterogeneidad de las inmunoglobulinas. El estudio de las Ig se efecta muchas veces tratando a las Ig con distintas enzimas. Las que ms se usan son la PAPANA y la PEPSINA. Si tratamos a una Ig con papana se van a clivar por encima de la regin de la bisagra, y se va a generar un fragmento denominado Fc, que va a estar constituido por las partes constantes de las cadenas H, y dos fragmentos que se denominan Fab (fragmentos de

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unin al antgeno). Estos dos fragmentos mantienen el sitio de unin al Ag, pero se comportan como univalentes, no van a dar reacciones de interaccin secundaria.

LAS CINCO CLASES DE INMUNOGLOBULINAS INMUNOGLOBULINA G (Ig G) Es la que se encuentra en mayor concentracin en el suero, entre 8 10 mg/ml. Es la que tiene mayor tiempo de vida media. Tiene capacidad de neutralizar agentes patgenos, de activar el complemento por la va clsica. El complemento es un conjunto de protenas que se activan en cascada, y si el complejo Ag-Ac que lo activ est formado por un Ag particulado, una clula o GR, tiene la capacidad de destruirlo. Es la principal Ig que se produce en una respuesta secundaria. En las respuestas primarias, que se producen cuando entra por primera vez un Ag, la principal Ig que se produce es la IgM, y en las respuestas secundarias, cuando entra el Ag por segunda vez, la principal que se produce es la IgG, porque los linfocitos ya hicieron el switch para poder producir otro tipo de Ig. La IgG es la que transfiere inmunidad al feto ya que es la nica que atraviesa placenta. Siempre es monomrica. La estructura de la IgG es tambin de dos cadenas H y dos cadenas L. Las cadenas H son del tipo , las cadenas L son de tipo o . En el hombre la mayora de las cadenas L son de tipo (70% de las IgG son y un 40% del tipo ). Clivaje de IgG con distintas proteasas: Si se tratara a la IgG con papana se va a producir el clivaje y se van a generar dos fragmentos Fab y un fragmento Fc. Tienen una movilidad electrofortica lenta. En el fragmento Fab va a estar el sitio de unin al Ag, los determinantes antignicos que se han compartido por todas las Ig ubicadas en las cadenas L. Si el tiempo de digestin con la papana es ms largo el fragmento Fc se va a dividir en otros fragmentos ms pequeos que se llaman Fc`. Entonces, en el Fab tenemos el sitio de unin al Ag y los determinantes compartidos por las Ig. En Fc estn los determinantes propios de las Ig porque estn formadas por cadenas H que son distintas para cada Ig, van a estar los marcadores genticos KM, y esta regin Fc es muy importante para todas las funciones efectoras que tienen los Ac. Existen muchos receptores para esos segmentos en distintas especies. Los fragmentos Fab van a poder unirse al Ag pero no darn interaccin secundaria porque son monovalentes. El PM de la IgG es alrededor de 150 KDa, las cadenas H pesan 50 KDa y las cadenas L alrededor de 25 KDa. Si clivamos con otra enzima, la pepsina, corta por detrs de los puentes disulfuro, y va a quedar un fragmento que se denomina F(ab`)2, porque va a tener a los dos fragmentos Fab juntos. Este fragmento s dar las reacciones de interacciones secundarias porque se comporta como bivalente. Con pepsina el fragmento Fc se degrada en pequeos pptidos, pero si se hace el tratamiento por menor tiempo se puede formar un fragmento pFc` que es parecido al que se generaba con la papana.

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Si tratamos a la IgG con 2-mercaptoetanol, iodoacetamida y cido propinico, vamos a poder escindir las cadenas H de las cadenas L. Las cadenas se pueden separar por filtracin con geles porque tienen distintos PM. Las cadenas H son las ms estudiadas, se pueden dividir en dos fragmentos: Fd, que a su vez tiene una parte ms variable y una parte constante, y un fragmento Fc constituido por dos dominios constantes de las cadenas H. El dominio variable de las cadenas H es el que se une al Ag. Con otros estudios se comprob que la mayor participacin en el sitio de combinacin con el Ag lo tiene la cadena H. Las Ig tienen hidratos de carbono porque son glucoprotenas, se ubican el las cadenas H. En la IgG estn ubicadas en el dominio CH2 del fragmento Fc. La IgG tiene alrededor de 2,5% de hidratos de carbono. Algunos autores consideran que los hidratos de carbono seran como protectores de las Ig para evitar su degradacin. Otros autores dicen que solo participan en los procesos de secrecin. En condiciones especiales de clivaje se puede generar un fragmento que se denomina Fv. El fragmento Fv estara formado por el fragmento variable de la cadena L y por el fragmento variable de la cadena H. Sera la pequea porcin de la molcula que es capaz de unirse al Ag. En el espacio, los dominios VL y VH se superponen, los CL y CH1 ayudan a mantener la unin de los dominios VL y VH. Los ltimos dominios CH3 tambin se superponen, dndole una cierta rigidez a la molcula. Los dominios CH2 en cambio estn separados por los hidratos de carbono. Subclases de IgG: se subdividen por la cantidad de puentes disulfuro que hay entre las dos cadenas H. Esto le va a conferir a cada subtipo de Ig una distinta funcionalidad o actividad. - La IgG1 tiene capacidad opsonizante, puede recubrir a un patgeno para el cual tiene los sitios especficos de reconocimiento y a travs de su fragmento Fc puede ser reconocido por un macrfago y ser fagocitado. - La IgG2 no se fija a piel heterloga, es decir, que no se fija a clulas que provengan de animales de otra especie. - La IgG3 es la que tiene mayor cantidad de puentes disulfuro entre sus cadenas H, tiene capacidad opsonizante, fija el complemento y tiene un menor tiempo de vida media, porque es ms fcilmente degradable por todas esas uniones que presenta. - La IgG4 no es capaz de fijar el complemento. INMUNOGLOBULINA M (IgM) Es la inmunoglobulina que se produce mayoritariamente en las repuestas primarias. Es la nica que se produce para los Ag TI. Es pentamrica o hexamrica, es decir, que los monmeros de Ig estn unidos por un pptido que se llama J de alrededor de 15 KDa, que se une al fragmento Fc. En la estructura pentamrica, si bien presenta 10 sitios de unin al Ag, se comporta como pentavalente. Esto es porque uno de los sitios de combinacin no funciona por impedimentos estricos. Si tratamos a la IgM con 2-mercaptoetanol, la vamos a clivar en los monmeros que la constituyen, pero esos monmeros siguen teniendo una actividad monovalente. Es decir uno de los brazos sigue sin funcionar por impedimento estrico. El tratamiento con 2-mercaptoetanol es muy importante para poder diferenciar un proceso agudo de un proceso crnico, y es muy til en la clnica.

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En un proceso agudo vamos a tener mucha cantidad de IgM. Si hacemos una reaccin de interaccin secundaria vamos a poder determinar un ttulo de Ac para un determinado sistema. Este ttulo es una medida de la cantidad de anticuerpos que hay. Por ejemplo, para un sistema Brucella abortus/ anti-Brucella abortus obtuve un ttulo igual a 200. Si ahora deseamos saber si esto se debe a un proceso agudo o a un proceso crnico, puedo tratar al suero con 2-mercaptoetanol. Este va a actuar sobre la IgM y la escindir en los monmeros. Esos monmeros, como se comportan como univalentes, no pueden dar las reacciones de interaccin secundaria (de aglutinacin). Si vuelvo a hacer la prueba con este suero y 2-mercaptoetanol y obtengo un titulo igual a 50, con el tratamiento escind las IgM. Si el ttulo baja es que en verdad escind a las IgM. El individuo est produciendo un proceso agudo. El ttulo era mayor antes del tratamiento con 2-mercaptoetanol, luego del tratamiento (las IgM son destruidas) el ttulo baja. El proceso es agudo porque las IgM son las primeras Ig que se producen. Las cadenas H de la IgM son propias de ellas. No tiene marcadores genticos en su cadena H. Tiene un PM de alrededor de 970 KDa por ser pentamrica. Este PM impide que pueda extravasar a los tejidos. La IgM es netamente vascular y es fundamental para defendernos contra los agentes que ingresan por va sangunea. Tiene capacidad aglutinante y tambin capacidad fijadora de complemento. Su actividad es pentavalente y si est escindida sus monmeros se comportan como monovalentes. No se sabe si hay en las clulas receptores para el fragmento Fc de la IgM. Su contenido en hidratos de carbono es de alrededor de 12%. Pueden dar reacciones cruzadas con IgG debido a las cadenas L. La IgM es la primera que se produce y es la ms importante en la respuesta primaria. La IgG es la mayoritaria en las respuestas secundarias. INMUNOGLOBULINA A (IgA) La cadena H de la IgA es de tipo , y hay dos tipos: 1 y 2. La cadena 1 tiene un residuo de galactosamina, que no tiene la 2. No se sabe mucho sobre la IgA, todos los estudios que se han hecho fueron sobre inmunoglobulinas provenientes de mielomas. Los mielomas son tumores de clulas LB, donde la clula B produce una gran cantidad de Ig monoespecfica. La IgA se la puede encontrar en forma de monmero, o en forma de dmero o trmero. En el caso de dmero o trmero estn unidas por el pptido J, que es el mismo pptido que una a la IgM. La IgA es muy importante en las secreciones mucosas, donde se encuentra en la forma de dmero, por ejemplo en la saliva, en la mucosa intestinal, etc. En estas secreciones est asociada a un componente secretor, que tiene unos 70 KDa de PM. La IgA adquiere este componente secretor despus que es producida. La IgA es secretada por el plasmocito que est ubicado en el subepitelio de la mucosa intestinal, por ejemplo, y esa IgA secretada se va a unir a un receptor (que contiene al componente secretor) que se llama poli-Ig, que es un receptor que especficamente va a fijar a la IgA. Se va a endocitar, se va a formar una vescula, y esa vescula con la IgA va a ser transportada hacia el otro extremo de la clula epitelial. Este proceso, que es un transporte a travs de un receptor con formacin de vescula, se llama TRANSCITOSIS. Cuando la IgA llega al otro extremo de la clula se corta parte del receptor, y le queda una porcin que es el componente secretor.

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IgA da bsicamente inmunidad mucosal. La IgA est en forma monomrica en circulacin y en forma dimrica en las secreciones. Conforman entre el 15 al 20% de las Ig sricas. Activan complemento por va alterna. Las IgA secretoras no necesariamente destruyen al patgeno, sino que inhiben su adhesin al epitelio.

INMUNOGLOBULINA D (IgD) No se sabe muy bien que funcin tiene. Parecera ser que interviene en el proceso de maduracin del LB, y se encuentra en la membrana junto con la IgM, en los LB vrgenes. Representan menos del 1% de las Ig plasmticas. INMUNOGLOBULINA E (IgE) Las cadenas H de la IgE son del tipo , el PM es de alrededor de 185 KDa. La concentracin en suero es baja porque esta Ig est unida fundamentalmente a clulas por su porcin Fc. Hay muchas clulas como los mastocitos y los eosinfilos que tienen receptores para el Fc de IgE, que se nombran FcR. Estos receptores tienen una muy alta afinidad por la IgE, sin necesidad que esta Ig est unida a un Ag. Esto es una diferencia con los receptores FcR, cuya afinidad aumenta cuando la Ig est unida a su Ag. Los receptores para IgG en las distintas clulas tienen baja afinidad por la IgG que no est unida a Ag, y la afinidad aumenta cuando la IgG se une a los Ag. En el caso del receptor de la IgE tienen muy alta afinidad por la Ig sin Ag. Su participacin en la respuesta inmune se centra en inducir la degranulacin de mastocitos unindose a estos a travs de su Fc. La IgE es responsable de las acciones de hipersensibilidad y tambin participa de forma muy importante en las respuestas contra infecciones parasitarias. Tienen la particularidad de fijarse a piel homloga, es decir, se fija a piel de individuos de la misma especie, no de otras especies. La IgG se puede fijar a piel de individuos de otras especies.

RECEPTORES PARA LAS INMUNOGLOBULINAS No alcanza con que los Ac reconozcan al Ag, sino que deben hacer algo para poder eliminarlos. Lo que hagan con el Ag va a depender de la porcin Fc, es decir, de donde esa Ig se vaya a unir. Para esto las clulas tienen receptores. Se nombran FcR y luego se indica la cadena a la cual se unen. Hay receptores para la IgG, para la IgE y la IgA. Dependiendo en qu clulas estn estos receptores va a ser la funcin que va a mediar la Ig. Cuando los receptores estn en los macrfagos, si tenemos una bacteria que est recubierta de IgG, mediante el segmento Fc se va a poder unir y as se va a favorecer la fagocitosis de esa bacteria. Si los receptores estn en un eosinfilo, la Ig se unir y este eosinfilo se degranulara.

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Entonces la unin de las Ig a sus receptores puede producir fenmenos de endocitosis fagocitosis; o fenmenos de exocitosis liberacin del contenido de las granulaciones. Pero para que esto ocurra siempre tiene que ocurrir lo que se llama ENTRECRUZAMIENTO DE RECEPTORES. Es decir dos Ig adyacentes se tienen que unir a dos determinantes antignicos de un mismo Ag.

Una Ig se fija con un brazo al Ag y la otra Ig se fija con el otro.

Debe ocurrir esto para que se puedan transmitir las seales al interior celular. Hay un receptor que se llama Receptor de Brambell, que es el receptor que le permite a la IgG atravesar placenta. Es un receptor diferente, est constituido por unas cadenas de tipo que son parecidas a las del CMH y se unen dos molculas del receptor por cada Fc de IgG. Entonces, este receptor le permite a la IgG atravesar placenta, le permite salir a los tejidos y permite el pasaje por las clulas endoteliales. Tambin puede llamarse FcRn, que se ve en ratones. FcRn: Receptor de Brambell

FUNCIN DE LAS INMUNOGLOBULINAS Los Ag van a ser reconocidos por un lado, por las Ig de la membrana del LB vrgen (BCR) y por otro lado, por los Ac secretados por los plasmocitos. Pueden neutralizar patgenos, pueden recubrir bacterias y evitar as que penetren en clulas. Las Ig que pueden hacer esto son las IgM, IgG y la IgA sobre todo en el tracto digestivo. Pueden activar el sistema complemento. Cuando se forman complejos Ag-Ac se puede activar el complemento que conduce a la lisis celular. Pueden activar el complemento las IgM, IgG y la IgA algunas veces. Pueden actuar como opsoninas y favorecer la fagocitosis (la IgG y la IgA). Pueden actuar mediante un mecanismo llamado ADCC: citotoxicidad anticuerpo dependiente. Dentro de los LT estn los LT citotxicos que tienen la capacidad de destruir clulas, pero no solo ellos. A travs de los Ac las clulas NK, que tienen receptores para las Ig, pueden destruir patgenos. Tambin pueden hacerlo los macrfagos y los eosinfilos. En el caso de los eosinfilos interviene la IgE, y en el caso de las NK y los macrfagos es la IgG. Pueden neutralizar toxinas. Las toxinas entran a la clula a travs de receptores. Si se consigue un Ac que neutralice el sitio por el cual la toxina se une al receptor, se evita la entrada de la toxina y por lo tanto la enfermedad. Esto se busca con algunas vacunas. Por ejemplo con el toxoide de la difteria. En este caso es necesario que los Ac sean de muy alta afinidad porque las toxinas se encuentran en una proporcin muy pequea.

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Pueden actuar en fenmenos inflamatorios o alrgicos, en la degranulacin de los mastocitos. Los mastocitos se encuentran en los epitelios respiratorios y digestivos, y tienen la capacidad por sus receptores de fijar IgE sin unin a Ag. Entonces la mayora de las IgE van a estar fijadas por su receptor a los mastocitos. Cuando entra un patgeno que es especfico para usar IgE, se va a unir, se va a producir el entrecruzamiento de receptores y ese mastocito o ese eosinfilo va a liberar el contenido de sus grnulos. El principal mediador qumico que tienen los mastocitos es la histamina, que es un potente vasodilatador. Entonces participa en los procesos inflamatorios. Muchas veces estos procesos de degranulacin son perjudiciales para el organismo, como en la alergia. Pero en otros casos, como las infecciones parasitarias pueden ser beneficiosas, porque el contenido de los grnulos, sobre todo los eosinfilos, pueden llegar a destruir la membrana de los parsitos, sobre todo aquellos muy grandes que no pueden ser fagocitados. Participan en la inmunidad de los recin nacidos o del feto. La que participa en la fase embrionaria es la IgG y despus en la lactancia participa la IgA. Toda la defensa del recin nacido va a estar dada por la IgG de la madre, pero llega un momento luego del nacimiento que esa IgG empieza a ser catabolizada, y los niveles de IgG que produce el beb todava no son suficientes. Entonces se produce un perodo de los 3 meses hasta casi el ao donde los nios se enferman seguido porque no tienen an el sistema inmune totalmente activo, y las Ig que les pas la mam fueron catabolizadas.

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ANTICUERPOS CO-PRECIPITANTES

Se empezaron a estudiar en el ao 1935. Son anticuerpos que se generan en todas las respuestas inmunes y pertenecen a la clase de IgG. Los investigadores inmunizaron a una oveja con DNP (dinitrofenol) unido a un carrier. Obtuvieron un suero anti-DNP protena. Hicieron una curva de precipitacin (TP N3) y fueron agregando distintas cantidades del Ag soluble a volmenes constantes de suero, y obtuvieron la siguiente curva:

x e

Ag Determinaron el punto x que es la zona de equivalencia donde la concentracin de Ac es mxima. Sacaron tambin a partir de la curva la cantidad de Ag que se tenan que agregar para precipitar la mxima cantidad de Ac. Luego pensaron que ocurrira si a esa cantidad de Ag la iban agregando de forma repetida y de a poco al suero. Entonces, en un tubo donde estaban los Ac anti-DNP le agregaron una cantidad menor a esa cantidad mxima de Ag, una cantidad 20 veces menor. Vieron un precipitado.

1/20 e

precipitado

Separaron el sobrenadarte y le volvieron a agregar la misma cantidad de Ag (1/20 e) y se volvi a formar precipitado.

1/20 e

nuevo precipitado As sucesivamente hasta que lleg un punto en donde no vieron ms precipitado. Con este sobrenadante repitieron la curva de precipitacin pero esta vez agregndole a cada tubo este ltimo sobrenadante. Cada tubo tendr: suero de la oveja, Ag y sobrenadante. Observaron que la curva nueva era ms alta:

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e x

En el punto x tenan una mayor cantidad de Ac. Dijeron que haba Ac en el suero que no alcanzaban a precipitar, pero que s podan unirse a los complejos ya precipitados. Los llamaban anticuerpos co-precipitantes. Lo que sigui es averiguar por qu estos anticuerpos co-precipitantes se comportaban de esta manera, no tenan la capacidad de precipitar sino la capacidad de pegarse a un precipitado. Entonces, a partir del ltimo sobrenadante donde no hubo precipitado lo pasaron por una columna de afinidad, que se la haba preparado con el Ag DNP. Aislaron as los Ac co-precipitantes. De todos los precipitados, los disolvieron y obtuvieron los Ac precipitantes. Ambos eran anti-DNP, es decir tenan la misma afinidad. Ahora, lo que hicieron fue inmunizar un ratn con ambos Ac. Las Ig al ser protenas tambin se comportan como Ag. Obtuvieron Ac que eran anti-Ac-precipitantes y otros Ac que eran anti-Ac-coprecipitantes. Utilizaron una reaccin de interaccin secundaria que se llama (TP N4) INMUNODIFUSIN. Se hace un agar, se prepara la placa de agar en un portaobjeto, por ejemplo, se le hacen agujeritos y se siembra el Ag y el Ac en las concentraciones ptimas, precipitan formando una lnea. Estas bandas que se observan son bandas de identidad. En nuestro caso quiere decir que el Ac estudiado reconoce los mismos determinantes antignicos en ambos Ag.
Ac coprecipitante Ac precipitante

Anti-Ac precipitante

Repitieron la experiencia pero en vez de poner el Ac anti-Ac-precipitante pusieron el anti-Ac-coprecipitante, y obtuvieron el mismo resultado:
Ac coprecipitante Ac precipitante

Anti-Ac-coprecipitante

Esto indicaba que no haba diferencias en el isotipo de los Ac, eran iguales.

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Esto llev a que si el problema no era el Fc, entonces era el Fab. Para estudiar las valencias da los Ac estn las tcnicas de interaccin primaria. Con estas tcnicas se dieron cuenta que los Ac coprecipitantes tenan dos sitios de combinacin para el Ag, es decir eran Ac completos, pero esos dos sitios tenan distinta afinidad. Cuando hicieron una cromatografa gaseosa vieron que los Ac coprecipitantes tenan ms hidratos de carbono que los precipitantes. Entonces cortaron al Ac coprecipitante con papana para obtener los fragmentos Fab. Al Ac precipitante lo trataron de igual manera. Pasaron una columna de afinidad con el Ag DNP y vieron que para el Ac precipitante todos los Fab eran retenidos, pero para el coprecipitante el 50% era retenido y un 50% flua. Esto ya indicaba que la afinidad era diferente. Ahora usaron una columna de afinidad que ligara residuos de hidratos de carbono como sepharosa-concavalina A. Esta columna es capaz de retener molculas que estn glucosiladas con residuos de manosa. Pasaron los Fab por esta columna. El 50% de los Fab de los Ac coprecipitantes eran retenidos en la columna. Cuando investigaron cmo estos Fab se fijaban al Ag se dieron cuenta que el 50% que quedaba retenido en la columna sepharosa-concavalina A tena una baja afinidad por el Ag y el resto una alta afinidad. Conclusin: los ANTICUERPOS COPRECIPITANTES o ASIMTRICOS tienen un sitio de combinacin de baja afinidad que se debe a la presencia de residuos ricos en manosa. Si se emplea una enzima capaz de remover esos residuos de manosa los Ac coprecipitantes se transforman en precipitantes, ya que al no tener ese residuo los dos sitios tendran la misma afinidad. Los investigadores buscaron si haba alguna diferencia en cuanto a si para generar esos Ac se usaban Ag solubles o particulados. Entonces, siguieron durante un ao un plan de inmunizacin. Para el caso de los Ag solubles, se generaban esos Ac coprecipitantes pero en una proporcin que iba del 1 al 10-15%. Si inmunizaban con Ag particulados, las concentraciones de los Ac coprecipitantes iba aumentando hasta llegar a un 70%, es decir, que haba mayor cantidad de Ac coprecipitantes que de precipitantes. Esta es una caracterstica de la multiestimulacin con antgenos particulados. Los Ac coprecipitantes compiten por masa con los Ac precipitantes.

CARACTERSTICAS Tienen un fragmento Fab glicosilado, por eso se llaman asimtricos, no activan el complemento, son citoflicos, es decir, tienen la capacidad de fijarse a clulas por el Fc ya que no est afectado. No tienen igual poder protector que los precipitantes y aglutinan GR de carnero sensibilizados. Esta aglutinacin de los GR no se debe a la formacin de la red, se debe a que los GR de carnero tienen receptores para el Fc de IgG. Entonces, si a un GR de carnero le pegamos el Ag DNP y lo enfrentamos a un suero con Ac asimtricos especficos para el Ag, algunos Ac se van a unir por el Fab con el Ag, y se van a unir por el Fc a otro GR pero por el receptor para Fc. Las redes que se van a formar se van a producir por la unin especfica del Fab al Ag y por la unin del Fc a su receptor. En el caso de GR humanos, hay que hacerles un tratamiento previo con tripsina para que expongan los receptores Fc.

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FUNCIONES Aparecen en las infecciones por Ag particulados, las multiestimulaciones generan estos Ac, pero no son protectores. Pueden aparecer frente a tumores, muchos de los Ag tumorales inducen la produccin de estos Ac que hacen que se evite la eliminacin de ese tumor (protegen al tumor). Pueden aparecer Ac coprecipitantes anti-insulina, se unen a la insulina y la protegen, evitan que se degrade y entonces baja la glucosa. Pero tambin tienen una funcin de proteccin en las enfermedades autoinmunes. Hay muchos Ag propios que generan este tipo de Ac coprecipitantes y, como no pueden activar una funcin importante que es la activacin del complemento, evitan que estos Ag propios sean destruidos. Podran participar en mecanismos regulatorios de la respuesta inmune idiotipo-anti idiotipo. Parece ser que son muy beneficiosos en la preez: los Ac que se generan contra los Ag paternos que porta el feto son de este tipo, coprecipitantes, y se evita que se agreda al feto. Se tratan de inducir en terapias anti alrgicas. Hay una interleuquina que parece ser la que favorece la produccin de Ac coprecipitantes que el la IL-6. En mujeres embarazadas esta IL-6 est muy aumentada. Algunos autores creen que esto tambin puede depender de clulas presentadoras de Ag (CPA) y de cmo las clulas procesan a los Ag. Tambin puede ser que haya estimulacin de las enzimas que participan en los procesos de sntesis de los hidratos de carbono de las Ig. Para investigar la presencia de estos Ac incompletos se utiliza la Reaccin de Coombs, otras son las Reacciones de interaccin primaria, como la inmunofluorescencia o el ELISA. Para estas reacciones no es necesaria la formacin de ningn tipo de red. Es importante tener en cuenta estos Ac incompletos en el momento de hacer un diagnstico, sobre todo en brucelosis. La brucelosis es una patologa donde se producen una gran cantidad de estos Ac y muchas veces las reacciones de aglutinacin dan negativas. Esto no quiere decir que el individuo no tiene Ac, sino que tienen estos Ac coprecipitantes.

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ANTICUERPOS MONOCLONALES

Si inmunizamos a un conejo con ovoalbumina (OA), por ejemplo, obtenemos un suero policlonal. En ese suero va a haber muchos Ac que tengan distinta especificidad y que reconocen a ese Ag. Entonces, va a haber muchos clones de LB que produzcan distintos Ac, pero cada uno de estos Ac es producido por un solo tipo de clula. Esta es la TEORIA DE LA SELECCIN CLONAL. Por ejemplo, si inmunizamos con OA a un conejo A y obtenemos un suero A; luego inmunizamos a un conejo B y obtenemos el suero B; y con un conejo C obtenemos el suero C, estos sueros A, B y C son diferentes porque los animales son diferentes, y se van a comportar de manera distinta. Los investigadores queran tratar de encontrar un Ac que se comportara de la misma manera, es decir, que el suero reconociera un solo epitope. En una experiencia inmunizaron un ratn con un Ag y le sacaron el bazo. A ese bazo lo disgregaron y se lo inyectaron a otro ratn que previamente haba sido irradiado, con lo cual se haba inhibido todo su sistema inmune. A este ratn irradiado, luego de inmunizarlo con el bazo disgregado del primer ratn, tambin le inyectaron el Ag. A este ratn tambin le sacaron el bazo y repitieron el proceso con otro ratn. Siguieron as hasta que obtuvieron los LB que ellos buscaban. Este era un proceso bastante tedioso de realizar. Luego se descubri que se podan fusionar clulas somticas y se podan producir mielomas, que son los tumores de los LB que producen Ig de una sola clase. Milstein, en 1975 ide la tcnica de produccin de Ac monoclonales. Las clulas de mieloma, que tienen la capacidad de crecer indefinidamente, van a fusionarse con un LB especfico para el Ag. El mieloma no debe ser cualquiera, ya que los mielomas producen inmunoglobulinas. Se usan mielomas que no produzcan Ig, y como se va a necesitar luego seleccionar las clulas de alguna forma, tiene que ser mielomas deficientes en una enzima, son hipoxantina guanil fosfato tibosil transferasa negativas: HPGRT (-). Esta enzima es necesaria para que se sinteticen las bases pricas. Estos mielomas HPGRT (-) no van a poder crecer en un medio HAT, que es el que se utiliza para seleccionarlos. El medio HAT tiene hipoxantina, aminopterina y timidina. La aminopterina inhibe la sntesis de novo de nucletidos. Los mielomas que tienen estas caractersticas se llaman NSO y son de ratn. El LB a utilizar debe ser tambin de ratn, al cual se lo inmuniz con el Ag especfico. (Funcionan mejor los hbridos que pertenecen a la misma especie). Milstein utiliz GR de carnero. Se sigue un plan de inmunizacin comn, por ejemplo inoculaciones una vez por semana durante un mes, y se observa si el animal produce o no Ac. Tres das antes de observar la fusin se le vuelve a inyectar el Ag, esto es para que haya una mayor cantidad de LB especficos. Se extrae el bazo, se disgregan las clulas y se realiza la fusin. Para la fusin se utilizan distintos agentes, el ms usado es el polietilen glicol (PEG). No se conoce muy bien el mecanismo de la fusin, ni qu es lo que hace el PEG. Algunos creen que son las impurezas del PEG las que actan. En fin las clulas se fusionan y se forman los HIBRIDOMAS. Ahora viene la seleccin.

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La seleccin es en medio HAT, en el cual solo van a poder crecer los hibridomas. Los linfocitos no sobreviven porque no crecen durante mucho tiempo en cultivo. Los mielomas no son capaces de sobrevivir en el medio HAT. La siguiente etapa es saber si los hibridomas producen o no el Ac buscado. Como es muy probable que la concentracin de Ac sea muy poca, se debe usar un mtodo de muy alta sensibilidad. Conviene usar una Inmunofluorescencia o una tcnica de ELISA. Si algunos hibridomas producen los Ac buscados, hay que clonarlos. Hay dos formas: uno es el CLONADO EN AGAR y otra es el CLONADO POR DILUCIN LMITE. Se asegura as que los Ac provengan de una sola clula. Luego de la clonacin hay que purificarlos. Para obtenerlos en gran cantidad se pueden hacer cultivos masivos o se puede obtener el lquido asctico en un ratn. La produccin de lquido asctico permite obtener una gran cantidad de Ac monoclonal. Para ello se inyecta intraperitonealmente el hibridoma al ratn. El hibridoma dentro del ratn comienza a producir los Ac que se van a encontrar dentro del lquido asctico. Los Ac monoclonales luego de obtenerlos deben ser purificados, usando, por ejemplo, columnas de afinidad. La tcnica de Milstein para la obtencin de Ac monoclonales requiere el uso de LB de un animal previamente inmuizado con el Ag de inters, y una clula plamtica maligna (mieloma) que son capaces de crecer bien en cultivo. Se procede a la fusin de ambas clulas, mediada por el PG. Los hbridos se seleccionan en un medio selectivo que contiene: aminopterina, la cual es un inhibidor que bloquea la ruta normal de biosntesis de nucletidos, hipoxantina y timidina (HAT). Por consiguiente, las clulas deben utilizar una ruta paralela para poder sintetizar sus cidos nuclecos, siendo esta va defectuosa en la lnea celular mutante a la que se fusionan los LB normales. Una clula B es incapaz de crecer bien en cultivo por si sola por largos perodos. Durante la fusin, los cromosomas de las clulas se mezcla, resultando clulas hbridas con capacidad de crecer en cultivo y de producir Ac. Las clulas del hibridoma pueden crecer ya que las clulas B contribuyen con enzimas que pueden sintetizar nucletidos por una ruta paralela a la bloqueada por aminopterina y por poseer las propiedades de crecimiento de las clulas de mieloma. Como el hibridoma deriva de una sola clula B, su Ac est restringido a una sola forma molecular, es decir, es un Ac monoclonal (Ac idnticos con un centro de unin al Ag idntico).

DIFERENCIAS ENTRE MONOCLONALES

ANTICUERPOS

POLICLONALES

La primer diferencia es que los Ac monoclonales son homogneos, mientras que los Ac policlonales son heterogneos. Como los Ac policlonales son muchos Ac distintos, sus propiedades van a ser un promedio de las propiedades de cada uno de ellos. En cambio, en el caso de los Ac monoclonales las propiedades van a depender de esa nica molcula.

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Los Ac monoclonales son ms lbiles a los procesos de congelacin y descongelacin, menos resistentes a variaciones de pH. La avidez es un trmino que se relaciona con la fuerza de unin y la afinidad. En el caso de los policlonales va a depender del promedio de todas las afinidades de todos los Ac. En los monoclonales va a depender de esa nica molcula. Los Ac monoclonales solamente van a dar interaccin secundaria si el epitope est repetido muchas veces en el Ag. Solo de esta manera va a poder formarse la red.

No hay formacin de red

Hay formacin de red

Los Ac policlonales, en cambio, igual forman la red, porque tienen distintos Ac para distintos epitopes en el Ag. En cuanto a la especificidad, no importa en qu momento se produzcan, los Ac monoclonales tendrn siempre la misma especificidad. Los policlonales no, porque al ser producidos en distintos animales van a depender de la variabilidad individual de cada animal. Los Ac policlonales pueden dar ms reacciones cruzadas, sin embargo los monoclonales, si el mismo epitope est en otra molcula diferente tambin van a poder dar una reaccin cruzada.

APLICACIONES Como los Ac monoclonales son ms homogneos y son monoespecficos, pueden servir para purificar protenas que estn formando una mezcla compleja. Se utilizan para identificar y aislar ciertas poblaciones celulares. Se usan mucho en citometra de flujo, para identificar los TCD4, TCD8 y para inmunofluorescencia. Sirven para detectar y tratar los tumores. En ciertos tumores hay expresin de Ag que no se expresan en las dems clulas. En investigacin se han utilizado mucho para estudiar los sitios de combinacin y para estudiar de terminados epitopes. Se pueden usar Ac catalticos si se consigue un Ac monoclonal que sea capaz de interactuar con algn producto de alguna reaccin qumica, acelerando la reaccin.

DESVENTAJAS Si se los utilizan como teraputicos hay que tener en cuenta que son Ac producidos en ratones. Si la inyectamos a un humano vamos a provocar una respuesta inmune contra esa molcula de otra especie.

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Se ha querido solucionar este problema. Se prob creando un hibridoma humano-ratn, pero son muy inestables y no sobreviven en cultivo. Quisieron fusionar un LB humano con una clula de mieloma humano, pero los mielomas humanos siempre producen Ac y adems tampoco viven. Gracias a la tecnologa del ADN recombinante se pudo fabricar un Ac que tuviera la mayor parte de la molcula de origen humano, y que solo las regiones variables provinieran de ratn. Estos Ac se llaman ANTICUERPOS QUIMRICOS. Fab de ratn, se trata de que solo el Fv sea de ratn Anticuerpos quimricos Fc humano Uno de los Ac que se est usando en algunas enfermedades es el Rituximab, que reconoce el CD20 del LB. El CD20 se expresa en todos los LB, pero se expresa en mucha mayor cantidad en cierto tipo de linfoma. Entonces, el Ac rituximab estara interactuando directamente con la molcula CD20 y desencadenara algn tipo de mecanismo que lleva a la destruccin de esa clula B.

In vitro se sabe lo que pasa, se genera un mecanismo de destruccin por activacin del complemento, pero in vivo se desconoce. Otro Ac monoclonal que se utiliza en teraputica es el simulet, que es un Ac contra el receptor de IL-2 y se usa en transplantes para generar inmunosupresin. Tambin se han podido expresar Ac monoclonales en plantas, usando plsmidos que codifican para las Ig que se quieren expresar. Se lo puede introducir en una bacteria que transforme a la clula vegetal y se han generado plantas que expresan cadenas H con una determinada especificidad, y plantas que expresan cadenas L. Despus cruzaron estas plantas y obtuvieron una planta que expresaba el Ac y lo extraan de las hojas.

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INMUNIZACIN

La inmunizacin en el hombre tiene como objetivo conferir una inmunidad protectora contra una enfermedad. Esto es, productos de una respuesta inmune que nos protejan contra la entrada de un patgeno. La inmunizacin as entendida se puede adquirir de dos maneras: una forma pasiva y una forma activa. A su vez la forma pasiva se puede adquirir artificialmente como naturalmente.

INMUNIZACIN PASIVA O SEROTERAPIA La forma natural es el pasaje de los Ac IgG que la madre le pasa al feto a travs de la placenta. Esto es la causa de que los recin nacidos tengan un repertorio de especificidad muy similar al de la madre. Esto asegura que en los primeros meses de vida tenga una proteccin. Adems de la transferencia placentaria est la transferencia a travs del calostro y la leche materna. Estos Ac son principalmente del tipo IgA, que dan proteccin en las mucosas. Tambin a travs de la leche materna puede haber una transferencia de LT. Se denomina transferencia pasiva porque el nio no fue quien gener estas especificidades de Ac. Una forma artificial de adquirir inmunidad es a travs de los antisueros, ya sean heterlogos u homlogos (distinta o misma especie respectivamente). Los antisueros especficos heterlogos estn en desuso, sobre todo aquellos que son para una enfermedad. Es decir, son sueros generados en una especie distinta a la del hombre y transferidas al hombre. S se siguen usando los sueros antiofdicos que se producen en caballos, lo mximo que se ha avanzado mediante un tratamiento enzimtico para escindir la porcin de ese gen. Los antisueros homlogos son los producidos en el hombre, que pueden ser especficos contra una enfermedad, o directamente preparados de sueros. Se busca la gammaglobulina humana obtenida de dadores sanos. La gammaglobulina humana es una fraccin del suero que contiene los Ac. Tambin puede usarse gammaglobulina humana inmune. En ello se inicia un plan de inmunizacin a dadores voluntarios para obtener Ac sobre todo contra algo en especial. En este caso el suero va a estar enriquecido en los Ac que necesitemos. Las gammaglobulinas se usan generalmente en personas que sufren inmunodeficiencia, las gammaglobulinas inmunes, por ejemplo, se usan para mujeres sensibilizadas con el Rh. Las complicaciones con la seroterapia provienen sobre todo con los antisueros heterlogos, ocurren reacciones de hipersensibilidad, sobre todo las alergias producidas por la IgE, que pueden llevar a que cuando vuelve a ingresar al organismo el mismo suero se produce un shock anafilctico que lleva a la muerte. La enfermedad del suero ocurra con los heterlogos, que como perduran durante un tiempo en el organismo, el paciente genera Ac contra esos Ac. Se forman complejos Ag-Ac, que a su vez fijan complemento y pueden depositarse en piel, rin y desatar una serie de sntomas. La transmisin de enfermedades con el tiempo ha desaparecido por los extensos controles que se le hacen a los sueros.

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La transferencia adoptiva de clulas T citotxicas es ms complicada porque debe existir una compatibilidad de las molculas del CMH I. Si no hay alelos compartidos la transferencia no ser exitosa por producirse rechazo.

INMUNIZACIN ACTIVA O VACUNOTERAPIA La inmunizacin activa tiene como objeto establecer niveles adecuados de Ac y generar una poblacin programada de clulas de memoria tanto T como B capaces de expandirse rpidamente y producir Ac ante un segundo encuentro con el Ag, y para poder as eliminar ms rpidamente y eficientemente el patgeno. Para que una vacuna sea exitosa debe: Activar las CPA y la produccin de IL y otros factores necesarios para que se activen los LT y LB, es decir, que se generen Ac a partir de los LB y se generen clulas de memoria tanto B como T. El inmungeno debe persistir en su conformacin nativa en las clulas foliculares, para poder as mantener un estmulo perdurable en el tiempo. Debe se fcil de obtener, ser estable, econmica y segura. El primer contacto no debe ser nocivo. TIPOS DE VACUNAS Las vacunas virales son las que se van a inocular para obtener una inmunidad contra ese virus, ya sean a travs de Ac o clulas, en este caso la inmunidad humoral es muy importante para la neutralizacin del virin. Las vacunas virales pueden estar compuestas por los virus vivos atenuados, es decir, se trata del mismo virus que ocasiona la enfermedad. La atenuacin se logra generalmente en cultivos de tejidos de especies no humanas, aunque tambin se pueden generar cepas atenuadas en el hombre. De vez en cuando por mutacin del virus en el contagio de persona a persona puede generarse una cepa atenuada. Si se recupera esa cepa atenuada puede utilizrsela para inmunizar. Una cepa atenuada mantiene su capacidad infectiva intacta, va a poder ingresar a la clula y replicarse, pero no tiene el efecto patognico, no va a desatar la enfermedad en el hombre. Ejemplo: la vacuna de la viruela estaba compuesta por un virus pariente de la viruela humana que era la viruela bovina, llamada vaccina. Comparte determinantes antignicos con la viruela humana. Los virus inactivados estn muertos, no conservan su capacidad de replicarse. Se los puede inactivar con agentes fsicos como la radiacin, el calor, o qumicos como tratamientos con formol. An conservan la capacidad de generar una respuesta inmune protectora. por lo tanto el numero de celular inoculaciones es menor Con virus atenuados inmunidad (generalmente una sola dosis). humoral Con virus inactivados solo inmunidad humoral, por lo tanto el nmero de inoculaciones debe ser mayor.

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De acuerdo al mecanismo infectivo del patgeno va a ser la estrategia de vacunacin. Con los virus atenuados, como van replicndose hay una estimulacin del sistema inmune a responder. El problema es tambin la posible reversin a la virulencia que puede sufrir la cepa. Ejemplo: Sabin, anti poliomieltica, es a virus vivos y contiene tres cepas, todas son necesarias para adquirir invasibidad. Una de ellas tiene mayor posibilidad de revertir y as desatar la enfermedad. Estas cepas tienen solamente 10 mutaciones en su genoma que la hacen no patognica para el hombre. Con una reversin de alguna de estas mutaciones es suficiente para que la cepa retome su virulencia. Las otras dos cepas tambin son mutadas pero tienen mayor nmero de mutaciones. Lo que ms se utilizan son vacunas de subunidades virales. Son las subunidades importantes para poder generar Ac solamente para esa subunidad. Debe generar Ac con capacidad neutralizante. Ejemplo: HBs Ag contra la hepatitis B, solamente contiene Ag de superficie del virin. En cuanto a las vacunas bacterianas se tienen las mismas consideraciones. Ejemplo de bacterias vivas atenuadas es la BCG que es para la tuberculosis. Se inocula una cepa atenuada de Mycobacterius tuberculosis bovino. Para las cepas inactivadas se utilizan los mismos mtodos de inactivacin que en virus. Los toxoides bacterianos tambin pueden ser utilizados para generar una respuesta inmune y produccin de Ac, por ejemplo el de la difteria y el ttanos, que componen la doble. El TOXOIDE es la toxina inactivada, tratada con formol generalmente. Los polisacaridos bacterianos son generalmente Ag T-I, generan una respuesta de tipo inespecfica. Generan igualmente una respuesta inmune con sus Ac efectores, pero no perdurable en el tiempo ya que no generan LBm y LTm. Hay una estrategia de vacunacin que es la de los polisacaridos bacterianos conjugados a toxoides como la difteria o ttanos y as en el contexto de respuesta frente a un Ag de tipo T-D, logre convertir a los linfocitos que se activan en linfocitos de memoria. Ejemplo: la cuadruple: Difteria Ttanos triple B. pertusis Haemophylus influenzae

La inmunidad en general cuando es a virus vivo es de por vida, no as la de virus muertos, que requieren refuerzos. En la de virus vivos es posble la revercin a la virulencia, no as en la de virus muertos o inactivados. Los adyuvantes ms utilizados en el hombre son el hidrxido de aluminio y el MF59 que tambin es una mezcla de aceite-agua. Las vacunas ADN y vectores microbianos an es un campo nuevo en las estrategias de vacunacin. Se inocula directamente con el ADN.

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VACUNAS COMO AGENTES TERAPETICOS Es utilizar el Ac generado fuera del hombre, en una especie diferente, que sern antiidiotipos especficos, por ejemplo. ANTICUERPOS ANTI-IDIOTIPICOS Las regiones de unin al Ag son los idiotipos del Ac. Son regiones variables, entonces se puede generar Ac contra esta parte, por eso se los denomina anti-idiotipo.
Fc

Anti-idiotipo idiotipos

Fc

Por ejemplo si un LB tiene una Ig de una determinada especificidad, hay muchos tumores de LB que van a expresar muchos Ac iguales con una determinada especificidad. Si se dispone de un Ac anti-idiotipo que reconozca el idiotipo de la Ig de superficie, se va a poder desencadenar algunos mecanismos que lleven a la destruccin de la clula. Este es un uso con fines teraputicos, no para prevenir.
LB

ANTICUERPOS ANTI-RECEPTORES O ANTI-MOLCULAS SOLUBLES Se usan para el tratamiento contra el HIV. El HIV infecta a las clulas a travs de la unin a una molcula CD4. Si se tiene un Ac anti-CD4 se puede bloquear ese sitio e impedir que se una el virus.

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GENTICA Y DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS

Siempre se trat de explicar la gran diversidad de Ac. Existan dos teoras a principios de siglo que trataban de explicar esta diversidad: TEORA DE LA LINEA GERMINAL Esta teora deca que en el genoma estaban todos los genes que se necesitaban para codificar todas las inmunoglobulinas de todas las especificidades que pudieran existir. Postulaba que haba un gen para cada tipo de Ig, o sea que el repertorio de Igs era hereditario. TEORA DE LA VARIACIN SOMTICA O DE LA RECOMBINACIN Deca que si bien haba muchos genes de inmunoglobulinas, estos genes podan mutar o recombinarse de tal manera de obtener una mayor variabilidad. Para su momento estaba la teora que deca que cada protena era codificada por un solo gen. 1 gen una protena

La teora de la diversificacin somtica postulaba que el repertorio se generaba de un conjunto de genes hereditarios que codificaban la porcin V de las Ig, los cuales se modificaban de manera particular en cada una de las clulas B. Estas se empezaron a complicar cuando se empezaron a secuenciar las Ig. Se vio que las Ig tenan una parte que era muy variable y otra parte muy constante.

La generacin de diversidad se produce por rearreglos o reordenamientos del DNA que codifican los dominios V de las Ig, proceso que ocurre durante la maduracin de los LB. Esta divesidad se incremente an ms por el proceso de hipermutacin somtica que sufren los LB maduros activados MODELO DE DREYER Y BENNET (1965) Entonces apareci la hiptesis de que las cadenas H y las cadenas L eran codificadas por dos tipos de genes, uno que codificaba para la parte variable y otro para la parte constante. Estos genes estaban separados en la lnea germinal y despus se unan para formar un gen que se poda expresar en un LB. Tambin deca que haba varios genes que codificaban para la parte variable, y algunos genes que codificaban para la parte constante. Las cadenas H y L de las Ig estn codificadas por distintos grupos de genes. En tods las clulas, salvo en los LB, los genes que codifican el dominio V de las Ig estn muy lejos de los que codifican la porcin C. En los LB maduros, los genes V estn mucho ms - 58 -

cerca de los genes que codifican la porcin C, como consecuencia de rearreglos de material gentico producidos durante la maduracin B. Las clulas cuyos genes de Ig no sufren este arreglo (todas las clulas, salvo los LB) poseen los genes de Ig en una coniguracin denominada configuracin germinal mientras que los LB maduros poseen los genes de las Ig rearreglados. Este proceso de rearreglo gnico se conoce con el nombre de RECOMBINACIN SOMTICA. Los genes que codifican para las cadenas H estn codificadas en el cromosoma 14. Las cadenas L pueden ser de dos tipos, las y las . Los genes para estas cadenas estn en cromosomas diferentes, los genes que codifican para la cadena estn en el cromosoma22, y los de la cadena en el cromosoma 2. Para las cadenas L, los genes que van a participar son: Genes L: codifican para el pptido lder Genes V: codifican para la parte variable. Genes J: codifican para la unin. Genes C: codifican para la parte constante. Recordar que hay dos alelos para cada gen. Las cadenas H adems de contener los genes anteriores, tienen un segmento ms: Segmento de diversidad (solo para las cadenas H). Cada dominio est codificado por un segmento gnico. Por ejemplo para la IgM, la cadena H tiene 4 dominios, entonces van a haber 4 genes. Estos genes estn separados en la lnea germinal y no se expresan. Tampoco se expresan en ninguna clula del organismo, solo en los LB. En los LB estos genes sufren un procesamiento que es un REORDENAMIENTO GNICO que permite que estos genes se expresen. Cada segmento a su vez tiene variantes, por ejemplo para los genes V de la cadena hay 30 variantes, para los segmentos J hay 4. Esto da muchas posibilidades de recombinantes. Para un proceso de recombinacin son necesarias enzimas y SSR o secuencias seal de reconocimiento. Las secuencias SSR estn ubicadas en los extremos 3`de todos los genes V, en el extremo 5`y 3`de los genes D, y en el extremo 5`de los genes C. Hay dos tipos de SSR, uno formada por un heptmero palindrmico (7pb) separados por 12 pb de una secuencia monomrica (9pb). El otro tipo de SSR est formado por 23 pb del monmero. Esto se conoce como regla del 12 + 23. Estas secuencias son el sitio de reconocimiento de las enzimas y permiten que el reordenamiento se lleve a cabo en forma correcta. Siempre se va a combinar una secuencia con un separador de 12 pb con una secuencia con un separador de 23 pb. Dentro del conjunto de enzimas que participan hay dos propias de los LT y los LB. Se llaman RECOMBINASAS, estn codificadas por dos genes el RAG1 y el RAG2. Las dems enzimas son las mismas de todas las clulas eucariotas: DNA ligasa, proten quinasa, etc..

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RECOMBINACIN Dos complejos de estas enzimas RAG se unen uno a una SSR separada por 23pb y el otro a otra SSR separada por 12 pb. Las secuencias se van a alinear, se va a formar un loop de ADN y se van a cortar. Se generan as dos segmentos que despus tienen que ser unidos. Esos fragmentos que se generan tienen extremos palindrmicos. Para unirlos se deben adicionar nucletidos que se llaman NUCLEOTIDOS P por enzimas que reparan el DNA. En ese momento tambin puede actuar otra enzima que se conoce como TdT: DEOXINUCLEOTIDIL TRANSFERASA TERMINAL. Esta enzima adiciona ms nucletidos. Los nucletidos que adiciona esta enzima se denominan NUCLEOTIDOS N. Este es otro evento que conduce a generar una mayor diversidad. Se agregan nucletidos que no estn codificados por la lnea germinal. Un evento que contribuye a la diversidad es la adicin de nucletidos P y N. Esta adicin de nucletidos se produce en la regin ms hipervariable de la Ig. Entonces tenemos dos factores que generan la diversidad: Mltiples segmentos gnicos para los distintos dominios. Adicin de nucletidos P y N. Como se sabe las Ig pueden presentarse unidos a las membranas o pueden ser secretadas. Las primeras Ig que se van a sintetizar son la IgM y la IgD. Estas dos se sintetizan de forma simultnea. Para que se sintetice la IgD no se necesita un reordenamiento gentico, se sintetiza por un splicing alternativo del ARN transcripto primario. Entonces a partir del mismo ARN transcripto primario se van a generar dos ARNm diferentes, uno lleva a la sntesis de IgM y otro a la sntesis de IgD. En los LB ocurre tambin un proceso que se denomina de EXCLUSIN ALLICA. Cada linfocito debe expresar una Ig de una sola especificidad, pero cada gen est codificado por dos alelos. En todos estos procesos de reordenamiento, si el reordenamiento es productivo, esto quiere decir que se puede sintetizar la protena, entonces el otro alelo no se reordena. Reordenamiento productivo en un alelo el otro alelo no se reordena.

En cambio, si el reordenamiento en un alelo es no productivo, se intenta reordenar el otro, si ocurre otro reordenamiento no productivo en el otro alelo la clula induce apoptosis y muere. Reordenamiento no productivo en un alelo se reordena el otro alelo si vuelve a ser no productivo APOPTOSIS

La adicin de los nucletidos P y N pueden ocasionar el corrimiento del marco de lectura, esto anula la sntesis de una protena funcional y conduce a un reordenamiento no productivo.

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Supongamos que ya se reordenaron los genes y se est sintetizando la IgM. Para que esta vaya a membrana necesita asociarse a otras dos protenas que se van a llamar Ig e Ig. Ig e Ig son necesarias para que la IgM pueda expresarse en la membrana del LB. Son protenas constantes, sin variaciones. Son las encargadas tambin de transmitir las seales de activacin al linfocito. Esto es porque la porcin citoplasmtica de la IgM de la membrana es muy corta, las Ig e Ig tienen una porcin citoplasmtica ms larga y les es ms fcil transmitir seales. Una vez que el LB se encuentra con el Ag, la IgM que estaba en membrana se comienza a secretar.

Para que la IgM se pueda secretar se va a dejar de expresar los genes que le permita anclarse a la membrana y se van a empezar a expresar otros genes que codifican para secuencias de secrecin. Para este proceso no hay reordenamiento gentico, sino splicing alternativo del ARNm transcripto primario. A medida que se va avanzando en un plan de inmunizacin, si se pudieran separar los Ac y secuenciarlos (por ejemplo una IgM), a la semana se observarn las secuencias de las partes variables de las Ig, y se vern ciertas regiones con mayor variabilidad. Esto ocurre tanto para las cadenas H como para las cadenas L. Dos semanas despus se observar que la variabilidad aumenta muchsimo ms. Estas variaciones se producen por un fenmeno de HIPERMUTACIN SOMTICA. Todos los genes pueden tener una determinada tasa de mutacin. En los genes de Ig, y en estas zonas en particular de hipervariacin, estas mutaciones estn muy elevadas. Estas hipermutaciones pueden generar Ac que pueden tener mayor afinidad por el Ag o que pueden tener menor afinidad. Por un proceso se van a ir seleccionando los Ac que tengan mayor afinidad, y se conoce como MADURACIN DE LA AFINIDAD. Se produce a lo largo de una respuesta inmune. La enzima que participa en el proceso de hipermutacin se llama histidina deaminasa (AID) y es inducible por activacin. Existe otra variacin que se puede producir en las Ig que se llama CAMBIO DE CLASE o CAMBIO DE ISOTIPO. Las IgM y la IgD se sintetizan en conjunto y no necesitan de un reordenamiento de genes para poder expresarse las dos. Para poder expresar las otras Ig (IgG, IgE e IgA) se necesita un proceso de recombinacin que se produce gracias a unas secuencias que hay en las cadenas H que se denominan secuencias S o de Switch. Son motivos repetitivos de nucletidos. Se ubican en la regin 3`de los genes de cadena , y en la regin 3`de cada uno de los otros genes de la cadena H. No en el gen de la cadena .

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La enzima que participa es la misma que produce hipermutacin somtica. No se sabe el mecanismo que le permite a esta enzima actuar en dos procesos distintos. Entonces, cuando se unen una de estas dos secuencias repetidas S se forma una horquilla de ADN que despus es cortada. De esta manera se pierde la expresin de las IgM e IgD y se puede empezar a expresar las otras cadenas H. Este proceso depende de las citoquinas que produzca el LT y se produce a lo largo de una respuesta inmune activa. Entonces, se van a poder expresar las distintas Ig que van a tener la misma especificidad por el antgeno pero que van a tener distintas regiones constantes y por lo tanto van a poder ejercer distintas funciones.

Recordando como es una molcula de Ac:

Tiene cuatro cadenas, dos cadenas pesadas H y dos cadenas livianas L. Cada una de estas cadenas tiene una parte constante y una parte variable. La parte que se une al Ag es la parte variable. En la parte variable hay una zona que son los CDR que son las regiones determinantes de complementariedad y hay tres: CDR1, CDR2 y CDR3 en cada cadena, tres en las H y tres en las L. Son las zonas de unin al Ag. La ms variable es la regin CDR3. Las cadenas H pueden ser de 5 clases: , , , y . Las cadenas L pueden ser de dos clases: o . Las ms comunes en el hombre son las cadenas . Estas Ig estn codificadas por distintas familias de genes, que en la lnea germinal tenan un cierto orden. Para que se puedan expresar en los linfocitos esos genes tienen que reordenarse o recombinarse. Las enzimas que participan se llaman recombinasas, la RAG1 y la RAG2. Estas tambin participan en la recombinacin del receptor de los LT. Adems hay unas secuencias seal de recombinacin o SSR que le indican a las enzimas donde deben unirse. Para cada cadena se producen distintos procesos. Cuando se unen los segmentos se produce la adicin de nucletidos con la enzima deoxinucleotidil transferasa terminal o TdT. Esta enzima agrega los nucletidos N y los nucletidos P en los puntos de corte, lo que aumenta la diversidad. Entonces la diversidad se genera antes que el linfocito se encuentre con el Ag y despus. Los eventos que ocurren antes del encuentro con el Ag son la recombinacin de los genes VDJ y la adicin de nucletidos N y P. Los eventos que ocurren despus de encuentro con el Ag son la hipermutacin somtica, en la cual se generan mutaciones en las regiones hipervariables de las Ig; y el otro fenmeno es el cambio de isotipo, que se conoce como Switch. Para este switch se debe producir una recombinacin, participa la enzima citidil deaminasa inducida por activacin y participan unas secuencias de reconocimiento que se conocen como secuencias S.

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Rearreglos de la porcin variable de las cadenas liviana (VL) y pesada(VH): El dominio V de la cadena L est codificado por dos genes diferentes: el primer gen (VL) codifica la mayor parte del dominio variable. El segundo gen (JL) codifica los restantes aminociodos del dominio V. La asociacin de un gen VL con un gen JL produce un exn continuo que codifica todo el domio VL. Una vez que se produjo la asociacin VL-JL este segmento queda seprado de la regin CL por un intrn y es esta configuracin la que se trascribe al RNAm. Para producir una cadena liviana completa, luego de la transcripcin, el intrn que separa al fragmento VL-JL del gen CL se elimina por corte y empalme del RNAm (splicing). El dominio V de la cadena H est codificada por tres genes diferentes denominados VH, DH y JH. El proceso de recombinacin somtica que produce un dominio VH involucra dos etapas. En la primera se produce la asociacin del gen DH con el JH y, luego, la porcin DH-JH rearreglada se asociar con el gen VH para generar el exn completo (VHDHJH) que codifica el dominio VH. Al igual que para la cadena L la asociacin de la regin VH con la regin CH vecina se produce por corte y empalme del RNAm. El DNA en configuracin germinal contiene mltiples genes V, D y J. La seleccin de un segmento u otro hace la posible la gran diversidad de dominios V en las Ig. Es posible generar distintas porciones variables de las Ig gracias a la seleccin de alguno de los mltiples genes V, D y J para la cadena H, o V y J para la cadena L: -Para la cadena L existen al menos 40 genes funcionales V y 5 genes J - Para la cadena L existen 30 genes funcionales V y cuatro genes J - Para la cadena H humana existen 65 genes VH funcionales, aproximadamente 27 genes DH y 6 genes JH. Durante la ontogenia B se produce en primera instancia el rearreglo de la cadena H. Luego la clula comienza varios ciclos de proliferacin y posteriormente, cada una de las clulas hijas cuyas cadenas H ya fueron rearregladas, comienza un arreglo independiente de la cadena L. La diversidad es an mayor devido a la unin impresisa de los segmentos gnicos y al proceso de hipermutacin somtica que sufren los LB maduros activados. El proceso de recombinacin somtica est guiado por secuencias seales de recombinacin e involucra distintas enzimas: Debe existir un sistema que asegure el ensamblado correcto de los distintos fragmentos gnicos durante el proceso de recombinacin somtica, de manera que un fragmento V se asocie con uno D o J, pero no con otro gen V. La recombinacin solo ocurre entre fragmentos gnicos que se encuentran en el mismo cromosoma y est guiada por secuencias conservadas de DNA no codificante denominadas secuencias seales de recombinacin (SSR). Estas se encuentran adyacentes a los puntos donde se lleva a cabo la recombinacin. La recombinacin somtica est guiada por secuencias conservadas de DNA no codificante. Esta secuencias consisten en un bloque de 7 nucletidos (heptmero), contiguo a la secuencia codificante, seguido por otro bloque de 9 nucletidos (nonmero). Mientras que los heptmeros y nonmeros presentan una secuencia conservada, los espaciadores varan en su secuencia pero conservan su longitud (12 o 23 nucletidos). La regin heptmero-espaciador-nonmero recibe el nombre de secuencia seal de recombinacin (SSR). - 63 -

La recombinacin somtica suele seguir la regla 12+23. Esto es, que un segmento gnico flanqueado por una SSR que integra une espaciador de 12 nucletidos se podr unir a otro segmento flanqueado por una SSR con espaciador de 23 nucletidos. Para la cadena H, esta regla asegura la asociacin correcta de fragmentos VH-DH-JH, ya que los genes VH y JH (flanqueados por SSR con espaciadores de 12 pb) pueden asociarse con los fragmentos DH (flanqueados por SSR con espaciadores de 23 pb), pero no pueden asociarse entre s. Los mecanismos por los cuales se produce la recombinacin somtica que dar lugar a la cadena H son similares a los utilizados para generar la cadena L. la forma ms comn de recombinacin involucra la formacin de un bucle (loop) de DNA y la prdida posterior de material gentico que se encuentra entre los fragmento recombinados en forma de DNA circular La unin entre los fragmentos recombinados (VL-JL, o VH-DH-JH) es imprecisa y esta caracterstica representa una fuente adicional de variabilidad para la porcin variable de las Ig. El complejo enzimtico que acta para producir la recombinacin V(D)J se conoce con el nombre recombinasa V(D)J. Los productos de los genes RAG-1 y RAG-2 forman parte de esa recombinasa y solo se expresan en linfocitos en desarrollo. Estas enzimas poseen actividad de endonucleasa y son las responsables del corte de la cadena de DNA. Por el contrario, el resto de las enzimas que forman parte de las recombinasas presentan una expresin ubicua y estn involucradas en la reparacin, modifcacin y plegado del DNA de todas las clulas. Las enzimas de reparacin de las cadenas de DNA incrementan an ms la diversidad, ya que son capaces de agregar o eliminar nucletidos al azar en los sitios de unin de los fragmentos gnicos. Los nucletidos adicionados se conocen como nucletidos P y N. Los nucletidos P se adicionan por las enzimas responsables de la reparacin del DNA y reciben este nombre debido a que generan secuencias palindrmicas. Los nucletidos N son adicionados sin molde por la enzima TdT, y se encuentra principalmente en las uniones VH-DH y DH-JH. La presencia de nucletidos N en la cadena L es menos comn porque la enzima TdT, en los LB, solo se expresa durante el rearreglo de la cadena H que es previo al rearreglo de la cadena L. Los nucletidos tambin pueden ser eliminados por mecanismos no muy bien definidos hasta el momento, que involucran enzimas con actividad exonucleasa. Como el nmero de nucletidos eliminados y adicionados por estos mecanismos es al azar, en el cambio de lectura que lleven a la reduccin de protenas no funcionales (rearreglos no productivos). Para que un LB pueda desarrollarse normalmente debe lograr un rearreglo productivo de su Ig, de no ser as, no podr continuar con su desarrollo y morir por apoptosis. Resumiendo: La generacin de diversidad en el repertorio de Ig se produce por los siguientes mecanismos: -La existencia de distintos segmentos V, (D )y J de H y L. Mientras que un LB durante su ontogenia utiliza un determinado conjunto de segmentos gnicos para la generacin de sus dominios variables, otro LB utilizar un conjunto diferente y generara diferentes dominios VH y VL. -La asociacin de la cadenas H y L. El paratope o sitio de reconocimiento del Ac involucra los dominios variables de las cadenas H y L, cada una de las cuales se rearregla en forma independiente.

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-La unin imprecisa de los segmentos gnicos, que produce diversidad por la adicin y sustraccin de nucletidos. -La hipermutacin somtica, que incrementa el repertorio de Ig luego del reconocimiento antignico. Un mismo exn VH puede asociarse con distintos genes CH durante el curso de la respuesta inmune: El cluster de la cadena H presenta distintos sets de regiones CH, cada uno de los cuales corresponde a un diferente isotipo de Ig. Todos los linfoncitos comienzan expresando un BCR que contiene IgM, esto ocurre en el estado de LB inmaduro, lo que implica que el exn del dominio VH debe asociarse, en primera instancia, con el gen C. Inmediatamente despus del gen C se encuentra el gen C, el cual codifica la porcin constante de la cadena H de la IgD. Los LB maduros coexpresan en la membrana Ig de isotipo IgM e IgD, como parte del BCR. Ambas Ig presentan una nica especificidad ya que comparten los mismos dominios V tanto en la cadena L como en la cadena H. Esto se explica gracias a que el exn VH generado por recombinacin somtica puede ser transcripto junto con los genes C o C. La asociacin de un mismo dominio VH con la regin C o C se produce por corte y empalme alternativo del RNAm. Los LB activados pueden realizar un cambio o switch de isotipo, en donde tambin un mismo dominio VH se asocia con distintos isotipos. Sin embargo, los mecanismos responsables de este proceso son distintos de los responsables de la coexpresin de IgE IgD en los LB maduros.

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VIDA DE UN LINFOCITO B

Se puede dividir en 4 etapas: 1 etapa: produccin y maduracin en la mdula sea. 2 etapa: eliminacin de LB que reconozcan Ag propios. 3 etapa: activacin del LB por el encuentro con el Ag. 4 etapa: diferenciacin a clula plasmtica productora de Ac. PRIMERA ETAPA: ONTOGENIA B Todas las clulas hematopoyticas se originan de un precursor comn, esta es una stem cell o clula troncal que tiene la capacidad de multiplicarse independientemente. La clula troncal en la mdula sea tiene los genes de las cadenas H y cadenas L en la configuracin de la lnea germinal, es decir, que no va a expresar ni cadenas H ni cadenas L, por lo tanto ninguna Ig. Esta clula se va a transformar en una clula pro-B temprana cuando empiece a reordenar los genes de la cadena H. Entonces, los primeros genes que se reordenan son los de la cadena H, sus segmentos DJ. En este estadio las cadenas L siguen estando en la configuracin de la lnea germinal y todava no se expresa ninguna protena. Cuando se comienzan a reordenar los genes V de la cadena H, el LB pasa a llamarse clula pro-B tarda. Todava no se reordenan los genes de la cadena liviana, y an no se expresa ninguna protena. Cuando terminan de reordenarse los genes de cadena H, el LB se llama clula pre-B grande. Este linfocito ya reorden los genes VDJ de cadena H, todava no reorden los genes de la cadena L, empieza a producir muchas cadenas H. La primera Ig que se produce es la IgM, es decir, que las primeras cadenas H que se producen son de tipo , pero para que estas cadenas H se puedan expresar, deben estar asociadas a una cadena L. Como los genes de cadena L an no se reordenaron se sintetiza una cadena liviana sustituta. As, en el estado de clula pre-B grande se expresan cadenas H asociadas a unas cadenas L sustitutas. Para que la Ig se pueda expresar en la membrana debe asociarse a otras dos protenas que se llaman Ig e Ig. Estas dos protenas siempre se asocian cuando la Ig se expresa en membrana, y forman parte del receptor B (BCR). En esta etapa de clula pre-B grande se inhiben las enzimas de la recombinacin y la clula se multiplica, es decir, la clula empieza a proliferar. Se generan as alrededor de 30 a 70 clulas pre-B pequeas. En el estadio de clula pre-B pequea comienzan a reordenarse los genes de las cadenas L. Las cadenas H se siguen sintetizando, pero no se van a expresar, se almacenan en el RE. Tambin se sintetizan las molculas Ig e Ig. El prximo estado, cuando ya se reordenan los genes de cadena L, se llama clula B inmadura. Esta clula B inmadura ya puede expresar una IgM entera en su membrana. La IgM junto con la Ig e Ig conforman el BCR. Para que el linfocito pase a clula B madura debe expresar adems la IgD en membrana. La IgM y la IgD se expresan simultneamente sin necesidad de reordenamiento gentico, sino solo un splicing alternativo del mismo ARN transcripto primario. El reordenamiento de los distintos segmentos con la adicin de los nucletidos puede generar secuencias que no estn en el correcto marco de lectura. Cuando se generan ese - 66 -

tipo de secuencias se dice que el reordenamiento es un REORDENAMIENTO NO PRODUCTIVO. La clula B tiene la posibilidad de reordenar los genes de ambos cromosomas. En el LB existe la EXCLUSIN ALLICA, es decir, que solo se expresan genes de un cromosoma. El LB en su estadio de pro-B temprano reordena los genes de cadena H de los dos cromosomas. El primer reordenamiento D-J se produce en los dos cromosomas. En el estadio de clula pro-B tarda, cuando ya se produjo el reordenamiento V-D-J en uno de los cromosomas, si ese reordenamiento es productivo, la clula contina la evolucin. Si no es productivo, es decir, si se gener alguna secuencia que no estaba en el marco de lectura adecuado, la clula intenta reordenar el otro cromosoma. Si este nuevo reordenamiento es productivo la clula sigue, si no es productivo la clula muere por apoptosis. Supongamos ahora que la clula reorden las cadenas H de forma correcta. Llegamos al estadio de clula pre-B, donde comienzan a reordenarse los genes de la cadena L. El reordenamiento comienza siempre por las cadenas . Entonces, comienzan a reordenarse las cadenas de un cromosoma. Si el reordenamiento es productivo la clula sigue, si no es productivo la clula intenta reordenar los genes del otro cromosoma. Si este reordenamiento es productivo se llega a un LB inmaduro que va a expresar una IgM que va a tener las cadenas H de tipo y las cadenas L de tipo . Si el reordenamiento de las cadenas no fue productivo, comienzan a reordenarse las cadenas . Se reordena la cadena de un cromosoma, si es productivo la clula sigue y se obtiene un LB que va a expresar una IgM con cadenas pesadas y cadenas livianas . Si el reordenamiento no fue productivo la clula trata de reordenar el otro cromosoma, si no es productivo se muere por apoptosis, y si es productivo se tiene un LB inmaduro que est expresando una IgM con cadenas L . Para que todo esto se lleve a cabo de forma ordenada y semicojugada, el linfocito tiene que saber cuando tiene que dejar de expresar las enzimas de la recombinacin, sino se estaran recombinando las cadenas indefinidamente. Entonces, hay puntos de control para que el linfocito deje de expresar las recombinasas y cesen los procesos de recombinacin. Los puntos de control van a estar dados en el estado de clula pre-B grande, cuando el linfocito expresa la IgM con la cadena sustituta. La expresin de esta molcula en membrana le enva seales al linfocito para que deje de sintetizar recombinasas. En esta etapa en que no hay recombinacin el linfocito prolifera. El otro punto para que el linfocito deje de recombinarse es cuando ya est en el estadio de clula B inmadura. Ya produjo la IgM correcta. La expresin de este producto en membrana tambin le indica al linfocito que debe dejar de recombinarse. La cadena L sustituta esta formada por una regin que se llama V pre B y otra 5 que 5, sera la parte constante. La IgM es el receptor de los LB vrgenes, los LB de memoria pueden tener otros isotipos, fundamentalmente IgG. Durante todo este proceso de ontogenia B, que la clula pluripotencial se empieza a diferenciar, participan de manera muy activa las clulas del estroma de la mdula sea. Entonces, es importante la interaccin entre el linfocito y las clulas estromales de - 67 -

mdula sea. Y no solo es importante la interaccin, sino tambin los factores que estas clulas producen. Un factor muy importante en el inicio de esta transformacin es la IL7. A medida que el linfocito va evolucionando se va haciendo menos dependiente de todos estos factores hasta que puede salir de la mdula sea y dirigirse hacia los rganos linfoides secundarios. Todos estos procesos deben estar muy bien regulados y la expresin de los genes para las distintas enzimas tambin tiene que estar controlado. La enzima TdT se expresa siempre que se reordenen las cadenas H, cuando se reordenan las cadenas L esta enzima no se expresa. Por eso en el reordenamiento de las cadenas L no hay adicin de nucletidos. Antes de que se produzca cada evento de recombinacin, se produce una pequea transcripcin de los elementos que se van a recombinar. Esto se hace para que las enzimas recombinasas se dirijan hacia los genes de las Ig y no hacia los genes del receptor T. Todo esto es para un tipo particular de linfocito: LB2. Hay tres tipos de linfocitos B: LB1, LB2 y LBZM. Los LB2 son los mayoritarios. La otra poblacin, los LB1, que son los primeros que se producen durante el desarrollo embrionario (por eso se llaman LB1), tiene un BCR que es menos diverso. Los primeros que se producen durante la vida fetal tienen muy poca diversidad en las uniones, y en esa poca no se expresa la enzima TdT. Por lo tanto no se adicionan los nucletidos N. Entonces, estos receptores de estos linfocitos tienen una menor variabilidad. Despus del nacimiento aumenta la variabilidad porque s se expresa la enzima TdT. Pero de todos modos la variabilidad es menor que para los LB2. Este tipo de linfocito va a producir solamente IgM en su mayora y muy poca cantidad de IgG. Son clulas que no van a generar clulas de memoria y son linfocitos donde tampoco se va a producir el fenmeno de hipermutacin somtica. Despus del nacimiento se produce durante algn tiempo en la mdula sea, pero llega un momento en que la mdula sea no la produce ms. Se mantienen por autorrenovacin. Estos linfocitos producen Ac contra polisacridos y contra ciertos hidratos de carbono. Estos son Ag TI-2. Como los Ac que producen son de menor afinidad se pueden unir a una gran cantidad de Ag, entonces se dice que son poliespecficos. Los LB1 se localizan principalmente en la cavidad peritoneal y pleural, en cambio los LB2 estn en los rganos linfoides. La autorrenovacin de los LB1 parece que depende de IL-10.

SEGUNDA ETAPA: SELECCIN Y DESARROLLO ADICIONAL DE LB El receptor de los LB debe ser capaz de no reconocer a los Ag propios. Los Ag propios se denominan autoantgenos. Estos autoantgenos pueden ser glucoprotenas, proteoglicanos o glucolpidos de las membranas celulares. Otro tipo de autoantgeno pueden ser protenas que se encuentren en elevada concentracin en el plasma o en la linfa. Este reconocimiento de autoantgenos se puede dar en el estadio de LB inmaduro. Entonces, en el estado de LB inmaduro, que tiene Ig en su membrana con las otras dos molculas asociadas, el LB va a sufrir un proceso que se puede denominar como INDUCCIN DE TOLERANCIA CENTRAL, que se produce en la mdula sea,

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aunque tambin puede ser cuando el linfocito recin haya salido de la mdula sea. Este proceso va a hacer que los LB que reconozcan Ag propios mueran por apoptosis o se transformen en anrgicos. Que ocurra una cosa u otra va a depender del tipo de autoantgeno con el que se encuentren y del tipo de seal que reciban. Si el linfocito no recibe ninguna seal, no reconoce ningn Ag, entonces va a transformarse en un LB maduro que expresa las dos Ig: la IgM y la IgD. Si el linfocito se encuentra con un Ag multivalente recibe una seal muy fuerte e intensa, entonces este linfocito muere por apoptosis. Si en cambio el linfocito recibe una seal dbil, como las que dan las protenas que estn en concentracin elevada en plasma o en linfa, el linfocito no muere sino que entra en estado de anergia o no respondedor. Este linfocito deja de expresar la IgM y empieza a expresar ms IgD. Este linfocito no va a poder despus activarse. clula B anrgica: expresa poca IgM y mucha IgD. As este linfocito por ms que valla a un rgano linfoide secundario no va a responder. Pero los LB tienen una propiedad que les permite volver a sintetizar un nuevo receptor, que se conoce como RE-EDICIN DEL RECEPTOR B. Si el LB se une a un autoantgeno multivalente y lo reconoce con una intensidad fuerte, antes de entrar en apoptosis intenta reordenan otra vez los genes de cadena L. Entonces se activan nuevamente las recombinasas, se reordenan los genes de cadena L y se intenta sintetizar una nueva cadena L. Si la nueva Ig de membrana no reconoce ningn Ag propio, el linfocito sigue su curso. Si lo reconoce muere por apoptosis. Esto es una particularidad de los LB que se llama re-edicin del BCR, y les da una nueva posibilidad de continuar el proceso de maduracin. Las cadenas L nuevas que se sintetizan reemplazan a las otras y se expresan en membrana. Ese linfocito inmaduro que expresa la IgM, que no reconoce ningn Ag propio se transforma en linfocito maduro y puede quedar en mdula sea o salir de ella. Cuando el LB maduro sale de mdula sea puede ir al ganglio linftico. Es decir, que los LB maduros van a los rganos linfoides secundarios. Pueden ubicarse algunos en los tejidos linfoides asociados a mucosas, pueden ubicarse en el bazo o en los ganglios. Prcticamente ocurre lo mismo en los tejidos linfoides secundarios. El LB maduro entra al ganglio por la sangre, y sale de los vasos sanguneos por las vnulas del endotelio alto. Estas vnulas tienen caractersticas especiales que no tienen las otras clulas endoteliales del resto del organismo. Los LB a travs de las molculas de adhesin van a entrar en contacto con las molculas de adhesin que expresan estas clulas endoteliales y van a poder salir. En el ganglio va a haber algunas zonas donde van a predominar los LT y otras donde van a predominar los LB. El linfocito que sali del vaso sanguneo se va a ubicar en un folculo primario o FOLCULO LINFOIDE PRIMARIO. En este folculo van a estar los LB vrgenes que nunca se contactaron con un Ag, va a haber macrfagos y va a haber un tipo particular de clula dendrtica llamada clula dendrtica folicular (CDF). Esta CDF no fagocita ni presenta Ag. Es decir, que no tiene la misma funcin que las otras clulas dendrticas. Todos los LB para poder sobrevivir deben pasar por el folculo linfoide primario. Si no encuentran ningn Ag estn un tiempo en este folculo primario y despus salen, y vuelven a circular. Continuamente en el folculo primario estn ingresando LB vrgenes, hay un continuo recambio de linfocitos. Los LB salen del ganglio por un vaso linftico eferente.

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Si el linfocito contacta a un Ag lo va a reconocer a travs de la Ig que tiene en su membrana. Este reconocimiento le va a mandar una serie de seales hacia el interior celular, pero a su vez este LB, para poder seguir montando la respuesta inmune necesita encontrarse con un LTh que previamente fue activado con el mismo Ag. El LB as activado comienza a proliferar. Algunos LB que proliferan van a transformarse rpidamente en PLASMOCITOS y van a producir Ac. Los plasmocitos se van hacia la mdula del ganglio, algunos salen del ganglio y van a la mdula sea. Estos primeros Ac que se producen son del tipo IgM. Siempre en una respuesta primaria lo mayoritario que se produce es IgM. La respuesta primaria es la reaccin ante la primera entrada del Ag al organismo. Otra parte de los LB que proliferan comienzan a formar un FOLCULO LINFOIDE SECUNDARIO. Los folculos secundarios son simplemente LB proliferantes, con macrfagos y CDF. As, despus del contacto con el Ag y con el LTh se generan una mayor cantidad de LB especficos para el mismo Ag. Los LB en proliferacin se llaman centroblastos y forman lo que se conoce como CENTRO GERMINAL. Los centroblastos son LB que ya reconocieron al Ag, no son vrgenes. Por ello los centroblastos no expresan Ig en su membrana. A los centroblastos les ocurre la hipermutacin somtica y el cambio de clase o isotipo (switch). Estos dos procesos ocurren mientras los linfocitos estn dividindose. Estos linfocitos van a producir Ac de mayor afinidad, porque sufrieron hipermutacin somtica, y que pueden ser de distinta clase: IgG, IgA o IgE. El cambio de clase depende de citoquinas producidas por los LTh. Los centroblastos dejan de dividirse en algn momento y se transforman en centrocitos. Los centrocitos ya sufrieron la hipermutacin somtica y el cambio de isotipo. Pero cuando se produce el fenmeno de hipermutacin somtica se pueden generar receptores que tengan mayor afinidad por el Ag o menor afinidad por el Ag. Esto es porque las mutaciones son al azar. Es por eso que se produce un proceso de seleccin de los centrocitos. Por supuesto que sobreviven los ms fuertes, por lo que quedan los que tengan mayor afinidad. Para esta seleccin tienen que interactuar con el Ag. El Ag va a estar pegado a la CDF. Las CDF tienen receptores para el complemento, receptores para el Fc de las Ig, o receptores que pegan al Ag solo. Los Ag pegados a la membrana de las CDF forman como perlitas que se denominan icosomas: acumulo de Ag en la membrana de las CDF. Entonces, el LB a travs de su receptor tiene que contactarse con el Ag que est pegado a la CDF. Las que tengan un receptor de alta afinidad se van a contactar fuertemente al Ag. Los de baja afinidad no. Los LB de mayor afinidad se seleccionan y van a poder transformarse en clulas B de memoria o en plasmocitos de larga vida. Para que puedan hacer esto tambin necesitan el contacto con los LTh. En resumen, una parte de la vida del linfocito es independiente del Ag, que va desde la clula troncal al LB maduro virgen. Es independiente porque nunca se contacta con ningn Ag. A partir del LB maduro comienzan fases que dependen del Ag. Si un LB no reconoce a ningn Ag tiene un tiempo de vida de 3 a 4 semanas y despus muere. -no expresan Ig en su membrana Clulas plasmticas -no expresan MHC solo secretan Ac. -no presentan Ag

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Las clulas de memoria pueden quedarse en los rganos linfoides secundarios o pueden recircular y volver a otros rganos linfoides secundarios. Estas clulas de memoria son las primeras que actan cuando ingresa un Ag por segunda vez y producen sobre todo IgG. Esta es una caracterstica de la respuesta secundaria. Los linfocitos que reconocan al Ag proteicos propios reciban una seal de baja intensidad y se transforman en LB anrgicos. Los LB anrgicos no responden porque no pueden entrar en los folculos primarios; otras teoras dicen que necesitan ms concentracin de los factores necesarios para que se activen. Uno de ellos se llama BAFF. Hipermutacin somtica y aumento de la afinidad de los Ac: La hipermutacin somtica (HS) es un mecanismo por el cual la porcin variable de las cadenas pesadas y livianas de las Ig sufren mutaciones puntuales con una tasa muy alta. Como consecuencia, luego de cada mitosis, la clulas hijas expresan porciones V(D)J diferentes del LB que les dio origen. Ninguna otra clula somtica posee un nivel de mutaciones tan alto como los centroblastos. Este mecanismo constituye la base molecular de un proceso muy ventajoso para el organismo: la generacin de Ac de mayor afinidad a medida que progresa la respuesta inmune humoral. Los centrocitos, que se originan de los centroblastos, expresan en su membrana Ig mutadas. Esto significa que expresan Ig distintas de las del LB que reconoci por primera vez al Ag. Como las mutaciones se producen al azar, muchas de ellas son perjudiciales para el LB que las porta ya que, por ejemplo, pueden impedir la expresin de la Ig en la membrana, lo que conduce a apoptosis de la clula B. Otras mutaciones disminuyen la capacidad de reconocimiento del epitope antignico, lo que provoca tambin apoptosis celular. Las mutaciones nocivas son frecuentes y por ello en el centro germinal tambin se encuentran numerosos macrfagos que son los encargados de fagocitar a los centrocitos apoptticos que se generen. Algunas mutaciones de las porciones V(D)J van a incrementar la afinidad del la Ig por el Ag y sern los LB que han sufrido estas mutaciones los que sean seleccionados en el centro germinal. TERCERA ETAPA: ACTIVACIN DE LOS LB Para que un LB se active debe reconocer al Ag y necesita un entrecruzamiento de receptores. Esta interaccin enva seales al interior celular. Esta interaccin an no es suficiente, se necesitan seales de otras molculas que tambin estn insertas en la membrana y que son la CD19, el receptor CR2 y la molcula CD81. En particular, el CR2 es un receptor para una fraccin del complemento, la fraccin C3d. Si algn microorganismo tiene fijada esta fraccin C3d, el LB necesita menos cantidad de Ag para activarse porque estar recibiendo mayores seales. Este receptor es importante en la activacin de los LBZM y responde rpidamente a Ag que entran por sangre. Estos LBZM no necesitan de la colaboracin T. La activacin del LB va a depender del tipo de Ag. Algunos Ag no necesitan la colaboracin T, estos son los Ag TI de los cuales hay dos tipos: los Ag TI-1 y los Ag TI-2. De los Ag TI-1 el ms conocido es el LPS (el lipopolisacarido) de la pared

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celular de la bacteria. Este Ag puede ser reconocido tanto por otros receptores de la clula B, como por una molcula que se llama CD14. Esta se une a otra que es ligadora de LPS, la LBP, y si el LB tiene su BCR especfico para el LPS estas interacciones hacen que se activen, proliferen y produzca IgM especfica para el LPS. A su vez, el LPS puede inducir la activacin de un linfocito que tenga un receptor para un Ag diferente en esa misma bacteria. Otra vez no es necesario la colaboracin T porque las seales que provee el LPS intensifica el resto de las seales. Entonces el LB se activa y puede producir Ac que no son especficos para el LPS, sino para otra protena de la bacteria. As, el LPS induce la produccin de Ac especficos contra Ag sin necesidad de colaboracin T. Los Ag TI-2 son los que tienen epitopes repetitivos, de hidratos de carbono por ejemplo. Pueden ser polisacridos, fosfatidilcolina, etc. Como tienen muchos epitopes repetidos producen una fuerte seal en el LB y lo activan. Esto es, porque tienen capacidad de inducir entrecruzamiebto del BCR en la superficie del LB1. Los LB que se activan por este tipo de Ag son los LB1. Los LB1 que se activan proliferan y se diferencian a plasmocitos para producir fundamentalmente IgM. Los otros Ag son TD, por ejemplo las protenas. Los principales linfocitos que responden a este tipo de Ag son los LB2 que s necesitan la colaboracin del LTh. Entonces, el LB2 reconoce al Ag en forma nativa a travs de su Ig de membrana. Esto ya le provee al linfocito una primer seal, pero que no es suficiente. El LB2 adems tiene la capacidad de poder endocitar el Ag que tiene unido, lo puede degradar y lo puede presentar a un LT. As, la Ig de membrana del LB2 tiene dos funciones: por un lado reconocer al Ag con entrecruzamiento de receptores necesaria para la activacin, y por otro lado lo puede endocitar, procesar y presentar en el contexto de una MHC-II. El LTh est activado porque ya reconoci antes al mismo Ag, aunque no precisamente el mismo epitope que reconoci el LB. El LTh reconoce al Ag que le muestra el LB2 a travs del receptor TCR, pero no es suficiente, debe haber interaccin con otras molculas de membrana. Una de ellas, muy importante para todo el proceso es la CD40 del LB2. Esta tiene un ligando en el LTh llamado CD40L.Esta interaccin es la que enva la segunda seal al LB2 y es la que hace que en el LB se comience a expresar la molcula IKAM 1. IKAM 1 favorece el contacto con el LTh. El linfocito tambin va a producir citoquinas durante el contacto que van a actuar sobre receptores del LB. Una citoquina muy importante del proceso es la IL-4. Esta hace que el LB empiece a proliferar: una parte se diferencia a plasmocitos para producir IgM y la otra parte forma el centro germinal. Los LTh tambin proliferan despus del contacto y migran con el LB al centro germinal y se ubican en la periferia. Las citoquinas que intervienen en el cambio de isotipo son IL-5, IL-6 y TGF-. Estas IL favorecen que se empiece a sintetizar otras Ig. Los centrocitos deben volver a encontrarse con un LTh. Los centrocitos toman el Ag de los CDF, lo procesan otra vez y se lo presentan al LTh. Se vuelven a producir las mismas interacciones: CD40-CD40L, y el centrocito va a poder diferenciarse a clula de memoria o a clula plasmtica.

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Parece ser que las interleuquinas que tienen que ver en esto son la IL-4 y la IL-10. La IL-4 favorece a las clulas de memoria y la IL-10 a los plasmocitos. Las interacciones entre el LB y el LT a travs de las molculas de adhesin es la que se conoce como SINAPSIS INMUNOLGICA. Los LB como tienen la capacidad de expresar las molculas del CMH-II se llaman clulas presentadoras de antgeno profesionales. Repasando: Vimos que la produccin del LB maduro se produce en la mdula sea. Durante todo el proceso el LB va reordenando los genes de las Ig. Reordena primero los genes de la cadena H y despus los genes de la cadena L. De los de la cadena L reordena primero los y luego los . En los LB hay exclusin allica y siempre se intenta el reordenamiento en un cromosoma y si no es productivo se intenta en el otro. En estos procesos actan las recombinasas, las SSR, las enzimas TdT que participa solo en las cadenas H. El LB recibe la seal para dejar de reordenar sus genes cuando se comienza a expresar una molcula de membrana. Cuando el LB expresa el receptor pre-BCR cesa el reordenamiento y comienza a proliferar. El receptor pre-BCR est formado por las cadenas pesadas de tipo y la cadena liviana sustituta, siempre acompaado por Ig e Ig. El otro momento donde cesa el reordenamiento es cuando se expresa el BCR que es una IgM acompaado por una Ig e Ig. En este momento es un LB inmaduro. En el estado inmaduro se produce una seleccin para solo sobrevivir aquellos LB que no reconozcan Ag propios. Entonces, si no reciben ninguna seal a travs de su BCR pasan a sen LB maduros. Estos van a expresar la IgM y la IgD. Los LB inmaduros que reciben seales muy fuertes e intensas que provienen de Ag propios multivalente de tipo particulado directamente mueren por apoptosis. Pero estos LB tienen la posibilidad de reeditar su receptor: antes de morir pueden intentar un nuevo reordenamiento de sus cadenas L para que no reconozcan Ag propios. Si la seal era dbil, producida por los autoantgenos de tipo protena, el LB se transforma en LB anrgico, un linfocito que no es capaz de responder ante una respuesta inmune. El LB maduro sale de la mdula sea y se dirige a los rganos linfoides secundarios, por ejemplo un ganglio. Aqu puede ser que se encuentre con un Ag o no. Si no se encuentra con ningn Ag permanece un tiempo en el ganglio y luego sale y recircula. Si reconoce a un Ag se activa: por un lado se une al Ag y esto ya le da una seal, y despus necesita entrar en contacto con un LTh2, el que le dar la segunda seal para ayudar en la activacin. El LB endocita al Ag, lo degrada y lo presenta en una MHC-II, as el LTh lo puede ver. El LTh2 previamente haba sido activado por el mismo Ag. Pero para que el LB se active no solo se necesita de la colaboracin del LTh, necesita que el LT tenga otras molculas. Una de ellas es la CD40 del LB que va a interactuar con una CD40L que est en el LT. Cuando se produce esta interaccin el LT empieza a producir citoquinas que se llaman interleuquinas. Una importante es la IL-4 que induce la proliferacin del LB. El LB prolifera, algunos van a diferenciarse en plasmocitos y van a producir un Ac de clase IgM. Esto es la respuesta primaria. Algunos LB que proliferan van a formar el centro germinal y se van a empezar a dividir otra vez. Se los llama centroblastos, que no tienen Ig en la membrana porque se estn dividiendo. Los centroblastos sufren el fenmeno de hipermutacin somtica y el cambio de Ig o switch. Luego de estos dos

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fenmenos se transforman en centrocitos, que ya no se dividen y van a tener una alta afinidad por el Ag y otros pueden llegar a tener una baja afinidad. En este momento se seleccionan por contacto con el Ag. El Ag va a estar en las CDF de los centros germinales. Las CDF no procesan al Ag, solo lo tienen pegado a la membrana. Este Ag puede estar pegado junto a Ac que lo reconocieron o recubierto por el complemento. El Ag pegado forma los icosomas de la CDF. Los LB que tengan la mayor afinidad por el Ag se lo van a sacar a la clula CDF, lo van a procesar y se lo van a poder presentar a un LTh. Estos son los que van a sobrevivir. Los LB de baja afinidad no van a poder sacar el Ag de la CDF y van a morir por apoptosis. Cuando el LB se contacta con el LTh pueden transformarse en clulas plasmticas productoras de Ac o en clulas de memoria. Las clulas de memoria pueden salir y volver a entrar al ganglio linftico, las clulas plasmticas no pueden recircular. Las clulas B de memoria son las que actan ante una segunda entrada del Ag, producen ms rpidamente Ac que tienen una mayor afinidad por el Ag, y generalmente son del tipo IgG. Estos LB van a tener como BCR una Ig distinta de la IgM, porque sufrieron el cambio de isotipo. Activacin del los LB2 por los Ag TD: El LB2 para activarse necesita la colaboracin T-B, esto se produce mediante reconocimiento ligado. Para la activacin del LB se necesitan dos seales: -Primera seal: El LB se une al Ag por el BCR, lo endocita, lo procesa y presenta sus pptidos en el CMH II. -Segunda seal: colaboracin T-B. Para que este proceso se produzca los LB y Th2 deben reconocer epitopes antignicos en el mismo Ag. Esto se denomina reconocimiento ligado. Esto no significa que el LB y LTh2 reconozcan el mismo determinante Ag, de hecho en la gran mayoria de los casos se trata de epitopes diferentes, ya que el LB reconoce el epitope en conformacin nativa, mientras que el LT reconoce pptidos presentados y procesados por CMH. Los LTh2 que han sido previamente activados por clulas dendrticas con el mismo Ag, reconocen el pptido presentado por el CMH II del LB. Este reconocimento se produce gracias a que el LTh2 activado expresar en su membrana CD40L (tipo de TNF-) que reconocer de CD40 (tipo de receptor TNF-) en la membrana del LB. Al producirse la unin LT-LB, el LTh2 va a secretar IL-4 necesaria para la activacin del LB. Por lo tanto la activacin del LB y el LTh2 es mutua. Cooperacin del LTh2- LB en el ganglio. Formacin del centro germinal: Los Ag que ingresan en el organismo a travs de los tejidos perifricos son endocitados por CPA profesionales, en particular por clulas dendrticas, que luego los transportan a los ganglios drenantes a travs de los linfticos aferentes. Por su parte, los LT vrgenes ingresan en la zona paracortical de los ganglios atravezando las vnulas del endotelio alto (HEV) y los que reconocen el pptido antignico presentado adecuadamente por la CPA son retenidos y activados, producindose la expansin clonal de estos linfocitos. Los LB vrgenes que ingresan en el ganglio atravezando las HEV son atraidos hacia los folculos primarios por la quemoquina CXCL13 secretada por las clulas foliculares dendrticas. Cuando el LB virgen del folculo primario entra en contacto con el Ag a travs de su BCR, aumenta la expresin del receptor CCR7, especfico para las quemoquinas CCL19 y CCL21 predominantes en la zona paracortical T del ganglio linftico e inicia por consiguiente la migracin hacia esa regin.

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En ausencia de IL-12 en su entorno, los LT que se activaron en respuesta al Ag presentado por la CPA se diferencian a LTh2 y migran hacia el borde del folculo primario. En este sitio interactuan col los LB especficos, se produce la colaboracin TB y ambas poblaciones linfocitarias proliferan durante varios das. Alguno de los LB abandonan este primer foco de prliferacin y se dirigen a la mdula del ganglio linftico diferencindose en plasmocitos. Estos producen los primeros Ac de la respuesta humoral, que son clase IgM. Otros LB del foco de proliferacin migran hacia el exterior del folculo primario ataridos por la quemoquina CXCL13. Una vez en el interior del folculo primario, los LB siguen proliferando en forma muy activa y dan lugar al centro germinal. A estos LB proliferantes se los conoce como centroblastos. Debido a su rpida expansin, desplazan a los LB en reposo que conforman el folculo primario, los cuales se disponen formando la zona del manto alrededor del ncleo de clulas proliferantes. Los centros germinales estn compuestos mayoritariamente por los centroblastos que se disponen formando lo que se conoce como zona oscura. Tambin integran parte del centro germinal LTCD4+ (denominados tambin LT foliculares) y clulas foliculares dendrticas (CFD) que proveen las seales estimulatorias necesarias para la expansin y diferenciacin de los LB. Las CFD no estn relacionadas con las clulas dendrticas presentadoras de Ag. Cuando los centroblastos dejan de proliferar, se transforman en centrocitos, que junto con los LTCD4 y las CFD conforman la zona clara del centro germinal. Si bien los Ac producidos por el LB del foco primario cumplen un papel protector importante, la diferenciacin de los LB en el centro germinal provee al organismo de Ac ms eficaces para el control de los patgenos, de mayor afnidad por el Ag y diferente isotipo: hipermutacin somtica y cambio de isotipo (switch). Diferenciacin de los centrocitos en LB de memoria o en plasmocitos: Los centrocitos que han sobrevivido al proceso de seleccin da lugar a dos tipos de clulas: plasmoblastos, que abandonan el centro germinal para completar su diferenciacin a clulas plasmticas productoras de Ig de alta afinidad, y los LB de memoria (LBm). En la diferenciacin del centrocito en uno u otro inciden varios factores: 1) La afinidad del BCR por el Ag: a mayor afinidad de la unin tiende a diferenciarse a plasmoblasto. 2) Interacciones entre clulas T y B durante el proceso de colaboracin T-B. 3) Las citoquinas producidas por las clulas T: IL-10 favorece la diferenciacin a clula plasmtica, e IL-4 favorece la diferenciacin hacia LBm. Los plasmocitos que abandonan el centro germinal migran a la mdula sea y dan lugar a plasmocitos de vida media corta (das) o vida media larga (meses). En una respuesta inmune secundaria, la mayor parte de los Ac sricos provienen de los plasmocitos de vida media larga que siguen produciendo Ac, an cuando el Ag no esta presente. Los LBm que abandonan el centro germinal recirculan por los tejidos linfticos secundarios, o hacen homing en estos tejidos y quedan retenidos transitoriamente. La reexposiscin al Ag induce una rpida y masiva expansin clonal de los LBm, generndose entre 8 a 10 vaces mayor nmero de plasmocitos que en la respuesta primaria. Los LBm expresan BCR de alta afinidad por el Ag como consecuencia de su paso por el centro germinal y niveles incrementados de molculas de clase II del CMH.

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Ambas caractersticas contribuyen a que los LBm contacten ms rpidamente con los LTh2 activados en comparacin con los LB vrgenes en la respuesta primaria. Esto contribuye a que la produccin de Ac sea ms rpida en la respuesta secundaria. Si los niveles de Ac que persisten en la circulacin son suficientemente altos, el reingreso del Ag al organismo no genera una respuesta secundaria, ya que los Ac son capaces de neutralizar al Ag favoreciendo su inmediata depuracin por el sistema mononuclear fagoctico. Si los niveles de Ac no son suficientes para neutralizar por completo al Ag, los LBm que expresan BCR de mayor afinidad son los primeros en activarse por el Ag. Esta activacin puede dar lugar a una nueva respuesta del centro germinal.

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EL RECEPTOR DEL LT

El TCR siempre va a estar en membrana, nunca se va a secretar como la Ig de membrana del LB. Est constituido por dos cadenas. Hay dos tipos de TCR. Los LT tienen en su mayora el TCR que est constituido por una cadena y una cadena . , Estas cadenas tienen una regin variable y una regin constante, tambin una regin transmembrana y una pequea porcin citoplasmtica. La regin transmembrana es muy rica en cargas positivas (+). Las regiones de combinacin con el Ag son regiones hipervariables que se encuentran en las regiones variables de las cadenas. Son como las de las Ig: CDR1, CDR2 y CDR3. Son regiones determinantes de complementariedad que les permiten al TCR interactuar con el Ag. Si se compara el TCR se parece al fragmento Fab de las Ig, pero el TCR no est compuesto solo por estas dos cadenas, necesita de una molcula que se llama CD3. El CD3 est compuesto por varias molculas a su vez. Hay dos heterodmeros que se llaman y , y un homodmero constituido por una molcula llamada . Estas molculas neutralizan las cargas positivas que tenan las dos cadenas y y le permiten una mayor estabilidad. Entonces la funcin que tienen las molculas CD3 es la de dar estabilidad al TCR y la de transmitir las seales. El TCR tiene una cola citoplasmtica muy corta, entonces la molcula de CD3 va a ayudar a transmitir las seales al interior celular. Hay otros LT que son minoritarios que tienen un TCR de tipo Estos LT no . reconocen a los Ag en el contexto de las molculas del CMH I y II clsicas; parece ser que reconocen Ag presentados por molculas no clsicas I b. Estos LT estn ubicados en piel, en el epitelio respiratorio, en el epitelio del aparato reproductor y en epitelio intestinal. Actan ante condiciones de estrs. Se postula que reconocen a las protenas del shock trmico, que son protenas que se incrementan en condiciones de estrs. Son los LT que primero se producen en la vida embrionaria y muchos autores postulan que actan en los mecanismos innatos de la respuesta inmune. Son los anlogos a los LB1. Los genes que codifican para estos receptores tienen una determinada estructura en la lnea germinal. Despus se van reordenando como los genes de las Ig. En estos reordenamientos participan las mismas enzimas recombinasas y tambin tienen las mismas SSR. Los genes de la cadena estn codificados en el cromosoma 14, y los genes de la cadena estn codificados en el cromosoma 7. Hay genes que codifican para la parte variable y un gen que codifica para la parte constante. Hay tambin segmentos J que van a estar en las cadenas y en la cadena estn adems los segmentos D. Existen muchsimas ms variantes para estos genes que las que existan para los genes de las Ig. Entonces la variedad de receptores TCR es mucho mayor que la variedad de Ig que se pueden producir. Los procesos de reordenamiento se van a producir en forma similar a los genes de Ig. En la cadena existe el mecanismo de exclusin allica, si se reordena el gen de un cromosoma no se reordena el gen del otro, pero para las cadenas no. En las cadenas se pueden reordenar los genes de las dos cadenas. El reordenamiento empieza por los genes de cadena , y cuando se reordena este gen en forma exitosa se expresa un receptor que se llama pre-TCR. Este receptor va a estar constituido por una cadena y por una cadena sustituta. Cuando se expresa este preTCR el LT prolifera, dejando de reordenarse.

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Todos estos procesos ocurren en el TIMO. Si bien los LT se originan en mdula sea, van a migrar al timo, que es un rgano linfoide primario porque en l se produce la maduracin de los linfocitos. En el timo no entran Ag extraos, es decir, no es un lugar donde se genera una respuesta inmune. El timo tiene solo circulacin sangunea, no hay circulacin linftica. Luego, se reordenan los genes de cadena . Los genes de cadena estn ubicados en el mismo cromosoma que en el que se encuentran los genes de cadena , y estn en el medio de esos genes. Si se reordenan primero los genes se excluyen los genes . Adems del TCR y la molcula CD3, el LT tiene otras molculas de membrana que son muy importantes para su funcin. Una de ellas es la CD4 y la otra es la CD8. La molcula CD4 est formada por cuatro dominios semejantes a los de Ig, y la molcula CD8 est formada por dos cadenas: y . En estos procesos de recombinacin para generar los receptores van a estar los mismos eventos que ocurren en el LB para generar la variabilidad. VARIABILIDAD EN EL TCR Estn las distintas posibilidades de recombinacin por la gran variedad de segmentos V, D y J. Tambin participa la enzima TdT, es decir, hay adicin de nucletidos en los sitios de unin, pero lo que no ocurre es hipermutacin. Entonces, el CD4 se va a unir a las MHC-II, y el CD8 se va a unir al MHC-I. Esto es importante en el proceso de activacin de linfocito. El dominio del CD8 interacciona con el dominio 3 del CMH-I. Estos linfocitos CD8+ son LT citotxicos. La molcula CD4 va a estar presente en los LTh. El dominio D1 del CD4 interacciona con la cadena 2 del CMH-II. Estas son molculas co-receptoras que va a ayudar a la activacin del LT.

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ONTOGENIA T

El LT se produce en mdula sea y luego va al timo. En el timo se forman LT maduros que pueden ir a los rganos linfticos secundarios. El timo aumenta mucho de tamao durante la niez y al llegar a la pubertad comienza a involucionar. La involucin del timo no afecta a la inmunidad porque ya se produjeron los LT necesarios para actuar ante la entrada de cualquier agente al organismo. El timo est formado por muchos lbulos y cada uno tiene una corteza y una mdula. La corteza es una zona mucho ms compacta, mientras que la mdula es ms laxa. En la corteza hay clulas epiteliales corticales y LT en proceso de maduracin. En la mdula hay clulas dendrticas, macrfagos y clulas epiteliales medulares. Las clulas epiteliales, tanto medulares como corticales, se originan en el propio timo, los macrfagos y las clulas dendrticas provienen de la mdula sea. En el proceso de maduracin de LT se va a producir una migracin de los mismos por todos los sectores del timo: por corteza y mdula. Durante el proceso de maduracin, los LT se van a nombrar segn expresen determinados marcadores en su membrana. Cuando no expresan ni CD4 ni CD8 se llaman dobles negativos (DN). El LT va a pasar por tres estados de DN hasta que empieza a expresar una parte del TCR en su membrana. En el primer estado expresa la molcula CD2: DN1. Luego pasa al estado de DN2, donde sigue expresando la molcula CD2 y empieza a expresar la CD25. La CD25 es la cadena del receptor de IL-2. Despus el LT pasa por el estado DN3, donde comienza a reordenar los genes de la cadena . Cuando pasa al estado DN4 ya expresa el pre-TCR. En este estado el LT prolifera y reordena los genes . En este momento empieza a expresar CD4 y CD8: doble positivo (DP). En el estado DP se expresa CD4, CD8 y un TCR. En este momento el LT sufre unos procesos que le permiten reconocer MHC propias, y que no reconoce Ag propios. Son procesos de SELECCIN POSITIVA Y NEGATIVA. En el estado DP, cuando expresan CD4 y CD8, sufren una seleccin positiva que le permitir al LT reconocer MHC propias, condicin para que el LT se active. Esta MHC se las muestran las clula de la corteza tmica. Le muestra pptidos propios, provenientes del propio timo, los que las reconocen van a sobrevivir, los que no mueren por apoptosis. Aquellos DP que reconocen un pptido en el contexto del CMH-I dejan de expresar la CD4, y expresan solo CD8. A partir de este momento pasan a ser simples positivos (SP). Los DP que reconozcan al pptido presentado en el CMH-II dejan de expresar CD8 y solo expresan CD4. Van a ser LTh. Luego se produce el proceso de seleccin negativa, por el cual los SP que reconozcan Ag propios son eliminados por apoptosis. Los que no los reconocen sobreviven. Las teoras sobre estas selecciones positivas y negativas postulan que hay diferencias en la intensidad del reconocimiento. Cuando el reconocimiento es muy fuerte, el LT es seleccionado en forma negativa. Cuando hay pocos pptido el LT se selecciona de forma positiva. Otros autores indican que dependen de las seales que se transmiten al interior celular, o al pptido al cual se unen.

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ACTIVACIN DEL LT

Los LT maduros salen del timo y se dirigen a un ganglio linftico. Entran por las vnulas del endotelio alto y se ubican en una zona propia de los LT. Si el LT no encuentra ningn Ag en esa zona sale por los vasos linfticos y vuelve a circular. Si encuentra algn Ag, se va a activar, va a proliferar y se va a transformar en LT efector. Para salir de los vasos sanguneos, los LT sufren los mismos procesos que los macrfagos. Es un proceso de varias etapas en el que intervienen varias molculas que tiene el LT en su membrana y molculas que van a expresar las clulas endoteliales. Las clulas endoteliales de los vasos del endotelio alto tienen una molcula llamada GlyCAM 1 y la CD34. Estas dos molculas reciben la denominacin de adhesinas vasculares. Las adhesinas vasculares no aparecen en otros endotelios. Estas permiten el pasaje solo de linfocitos. Las molculas del LT que interactan con las adhesinas vasculares son las L-selectinas. La L-selectina unindose a una u otra de estas molculas hace que el LT ruede por el endotelio. A su vez el LT tiene receptores para factores quimioatractantes. Un receptor se llama CCR7, que se une a las quemoquinas que est produciendo la clula endotelial. Esta quemoquina es la CCL21. Cuando interacta CCR7 con CCL21, se produce una adhesin ms fuerte del LT con la clula endotelial, que est mediada por otras molculas: la LFA-1 del LT y la ICAM-1 de la clula endotelial. En este momento el LT se frena y empieza a pasar por clulas endoteliales por diapdesis y migra hacia el interior del ganglio. Esto est todo mediado por las quemoquinas que estn producindose en el ganglio. Dentro del ganglio si el linfocito se topa con un Ag para el cual tiene un receptor lo va a reconocer. Este Ag va a estar presentado por macrfagos, clulas dendrticas y los LB. Las clulas dendrticas son muy importantes en la activacin, porque estas clulas pueden migrar, as pueden llegar al ganglio desde otros lugares del cuerpo. Por ejemplo, las clulas de Langerhans en la piel son clulas dendrticas, si algn Ag entra por la piel, estas clulas lo pueden captar y lo pueden llevar hasta el ganglio. Estas clulas son inmaduras al captar el Ag, luego de capturarlo lo procesan y llegan al ganglio donde se transforman en clulas maduras que tienen disminuida la capacidad de captar Ag, pero tienen muy aumentada la capacidad de presentarlos, expresando muchas molculas del CMH tanto de clase I como de clase II. Estas clulas tambin pueden ser infectadas por virus, entonces van a presentar Ag virales en el contexto de las MHC-I. Los macrfagos, que son muy buenos para presentar Ag a los LT vrgenes, son los que estn en el ganglio. Los macrfagos que estn en los tejidos perifricos son clulas residentes, no pueden migrar, entonces solo van a actuar con LT efectores. Entonces las clulas ms importantes para presentar Ag a los LT vrgenes son las clulas dendrticas. Se necesita una colaboracin estrecha entre el LT y la clula que le presenta el Ag. Esta unin estrecha se produce a travs de distintas molculas de adhesin. La clula dendrtica expresa varias molculas que se tienen que unir a varias molculas del LT. Estas uniones son necesarias para que el LT pueda inspeccionar toda la membrana de la clula dendrtica o de la CPA buscando si hay algn complejo de MHC que pueda reconocer. Por lo tanto, primero se tiene que producir la interaccin entre las molculas de adhesin de la CPA y del LT. As, el LT puede ver si en la

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CPA hay algn Ag que l pueda reconocer. Si hay algn complejo MHC-pptido, se une. Esta unin enva seales al interior celular. Si el LT es un CD4+ o helper se va a unir la molcula de CD4 a la MHC-II. Pero esto no alcanza para que el LT se active, se necesita otra interaccin ms, mediada por otra molcula que es la molcula CD28 que est en el LT. Se tiene que unir a una molcula que est en la CPA que se llama B7. La B7 puede denominarse tambin CD80 o CD86, o B7.1 o B7.2. Sin la seal de la molcula B7 el linfocito no se activa. Las molculas B7 normalmente no se expresan. Para que se expresen el macrfago o la clula dendrtica debe haber reconocido algn agente extrao. Esto es una manera de control de la activacin, sino los LT se estaran activando continuamente. Esto, de que se necesitan tantas seales pasa con los LT vrgenes, es decir, LT que nunca vieron un Ag. Para los LT efectores que se generan despus del proceso de activacin, las seales que se necesitan no son tan fuertes, y no se necesita de la molcula B7.

Repasando: Los LT maduraban en el timo para que al salir fueran LT capaces de reconocer las MHC propias, que es la condicin necesaria para que se genere la respuesta inmune, pero que no reconocieran Ag propios. Para que se logre esto a los LT les pasaba dos cosas: primero un proceso de seleccin positiva y despus un proceso de seleccin negativa. En la seleccin positiva seguan madurando los que reconocan MHC propias, y en la seleccin negativa moran por apoptosis los que reconocan Ag propios. Durante el proceso de maduracin en el timo los LT van expresando distintas molculas en sus membranas, pasando por distintos estados: cuando no expresaban ni CD4 ni CD8 se llaman DN, despus empiezan a expresarse las dos, entonces se llaman DP. Cuando experimentan el proceso de seleccin positiva, donde reconocen MHC propias, dejan de expresar una de las dos molculas. Las que reconocen el CMH-I dejan de expresar CD4 y expresan solo CD8. Los que reconocen el CMH-II dejan de expresar CD8 y solo expresan CD4. CMH-I CMH-II expresa CD8 expresa CD4

Durante este proceso de maduracin se van recombinando los genes para poder expresar el TCR. En este proceso participan las mismas enzimas que participan en el LB: las recombinasas. Las cadenas que componen el TCR tambin tienen una parte constante y una parte variable. Tambin existen mecanismos que permiten aumentar la diversidad de estos receptores. Por ejemplo, hay muchos segmentos que codifican para cada gen, se adicionan nucletidos por la TdT, todo esto aumenta la variabilidad. Despus de todo el proceso de maduracin en el timo, que se van produciendo en las distintas zonas del timo, algunas se producen en la corteza y otras en la mdula, se generan entonces LT capaces de reconocer Ag. Los LT maduros van a los rganos linfoides secundarios, por ejemplo el ganglio linftico, al cual entran a travs de las vnulas del endotelio alto. Este es un mecanismo de reconocimiento sobre las clulas endoteliales y que los LT expresan en su membrana,

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despus la diapdesis y la migracin. Una vez en el ganglio linftico, si el LT encuentra un Ag se puede activar. Este Ag debe estar presentado por una CPA: clulas dendrticas, macrfagos o los LB. Para que el LT se active es necesario el contacto con la clula que le presenta ese Ag, y ese contacto se hace a travs de molculas de membrana del LT y de la CPA. LT CD2 LFA-1 LFA-2 ICAM-3 CPA LFA-3 ICAM-1 ICAM-2 DC SING

Esta interaccin va a permitir al LT recorrer toda la clula y ver si hay algn complejo pptido-MHC que pueda reconocer a travs de su TCR. Si hay alguna molcula que el LT pueda reconocer, se genera una primera seal de activacin, aunque no es suficiente para que el LT se active. Necesita la presencia de otra molcula co-estimulatoria que es la B7 de la CPA, y que se une a la CD28 del LT. Esta interaccin es condicin indispensable para que el LT virgen se active. La molcula B7 no la expresan todas las clulas, solo las CPA. Es decir, las dendrticas, los macrfagos y los LB. La expresan cuando existen condiciones de infeccin o ante la presencia de un patgeno. Presencia de un agente extrao Sntesis de B7 en la CPA

Esta interaccin es necesaria para que se transmitan seales al interior celular. Estas seales van a estar mediadas por distintas fosforilaciones de diferentes protenas, que lo que va a hacer es inducir la sntesis de ciertos factores de transcripcin, entre los cuales estn NKF- y AP-1. Estos factores de transcripcin lo que van a hacer es estimular la sntesis de IL-2, y del receptor de alta afinidad de IL-2. La IL-2 induce la proliferacin celular. la misma CPA tiene que mostrar el Ag en la MHC y adems proveer la seal coestimulatoria de la B7. Esto ya no es necesario cuando el LT es un linfocito efector. el LT efector no necesita de la interaccin con B7. Es decir, cuando ya sufri un impacto con el Ag, para un segundo encuentro con el mismo Ag no necesita de esta interaccin. Cuando el LT se activa empieza a expresar una molcula que se llama CTLA-4. Esta molcula es muy parecida a CD28, y tambin se va a unir a B7, pero tiene una funcin contraria: inhibe la proliferacin celular. Lo que induca la proliferacin celular es la IL-2. Entonces la interaccin entre CTLA-4 B7 inhibe la proliferacin celular. Esta es una forma de control, porque sino el LT estara proliferando independientemente. Entonces, una vez que el LT se activa, para controlar su propia proliferacin empieza a expresar CTLA-4. Los vrgenes no la expresan.

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Ahora, los LT pueden ser de dos clases: CD4+ y CD8+. Los CD4+ son los LTh o colaboradores, y los CD8+ son los citotxicos. El mecanismo de activacin es distinto para cada tipo de linfocito, pero el CD8+ tiene la particularidad de que necesita seales co-estimulatorias. Esto es porque la accin que ejerce el CD8+ es mucho ms drstica que la del CD4+: va a matar a las clulas infectadas. Es por eso que necesita una mayor accin de las molculas coestimulatorias. El linfocito CD8+ se va a poder activar de tres formas diferentes: 1) Una clula dendrtica infectada por virus que expresa en su membrana una MHC-I con un pptido. Cuando los Ag son intracelulares el virus se comportara como una molcula propia, y son presentados en el contexto del CMH-I. La clula dendrtica infectada por virus adems expresa mucha cantidad de molculas B7, las cuales inducen una fuerte seal para que el linfocito CD8+ se active. 2) Puede ser que la clula dendrtica no exprese muchas molculas B7. Esta clula muestra un pptido en el contexto del CMH-II y es reconocido por un LTCD4+. El LTCD4+ ya ha sido previamente activado, es un linfocito efector. Este LT va a secretar citoquinas que van a actuar sobre la clula dendrtica y van a hacer que esta clula dendrtica exprese la molcula B7. Ahora la clula dendrtica est en condiciones de activar al LT CD8+ que estaba unido al pptido que se le estaba presentando. Esta activacin induce la produccin de IL-2 y el receptor de IL-2. 3) Por ultimo, puede interactuar un LTh virgen. Este LT CD4+ va a activarse cuando la clula dendrtica le muestra la molcula B7. No hay muchas molculas B7, por eso el LT CD8+ no se puede activar. Entonces se activa el LT CD4+ virgen, este empieza a producir IL-2 que va a actuar sobre el LT CD8+ y lo va a activar haciendo que prolifere.

FUNCIONES EFECTORAS DE LOS LT Los LT CD8+ son los citotxicos, van a actuar en las infecciones virales, y su funcin va a ser la de destruir clulas infectadas por virus. Para ello debe activarse, luego puede salir del ganglio (todos los procesos de activacin de los LT vrgenes se producen en el ganglio). Los que salen del ganglio son los LT CD8+ y algunos LT CD4+ que son los LTh1. Los LTh2 se quedan en el ganglio linftico ya que son los que estimulan a los LB. El LT CD8+ efector no necesita la colaboracin de la molcula B7 para actuar. Si reconoce una clula que est infectada por un virus, la cual est expresando un pptido viral en el contexto del CMH-I, se va a volver a activar y va a ejercer sus funciones efectoras. El LT sintetiza unas protenas y las almacena en unos grnulos. Estas protenas son las perforinas y las grazimas. Cuando se produce la interaccin de su receptor con el pptido presentado por la MHC-I, y adems hay interaccin con otras molculas de membrana, se necesita un contacto ntimo, el LT libera stas enzimas, las perforinas y granzimas, se produce la exocitosis de los grnulos. Para explicar este proceso, algunos autores postulan que primero se libera la perforina, la cual se polimeriza y forma poros en la membrana de la clula. Luego entran las granzimas y son las que inducen la apoptosis. Otros autores dicen que se liberan en forma de complejos las perforinas y las granzimas. Son endocitadas por la clula diana, despus las perforinas perforan las membranas de las vesculas endocticas y se liberan las granzimas.

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El mecanismo, en definitiva, se polimeriza y forma poros en la membrana. A travs de estos poros penetran las granzimas, que son proteasas que van a actuar sobre distintos sustratos y se generaran molculas que activan a las DNAasas. Entonces, se produce el clivaje del DNA de la clula diana o blanco, que en este caso est infectada por virus. Entonces esta clula entra en apoptosis. Algunos textos tambin dicen que las perforinas lisan las clulas por permitir el ingreso de lquido al interior celular. Los LT CD8+, una vez que liberaron el contenido de sus grnulos, se desprenden de la clula diana y pueden ir a actuar sobre otra clula vecina que tambin est infectada por virus. Los LT CD8+ tambin expresan el ligando Fas. La interaccin entre una molcula Fas, que est expresada en la clula blanco, y el ligando Fas induce la apoptosis de la clula que expresa Fas. LT CD8+ expresa ligando Fas Clula diana expresa Fas esta interaccin induce la apoptosis de la clula infectada por virus.

Adems, el LT CD8+ puede producir citoquinas: INF-, TNF- y TNF-. El INF- tiene un efecto antiviral y adems activa a los macrfagos. El TNF- y el TNF- pueden inducir apoptosis celular y tambin actan sobre las clulas endoteliales alterando su permeabilidad. Los LT CD4+ vrgenes tambin se denominan LTh0. Luego de impactar con el Ag van a diferenciarse en dos poblaciones: LTh1 y LTh2. Estas dos poblaciones van a tener funciones diferentes y producen distintas citoquinas. Ambas poblaciones se autorregulan: las citoquinas que producen los LTh2 inhiben a los LTh1 y viceversa. El proceso de activacin es el mismo. Para que se diferencien a Th1 o Th2 tienen mucho que ver las citoquinas del entorno. Para que el LT se diferencie a Th1 son muy importantes la IL-12 y el IFN-, para que se diferencien a Th2 es muy importante la IL4. Por lo tanto, para que se diferencien hacia un perfil o hacia otro, un factor clave son las citoquinas que existen en el entorno durante su activacin. Los LTh1 se llaman comnmente linfocitos inflamatorios. Son los que participan en las respuestas mediadas por clulas, y son fundamentales en las repuestas inmunes contra Ag intracelulares. Los LTh2 actan contra Ag extracelulares, y participan en las respuestas de tipo humoral: respuesta inmune humoral. Son los que participan en la produccin de Ac. El LTh1 fundamentalmente activa macrfagos. El macrfago capta un Ag, lo endocita, lo procesa y lo presenta en el contexto con la MHC-II. El LT adems necesita del contacto con la molcula CD40. Entonces, hay interaccin MHC-II-pptido con TCR y CD40 con CD40L. Luego de esta interaccin el LT libera sus citoquinas: INF-, GMCSF (factor de crecimiento de granulocitos y monocitos), TNF-, IL-3 e IL-2. La IL-2 va a hacer que el LT pueda proliferar. Estas citoquinas incrementan la actividad microbicida o bactericida que tiene el macrfago. El macrfago de por si, en forma natural, tiene esta actividad. Cuando acta en la respuesta inmune no hay LT efectores, pero el macrfago acta igual. En la respuesta especfica esta actividad se incrementa mucho. Si el macrfago no puede - 84 -

eliminar el agente que fagocit, puede ser destruido por el TNF- o del FasL. Es decir, que los LTh tambin pueden llegar a comportarse como citotxicos. Producen IL-2 que induce la proliferacin celular. La IL-3 y el GM-CSF actan sobre la mdula sea y van a inducir la produccin de ms monocitos despus que despus se van a diferenciar a macrfagos. El TNF- va a estimular la migracin de los macrfagos a travs del endotelio, y tambin se va a secretar la quemoquina CXCL2 que va a favorecer la llegada de ms macrfagos al sitio de infeccin. Para que el macrfago se active debe interactuar la molcula CD40 con el ligando del LT, adems de la unin al Ag. El LTh2 reconoce el mismo Ag que el LB que est activado. El LB reconoce un Ag por la IgM de su membrana, lo endocita, lo procesa y lo presenta al LTh2. El LTh2 previamente fue activado con el mismo Ag, aunque no necesariamente reconozca el mismo epitope que el LB. Se necesita tambin la molcula CD40 y el CD40L. Entonces, el LB se activa y pasa a plasmocito o a clula de memoria. Las citoquinas que producen los LTh2 son los IL-4, IL-5, IL-15, IL-10, TGF-. Todas ellas intervienen en la diferenciacin de los LB a plasmocitos y en el cambio de isotipo.

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RESPUESTA INMUNE HUMORAL ESPECFICA

Es la que est mediada por Ac. Van a actuar eliminando patgenos extracelulares y evitando la diseminacin de los intracelulares. Los patgenos intracelulares para infectar otras clulas deben estar un tiempo en los fluidos, en ese momento pueden actuar los Ac.

FUNCIN DE LOS Ac Los anticuerpos son inmunoglobulinas. Estos pueden inactivar toxinas, pueden neutralizar virus. Esto es por la unin de Ac con virus o toxinas a travs del Fab. Tambin tienen otras funciones mediadas por el Fc, que est formado por las cadenas H de la Ig. Una de las funciones del fragmento Fc es la de activar el complemento. El complemento puede activar la lisis celular, puede participar en la quimiotaxis porque cuando se activa el complemento se generan unas molculas: C3a y C5a que tienen la capacidad de atraer neutrfilos o macrfagos. Cuando se activa el complemento tambin se generan otros fragmentos como el C3d y el C3b que tienen funcin de opsoninas, es decir recubren a los patgenos y permiten que sean ms fcilmente fagocitadas. Los Ac tambin pueden opsonizar, que es recubrir por ejemplo una bacteria de Ac y facilitar su fagocitosis por un macrfago que tiene receptores para el Fc. Tambin participan de un mecanismo llamado citotoxicidad anticuerpo dependiente (ADCC). El mecanismo tambin destruye clulas, pero no es producido por los LT CD8+, es producido por las NK, los macrfagos o los eosinfilos.

FASES DE LA RESPUESTA HUMORAL Se puede dividir a la respuesta humoral en dos fases: la induccin de los Ac y la efectora (accin de los Ac). La fase de induccin de la produccin de Ac tiene como primer punto la activacin de los LTh vrgenes: El LTh virgen debe unirse a la CPA que presenta el pptido en el contexto del CMHII. La CPA fagocit una bacteria extracelular, la proces, la degrad y le present un pptido al LTh 0. El LTh 0 lo reconoce a travs de su TCR (del tipo ) acompaado de la molcula CD3 (que estabiliz al TCR, permite que se exprese en membrana y participa en la transduccin de seales), de la CD28 que se combina con B7, y el CD4 que reconoce a la MHC-II. Entonces el LTh2 se activa. Esto se produce en la corteza del ganglio. Un LB, que reconoce al mismo Ag que el LTh2, tiene un BCR que es una IgM ya que el LB es virgen, acompaado de Ig e Ig. El LB reconoce el Ag, lo endocita, lo procesa y lo presenta en la MHC-II. El LB interacta con el LTh2 que haba sido activado, ya que los dos reconocen el mismo Ag, se produce una interaccin en la cual es importante la molcula CD40 del LB y la CD40L en el LT. Esto es para que el LB pase a plasmocito y produzca Ac.

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El LB prolifera porque el LT produce citoquinas: IL-4, IL-2, IL-10 e IL-5. Los primeros Ac que se van a producir son de tipo IgM. Todos estos procesos ocurren en la corteza del ganglio linftico. Parte de los LB que proliferan se van a ubicar en un folculo secundario donde se forma el centro germinal y los LB van a llamarse centroblastos y van a proliferar. Van a sufrir hipermutacin somtica y el cambio de isotipo. Los LB luego son seleccionados por las CDF, que tienen pegado en su membrana al Ag. Los LB que tenan mayor afinidad seguan proliferando y pueden pasar a plasmocitos productores de Ac o clulas de memoria. Los LB de memoria pueden expresar en la membrana IgM o IgG. Los plasmocitos no presentan ninguna Ig en su membrana, solo secretan Ac. Todo esto es para los Ag-T-dependientes, que son protenas fundamentalmente. Estos Ag-T-dependientes tienen una respuesta que se caracteriza porque tiene memoria, va a haber maduracin de afinidad y tambin se van a producir Ig distintas de la IgM. Para los Ag-T-independientes, que no son protenas sino polisacridos y lipopolisacridos, que tienen epitopes repetitivos, para ellos no hay memoria, no hay maduracin de afinidad y solamente se producen Ac IgM. Ante la entrada de un Ag se va a producir la respuesta primaria, que es la respuesta que se produce cuando entra el Ag por primera vez; es bsicamente de IgM al principio, luego puede producirse algo de IgG. La respuesta secundaria se produce cuando entra por segunda vez el Ag, que es ms rpida, ms intensa, y se generan una gran cantidad de IgG. Ante esta segunda entrada del Ag se van a impactar las clulas de memoria.

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RESPUESTA INMUNE CELULAR

A) INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS FAGOCTICAS Las clulas fagocticas son los neutrfilos y los macrfagos. Estas clulas participan en los mecanismos innatos, y los macrfagos son el nexo entre la inmunidad innata y adaptativa, porque adems de fagocitar, los macrfagos tienen la capacidad de presentar Ag. 1)El primer paso es la quimiotaxis, es decir llegar al sitio de infeccin o al sitio de entrada de un agente agresor. Se sienten atrados por pptidos que producen las propias bacterias, son pptidos cortos derivados de protenas bacterianas, y generalmente son pptidos formilados. Tambin pueden llegar por accin de las molculas C3a y C5a que se generan cuando el complemento se activa por cualquiera de las tres vas. 2)Despus necesitan unirse al agente agresor, por lo tanto lo tienen que reconocer, y lo reconocen a travs de receptores que tienen los neutrfilos y los macrfagos. Estos receptores reconocen patrones moleculares conservados en los patgenos, Pueden reconocer lectinas, y tambin estn los receptores toll. Pero tambin pueden reconocer molculas propias del organismo, como las Ig, ya que tienen receptores para el Fc. Es por eso que si hay una bacteria recubierta por una Ig el macrfago la puede reconocer y fagocitar. Tambin tienen receptores para la molcula C3b del complemento. 3)Una vez fagocitado el patgeno puede ser destruido por dos mecanismos, algunos que degradan el O2 y otros que no dependen del O2. Los mecanismos dependientes del O2 abarcan los intermediarios reactivos del O2 (ROI) y los intermediarios reactivos del N2 (NOI). En los NOI se genera NO que es txico para la clula, y en el ROI se genera el H2O2. Los mecanismos dependientes del O2 se conocen tambin como estallido respiratorio. En los mecanismos independientes del O2 alteran la membrana de la bacteria. Las defensinas, las catepsinas y la lisozima actan alterando las membranas de las bacterias, y la lactoferrina lo que hace es secuestrar Fe (hierro) que es indispensable para el desarrollo del microorganismo. El macrfago tiene un lugar preponderante en la respuesta inmune, porque no solamente participa en los mecanismos innatos, sino que es el nexo para que se generen las respuestas adaptativas, ya que es una CPA. Por lo tanto, en la fases iniciales el macrfago no est activado, pero igualmente tiene capacidad para fagocitar y destruir microorganismos. En la fase efectora, cuando ya se generan los LTh, este macrfago se puede activar y se estimula mucho ms sus funciones microbicidas. El macrfago produce la IL-1, la IL-6 y el TNF- que inducen el aumento de la temperatura corporal y la sntesis de protenas de fase aguda.

B) INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS T Los LT son los que determinan la especificidad de la respuesta ya que reconocen un Ag especfico, y tambin eligen el mecanismo por el cual el Ag va a ser eliminado. Los

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CD8+ va a eliminar las clulas infectadas por virus. Los CD4+ van a participar ya sea colaborando con los LB o activando los macrfagos.

C) CITOTOXICIDAD MEDIADA POR CLULAS En este se destruye la clula infectada y se puede llevar a cabo por varios mecanismos. Un mecanismo directo especfico es el mediado por LT CD8+. Hay otras clulas que pueden ejercer citotoxicidad pero de manera inespecfica, estas son las clulas NK o Natural Killer, son linfocitos granulares grandes. No tienen ni marcadores T ni marcadores B. Actan en la inmunidad innata, en los primeros mecanismos de defensa. Pueden destruir clulas infectadas por virus u otros agentes intracelulares. Tambin tienen grnulos donde almacenan perforina y granzima. Tienen receptores KIR que inhiben la activacin de la clula NK. Detectan cundo son normales o hay una disminucin en el nmero de MHC. Tienen varios receptores, algunos, como el NKR-P1, puede reconocer alguna glicoprotena en una clula infectada, una glucoprotena anmala. Estn los otros receptores NKG-2, que estn unidos a una MHC y por lo tanto la clula NK no se activa. Es decir, que estos receptores ejercen una seal inhibitoria. Si en cambio esta clula que est infectada por un virus deja de expresar la MHC, o expresa otras molculas distintas, cambiadas, los receptores que protegan a la clula de la activacin no funcionan, entonces la clula NK se activa y puede producir la lisis de la clula infectada. Las clulas NK pueden participar en el mecanismo de ADCC. Las clulas NK tienen receptores para el Fc, y tienen la particularidad de unirse a la IgG cuando est unidada a un Ag. Entonces si una clula es reconocida por Ac que se fijan a su membrana celular, y como la clula NK tiene receptores, se induce a la clula NK a la activacin y liberacin de sus grnulos que puede conducir a la lisis de la clula infectada. Este mecanismo tambin lo pueden llevar a cabo los macrfagos y los eosinfilos. Los eosinfilos a travs de la IgE, el macrfago y la clula NK a travs de la IgG. La actividad de las clukas NK est regulada por diversos receptores expresados en su superficie. Algunos de ellos son receptores inhibitorios que disparan seales intracelulares que mantienen a las clulas NK en reposo, sin desarrollar su actividad citotxica ni secretar citoquinas. Otros, los receptores estimulatorios, disparan seales intracelulares de activacin de las clulas NK. Un delicado equilibrio establecido entre seales inhbitorias y activadoras determinar, en ltima instancia, si la clula NK permanece en reposo o activar su poderoso arsenal citotxico antimicrobiano y antineoplsico. Este equilibrio puede ser alterado en el transcurso de un proceso infeccioso. Un patgeno podr transformar una clula del husped en un blanco potencial de las clulas NK por dos mecanismos: - stimulando la expresin en la clula diana de ligandos para los receptores activadores de las clulas NK. - Inhibiendo la expresin en la clula diana de ligandos para los receptores inhibitorios de las clulas NK. Los ligandos de receptores inhibitorios mejor conocidos son las molculas de clase I del CMH. Su reconocimiento por parte de los receptores inhibitorios evitar que las NK destruyan clulas normales. En cambio, clulas infectadas o neoplsicas, que

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suelen expresar menores niveles de molculas clase I del CMH (como consecuencia de la infeccin o de la neotransformacin) desencadenarn una sealizacin intracelular de menor intensidad, lo que permite en estos casos que prevalescan las seales de activacin desencadenadas por lo receptores correspondientes. Esta ausencia de seales inhibitorias mediada por molculas de clase I del CMH inclina la balanza hacia seales que activan a las NK. Las clulas NK realizan un control permenente de los niveles de expresin de molculas de clase I del CMH en las clulas del organismo y se activan cuando estos niveles disminuyen.

D) CLULAS NKT Son clulas que tienen receptores T de cadenas , y adems marcadores de clulas NK. Tienen la particularidad de que no reconocen a los Ag a travs de la MHC de clase II o I, sino que reconocen glucolpidos presentados por la molcula de histocompatibilidad CD1d. Lo que hacen es producir citoquinas. Existen dos tipos de clulas NKT, de acuerdo a si expresan o no la molcula CD4 en su membrana. Las clulas NKT CD4+ van a estimular con sus citoquinas a los LTh2. Las clulas NKT CD4 van a estimular con sus citoquinas a los LTh1.

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MECANISMOS REGULATORIOS DE LA RESPUESTA INMUNE

Los mecanismos de regulacin no estn totalmente dilucidados, y son bastante complejos. En l intervienen todas las clulas del sistema inmune. El sistema inmune puede interaccionar con otros sistemas: nervioso, neuroendcrino. Es decir, que hay muchos factores que influyen en cada uno de estos procesos, y es por eso que los mecanismos no estn completamente establecidos. Adems muchas funciones de la clulas se han determinado en cultivo in vitro, que no es lo mismo que lo que puede ocurrir in vivo. An as existen algunos factores que intervienen: EL ANTGENO Si tenemos mucha cantidad de Ag el sistema inmune va a actuar y se va a generar una buena respuesta. A mayor cantidad de Ag mayor respuesta para tratar de eliminarlo.

Si hay una mezcla de Ag, algunos pueden potenciar la respuesta de otros menos inmunognicos, pero tambin puede ocurrir que algunos Ag inhiban los receptores de otros. Lo mismo ocurre en una molcula. En una molcula puede haber epitopes que induzcan una mayor respuesta, y esos epitopes pueden hacer que sean disminuidas las respuestas hacia otros epitopes. En una mezcla un Ag puede disminuir la respuesta hacia otro Ag. Un epitope en una molcula ejerce un efecto negativo sobre la generacin de una respuesta contra otro epitope. Por ejemplo, si se quieren obtener Ac contra el Fab de la IgG, se puede inmunizar a un animal con la IgG entera o con el Fab. Cuando se inmuniza con la molcula entera a un animal se obtienen los Ac contra todos las partes de la Ig. Si inmunizamos solo con el Fab se obtendrn Ac contra el Fab. En la inmunizacin con la molcula entera se obtienen menos Ac anti-Fab que si se inmuniza con el Fab solo. Esto da una idea que los epitopes del Fc pueden estar modulando en forma negativa la respuesta hacia los otros epitopes. Esto tiene que ver con la INMUNODOMINANCIA. Est determinada por: El nmero de LB capaces de reconocer un determinado Ag o un determinado epitope. La afinidad del BCR por el epitope. La proteccin que la Ig de membrana (BCR) le otorgue al Ag. Cuando el LB le presenta un Ag al LT, primero reconoce al Ag y despus lo engloba. La unin del BCR al Ag puede proteger algunas regiones del Ag, justamente los que estn unidos al BCR. Entonces puede ser que las enzimas que lo tienen que degradar no acten. La competencia de los pptidos generados por unirse a la MHC. Las MHC tienen una unin al pptido de tipo degenerada, es decir, que pueden unir muchos pptidos. Si esos

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Ag tienen determinadas secuencias que pueden ser ms accesibles a las proteasas que los degradan, se van a formar ms pptidos con mayor afinidad por las MHC (se degradan ms fcil y son ms rpidamente presentados). Entonces van a haber: Epitopes dominantes: se unen con mayor facilidad a las MHC (se unen ms y mejor). Epitopes subdominantes: van a tener una capacidad de unirse intermedia. Epitopes crpticos: no se unen a la MHC o se unen muy poco y por lo tanto no son presentados. Cuando se elaboran vacunas se deben tener en cuenta estas caractersticas. En cuanto al tipo de Ag, los extracelulares o solubles van a tender a producir respuestas mediadas por Ac. Si los Ag son intracelulares las respuestas van a estar mediadas por clulas. La dosis del Ag es muy importante. Si se inoculan altas dosis se puede generar en vez de respuesta, TOLERANCIA. Esto depende en particular de cada tipo de Ag. Tolerancia: es la capacidad especfica y adquirida por el sistema inmune para no responder a uno o ms Ag, mientras mantiene su capacidad para responder a todos los otros.

Otro punto importante es la va de administracin. Las vas que ms respuesta generan son las intra drmica y la subcutnea. La va intravenosa tambin puede generar una buena respuesta pero si no se inoculan cantidades muy grandes, ya que se generara tolerancia. La va oral de administracin generalmente produce tolerancia. Esto puede deberse a una inadecuada presentacin antignica, en este caso los enterocitos pueden presentar Ag, pero no pueden suministrar la segunda seal co-estimulatoria, no tienen la molcula B7 y por lo tanto no se van a activar los LT adecuadamente. Tambin puede deberse a que se activen LT reguladores. Todo depende del tipo de Ag EL ANTICUERPO La unin de los Ac debe diferenciarse en lo que hace una IgG de lo que hace una IgM. Elevadas concentraciones de IgG inhibe la respuesta. Esto es porque la IgG compite por el Ag con los receptores de membrana de los LB. Es decir, mucha IgG circulante no va a dejar Ag libre para que se unan a los BCR. Entonces solo se van a poder activar los LB que tengan mayor afinidad. Con la IgM ocurre un fenmeno del cual no se conoce muy bien su causa, pero si se inocula un Ag con un Ac monoclonal IgM especfico para este Ag, se estimula la respuesta. Esto se puede dar por dos mecanismos: una de formacin de redes idiotipoantiidiotipo, o por una mayor estimulacin de las CPA. Estos dos mecanismos se postulan pero no se pueden explicar an. EL COMPLEMENTO El complemento va a actuar en varias etapas de la respuesta inmune. En la respuesta innata, cuando el complemento se activa por las lectinas o por la va alterna, va a generar molculas como C3a y C5a que tienen actividad quimiotctica, esto es, que

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pueden llegar mayor cantidad de neutrfilos y macrfagos al sitio de ingreso del agente agresor. As est modulando de algn modo la respuesta. Tambin cuando el complemento se activa puede generar C3b, que puede unirse a los patgenos, proceso de opsonizacin, y favorece la fagocitosis. Tambin se puede generar C3d, que puede unirse a los Ag. La unin de un Ag recubierto por C3d puede estimular una segunda seal en un LB y puede activarlo. Por ejemplo, el BCR se une al Ag, si ese Ag est unido a C3d, C3d se une a la molcula CD21 del LB e induce su activacin. En este caso no se necesita del LT. As, el complemento est actuando en la inmunidad inespecfica y en la inmunidad adaptativa. LOS INMUNOCOMPLEJOS Son complejos formados por uniones Ag-Ac. Pueden actuar de distintas formas. Se pueden formar inmunocomplejos con exceso de Ag o con exceso de Ac. Los inmunocomplejos con exceso de Ag tienen la funcin de activar el complemento. Cuando esos complejos estn con exceso de Ac pueden favorecer la fagocitosis. Pero tambin la formacin de estos complejos puede causar la inhibicin de la respuesta. Por ejemplo, una IgG se une a dos Ag. Esta IgG se puede unir a un receptor para su Fc de un LB. Si el LB es especfico para el mismo Ag que est unido a la IgG, el entrecruzamiento de receptores inhibe al LB. Este mecanismo parece ser el que ocurre en el caso de mujeres Rh- que tienen un primer hijo Rh+. A esas madres se les da una vacuna que tiene Ac anti-D. La vacuna se llama RHOGAM. Esos Ac anti-D van a funcionar a travs de este sistema: se van a unir a los GR del feto que tenan el Ag D. Estos inmunocomplejos van a ir a los LB de la madre que puedan reconocer el Ag D entonces estos clones de linfocitos se van a inhibir. Ante una nueva entrada del Ag D no van a responder. LAS CLULAS PRESENTADORAS DE ANTGENOS Se necesita que las dos seales para la activacin partan la misma CPA: se necesita la seal de reconocimiento especfica del pptido y la seal co-estimulatoria a travs de la molcula B7. LA REGULACIN POR LAS CLULAS T Las clulas T producen una gran cantidad de citoquinas. Se considera que existen clulas T supresoras que son CD8+. Hay dos tipos de estas clulas: CD8+T1 y CD8+T2. Estas clulas producen citoquinas que inhiben a las poblaciones Th. Las CD8+T1 producen INF- e inhiben a los LTh2. Las CD8+T2 producen IL-4, IL-10 e inhiben a los LTh1. La IL-10 es siempre inhibitoria. A su vez las poblaciones de LTh se inactivan mutuamente unas a otras. La IL que producen los LTh1, que la principal es el INF-, va a inhibir a los LTh2. Los que producen los LTh2: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, van a inhibir a los LTh1. Hay otras clulas reguladoras que tienen marcador CD4 en la membrana. Algunas de estas clulas se generan como tales en la mdula sea y se denominan LTreg y son clulas T reguladoras naturales, se generan ya con este fenotipo en mdula sea. Tienen el marcador CD4, el CD25 y expresan el gen Foxp3. Este gen codifica para una protena que se llama escurfina, la cual inhibe la proliferacin T. Estos LTreg actan ya sea para eliminar a los linfocitos autorreactivos o tambin regulan las respuestas contra agentes microbianos. Se activan con bajas concentraciones de Ag y pueden inhibir a los LTh1, LTh2 y LTc, aunque no sean especficos para ese

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Ag. Es decir, su accin es inespecfica, inactivan a cualquier poblacin de LT sin importar su especificidad. Producen IL-10 y TGF-, que son citoquinas inhibitorias. Hay otras clulas T reguladoras que son las LTr1, que son inducibles. Se cree que la generacin de estas clulas se debe a que se activan con un tipo particular de clula dendrtica llamada semimadura. Son cd que captaron un Ag pero en condiciones de estrs. Expresan una menor cantidad de molculas CD40 y de IL-2. Los LTr1 producen tambin IL-10 y TGF-, y tambin inhiben a todas las poblaciones de LT. Otros son los LTh3, aparecen en gran cantidad en la mucosa intestinal, y parece ser que son responsables de la tolerancia a los Ag que ingresan por va oral. Todas las clulas T reguladoras producen IL-10 y TGF-. Las clulas NKT actan sobre los LTh1 y LTh2. Las NKT CD4+ estimulan a los LTh2 y las NKT CD4- estimulan a los LTh1. Hay un tipo de clula CD8+ que tambin puede ser reguladora. La clula TCD8+reg acta como los LTr1. LA MUERTE INDUCIDA POR ACTIVACIN Est mediada por Fas-FasL que induce apoptosis. El LT expresa de forma constitutiva la molcula Fas. Cuando se activa empieza a expresar el FasL. Es por eso que los LT efectores no tienen una vida media muy larga. Otra es la expresin de la molcula CTLA-4, es parecida a la CD28, la comienza a expresar el LT despus de que se activa, tambin se une a B7 pero inhibe la produccin de IL-2, e inhibe la proliferacin. LAS REDES IDIOTPICAS Los idiotipos de los Ac estn ubicados en las regiones hipervariables del Fab. Son las regiones que se van a unir al Ag. Cada Ac va a tener un idiotipo diferente. Un investigador llamado Jerne propuso que si las Ig tienen distinto idiotipo, y esos idiotipos son capaces de reconocer una gran variedad de Ag, esos idiotipos estaran reflejando la variedad antignica del mundo exterior. Propuso que si hay un Ac capaz de reconocer un Ag a travs de su idiotipo, puede haber otro clon de LB que fuera capaz de reconocer este idiotipo. Esto es porque las Ig tambin actan como Ag. En la poca fetal estas protenas se van produciendo, y las porciones Fab que son las ms abundantes van a generar una cierta tolerancia, es por eso que el individuo es poco probable que sea capaz de responder a la Fc de las Ig. Por eso las porciones Fab, que estn en una concentracin menor, van a poder ser generadoras de Ac. En esta teora se postula que si un LB gener un Ac1, este Ac puede actuar como Ag para otro LB. Este LB va a producir un Ac2 contra el Fab del Ac1. La accin es inhibitoria. A su vez, los Ac2 pueden ser Ag para otros LB. Van a producir Ac3 contra el idiotipo del Ac2, e inhibe al clon del LB2. Son redes llamadas idiotipo-antiidiotipo que son inhibitorias. Esto se aprovecha para la vacunacin: un Ag es reconocido por un LB1. Otro clon de LB2 reconoce el paratope del Ac del LB1. Este nuevo paratope 2 va a ser la imagen del

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epitope del Ag. Este LB2, en su BCR estara mostrando la imagen del Ag que entr. Esto permite que se siga manteniendo la respuesta aun cuando el Ag no est. Esto se utiliza para vacunaciones contra agentes que son muy peligrosos para el organismo. Entonces, en vez de inmunizar con el Ag, se utiliza un Ac antiidiotipo, que es la imagen del Ag. Esto se ha ensayado para la rabia. Estas redes idiotipo-antiidiotipo son fundamentales para que funcione bien la respuesta inmune. Esta teora de la red est asociada con la HIPTESIS DE LA HIGIENE. Esta hiptesis sostiene que si se cra a un individuo en un ambiente excesivamente protegido, hace que su sistema inmune no est preparado para responder a los agentes agresores. Se necesita una interaccin con el ambiente para que el sistema inmune pueda funcionar de forma adecuada ante un agente agresor. LOS FACTORES GENTICOS Tienen que ver con las MHC. Estas son heredadas del genotipo paterno y materno. Se han detectado asociaciones de determinados alelos de la MHC con una mayor susceptibilidad a padecer infecciones o a veces con una mayor resistencia. Entonces el polimorfismo de las MHC se asocia con una mayor resistencia a padecer una enfermedad, a una mayor susceptibilidad. Los mecanismos por los cuales se produce esto no estn establecidos. En un individuo altamente respondedor la CPA le presenta el Ag al LT y este lo reconoce. Si la CPA no tiene la adecuada MHC para poder presentar el Ag no hay ningn LT que lo pueda reconocer. Puede ocurrir tambin que la CPA presente bien el Ag, pero el LT haya sido seleccionado en el timo. Si el pptido extrao tiene algn parecido con un pptido propio, el LT capaz de reconocer a ese pptido fue eliminado. Tambin puede ocurrir que haya una buena unin CPA-LT, pero puede que acte una clula reguladora e impida la activacin. LAS REDES INMUNOEDCRINAS La regulacin se complica aun ms porque el sistema inmune puede interaccionar con hormonas, pptidos provenientes del sistema nervioso, etc. Los glucocorticoides que se generan en situaciones de estrs inhiben las respuestas, fundamentalmente las de tipo inflamatorias, donde estn involucradas los macrfagos y los LTh1. Los estrgenos estimulan mucho las respuestas inmunes, en las mujeres hay mayor produccin de Ac y mayor cantidad de protenas en suero. Esto puede aumentar la probabilidad de producir enfermedades autoinmunes, por una mayor estimulacin de toda la respuesta. LOS EFECTOS DE: A) La dieta: la desnutricin calrica-proteica va a afectar a la inmunidad celular por atrofia de los tejidos linfoides. Los dficit de vitaminas D y E disminuyen la respuesta, pero un exceso de la vitamina D inhibe la proliferacin T. B) El ejercicio: es una situacin de estrs, esto genera mucho cortisol que a su vez disminuye la respuesta. C) La edad: hace que vare las citoquinas que se producen.

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REACCIONES DE INTERACCIN PRIMARIA

La parte del Ac que se une al Ag se llama paratope, est ubicado en el Fab y est determinado por las regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad: CDR. Estas son tres: CDR1, CDR2 y CDR3 y son las que se van a unir al Ag. La parte del Ag que se une al Ac se llama epitope. La interaccin entre el Ag y el Ac es una interaccin de tipo reversible, se forman enlaces que no son covalentes y pueden ser disociados por variaciones de pH o por variaciones de concentracin salina. La unin entre el Ag y el Ac puede ser a travs de un pequeo hueco hasta una regin mucho ms extensa, todo dependiendo del tamao que tenga el Ag. Cuando el Ag es muy grande la regin de unin puede abarcar inclusive las zonas constantes que estn entre las regiones hipervariables, que se llaman regiones marco. La unin Ag-Ac es de tipo llave-cerradura y tanto el Ag como el Ac se van moldeando para poder interactuar. Las fuerzas que van a intervenir en esta unin son cuatro. Las fuerzas que ms participan en la interaccin son las fuerzas hidrofbicas, que se generan cuando se excluyen las molculas de agua. Otras fuerzas son las uniones electrostticas que se producen entre grupos cargados, por ejemplo un grupo amino de una protena con un grupo carboxilo de otra protena. El otro tipo de fuerza son las uniones o puentes de hidrgeno, que si bien son enlaces dbiles son muy importantes en esta interaccin. Las otras fuerzas son las de Van der Wals. Dependiendo del complejo Ag-Ac va a predominar un tipo de fuerza sobre las otras. Una caracterstica que tienen todas estas fuerzas es que son inversamente proporcionales a la distancia, es decir, que cuanto ms cerca estn las molculas de Ag y Ac, ms fuerte va a ser la interaccin. Para poder estudiar este tipo de interaccin Ag-Ac se utiliza un Ag que sea univalente, es decir, que tenga un solo sitio de unin al Ac, por ejemplo un hapteno (Hp). Si recordamos, el Hp por s solo no puede no puede generar una respuesta inmune, debe estar fijado a una protena. Un Hp muy usado es el DNP, entonces si queremos generar una respuesta inmune contra el DNP debemos fijarlo a OA, por ejemplo. Obtendremos una molcula de OA que va a tener pegadas muchas molculas de DNP. Esto se inocula a un conejo y se obtiene Ac anti-DNP-OA. Si pensamos en la interaccin Ag-Ac como una frmula qumica: Ac + Hp AcHp

Cuando el complejo AcHp se puede disociar se tendr una constante de asociacin k y una constante de disociacin k`. A esta ecuacin qumica se le puede asociar una frmula: [ AcHp ] = k = K [Ac] x [Hp] k` (1)

Esta relacin se llama CONSTANTE DE ASOCIACIN INTRNSECA. Esta constante determina el parmetro de afinidad. La AFINIDAD es una medida de la fuerza de unin entre dos molculas (Ag y Ac) a travs de un sitio de combinacin.

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Para poder determinarla se elige una condicin de equilibrio. Entonces, la constante de afinidad en el equilibrio se define cuando el 50% de los sitios de combinacin de un Ac estn ocupados. Las unidades de la constante de afinidad son M-1 o L/ mol. Cuanto mayor sea la Ka mayor ser la afinidad, es decir, se van a necesitar menos molculas de Hp para saturar el 50% de los sitios de combinacin. Por pasajes de trminos se puede llegar a la ecuacin (2): K x [Ac] x [Hp] = [AcHp] (2)

La [Ac] libre se puede expresar en funcin de la [AcT] total: [Ac] = [AcT] - [AcHp] (3)

Si reemplazamos (3) en la ecuacin (2) obtenemos: [AcHp] = K x [Hp] x [AcT] 1 + K x [Hp] (4)

A partir de la ecuacin (4) se han desarrollado distintos mtodos matemticos que permiten calcular la constante de afinidad K.

MTODO DE SCATCHARD En este mtodo la frmula va a tener dos formas de expresin, una expresin que no tiene en cuenta la valencia del Ac y otra que s tiene en cuanta la valencia del Ac. Si llamamos b = [AcHp] y c = [Hp] , a partir de la frmula (4) podemos obtener: 1 = 1 + 1 b [AcT] x K x c [AcT] (5)

La representacin grfica de la ecuacin (5) es una recta:

1/b

1/c

Para el punto donde la recta corta el eje de las ordenadas, 1/c = 0, lo que significa es que c tiende a infinito. Esto se interpreta como que la [Hp] est saturando todos los sitios de unin al Ac. Entonces, a partir de este valor se puede despejar c que ser la concentracin de [AcT]. La Ka se define en el equilibrio, que es cuando estaba el 50% del Ac saturado. Entonces, si al valor b se lo divide por 2, se le hace la inversa y entramos en la curva se puede sacar la Ka.

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Entonces, con la [AcT], se lo divide por 2, se entra en la curva y se obtiene un valor de 1/c que corresponde a la ka. Scatchard se puede graficar de otra forma si se tiene en cuanta la valencia del Ac: n. Se establece una relacin r entre la [AcHp] / [AcT] . r= nxKxc 1+Kxc r =nxKrxK c

La representacin grfica de esta frmula es una hiprvola:

r/c

Cuando la [Hp] o c es muy grande, la curva va a cortar el eje de las absisas. Entonces, para r/c = 0 se va a obtener r que es la valencia del anticuerpo. Si el Ac es bivalente, es decir, que su valencia es igual a 2, y como la Ka se defina cuando estaban la mitad de los sitios de combinacin ocupados, cuando r = 1 se puede obtener la Ka.

MTODO SIPS Este mtodo introduce el trmino a que involucra heterogeneidad de los Ac. Se trabaja con un suero policlonal, estos son muy heterogneos, es decir, que los Ac no van a tener la misma afinidad por el Ag. Entonces la ecuacin queda: r = n x ( K x c)a 1 + ( K x c)a Haciendo pasajes de trminos y aplicando log se obtiene: log r = a x log K a x log c nr

Cuya grfica es una recta:

Log r n-r

Log c

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Esta recta nos permite determinar el ndice de heterogeneidad, que est dado por la pendiente. Este ndice puede variar entre 0 y 1. El valor 1 corresponde a un Ac monoclonal. Cuando es 0 se puede determinar la Ka. Estos mtodos sirven para determinar Ko dependiendo de los parmetros conocidos. Estamos trabajando con Ac bivalentes y Ag multivalentes, entonces no se puede hablar de afinidad, por lo tanto se define la AVIDEZ, en la cual estn involucrados ms de un sitio de unin. Generalmente, cuando se produce la unin del otro paratope es mucho ms fuerte. Con la avidez se define la constante de asociacin mltiple: Km. La Km se define como: Km = F x Ko n n = valencia del Ac F = valencia del Ag

La Km es una medida de la fuerza de unin de un Ag multivalente con un Ac. Entonces, se habla de: AFINIDAD: Para un Hp, es decir, un Ag con un nico determinante antignico. AVIDEZ: Para un Ag con mltiples determinantes antignicos.

La AFINIDAD no es lo mismo que la ESPECIFICIDAD. Un Ac puede tener una afinidad muy alta y no ser especfica. La especificidad va a estar dada por la complementariedad de unin, es decir, un Ac es especfico para el Ag que le dio origen. Un Ag2 que se relacione con el Ag1 que dio origen al Ac1, tambin puede ser reconocido por el Ac1. Esta es una reaccin cruzada. Cuando los Ag se relacionan y comparten ciertos determinantes antignicos, un Ac generado contra uno de ellos puede reaccionar con el otro. Los factores que van a influir en la especificidad van a ser: La pureza del Ag que se usa para inmunizar. Cuanto ms puro sea el Ag se obtendrn Ac que solo reconozcan al Ag. La ubicuidad del Ag, es decir, cuando hay una gran posibilidad de encontrarlo en muchos lugares. La estructura de un Ag relacionada con otros Ag va a disminuir la especificidad del Ac. La especificidad est muy relacionada con el Ag, por su pureza y ubicacin. La afinidad va a estar tambin influida por el Ag, pero por su concentracin. Cuanto menor concentracin de Ag haya se van a impactar aquellos linfocitos con receptores de mayor afinidad. Si tenemos una concentracin de Ag muy grande se van a impactar tanto con los receptores de baja como de alta afinidad. Otro fenmeno que influye en la afinidad es la hipermutacin somtica. Generalmente son de mayor afinidad para un Ag, los Ac que se obtuvieron inmunizando con ese Ag.

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A veces, un Ac de muy alta afinidad puede llegar a unirse a otros Ag que estn relacionados con el que le dio origen. EPECIFICIDAD: coplementariedad. AFINIDAD: fuerza de unin.

MTODOS PARA EL ESTUDIO DE LA INTERACCIN PRIMARIA Algunos mtodos necesitan el Ac purificado y otros no. Estos tres mtodos son para un Ac anti-Hp. EQUILIBRIO DE DILISIS Se tiene una cmara de dilisis, constituida por dos compartimientos separados por una membrana de dilisis. Esa membrana tiene un determinado poro y va a permitir el pasaje de las molculas de Hp. En uno de los compartimientos se coloca el Ac y en el otro el Hp. El Ac es especfico para el Hp. Las molculas de Hp van a difundir y va a llegar un momento en que se van a equilibrar las concentraciones de Hp de los dos lados de la cmara. Si el Ac es especfico, parte del Hp que se pase por la membrana se va a unir. Se generan entonces distintos estados de equilibrio con distintas cmaras. El Ac se coloca en cantidad constante y se va variando la concentracin de Hp. Se deja un determinado tiempo para que se llegue al equilibrio, y como el Hp que se usa es el DNP que se puede medir a 360nm, se hacen lecturas del contenido de cada una de las cmaras.

Hp

Ac

Medimos Hp libre

Medimos el AcHp + el Hp libre (equilibrio)

La diferencia entre AcHp + Hp libre y Hp libre nos da la cantidad de Hp que est unido al Ac (AcHp). Con estos datos se construye una grfica (cuadro 8-1). EXTINCIN DE FLUORESCENCIA (quenching de fluorescencia) Se bloquea la fluorescencia que puede emitir un Ac. En el sitio de combinacin del Ac hay algunos aminocidos, como el Trp que son capaces de emitir fluorescencia. Cuando ese sitio de combinacin se une al Ag, disminuye la fluorescencia del Ac. En este caso se debe trabajar con un Ac purificado, porque pueden haber otras protenas que tambin emitan fluorescencia.

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Es muy til esta tcnica cuando se usan Ac anti-DNP porque el DNP absorbe a 360nm, que es la donde emitira el Ac. Se trabaja con una determinada concentracin de Ac, en una cubeta de espectrmetro se van agregando distintas concentraciones de Hp, y se va midiendo como para cada concentracin de Hp agregada va disminuyendo la fluorescencia del Ac. Se necesita hacer un control para determinar el bloqueo mximo (Q max) o una cantidad muy grande de Hp como para que se bloqueen todos los sitios del Ac y tambin se necesita hacer un control de bloqueo de fluorescencia con un suero. En este caso es necesario tener en cuenta la valencia del Ac. Para cada punto se puede hacer los grficos antes vistos. PRECIPITACIN CON (NH4)2SO4 Cuando se enfrenta un Ag con un Ac, se va a producir el fenmeno de precipitacin si el Ag es multivalente. En este caso, como el Ag es monovalente, para lograr la precipitacin hay que agregar (NH4)2SO4. Este precipita los complejos Ag-Ac. En este caso se debe trabajar con un Ac libre de albmina, ya que puede fijar el Hp en forma inespecfica. Se hacen dos series de tubos. En una serie se colocan concentraciones de Ac constantes y concentracin de Hp crecientes. En la otra serie se agrega diluyente y concentracin de Hp creciente, no hay Ac. Se agrega (NH4)2SO4 luego de incubar. Van a precipitar los complejos Ag-Ac. Centrifugamos y medimos en el sobrenadante la cantidad de Hp que qued. En la serie A (Ag-Ac) medimos Hp libre. En la serie B se tiene Hp total, ya que no hay Ac. Con estos valores se hacen los grficos. POLARIZACIN DE FLUORESCENCIA Se basa en medir la diferencia de velocidad de rotacin que tiene una molcula. Se usa un Ag que tiene una determinada velocidad de rotacin. Cuando el Ag se une al Ac, la velocidad de rotacin disminuye, porque el tamao es mayor. Hay aparatos que permiten medir esta diferencia.

REACCIONES DE INTERACCIN PRIMARIA PARA LA DETECCIN DE ANTGENOS Y ANTICUERPOS Las reacciones de interaccin secundaria tienen fenmenos visibles asociados. Las reacciones de interaccin primaria no tienen fenmenos visibles asociados. Hay mtodos que se utilizan para determinar Ag o Ac que estn basados en las reacciones de interaccin primaria, y se usan porque son muy sensibles. Pueden ser utilizados para detectar pequeas cantidades de Ag o de Ac. Miden directamente la primera interaccin, la unin del Ag con el Ac. No necesitan ningn otro fenmeno asociado. estos mtodos de interaccin primaria son tiles porque tienen una alta sensibilidad y tambin porque permiten medir Ac incompletos 1) INMUNIFLUORESCENCIA (IF) Se utiliza un Ac marcado con una sustancia fluorescente: isotiocianato de fluorescena o lisamina-rodamina. La desventaja es que se debe disponer de un microscopio de fluorescencia para ver todas estas interacciones.

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El Ac marcado se denomina conjugado. En este caso puede estar conjugado con una sustancia fluorescente. La inmunofluorescencia puede ser directa o indirecta. La inmunoflourescencia directa se utiliza para detectar Ag y usa un Ac marcado especfico para el Ag. Se produce en un solo paso. La inmunofluorescencia indirecta se produce en dos pasos. En una primera etapa se une un Ac sin marca al Ag, y ese complejo es detectado por un segundo Ac marcado, que es un Ac anti- el primer Ac. Esta tcnica es altamente sensible pero corre con la desventaja de que necesita un operador muy entrenado para poder detectar lo que es positivo de lo que es negativo. Estos mtodos de inmunofluorescencia se pueden hacer en medio lquido, y es lo que se utiliza para la CITOMRTRA DE FLUJO. En citometra de flujo se usan Ac fluorescentes para detectar Ag de membrana de diferentes poblaciones celulares, por ejemplo. 2) RADIO INMUNOANLISIS (RIA) Se utilizan Ag marcados con una sustancia radiactiva, que puede ser 125I y 131I, que son los ms usados. Se utilizan para determinar hormonas, y se basan en la competencia entre el Ag de la muestra que se quiere determinar y un Ag*. Se necesita un Ac de muy alta afinidad, y un trazador que es el Ag* que se puede colocar en cantidades pequeas. La competencia se produce entre el Ag y el Ag* por el Ac. Otra tcnica que utiliza compuestos radiactivos se llama IRMA o ANLISIS INMUNO RADIO MTRICO. Hay dos tcnicas de IRMA que se utilizan en la deteccin de alergias. Son PRIST y RAST y se utilizan para detectar IgE. En el PRIST se pega en un papel o soporte en Ac anti-IgE. Se agrega el suero del paciente, la IgE est aumentada en las alergias, despus se agrega un Ac* anti-IgE. Si habra IgE en el suero del paciente se va a unir al anti-IgE*. Los Ac que se unen deben reconocer distintos epitopes de la IgE. El RAST se utiliza para detectar una IgE que sea especfica para un Ag. En el papel se pone el alergeno o Ag. Se agrega el suero que posee los Ac tipo IgE que pueden ser especficos para este alergeno, y luego se agrega un Anti-IgE*. Entonces, la PRIST detecta IgE total, y la RAST utiliza una IgE especfica para algo. 3) TCNICA ELISA Emplea Ac o Ag marcados con una enzima. Las enzimas que ms se usan son la peroxidasa del rbano o la fosfatasa alcalina. Los mtodos se pueden clasificar en homogneos y heterogneos. Los homogneos se hacen en fase lquida y los heterogneos son los que fijan algn reaccionante a un soporte. Los homogneos se utilizan para detectar drogas o haptenos, y se usan drogas o haptenos marcados con una enzima. Cuando a estos compuestos se les une un Ac especfico, la actividad enzimtica va a disminuir porque se bloquea la enzima. Los ensayos son siempre competitivos. Se coloca la muestra a investigar, se agrega la droga o el hapteno marcado con la enzima y el Ac. Cuanto ms hapteno haya en la

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muestra, ms se va a unir al Ac, menos Ac se va a unir al compuesto marcado con la enzima y, por lo tanto, la actividad enzimtica no se va a ver disminuida. En los heterogneos uno de los reactantes, o el Ag o el Ac se fija al soporte. Se pueden dividir en mtodos que se utilizan para analizar Ac o para analizar Ag. Para detectar Ac uno de los mtodos es indirecto. Se tiene un Ag pegado a una placa, todas las protenas son capaces de fijarse a las placas de poliestireno. Siempre que se hace la fijacin de un Ag se debe hacer luego un bloqueo para que no se unan los Ac, que tambin son protenas. Estos bloqueos se hacen con leche descremada, tambin se pueden hacer con otras protenas que no reaccionen, pero lo ms comn es usar leche descremada. Despus se hacen lavados para eliminar todo lo que no se uni, y despus se agrega el suero con el Ac a investigar. Tambin se hacen lavados para eliminar todo lo que no se haya pegado y se agrega un Ac contra el Ac en estudio, marcado con una enzima. Se agrega el sustrato y se mide el color del producto de reaccin. En el mtodo competitivo hay que realizar dos determinaciones en paralelo. Se fija el Ag a la placa, se bloquea para evitar cualquier reaccin posterior, y se trabaja con un Ac marcado con la enzima. Se mezcla el Ac* con el Ac del paciente, se agrega al pocillo donde est el Ag. Va a haber una competencia con los dos Ac por el Ag fijado. Si en el suero del paciente hay Ac se van a pegar y no van a dejar que se pegue el marcado. Cuando acaba la reaccin luego del agregado del sustrato se va a tener una determinada lectura. Paralelamente, en otro pocillo se agrega solamente el Ac*. Despus de agregar el sustrato se obtendr una DO. La diferencia entre las dos DO va a ser proporcional a la cantidad de Ac que tiene el suero del paciente. Para detectar Ag se tienen tres mtodos. Un mtodo es competitivo, se hacen dos determinaciones en paralelo. En este mtodo se pegan Ac a la placa. Se bloquean las uniones inespecficas y se hace una competencia entre el Ag* y el Ag que se encuentra en la muestra. Se pone Ag* y la muestra en el mismo pocillo, si hay Ag en la muestra va a competir con el Ag* por la unin al Ac, y luego del agregado del sustrato se va a obtener una determinada DO. En el otro pocillo solo se agrega el Ag*, luego de la adicin del sustrato se va a tener otra DO. La diferencia entre la DO da idea de la cantidad de Ag que haba en la muestra. Otro mtodo es el sndwich. Se tiene un Ac pegado a la placa, se agrega la muestra con el Ag a investigar y despus se agrega un segundo Ac* contra el Ag. Si haba Ag en la muestra el segundo Ac se va a unir, y va a haber medicin. Despus est el mtodo de inhibicin. Se tiene un Ag pegado a la placa y se va a mezclar un Ac* con la muestra donde se supone que hay Ag. Puede ocurrir dos cosas: Si en la muestra hay Ag, se une al Ac* y cuando se agregue la mezcla al pocillo donde hay Ag pegado, como todo el Ac* se uni a la muestra no queda nada para unirse al Ag fijado, entonces, luego del lavado, aunque agreguemos el sustrato no se producir degradacin. Si no hay degradacin de sustrato, la muestra contiene Ag. En la otra situacin, cuando en la muestra no hay Ag, aunque se mezcle con el Ac*, no hay interaccin y cuando se agregue la mezcla al pocillo, el Ac* se unir al Ag pegado a la placa y va a haber degradacin de sustrato.

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4) QUIMIOLUMINISCENCIA Se basa en generar luz a travs de una reaccin qumica. El compuesto que ms se usa en este tipo de reacciones es el luminol. El luminol se oxida por una reaccin catalizada por enzimas y se libera luz que se detecta. Se puede utilizar luminol unido a Ag o a Ac. Tambin se puede usar el luminol para una deteccin western blot. El Ac* con enzimas a utilizar puede ser la peroxidasa, si luego se agrega luminol como sustrato se observa emisin de luz. 5) INTERACCIN AVIDINA-BIOTINA Es simplemente una amplificacin de las seales. La avidina se extrae de la clara de huevo, y la biotina es una vitamina del complejo B. La biotina se puede unir con una gran avidez, con una gran fuerza, a la avidina. Si se marcan Ag o Ac con biotina o avidina se puede amplificar mucho ms la seal, esto hace que el mtodo sea ms sensible y que se puedan detectar menores concentraciones de Ag o de Ac.

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INMUNOQUMICA

La inmunoqumica trata sobre mtodos y tcnicas qumicas que se emplean en la inmunologa para aislar aquellas macromolculas de inters biolgico, es decir, Ag y Ac. La inmunoqumica estudia las tcnicas y mtodos que se emplean para separar, purificar y caracterizar Ag y Ac. Los mtodos se basan en distintas propiedades y caractersticas que tienen las molculas. Es decir, de acuerdo a la propiedad en que estn basados los mtodos se van a usar: El tamao molecular diferente, cuya tcnica es la filtracin por geles. La diferente carga elctrica que tienen las molculas, cuyos mtodos son la cromatografa de intercambio inico y la electroforesis en gel de poliacriamida. La especificidad que existe entre el Ag y el Ac, en la cual se basa la cromatografa de afinidad. Otras propiedades, como la cromatografa de covalencia.

SEPARACIN DE LAS BIOMOLCULAS POR EL DIFERENTE TAMAO La tcnica se llama FILTRACIN POR GELES o CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN ESTRICA o CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN POR TAMAOS. La separacin de las molculas se basa en el volumen hidrodinmico, que es la forma que adquiere la macromolcula en solucin. Es decir, que la separacin no est dada solo por el PM, sino tambin por la forma que adquiere y el grado de hidratacin que sufre cuando est en solucin. Todo este conjunto de factores definen lo que se llama VOLUMEN HIDRODINMICO. Este tipo de cromatografa es lquido-slido, la FM va a ser un buffer y la FE es slida y est dada por un material microparticulado y poroso que va a estar contenido dentro de una columna cromatogrfica, que es un tubo de acero que se llena con otro material a alta presin. Este material que forma la FE tiene un dimetro de 3 a 10 m. Es un material poroso, cuyos poros tienen una dimensin determinada. Adems tiene la capacidad de adsorber sustancias. Existen distintos materiales, son polmeros orgnicos derivados de la slica. Por ejemplo, est el dextrn (nombre comercial sephadex), la agarosa (sepharosa), la poliacrilamida y mezcla de agarosa y acrilamida. La FM es un buffer acuoso que produce condiciones de elusin muy suaves. Por lo tanto, el grado de desnaturalizacin que va a producir en la molcula va a ser mnimo. Tiene una fuerza inica elevada que va a impedir las adsorciones inespecficas de cualquier macromolcula a la fase slida o FE. Va a minimizar la aparicin de las fuerzas de Van der Wals o fuerzas electrostticas que produzcan una adsorcin del material. Las caractersticas a tener en cuenta del gel son que tenga un dimetro de poro apropiado. Si es muy pequeo no separar las sustancias porque ninguna entrar en

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ellos, si es muy grande entran todas las molculas. En ambos casos no puede producirse una separacin fraccionada de la muestra. Otra de las caractersticas es que debe ser inerte, no debe ser atacado por ninguno de los componentes de la FM. Tambin tiene que tenerse en cuenta que el tamao de partcula sea adecuado. Las partculas pueden venir en distintos tamaos: grueso, mediano, fino y superfino. Este tamao no va a influenciar en el rango de funcionamiento, sino que va a afectar la eficiencia de la separacin, es decir, los picos de elusin tendrn base ms angosta. Es decir, que en un volumen determinado va a fluir toda la sustancia. Hay parmetros del gel que son importantes conocer. Uno de ellos es el dimetro de poro adecuado. Esto se conoce con el nombre de lmite de exclusin: menor PM incapaz de entrar al poro. Aquellas molculas que tienen un volumen hidrodinmico grande no pueden entrar dentro de los poros de las partculas del gel, van a quedar afuera, por entre las partculas, por eso son las primeras en eluir. Las molculas ms pequeas son capaces de ingresar a los poros, por lo tanto van a ser ms retenidos y eluirn con posterioridad. Otro parmetro es el volumen libre o Vo, que es el volumen que existe entre las partculas, y es le volumen donde se encuentran las macromolculas que tienen un volumen hidrodinmico mayor que el dimetro del poro. Aquellos que pueden ingresar al poro, acuden a lo que se llama volumen incluido (Vi), que es el volumen adsorbido dentro de los poros. Se calcula como: Vi = a x Wr a = gramos del gel Wr = agua embebida

El Wr viene especificado en el envase. Para calcularlo en forma experimental se llena una columna con un gramo de producto, se tapa la salida con una maya de nylon 400 y se ejerce presin hasta que no se pueda ms. El volumen desalojado corresponde al Wr. El volumen incluido: Vi = Vt Vo Cuando el volumen hidrodinmico de esa molcula sea superior al dimetro del poro directamente va a quedar en el Vo. Este es el caso de una protena que excede el lmite de exclusin. Si el volumen hidrodinmico de la molcula es menor al dimetro del poro, va a acceder tanto al Vi como al Vo. Esto es lo que ocurre con las molculas del buffer. Hay una situacin intermedia, una molcula que tenga un volumen hidrodinmico que no sea muy pequeo, va a poder ingresar a los poros y va a estar un cierto tiempo dentro de la partcula. Entonces, van a eluir con un volumen de elusin Ve que va a ser superior a aquellas molculas que son totalmente excluidas pero a su vez menores al de aquellas molculas que como el buffer pueden acceder al volumen total. El Ve de una sustancia va a depender del coeficiente de distribucin Kd. El Kd es la relacin que existe entre la concentracin del soluto en la FE respecto a la concentracin del soluto en la FM. Por lo tanto, el Kd es caracterstico de cada sustancia. Aquellas sustancias que tienen un PM muy elevado van a tener un Kd = 0, porque en la FE no va a haber nada, va a estar todo en la FM. Entonces el Kd = 0 corresponde a aquellas sustancias que no pueden ingresar a los poros. En cambio un Kd = 1 corresponde a aquellas sustancias que tienen un PM muy bajo, por lo tanto, van a entrar en los poros, y se va a dar que en la FE hay la misma cantidad que en la FM.

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Entonces para un soluto que entra a los poros: Ve = Vo + Kd x Vi

Proporcin del Vi

Caracterstico de una sustancia que no ingresa

Cuando se tienen dos sustancias, cada una va a tener su Ve, y nos es necesario conocer el volumen que separa una sustancia de la otra, entonces se define el volumen de separacin Vs: Vs = Vi (Kd`- Kd``) Entonces se puede decir que el orden de elusin de una mezcla compleja de protenas de distinto peso molecular es inversamente proporcional al dimetro hidrodinmico de cada una de ellas. Las matrices estn compuestas por el material adsorbente y poroso. Hay columnas de tipo analtico y columnas separativas. Las columnas analticas son ms cortas, de 8 a 300 mm, pueden cargar un pequeo volumen con muy pocos mg de protenas, y se saturan rpidamente. En cambio las columnas separativas son columnas ms largas, de 20 a 400 mm y permite sembrar una muestra que tiene mayor concentracin de protenas, hasta 100 mg de protenas. Para las columnas analticas siempre hay que centrifugar la muestra para evitar saturaciones. Con respecto al sephadex, viene clasificado de acuerdo al grado de entrecruzamiento. Se le asigna una letra G y un nmero. Cuanto ms chico sea el nmero mayor ser el entrecruzamiento entre las molculas dextrano, por lo tanto el dimetro de poro ser menor. Esto tambin hace a la matriz ms rgida y permite aumentar la velocidad sin problemas. Requisitos del solvente (FM): se usan buffers acuosos con un pH compatible con la matriz del gel. La fuerza inica debe ser elevada para minimizar cualquier tipo de interaccin inespecfica que pueda existir entre las macromolculas que quieren separar y la matriz slida: fuerzas electrostticas, de Van der Wals, etc. El buffer ms usado es la solucin salina tamponada de pH = 7,5, es decir, un buffer fosfato 0,001M + NaCl 0,15M. La filtracin por geles sirve para el desalado de los solutos y dilisis rpida. Caracterizacin molecular a partir de la siembra de sustancias de PM conocido.

SEPARACIN DE LAS BIOMOLCULAS POR LA CARGA ELCTRICA CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO (IEC) La molcula se separa por la carga elctrica que posee. Las sustancias que se emplean como FE se conocen con el nombre de RESINAS. Tienen grupos fijos que estn

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cargados, estos se asocian con iones de carga opuesta y que son intercambiables. Estos iones estn unidos electrostticamente. La muestra tendr biomolculas con grupos cargados con la misma carga que los iones intercambiables. Entonces la muestra reemplaza a esos iones intercambiables y queda unida electrostticamente la molcula que se quiere separar. Las resinas, segn el in que intercambien se las clasifica en resinas de intercambio aninico o resinas de intercambio catinico. Segn la fuerza del in intercambiado, se clasifica en resinas de intercambio fuerte o dbil. La separacin se va a producir por un mecanismo de adsorcin reversible. El in intercambiable va a ser sustituido por las biomolculas cargadas. Las protenas son sustancias anfteras, de acuerdo al pH con el que se trabaje, las protenas pueden llegar a tener carga (+), carga (-) e inclusive carga neta 0 (pI). Entonces, es muy importante elegir un buffer adecuado para que la biomolcula est cargada. La separacin se realiza en dos pasos: 1) se une la sustancia a separar en la resina. 2) se eluye la sustancia unida. La elucin se puede realizar, o bien incrementando la fuerza inica del buffer, o bien modificando el pH hasta llegar al pI. El incremento de la fuerza inica del buffer va a producir una interferencia en la unin electrosttica temporaria que hay.

ELECTRFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA Tambin es una separacin por carga. El gel de poliacrilamida se prepara mezclando acrilamida y bisacrilamida. De acuerdo a las proporciones de cada uno de ellos se formar un dimetro de poro determinado. Esta metodologa cambiar la migracin de estas molculas por la accin de un campo elctrico con una filtracin por geles, es decir, un tamizado molecular. El tamao de ese tamiz estara dado por las proporciones de acrilamida y bisacrilamida. Esta tcnica se puede hacer tanto en tubo como en placa. Es muy comn utilizar en esta tcnica el detergente no inico Dodecil sulfato de sodio (SDS). El SDS se fija con una proporcin constante a los pptidos. Se utiliza adems el 2 mercapto etanol (2ME) que reduce los puentes disulfuro de los pptidos. Se fija 1,4 g de SDS por g de pptido. Como el SDS tiene carga (-) hace que todas las cadenas polipeptdicas adquieran todas la misma carga (-). As, el nico factor que incide en la velocidad de migracin va a ser el PM.

SEPARACIN DE ESTRUCTURAL

LAS

BIOMOLCULAS

POR

ESPECIFICIDAD

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Aprovecha la especificidad estructural: hormona-receptor, enzima-ligando, antgenoanticuerpo. Estas uniones son dbiles y se pueden disociar en determinadas condiciones. Se realiza en tres pasos: 1) Se insolubiliza uno de los reactivos, que va a ser una sustancia fijadora insoluble que tiene afinidad biolgica por la sustancia a separar. Pero no debe perder esa capacidad de fijacin. 2) Unin de la sustancia a separar a la matriz fijadora, por uniones no covalentes.

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3) Elucin de la sustancia a purificar. Se puede hacer de tres modos distintos: modificando el pH, la fuerza inica, o por competencia. Generalmente se utiliza para separar Ac. Se prepara entonces el INMUNOADSORVENTE. El Ag se insolubiliza mediante un tratamiento con glutaraldehdo, y se debe trabajar a un pH prximo al pI de la protena. Frente a esas condiciones se va a producir la polimerizacin del Ag. Este tratamiento se hace durante 24 hs en heladera. Se obtiene un gel, que con un agitador magntico se rompe todo. La desventaja es que solo quedan expuestos un 10% de los determinantes antignicos. Otra forma es prepararlo en una columna.

SEPARACIN DE LAS BIOMOLCULAS POR OTRAS INTERACCIONES CROMATOGRAFA DE COVALENCIA Se produce un enlace covalente. Las resinas thiol-activadas permiten fijar solutos que tengan grupos tiol. La separacin se produce por accin de un agente reductor.

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE Ig

Nos ocupamos de aislamiento y purificacin de Ig que tienen actividad de Ac. Las Ig difieren entre si y con el resto de las protenas presentes en el suero en distintos aspectos: la solubilidad que tienen en solucin acuosa, tambin difieren en el PM, en la densidad electrosttica y en el pI. Los mtodos que se utilizan en la separacin se los puede dividir en: Mtodos inespecficos: permiten la separacin de las Ig totales purificadas, sin distinguirlas en inmunes y no inmunes con respecto a un Ag en particular. Mtodos especficos: permiten separar aquellas Ig que tienen actividad Ac contra un Ag especfico.

MTODOS INESPECFICOS Partiendo de un suero total, mediante una metodologa lograremos la precipitacin total de las Ig, que recibe el nombre de FRACCIONAMIENTO. MTODOS DE PRECIPITACIN La precipitacin se puede lograr de dos formas distintas. a) precipitacin salina: Con el agregado de una sal en alta concentracin se produce una interferencia entre la relacin que existe entre los grupos cargados que tienen las protenas y las molculas de H2O. Al perderse esa relacin las molculas se van a volver insolubles. La concentracin salina que se requiere para volver insolubles a cada una de las protenas es particular de cada una de ellas. En general la fraccin de las Ig tienen aproximadamente la misma concentracin salina para volverse insolubles. Esta precipitacin salina permite purificar Ig y tambin para concentrar un suero que tenga baja concentracin de estas Ig. Se pueden utilizar dos sales: La ms usada es el (NH4)2SO4, sirve para obtener una fraccin cruda, que es una fraccin grosera de Ig impurificada. El (NH4)2SO4 es una sal muy soluble, y su solubilidad no se modifica en un rango de temperatura de 0C-25C. El Na2SO4 es ms soluble a 25C, luego baja su solubilidad hacia 0C. El (NH4)2SO4 se agrega hasta saturacin, al 33%. b) Precipitacin alcohlica: debe hacerse en fro.

SEPARACIN DE LAS FRACCIONES PROTEICAS DE UN SUERO Y SU PURIFICACIN 1) PURIFICACIN DE ALBMINA Protocolo: A un volumen de suero se lo mezcla con un volumen igual de (NH4)2SO4 33% (a saturacin). En estas condiciones las , y globulinas se vuelven insolubles, en cambio la albmina se mantiene en solucin. Al sobrenadante, que contiene las albminas, se le agrega (NH4)2SO4 slido hasta saturacin. En estas condiciones la albmina s se vuelve insoluble y precipita.

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Este precipitado est enriquecido en albmina. En estos casos en que se tienen muy pocas impurezas se emplea una resina de intercambio inico. Se usa un buffer con un pH prximo al pI de la macromolcula que se quiere aislar. De este modo al pasar la muestra todas las impurezas quedarn pegadas a la resina y la macromolcula de inters queda elctricamente neutra y eluye primero. pI ~ 5 se trabaja con una resina catinica dbil, y un buffer pH 5; la albmina estara elctricamente neutra, y el resto de las protenas tendrn carga (-). Entonces eluye la albmina pura. 2) PURIFICACIN DE INMUNOGLOBULINAS G Protocolo: A un volumen de suero se le agrega un volumen igual de (NH4)2SO4 33%, van a precipitar las , y globulinas. Con H2O destilada se disuelve el precipitado y se lo dializa frente a NaCl 0,15M. Luego se lo vuelve a re-precipitar (NH4)2SO4 33% pero en una proporcin de dos volmenes de muestra y un volumen de (NH4)2SO4 saturado. El precipitado va a ser rico en inmunoglobulinas. Se dializa el precipitado con un buffer pH = 8, las Ig adquieren carga (-). Se utiliza una resina de intercambio aninico, como la DEAE-celulosa, y por lo tanto, se van a pegar las Ig a la resina. Las Ig difieren entre s en la intensidad de carga elctrica. Se hace un fraccionamiento variando la fuerza inica del buffer. Variando la molaridad del buffer se generar interferencias de forma fraccionada. La IgG es la que eluye en mayor concentracin. La IgA est en mucha menor concentracin que la IgG, y la IgM en muchsima menor concentracin. 3) PURIFICACIN DE INMUNOGLOBULINAS A Protocolo: Es idntico al de IgG, pero como la IgA est en menor concentracin se parte de un suero rico en IgA, como el de un paciente con un mieloma a IgA. Todo el procedimiento es igual, pero los picos finales tendrn una concentracin diferente. 4) PURIFICACIN DE INMUNOGLOBULINA M Protocolo: Se utiliza un suero de un mieloma a IgM, en el cual la IgM va a ser ms abundante. La IgM tiene la particularidad de ser poco soluble en agua y precipita en agua boricada al 7%o. Al sobrenadante se lo re-precipita dos veces, despus se lo dializa frente a solucin fisiolgica y luego se realiza una filtracin por geles. Como la IgM tiene elevado PM va a fluir primero.

MTODOS ESPECFICOS Separan Ig que sean especficas contra un Ag en particular. 1) PURIFICACIN DE UN Ac CONTRA UN Hp Ejemplo: purificacin de IgG especfica contra DNP. a) Se puede hacer empleando resinas de intercambio inico.

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Al suero de un animal inmunizado con un Hp, se le realiza una curva de precipitacin cuantitativa para calcular cuanta concentracin de Ac se dispone. Con este dato se puede determinar la cantidad de Ag que se debe agregar en la zona de equivalencia para lograr una precipitacin cuantitativa. Para hacer esto es necesario cambiar el soporte del Hp. El precipitado se lava con NaCl 0,15M Luego hay que disociar los complejos Ag-Ac, y se puede hacer de dos formas: acidificando, y de esa manera desplazar la unin, y tambin agregando el Hp, por competencia. As se obtiene un sobrenadante que, si la disociacin se realiza por competencia, va a estar compuesto por: el Ag prot-DNP, el Hp DNP, el complejo Ag-Ac y los Ac antiDNP. Se agrega una resina de intercambio inico mixta. En la columna se agregan dos resinas diferentes: una resina aninica dbil y una resina aninica fuerte. Trabajando con un buffer pH = 8, como la SST, el Ag prot-DNP est cargado (-), los anti DNP estn elctricamente neutros. La DEAE-celulosa va a fijar al Ag, y la otra resina: IRA400 es capaz de fijar al DNP. Al producirse esto tambin disminuye el complejo Ag-Ac, ya que al fijarse el DNP se desplaza la unin al anti-DNP. Quedan as libres los Ac anti-DNP. En estas condiciones fluye el anti-DNP puro. b) Por cromatografa de afinidad Primeramente se determina la cantidad de Ag que se debe agregar para lograr la precipitacin cuantitativa de los Ac anti-DNP. Se prepara el inmunoadsorvente produciendo la polimerizacin del Ag con el agregado de glutaraldehdo y con un pH prximo al pI. Recordar que quedan expuestos solo el 10% de los determinantes antignicos, entonces se debe multiplicar por 10 la cantidad de Ag determinados por precipitacin cuantitativa. Cuando se agrega el suero se van a pegar todos los Ac anti-DNP. Se lava para eliminar todo lo que no se uni, y se disocia con medio cido. 2) PURIFICACIN DE Ac CONTRA UNA PROTENA COMPLEJA Ejemplo: purificacin de Ac anti-OA. Una de las tcnicas es la inmunoadsorcin. Otra es empleando una filtracin por geles. Se hace una precipitacin cuantitativa del Ac, se lava el precipitado, se lo disocia con medio cido y se pasa la muestra por sephadex G-200. En solucin hay complejo Ag-Ac sin disociar, Ac libre y Ag libre. Como tienen PM distintos, van a separarse.

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DEGRADACIN DE Ig POR MTODOS ENZIMTICOS

Dependiendo de la Ig son los fragmentos que se obtienen. Nosotros trabajamos sobre la IgG, que es la que aparece en una respuesta secundaria. Se puede hacer una ruptura de la IgG usando enzimas. Cuando a la IgG se la somete a la accin de la papana se produce una ruptura por encima del puente disulfuro y se obtienen dos fragmentos Fab y el fragmento Fc. La papana, en presencia de cistena y EDTA y a 37C por 4 hs produce la ruptura de la IgG en Fab, Fc, queda algo de IgG sin digerir y unos pptidos pequeos (entre los cuales est el Fc`). La IgG1 y 4 por accin de la papana sola se rompe, en cambio la IgG3 necesita que est presente la Cys y la IgG2 es resistente a la digestin. Si se prolonga la incubacin a 16 hs la cantidad de IgG sin digerir va a disminuir a expensas de un aumento del fragmento Fc`. Los fragmentos Fab y Fc tienen un PM alrededor de 55 KDa cada uno. Entonces con una filtracin por geles se pueden separar los fragmentos de la protena sin digerir y de los pptidos pequeos. Fab y Fc tienen intensidad de carga distinta, el de mayor intensidad de carga es Fc a pH=8 (carga (-)). Entonces con una resina de intercambio aninico como la DEAEcelulosa y variando la fuerza inica del buffer pH=8 se puede separar el Fab (que eluye primero) del Fc (de densidad de carga mayor). Otra de las enzimas que se utilizan es la pepsina. El tratamiento de la IgG con pepsina en medio cido (la pepsina para que se active debe estar al pH del estmago) produce una parte de Ig sin digerir, y la pepsina corta por debajo del puente disulfuro, produciendo un fragmento F(ab`)2 y pptidos pequeos. Con el uso de sephadex G-200 va a eluir primero la IgG sin digerir, luego F(ab`)2 y por ltimo los pptidos pequeos. La IgG puede sufrir tambin una ruptura qumica, que es un tratamiento con 2ME en presencia de iodoacetamida en medio cido que logra romper la IgG en los pptidos constituyentes: cadena L y cadena H. El 2ME reduce los puentes disulfuro, y a su vez, la iodoacetamida impide que se vuelvan a unir los grupos por regeneracin de los puentes disulfuro. El cido propinico da el pH=3, reduce las fuerzas de interaccin de Van der Wals. Como los PM son distintos se utiliza una filtracin por geles.

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INTERACCIN SECUNDARIA

Cuando un Ag se pone en contacto con su Ac especfico, se forma el complejo Ag-Ac en el cual participan uniones no covalentes, por lo cual es posible disociar esta interaccin. Cuando un Ag con un Ac especfico se ponen en contacto lo primero que ocurre es la INTERACCIN PRIMARIA (las reacciones primarias son detectadas por fenmenos de interaccin primaria). El fenmeno de interaccin primaria es simplemente la unin que forma el complejo Ag-Ac. Esta interaccin se da inmediatamente entre el Ag y su Ac correspondiente y es un fenmeno no visible. Es inmediato y no visible. Este fenmeno es independiente de la concentracin de electrolito y de la temperatura. Si se dan ciertas condiciones se pueden llegar a tener reacciones de INTERACCIN SECUNDARIA. Este fenmeno es visible mediante reacciones de precipitacin o de aglutinacin, segn el tipo de Ag. Este tipo de reacciones ocurren in vitro. Hay otro tipo de interaccin que se puede dar entre Ag y Ac y se llaman INTERACCIN TERCIARIA y se producen in vivo. Una de ellas tienen como manifestacin la necrosis, y la otra es la anafilaxia, en la cual la consecuencia de la interaccin del Ag-Ac en la superficie de una clula produce la liberacin de grnulos con una gran cantidad de mediadores qumicos que producen contraccin de musculatura lisa, prdida de la permeabilidad capilar, etc. Para que se den las reacciones de interaccin secundaria y terciaria se requieren unas determinadas relaciones de concentracin entre Ag y Ac.

REACCIONES DE PRECIPITACIN Este tipo de interaccin secundaria ocurre cuando un Ag soluble entra en contacto con su Ac especfico. Si esto ocurre en un medio salino adecuado se va a visualizar la formacin de un precipitado blanquecino. Esto ocurre si los Ac son precipitantes, es decir, que tienen la capacidad de precipitar, y estos tienen una alta afinidad por el Ag en ambos sitios de combinacin. En cambio, en los Ac no precipitantes tienen una baja afinidad por el Ag; y otro caso es el de los Ac bloqueantes, incompletos o coprecipitantes. Son Ac bivalentes pero con distinta afinidad por el Ag en cada sitio de combinacin, tienen un sitio de alta afinidad y otro de baja afinidad. Es por esto que solamente van a dar reacciones de precipitacin aquellos Ac que sean capaces de precipitar. La precipitacin puede ser total o zonal. El Ring Test es un mtodo de precipitacin zonal, y una precipitacin cuantitativa para la curva de precipitacin es una precipitacin total. La precipitacin se puede dar en medio lquido o en medio gelosado. PRECIPITACIN EN MEDIO LQUIDO Se puede realizar en forma cualitativa o cuantitativa. A) PRECIPITACIN CUALITATIVA La precipitacin cualitativa puede servir para identificar un Ag o un Ac, segn el caso. Ocurre en dos etapas. Una primera fase de reaccin primaria, se produce de manera rpida cuando el Ag y su Ac correspondiente se ponen en contacto. Esta etapa es muy

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poco influida por la temperatura y la concentracin de electrolitos. En esta etapa se forman los complejos primarios. Ahora, si se dan las siguientes condiciones: Ag multivalente. Ac bivalente como mnimo. Concentracin adecuada de Ag y Ac. Concentracin adecuada de electrolito. Temperatura. Agitacin. Se podr visualizar la reaccin secundaria. Cuando los complejos Ag-Ac se van agregando constituyendo micelas, esta micelas cuando adquieren un determinado volumen, y por lo tanto, peso, van a sedimentar haciendo visible la reaccin. La velocidad a la cual sedimentan va a ser directamente proporcional al volumen que tiene la micela, a la diferencia entre las densidades de la partcula y del sobrenadante, y a la aceleracin de la gravedad. No siempre se pasa de la reaccin primaria a la secundaria, ya que se requieren determinados requisitos para esto. Esto no ocurre por ejemplo cuando el Ag es monovalente (por ejemplo con un Hp). Tampoco cuando el Ag tiene un solo determinante antignico, ni cuando el Ac es monovalente. Cuando se inmuniza a un animal vertebrado inmunolgicamente maduro, con la inoculacin de un Ag multivalente, con determinantes antignicos iguales o distintos (mono o poliespecficos respectivamente), el sistema inmune va a responder produciendo Ac especficos para cada epitope. El suero va a ser una mezcla de Ac dirigidos contra distintos epitopes. Por ello se dice que es poliespecfico. Si se pone en contacto el suero del animal frente al Ag que se utiliz para inmunizar se formaran complejos Ag-Ac mixtos. En un caso particular si se enfrenta el Ag multivalente con un solo determinante antignico que tiene especificidad para un Ac monoclonal bivalente se va a formar el complejo Ag-Ac, pero no va a dar precipitado porque el determinante antignico es nico. Teora de la red o de Marrack La formacin del precipitado es una consecuencia del modo en como el Ag y el Ac se han unido. Adems de tener un Ag multivalente y un Ac bivalente como mnimo, tambin debe haber relaciones adecuadas entre el Ag y el Ac. Debido a esto pueden ocurrir tres casos: Un caso donde las proporciones entre el Ag y el Ac son las adecuadas. La relacin Ac/Ag depende del PM del Ag, se forman las micelas y se puede observar la formacin de un precipitado. Cuando hay un exceso de Ag respecto de Ac, se forman complejos Ag-Ac que son solubles. Cuando el Ac est en exceso no alcanza la cantidad de Ag como para formar micelas. La reaccin de Ag-Ac es de tipo reversible y se da en condiciones estrictas de equilibrio. El complejo Ag-Ac ante un exceso de Ag pasa a ser soluble. Esto tambin puede lograrse agregando Hp en exceso, ya que se obtiene la formacin de los complejos solubles Hp-Ac. - 115 -

B) PRECIPITACIN CUANTITATIVA Permite cuantificar tanto Ag como Ac. Generalmente se desea cuantificar los Ac de un suero de un animal que ha sido inmunizado. Hay dos casos: 1) Cuando se quieren obtener Ac especficos contra un Ag no proteico, como puede ser un polisacrido. En este caso cuando est formado todo el complejo Ag-Ac, de todo ese complejo lo nico que va a ser proteico es el Ac. Se lee el contenido proteico disuelto en NaOH por espectrofotometra a 280nm, ya que a esa longitud de onda las protenas absorben. Si se grafica g de Ag aadido vs. mg de protena Ac en el precipitado se obtiene la curva de precipitacin. Se fueron aadiendo cantidades crecientes de Ag, y se van formando mayores cantidades de complejo Ag-Ac, en este caso mayor cantidad de protena Ac. Esto va aumentando hasta un momento donde la cantidad de protena Ac precipitada es mxima. Luego, al seguir agregando Ag la cantidad de protena Ac precipitado va a ir disminuyendo. Si al sobrenadante de cada tubo se lo divide en dos y a uno se lo enfrenta al Ag que se utiliz para hacer la curva, y al otro al Ac, en los primeros tubos van a dar reaccin (+) cuando se enfrente al Ag, ya que se tienen Ac sin reaccionar. Esta se llama zona de exceso de Ac. En los ltimos tubos cuando lo enfrente al Ac va a dar reaccin (+), es la zona de exceso de Ag. En el lugar donde se alcanza el pico mximo, con mayor cantidad de protena Ac precipitada, tanto frente a Ag como frente a Ac el sobrenadante dar reacciones (-). Esta zona o tubo donde hay doble reaccin (-) es la zona de equivalencia, y corresponde a la zona donde la precipitacin es mxima y es total para todos los Ac precipitantes. 2) Cuando se quiere valorar un suero que se obtuvo por inmunizacin con un Ag proteico. Hay dos casos: a) El Ag es una protena, pero tiene un marcador que es un Hp con la capacidad de dar una seal. Por ejemplo el DNP tiene la propiedad de poder absorber a 360nm. Se realiza el mismo procedimiento anterior pero con dos lecturas: la lectura a 280nm se va a leer el complejo Ag-Ac como protena total. La lectura a 360nm se puede determinar la cantidad de Ag. La diferencia entre la concentracin del complejo Ag-Ac (280nm) en la zona de equivalencia y la cantidad de Ag (360nm), puede determinar la concentracin de Ac. b) El Ag proteico es una molcula compleja, como la OA, sin marca. El protocolo de trabajo es exactamente el mismo, pero en este caso debe determinarse la zona de equivalencia haciendo la determinacin cualitativa a travs del mtodo del anillo. Se hace tambin una lectura espectrofotomtrica a 280nm del precipitado en la zona de equivalencia que corresponde al complejo Ag-Ac, y se le resta la cantidad de Ag agregado.

INHIBICIN DE LA PRECIPITACIN POR EL AGREGADO DE Hp El Hp es la parte reaccionante del Ag, es la regin especfica que se une al Ac. Si el suero que contiene los Ac se lo enfrenta al Hp, se formar una interaccin primaria por la unin Ac-Hp que no es visible. Esto se puede hacer cualitativa o cuantitativamente, y la lectura se hace al 50% de inhibicin. Se usa para hacer estudios de especificidad de Ac y tambin para hacer estudios de Hp que estn relacionados y comparar esas afinidades con el Ag.

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REACCIONES DE FLOCULACIN En ellas hay precipitado abundante en la zona de equivalencia. Lo que ocurre en la zona de exceso de Ag y de exceso de Ac es una redisolucin del precipitado. Esto se debe a una caracterstica del Ac. El caso tpico es cuando se inmuniza el caballo con protenas como la toxina tetnica o difteria. Los sueros H (de horse: caballo) son sueros que floculan. Los sueros R (de rabit: conejo) son precipitantes.

PRECIPITACIN EN MEDIO GELOSADO Estos mtodos se pueden realizar porque las macromolculas tienen la propiedad de poder difundir por un medio que contiene geles. Esa difusin va a estar limitada por la cantidad de gel que haya en el medio. Mucha concentracin de gel va a poner mucha mayor resistencia a la difusin de la macromolcula. Obviamente el agar debe estar disuelto en una solucin de electrolitos adecuada: NaCl 0,15M (fisiolgica). Si en una placa de gel practicamos dos pocillos, en uno se siembra un Ag y en el otro pocillo se siembra el Ac correspondiente, estas macromolculas van a ir difundiendo y cuando se encuentren, si existe especificidad, es decir, si son complementarias, aparecer una banda de precipitacin. Los geles que se pueden usar para hacer la precipitacin por geles pueden ser varios: pectina, poliacrilamida, acetato de celulosa, agar. Las tcnicas que se basan en la precipitacin en medio gelosado pueden ser cualitativas o cuantitativas. A) DIFUSIN SIMPLE MONODIMENSIONAL (tcnica de Oudin simple) La tcnica consiste en colocar en un tubo de ensayo una mezcla de agar disuelto en solucin fisiolgica y el suero a investigar, mezclado en partes iguales. Se deja solidificar y despus se coloca por encima una solucin del Ag conocido disuelto en solucin fisiolgica. Se deja difundir, y en una zona prxima a la interfase entre el agar y la solucin del Ag no se va a ver precipitado porque el Ag va a difundir por el agar y como estara en mucha mayor proporcin se producir redisolucin del precipitado. Cuando se llega a las concentraciones adecuadas, si existe especificidad, aparecer una banda de precipitacin Ag-Ac especfica en una determinada posicin dentro del gel. Este sistema sencillo permite discernir si hay especificidad Ag-Ac, y adems permite diferenciar si hay ms de un sistema Ag-Ac interaccionante. B) DIFUSIN SIMPLE BIDIMENSIONAL En esta tcnica se coloca en la parte inferior del tubo de ensayo agar al 1% en solucin fisiolgica mezclado en partes iguales con el suero a investigar. En una fase intermedia se pone agar disuelto en solucin fisiolgica, y en una tercera fase superior se coloca nuevamente agar disuelto al 1% en solucin fisiolgica mezclado en partes iguales con la solucin antignica. Nuevamente va a haber difusin, el Ag migrar hacia abajo y el Ac hacia arriba, y si existe especificidad Ag-Ac aparecer una banda de precipitacin en la zona del agar solo. En este sistema tambin se puede investigar si hay especificidad Ag-Ac, si hay uno o varios sistemas interaccionantes, y la posicin de la banda da informacin sobre las concentraciones relativas del Ag y el Ac.

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Si la banda de interaccin aparece en una zona intermedia del agar solo se puede decir que las concentraciones del Ag y del Ac son correspondientes a la zona de equivalencia. Esto no significa que sean iguales, sino que la proporciones son las adecuadas como para producir el fenmeno de precipitacin. Si la banda aparece cerca del gel que contiene el Ag se debe a que el Ac est en exceso, por ello tuvo que migrar mucho ms hasta llegar a las concentraciones adecuadas del Ag. Cuando el Ag est en exceso la migracin de ste va a producir redisolucin del precipitado hasta que se llegue a las concentraciones adecuadas y se forma la banda, en este caso cerca del gel con el Ac. C) DOBLE DIFUSIN BIDIMENSIONAL (Mtodo de Ouchterlony) Este mtodo consiste en preparar una placa con el agar disuelto en solucin fisiolgica y homogneamente distribuido. Se practican dos orificios, en uno se siembra el Ag y en el otro el Ac. Se va a producir la difusin en forma radiada, y si se dan las condiciones ptimas, aparecer una banda que indica que hay especificidad Ag-Ac. Si hay ms de un sistema interaccionante se vern varias bandas. Siempre permite identificar el mnimo de sistemas interaccionantes. Puede darse el caso de que un sistema no se halle en las proporciones adecuadas, por lo tanto no dar banda, y tambin puede ocurrir superposicin de bandas. Este sistema nos da informacin acerca de si hay o no especificidad Ag-Ac, si hay ms de un sistema interaccionante, segn la posicin de la banda se puede tener idea de las concentraciones relativas de Ag y Ac (siempre la banda se aproxima ms al ms diluido). El espesor de la banda nos indica si hay mucha o poca cantidad de Ag y Ac. Otra informacin que se puede obtener es sobre el PM. Cuando el PM del Ag es aproximadamente igual al PM del Ac la banda ser recta, si los PM son distintos, la banda ser curva, y esa curvatura ser cercana hacia el de mayor PM. Esto se corresponde con las leyes de la difusin, que dicen: La distancia a la cual una sustancia difunde est en relacin directa con su concentracin (a mayor concentracin mayor migracin) y a su vez est en relacin inversa a su PM (a mayor PM menor migracin). Otro tipo de informacin que es muy til y que se puede obtener a partir de esta tcnica es sobre la similitud antignica entre dos o ms soluciones enfrentados a un antisuero obtenido contra ellos. Ochterlony observ que entre los dos Ag analizados pueden darse tres tipos de reacciones: 1. Reacciones de identidad, cuando aparecan bandas que se fundan y era que los Ag compartan los mismos determinantes antignicos. 2.Reacciones de no identidad, cuando cada sistema Ag-Ac acta de manera independiente uno del otro, por lo cual las bandas se cruzan. 3.Reacciones de identidad parcial, se da cuando un Ag comparte algunos determinantes antignicos con otro, entonces aparece un espoln que apunta al Ag con menor determinantes antignicos. D) DIFUSIN SIMPLE EN PLACA O DIFUSIN RADIAL Es una tcnica muy importante como mtodo cuantitativo, permite cuantificar Ag an en muy pequeas cantidades. Esto es posible por la forma en que se prepara la placa: se coloca una placa de agar al 3% en solucin fisiolgica mezclada en partes iguales con el suero monoespecfico del Ag que se quiere estudiar. Si en los pocillos se siembra el Ag aunque est con impurezas, si est el Ag, va a interactuar solamente con su Ac monoespecfico que est homogneamente en concentracin constante en la placa de agar.

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Como la concentracin de Ac es constante en toda la placa, el Ag va a difundir en forma radial y el dimetro del halo va a ser directamente proporcional a la concentracin del Ag en el pocillo. Se deja difundir hasta halo constante, y se siembran junto con la muestra tres disoluciones patrones de Ag de concentracin conocida, junto con testigos. Se construye una curva de calibrado graficando el r2 de los halos testigos vs. concentracin de Ag. Luego se entra con el r2 de la muestra y obtenemos su concentracin en mg/ml. Todo producto comercial trae ya su tabla con los dimetros de halo y su correspondiente concentracin, por lo tanto no es necesario sembrar testigos. Este mtodo permite cuantificar Ag en mezclas complejas an en cantidades mnimas. Diferencias entre Ac monoclonal y Ac monoespecfico El Ac monoclonal es un Ac que es qumicamente idntico en su patrn molecular. Es decir, en una solucin de Ac monoclonal todas las molculas son idnticas, hasta en su especificidad por el Ag. En cambio, un Ac monoespecfico es aquel Ac o suero que tiene un conjunto de Ac que van a reconocer un mismo determinante antignico, pero son distintos paratopes los que actan. Recordar que la unin del epitope con el paratope no es especfica, hay complementariedad, es por eso que pueden existir distintos paratopes que sean capaces de interactuar con un mismo epitope. Un monoclonal es siempre el mismo paratope el que reacciona, repetido millones y millones de veces. E) REOFORESIS Es una tcnica que utiliza una placa de agar disuelta en solucin fisiolgica. Se hacen pocillos, en el centro se siembra el Ac y en la periferia distintos Ag. Por fuera de todos los pocillos se hace una canaleta circular donde se pone buffer. Se tapa con una tapa que posee un orificio central. Se va a producir una evaporacin del buffer y la corriente de evaporacin va a salir hacia el orificio, y en el gel tambin se va a formar una corriente. Esto va a facilitar la migracin de los Ag de forma convergente al centro. Entonces van a aparecer las bandas de precipitacin Ag-Ac entre los pocillos de Ag y de Ac, y la ventaja de este mtodo es que las bandas se ven ms ntidas. F) INMUNOELECTROFORESIS Es un mtodo analtico y est basado en dos procesos, una combinacin de dos metodologas. La primer etapa consiste en una separacin electrofortica de las protenas de la muestra antignica. En una segunda etapa se siembra un antisuero especfico contra el Ag que se separ en la primer etapa. Es la etapa de inmunodifusin. En la zona que exista interaccin especfica aparecern bandas de precipitacin. La ubicacin de la banda de precipitacin va a depender de la movilidad electrofortica y de la velocidad de difusin de cada Ag que constituye la muestra. La primera etapa aprovecha la capacidad que tienen las macromolculas de tener carga segn el pH del medio. Las protenas son anfteras. Se trabaja generalmente con un buffer pH = 8,4, en el cual la mayora de las protenas del plasma tendrn carga (-). Entonces, en una electroforesis van a migrar al polo (+) o

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nodo. La intensidad de la carga depende de la diferencia que existe en unidades del pH de trabajo y el pI. Fenmeno de electroendosmosis Es un movimiento opuesto al campo elctrico. Esto ocurre porque el gel no es elctricamente neutro, y al pH=8,4 de trabajo las molculas de agar adquieren carga (-). Como se usa medio acuoso, las molculas de agua se cargan (+) y en presencia de un campo elctrico se desplazan las molculas de agua hacia el ctodo. La fuerza del flujo electroendosmtico va a variar segn el soporte o gel que se utilice. De esto depende donde se colocar el punto de siembra. La inmunodifusin va a consistir en sembrar el antisuero correspondiente. G) INMUNOFIJACIN Se hace en acetato de celulosa, se siembra el Ag y se hace una electroforesis comn. Se obtiene la separacin de todas las porciones del suero. Se agrega luego el Ac y la banda de precipitacin permite localizar la posicin del Ag buscado. Entonces, sabiendo la posicin agrego a otras tres placas distintos isotipos de Ig, se deja interactuar y se hace la coloracin. Se utiliza cuando se quiere investigar mielomas, detectar gamapatas monoclonales, que da una banda muy intensa en la electroforesis en el sector de las G. Con el enfrentamiento de las distintas Ig se puede determinar cual es el isotipo que est aumentando. Con Ac monoclonales se puede determinar qu tipo de cadena est afectada en la gamapata: o . H) INMUNOELECTROFORESIS O ROCKET ELECTROPHORESYS Es un mtodo cuantitativo, consiste en preparar una placa de agar que tiene disuelto homogneamente el Ac monoespecfico. Se siembra el Ag junto con distintos patrones y se aplica un campo elctrico. Se va a producir la migracin del Ag y van a aparecer picos, porque a medida que el Ag migra se produce redisolucin del precipitado hasta que alcanza las concentraciones adecuadas donde aparecer una banda. Si se siembra un patrn puede cuantificarse el Ag.

I) CROSSING-OVER ELECTROPHORESIS O CONTRA INMUNOELECTRFORESIS Como las Ig van a migrar en una placa de agar hacia el polo (-) por un efecto electroendosmtico, y la mayor parte de las protenas del plasma que pueden presentar Ag contra esa Ig van a migrar hacia el polo positivo, se van a encontrar y va a aparecer una banda de precipitacin entre los dos pocillos. Es una tcnica cualitativa que va a permitir identificar al Ag.

Ac

Ag

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REACCIONES DE AGLUTINACIN

Para que se d el fenmeno de aglutinacin se describen dos etapas. La interaccin primaria que no es visible, se produce cuando se ponen en contacto el Ag con su correspondiente Ac. Se produce as un complejo primario, que es prcticamente independiente de la temperatura, de la concentracin de electrolito, etc. Solo es necesaria la especificidad Ag-Ac. Si se dan otras condiciones: Ag multivalente Ac bivalente Proporciones adecuadas entre Ag y Ac Se ve favorecido por la concentracin de electrolito adecuada (NaCl 0,15M) y es acelerado por la temperatura (37C) y la agitacin. Si se cumplen todos los requisitos y los factores que lo favorecan se va a poder visualizar el fenmeno de interaccin de manera visible. Esto se llama reaccin secundaria y se produce in vitro. Segn el tipo de Ag se va a producir precipitacin o aglutinacin. Para la aglutinacin el Ag debe ser particulado. Los fenmenos de aglutinacin sirven para hacer determinaciones cualitativas y tambin semicuantitativas.

DETEMINACIONES CUALITATIVAS Sirven para investigar tanto un Ag o un Ac, dependiendo de lo que se tenga conocido. Un uso muy comn es para investigar Ag en un muestra incgnita, un inmungeno microbiano. Se hace una suspensin del suero, y si se dispone de un antisuero especfico para distintas especies bacterianas, se puede identificar mediante la aglutinacin especfica. Es para identificar Ag hemticos, Ag ubicados en la superficie de los glbulos rojos. Importante: el control negativo es simplemente una suspensin de microorganismos con solucin fisiolgica (NaCl 0,15M). Permite identificar las aglutinaciones inespecficas. Con ello se diferencia lo que es una suspensin de un aglutinado. Tambin se pueden hacer investigaciones cualitativas de la presencia de Ac especficos. En un suero incgnita, si se dispone del Ag conocido se puede enfrentar al Ag conocido con el suero incgnita. En un banco de sangre, cuando hay que garantizar que una persona tenga un grupo sanguneo determinado, no solamente se hace la determinacin de antgenos en la superficie del GR, sino que se hace una contraprueba. Si se determina que una persona tiene grupo sanguneo A porque dio un aglutinado positivo. Si es as, en su suero existen Ac naturales (isoaglutininas) tipo anti-B. Se enfrenta el suero del paciente con GR B, y deben dar aglutinacin.

VALORACIONES SEMICUANTITATIVAS En aglutinacin no hay un mtodo cuantitativo. Los mtodos que se emplean son semicuantitativos.

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Se informa siempre un ttulo, que es la inversa de la mxima dilucin aglutinante. Con estos mtodos se puede hacer un seguimiento de una enfermedad provocada por una bacteria. Cuando hay un incremento de un solo tubo no es significativo, pero con diferencias de dos o ms tubos en funcin del tiempo s es evidencia de infeccin bacteriana, porque el microorganismo se va reproduciendo y est haciendo reestipulaciones. Segn el tiempo que se emplea para hacer la lectura se va a tener metodologas de aglutinacin rpida y lenta. Las reacciones de aglutinacin rpida van a usar el Ag en una concentracin mucho mayor. La tcnica se realiza directamente en una placa de vidrio, se colocan volmenes decrecientes del suero directo y se lo enfrenta al Ag en una cantidad constante. Se mezcla con varilla y se lee de 3 a 5 minutos. Se informa tambin un ttulo que se asigna por convensin. AGLUTINACIN LENTA EN TUBO: se utilizan diluciones crecientes del suero. ttulo es la inversa de la mxima dilucin aglutinante. el

AGLUTINACIN RPIDA EN PLACA: se utilizan volmenes decrecientes del suero el ttulo se asigna por convensin.

FENMENO DE PROZONA Se produce cuando hay exceso de Ac, ya que al haber mucha cantidad de Ac, como los dos Fab son de alta afinidad, los dos Fab se unen a determinantes antignicos de la misma molcula de Ag. Entonces, aunque parezca que no hay interaccin AgAc especfica, lo que ocurre es que hay tantos Ac que no se ve la real. Debe hacerse una dilucin del suero.

ANTICUERPOS INCOMPLETOS (REACCIN DE COOMBS) Cuando se hacen estimulaciones con Ag particulados a repeticin pueden obtenerse Ac incompletos. Respuesta inmune:

1 estimu- 2 estimu- 3 estimulacin lacin lacin

IgG

IgM

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La IgG es una inmunoglobulina que rene Ac con distintas caractersticas: Las IgG que tienen la capacidad de precipitar o aglutinar, las que se llaman coprecipitantes o bloqueantes, y las no precipitantes. Cuando el Ag es soluble, la mayor cantidad, del 70 al 80%, son Ac precipitantes, con ambos Fab de alta afinidad. De los coprecipitantes o bloqueantes y los no precipitantes, cada uno de ellos representa un 10% de la IgG. Por ms que se reestimule, la mayor cantidad de Ac que producen los Ag solubles son Ac precipitantes. Ac coprecipitantes o bloqueantes tienen un Fab con alta afinidad por el Ag y el otro, debido a que tiene un residuo de manosa, tiene baja afinidad. Ac no precipitantes tienen los dos Fab con tan baja afinidad que no se unen al Ag. Representan siempre el 10% de las IgG, sin importar si la estimulacin se hizo con un Ag soluble o particulado. Cuando se estimula con Ag particulados se producen tambin estos tres tipos de Ac. Pero cuando el estmulo se hace a repeticin empiezan a aumentar mucho los bloqueantes, y disminuyen aquellos que tienen la capacidad de aglutinar. Los bloqueantes pueden aumentar del 30 al 70% de las IgG. Para investigar estos Ac hay tres mtodos: Por bloqueo: en una batera de tubos se coloca una cantidad constante del Ag. Se agrega un volumen constante del suero a investigar y se hacen diluciones razn 2. Entonces se van a unir los Ac bloqueantes al Ag, pero como va a ir aumentando las diluciones, va a empezar a quedar Ag libre. En un segundo paso se aade, despus de lavar los precipitados, una cantidad constante de Ac especfico contra el Ag, pero bivalente. Si en el primer tubo haba Ac incompletos, ya van a estar todos los determinantes antignicos bloqueados y entonces el Ac bivalente no va a dar aglutinacin. Esto se llama inhibicin de la aglutinacin. Como luego se fue agregando diluciones crecientes del suero, empiezan a aparecer determinantes antignicos libres y cuando se agregan los Ac bivalentes va a aparecer aglutinacin. El resultado se informa como la ltima dilucin que produce inhibicin. Por conglutinacin: el medio de reaccin no solo tiene solucin fisiolgica sino adems la protena albmina al 2 %. Se hace la dilucin del suero razn 2 con esta solucin. El Ag tambin se prepara en la misma solucin de albmina al 2%. En este caso se va a producir aglutinacin en caso de haber Ac incompletos. El ttulo se expresa como antes. Esto se explica porque en el suero estn las protenas del complemento. Una de las protenas es la fraccin C3. Esta se une al complejo Ag-Ac incompleto, la albmina tiene conglutininas, que tienen la capacidad de unirse a los residuos hidrocarbonados de la protena C3, y as se forma un aglutinado. Adems la albmina ayuda a neutralizar cargas. Por reaccin de Coombs o de la antiglobulina: se agrega el Ag frente al suero y se lo deja en bao a 37C para que se produzca la interaccin Ag-Ac. No aparece aglutinado. Se lava para eliminar todas las protenas que no interaccionaron. En el control negativo no se pone suero sino solucin fisiolgica. Despus se agrega Ac anti-especie contra la especie que produjo los Ac bloqueantes. Entonces se va a producir aglutinado.

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AGLUTINACIN PASIVA Consiste en transformar al Ag soluble en particulado. Se puede usar como soporte distintos tipos de Ag particulados, partculas inertes como bentonita, poliestireno, colodin o GR. Si se elige como soporte el GR se llama hemaglutinacin pasiva. Cuando el Ag soluble es hidrato de C, la unin se hace por mezclado directo. Cuando el Ag soluble es una protena hay que hacerle un acondicionamiento previo al GR por tratamiento con cido tnico, aldehdo o CrCl3. Cuando se agrega el Ag soluble se une firmemente al GR. Se dice que el GR est sensibilizado. Cuando se analice un suero con Ac especficos contra el Ag, se observar un fenmeno de aglutinacin.

REACCIN DE FIJACIN DE COMPLEMENTO El complemento es un conjunto de protenas con actividad enzimtica, una acta sobre la siguiente y finalmente se obtiene un complejo que va a tener la capacidad de fijarse de manera inespecfica a cualquier complejo Ag-Ac presente. Si el Ag es un GR se va a producir la hemlisis. Una reaccin serolgica utiliza como material biolgico un suero. La hemolisina es un Ac contra el GR. Se hace en dos etapas: 1) se coloca el suero incgnita frente al Ag. Luego se aade C en una dilucin apropiada. Si hay especificidad se formarn complejos Ag-Ac y el C se unir a estos complejos. No se observa nada. 2) se aade GR unido ya a su hemolisina. Esto se llama sistema hemoltico. Si el C ya est unido a otro sistema Ag-Ac, no va a haber C libre como para unirse al sistema hemoltico no va a haber lisis. Si en la primera etapa no hubo especificidad Ag-Ac, al agregar el sistema hemoltico el C que est libre se unir al complejo GR-hemolisina y se producir la hemlisis. NO LISIS: especificidad Ag-Ac. LISIS: no hay especificidad Ag-Ac. Este mtodo tambin se puede realizar de forma semicuantitativa, informando un ttulo.

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RESPUESTA INMUNE DE LAS MOCOSAS

Las mucosas son una puerta de entrada muy importante para los Ag. Esto se debe a que existe una gran superficie mucosa, unos 400 m2, por eso deben tener un sistema inmune adecuado para poder impedir la entrada de esos agresores. En particular, la mucosa del sistema gastrointestinal est poblada de una gran cantidad de microorganismos. Estos se denominan microorganismos comensales y no ocasionan dao. Se ha visto que la presencia de esos microorganismos es fundamental para un adecuado funcionamiento del sistema inmune. Se han hecho experimentos en animales, criados en condiciones aspticas, sin grmenes y el desarrollo de los rganos del sistema inmunolgico es deficiente, y esos animales tampoco pueden montar respuestas inmunes adecuadas. La presencia de estos microorganismos comensales en la mucosa gastrointestinal es de suma importancia para un adecuado montaje de la respuesta inmune, y para un adecuado desarrollo de todos los rganos que participan en el montaje de la respuesta. Los agentes agresores se encuentran con una primer barrera mecnica en las mucosas que es el moco. Todas las mucosas, tanto del tracto respiratorio como del digestivo poseen secrecin de moco. Esto est impidiendo la entrada de determinadas bacterias. La estructura de una mucosa es: - Una capa de clulas epiteliales. - Una membrana basal. - Un tejido conectivo o lmina propia, donde van a estar ubicadas las clulas efectoras. En las mucosas vamos a encontrar sitios inductivos o inductores, que son los lugares donde se van a generar la respuesta, y tambin sitios efectores, que son los lugares donde van a actuar las distintas clulas generadoras. Existe una interrelacin muy importante entre todas las mucosas de los diferentes tractos. Es decir, las clulas que se produzcan en determinados sitios inductivos van a poder actuar en sitios alejados a los lugares donde se produjeron. Los sitios inductivos del tracto respiratorio se pueden dividir es sitios inductivos del tracto respiratorio superior (NALT): las amgdalas, las adenoides, y los tejidos linfoides asociados a los bronquios, que se conocen como BALT. Despus en el tracto gastrointestinal las placas de Peyer por un lado y los ganglios mesentricos y el apndice por otro. Las clulas que se generan en los sitios inductores van a poder actuar en las glndulas salivales y lagrimales, en los bronquios, en las glndulas mamarias, en el intestino delgado y grueso y en el tracto urogenital. Esto se debe a las molculas de adhesin que tengan, a los receptores para quemoquinas y a las quemoquinas que expresen. Las mucosas tienen funciones importantes, una de ellas es la de inducir tolerancia, sobre todo la mucosa gastrointestinal, hacia los Ag locales. Se est sometido a un ingreso muy importante de Ag durante la dieta. Sin embargo, estos Ag no desencadenan respuestas inmunes. Entonces, una funcin de la mucosa gastrointestinal es generar tolerancia ya sea a los Ag dietarios o contra los microorganismos comensales.

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La otra funcin es la de la vigilar o la de montar una respuesta adecuada contra los Ag patgenos.

MUCOSA GASTROINTESTINAL En la mucosa gastrointestinal van a estar las clulas epiteliales intestinales. Todas ellas se originan a partir de precursores comunes, que se encuentran en las bases de las criptas de Lieberkhn. Son clulas madres, que a partir de ellas se van a originar todas las clulas epiteliales: los enterocitos, las clulas caliciformes que van a producir el moco, las clulas enteroendcrinas y la clulas M. Entonces, a partir del mismo progenitor comn en la mucosa gastrointestinal se van a originar todas estas clulas, que tienen como principal funcin la de ser barreras mecnicas para evitar la entrada de agentes extraos. Para poder ejercer esta primera funcin tienen uniones entre clulas que son muy estrechas. En esas uniones intervienen complejos macromoleculares con distintas protenas. Estas protenas son claudinas, ocludinas y zonulinas. Estas producen una interaccin muy estrecha e impiden la entrada de molculas que tengan dimetros mayores a los 6-12 A, o PM mayor a los 500-900 Da. La expresin de estas protenas est regulada por citoquinas, por la presencia de toxinas bacterianas y tambin por la accin de distintos frmacos. En particular las citoquinas inflamatorias como la IL-6 y TNF- lo que hacen es disminuir la expresin de estas protenas. Al disminuirse va a aumentar la permeabilidad y va a permitir el ingreso de Ag. En cambio, otras citoquinas como la IL-10 y TGF- aumentan la expresin, por lo tanto van a aumentar la resistencia al pasaje de agentes agresores. Por otro lado, producen glicoprotenas que van a constituir el moco, algunos factores del complemento, que son las fracciones C3, C4 y el factor B. Tambin producen pptidos antimicrobianos: las defensinas y , la bactofenina y la lisozima. El principal Ac que se encuentra en las mucosas es la IgA. Se pueden encontrar todos los tipos de Ig, pero la mayoritaria es la IgA. La IgA de las secreciones es de forma dimrica, a diferencia de la IgA srica que es monomrica. Hay dos clases de IgA: la IgA1 y la IgA2. La IgA1 es mayoritaria en el intestino delgado y la IgA2 es mayoritaria en el intestino grueso. Cuando hay deficiencias en la produccin de IgA, pasa a ser la principal en producir el mecanismo de defensa la IgM, que aumenta su produccin y la suplanta. La funcin de la IgA de mucosas es la de neutralizar bacterias, virus y toxinas. La IgA no activa complemento (C) por la va clsica, esto es beneficioso ya que al haber tantos complejos Ag-Ac que pueden formarse en las mucosas por la presencia de tantas bacterias, si la IgA activa C se estara en un constante entorno inflamatorio. Agregados de IgA pueden activar el C por la va alterna, pero esto no ocurre en condiciones normales. El mecanismo de transporte de la IgA es por transcitosis. Las clulas epiteliales intestinales tienen una porcin apical que se encuentra hacia la luz intestinal, y una porcin basolateral o basal que se encuentra hacia el lado de la lmina propia de la membrana basal. Los linfocitos que producen la IgA se encuentran en la lmina propia. La IgA producida en la lmina propia debe ejercer su funcin en la luz intestinal, por lo cual debe ser transportada. Existe un receptor que es el poli-Ig que es el encargado de captar la IgA que se produce en la lmina propia. Este receptor tiene cinco dominios semejantes a los de Ig, capta a la IgA a travs de su extremo N-terminal, la endocita y la

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transporta en una vescula hacia la regin apical. Este transporte se llama TRANSCITOSIS. Cuando llega a la regin apical el receptor se corta y una parte queda unida a la IgA y es lo que se llama COMPONENTE SECRETOR. Actuara ejerciendo una cierta proteccin sobre la IgA para evitar degradacin. Los LB que producen IgA sufrieron un cambio de isotipo o switch, favorecido por la IL-10 y el TGF-. Estas son citoquinas regulatorias producidas por los LTh2 y los LTh3 o reguladores. Estas citoquinas inhiben a los LTh1, que participan en los procesos inflamatorios. Esto tambin da una idea de que el entorno de la mucosa es un entorno no inflamatorio, para que no se generen reacciones adversas. Los LB que producen IgA van a dirigirse a estos lugares porque presentan en su membrana determinadas molculas de adhesin, ellas son la 41 y la 47. Estos interactan con determinadas molculas de adhesin que se encuentren en ciertos epitelios importantes. Los LB que tengan la molcula 41 van a llegar a los tejidos de mdula sea y del tracto respiratorio, urogenital y glndulas salivales. En estos lugares hay una molcula de adhesin que es la VCAM1 que es el ligando de la 41. Otra cosa que influyen son los receptores para quemoquinas. El CCR10 y el CXCR4 interactan con quemoquinas que se expresan en la mdula sea y en los tractos respiratorio, urogenital y glndulas salivales. Otra poblacin de LB, que se va a dirigir al intestino delgado, tiene otras molculas de adhesin. La 47, y otros receptores para quemoquinas. As, los LB efectores que se generaron en el intestino delgado van a poder actuar en las glndulas mamarias, en el colon y en el intestino delgado. Esto indica que hay una comunicacin muy importante entre las mucosas. En las clulas epiteliales hay otro receptor para las Ig que es el FcRn o receptor de Brambell. Es un receptor para IgG y es muy importante para la captacin de la IgG del recin nacido, quien recibe la IgG a travs del calostro. Se unen dos molculas del receptor al Fc de la IgG. Este receptor va a estar en la porcin apical del enterocito, porque capta una Ig que est en la luz intestinal. En la produccin de la IgA participan los LB1, que no necesitan de la colaboracin T y que producen en su mayora IgM, pero tambin producen IgA. Parece ser que son los que responden a todas las bacterias comensales que se encuentran en el intestino.

SITIOS INDUCTIVOS Tanto en el tracto gastrointestinal como en las vas respiratorias superiores se han desarrollado sitios especficos para la captura, procesamiento y presentacin antignica que, en conjunto, se denominan sitios inductivos Los sitios de induccin de respuesta inmune en la mucosa intestinal son fundamentalmente las placas de Peyer, los ganglios mesentricos, el apndice y hay tambin pequeos agregados linfoides. En las placas de Peyer, el tejido linfoide asociado est muy relacionado con el epitelio que lo separa de la luz y forma una unidad integrada llamada FAE (epitelio asociado con el folculo), en la que el elemento distintivo es la clula M. Tanto las clulas epiteliales como las clulas M se originan en las criptas a partir de clulas progenitoras. La proximidad del folculo linfoide genera un gradiente de seales que estimula la diferenciacin a clulas M.

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Las clulas M tienen poco ribete en cepillo, secretan muy poca mucosidad, no tienen prcticamente glucocalix, tampoco tienen enzimas degradativas y no participan en el transporte de la IgA. Este tipo de clula est en estrecho contacto con las clulas efectoras, con los linfocitos, los macrfagos y cd. Su funcin es la de permitir el pasaje de Ag: bacterias, parsitos, virus. Algunos agentes se valen de este punto de entrada para poder diseminarse, como por ejemplo el virus del polio. Los Ag que penetran por las clulas M van a poder ser captados por las clulas dendrticas o los macrfagos, para que se inicie una respuesta. Las clulas M, para captar el Ag, pueden reconocerlo a travs de receptores e internalizarlo mediante vesculas de clatrina, por endocitosis en fase fluida o por fagocitosis. La clula M no es una clula presentadora de Ag, solamente permite el pasaje. Una vez que pasan por las clulas M, los Ag pueden ser captados por las clulas dendrticas. Las cd son bastante abundantes en la lmina propia. Hay distintas poblaciones de clulas dendrticas: algunas inducen tolerancia, otros favorecen la respuesta y tienen la particularidad de que pueden emitir prolongaciones, algunas de las cuales pueden pasar entre dos enterocitos, y van a poder reconocer y captar Ag que se encuentren en la luz intestinal. Para ello deben expresar las molculas de adherencia a las clulas epiteliales, por ejemplo molculas de claudinas. Estos Ag son procesados y llevados a los ganglios mesentricos o a las placas de Peyer para presentarlos a los LB. Tambin las cd pueden captar los Ag que atraviesan las clulas M y los Ag tambin pueden atravesar los enterocitos, por entre dos de ellos si la impermeabilidad est alterada (paracelular), o por un proceso de transcitosis (transcelular). Estos mecanismos no son muy eficientes en forma individual, pero si se tiene en cuenta la gran superficie mucosal, estos mecanismos se tornan relevantes. En los ganglios mesentricos o las placas de Peyer los LT van a reconocer los Ag presentados por las cd, se van a transformar en LT efectores y van a poder salir de los ganglios mesentricos, entrar a circulacin, por el conducto torcico y se van a trasvasar a los sitios efectores. Los LB y los LT van a poder encontrarse en las placas de Peyer, donde van a estar los linfocitos vrgenes y van a ser impactados por el Ag. En la lmina propia y los linfocitos intraepiteliales van a ser linfocitos efectores. los linfocitos van a encontrarse en tres sitios: - Placas de Peyer, que son los linfocitos que tambin se encuentran en los rganos linfoides secundarios: LTCD4+ y LTCD8+, son mayoritarios los LTCD4+ con perfil Th2. -Los LT efectores van a ser los de la lmina propia y los linfocitos intraepiteliales. Estos linfocitos efectores van a tener un fenotipo de memoria, van a expresar la molcula CD45RO y van a ubicarse en la lmina propia o entre los enterocitos por las molculas de adhesin que tienen. Los que se ubican en la lmina propia van a tener la molcula 47, la cual es reconocida por un receptor presente en la vasculatura de la mucosa intestinal. Esa molcula 47 no va a estar en los linfocitos intraepiteliales, de los cuales la mayora son CD8+. Algunos de los linfocitos intraepiteliales presentan la molcula CD8 que va a estar formada por cadenas , es decir un dmero . Adems van a tener un receptor TCR de tipo o de tipo . Un 50% de ellos tienen el TCR , y estos tambin tienen un receptor de clulas NK, el receptor NKG2D, que reconoce MHC no

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clsicas: MIC-A y MIC-B que se expresan en condiciones de estrs. Entonces estos linfocitos son capaces de destruir clulas epiteliales que se hayan infectado. La luz gastrointestinal est poblada de numerosos microorganismos, pero que, sin embargo, no generan una respuesta inmune. No est muy claro cmo es que ocurre esto. Se piensa que la IgA que se encuentra en estas secreciones estara bloqueando a estos microorganismos y entonces impediran que fueran reconocidos. Otra explicacin sera por los receptores que presenta la flora normal. Las clulas reconocen a los agentes agresores a travs de los patrones moleculares asociados a patgenos (PAMP); algunos investigadores sostienen que estas PAMP son diferentes en la flora comensal y en la flora patgena. Otros dicen que la flora comensal no tiene PAMP, o si tienen y son iguales a las dems PAMP, se activan de forma diferente, y estos receptores de la flora comensal no generan una respuesta inmune. Para que se desencadene una adecuada respuesta inmune es necesario un proceso inflamatorio. Parecera ser que estas bacterias comensales no ejercen o no inician la respuesta inflamatoria. Un factor clave para iniciar la respuesta inflamatoria es el factor de transcripcin NFK-, el cual es necesario para la liberacin de las citoquinas inflamatorias. La flora comensal estara ejerciendo una accin inhibitoria de ese factor de transcripcin. Parece ser que las clulas dendrticas que captan los Ag provenientes de los microorganismos comensales, seran clulas dendrticas tolerognicas, es decir, que carecen de ciertas seales coestimulantes, por lo tanto no activan a los linfocitos. La tolerancia oral, es decir, la tolerancia que se genera a partir de Ag que ingresan por la mucosa digestiva, depende de la dosis del Ag. Si hay dosis muy altas del Ag se genera tolerancia, que se va a producir por anergia, es decir, una falta de respuesta de los LT, o por una delecin clonal que es la muerte de los linfocitos por apoptosis. Si se est en presencia de bajas concentraciones de Ag, por va oral, se generan clulas T reguladoras. En la mucosa estn los tres tipos de clulas T reguladoras: las clulas T reguladoras naturales que se generan como tales en la mdula sea, y otros dos tipos que son inducibles: Th3 y Tr1. La ms importante en la mucosa intestinal es la clula Th3, la cual produce IL-10 y TGF- que son citoquinas supresoras. Otra cosa importante en la induccin de tolerancia es el tipo de Ag. Los Ag proteicos, que son mayora en la dieta, son solubles e inducen tolerancia. Es decir, que la tolerancia se induce ms fcilmente con los solubles que con los particulados. Tambin es importante el estado de inflamacin. En condiciones normales, con una mucosa intestinal intacta, no hay estado de inflamacin, se genera tolerancia. Otro factor importante es el fenotipo que tenga el individuo en sus MHC. Tambin es importante la forma en que se administre el Ag. Si se administra de forma tal que puede estar mucho tiempo en el organismo, puede inducir tolerancia. Muchas veces se utiliza este mecanismo de induccin de tolerancia oral como teraputico, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes. Se trata de inducir a travs de la administracin oral de un Ag una falta de respuesta contra ese Ag. As, cuando ese Ag se administre en forma sistmica, no cause una respuesta. Tambin se utiliza para el tratamiento de las alergias. Entonces, cuando ingresa un Ag a las mucosas, se puede generar una inmunidad secretoria y tambin tolerancia, o alergia. La generacin de tolerancia y de inmunidad

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secretora no son autoexcluyentes. Puede ingresar un Ag, generar la produccin de IgA, pero a su vez generar tolerancia.

INDUCCIN DE TOLERANCIA EN LAS MUCOSAS La tremenda carga antignica que supone la ingesta de alimentos no suele acompaarse por el desarrollo de una respuesta inmune contra sus componentes, sino por un estado de tolerancia (ausencia de respuesta frente a ellos). La modulacin de la respuesta inmune mediante la administracin de Ag a travs de los tractos ha sido reconocida como uno de los mejores mtodos para generar tolerancia perifrica. La administracin de Ag por va oral o nasal en conjunto con adyuvantes puede emplearse para modular la respuesta inmune, no solo local sino tambin sistmica. Esta va constituye una potencial herramienta para la induccin de tolerancia frente a autoantgenos en el tratamiento de diferentes enfermedades autoinmunes. El fenmeno de tolerancia oral puede explicarse por tres mecanismos: Delecin clonal: la administracin oral de una alta dosis de Ag conduce a la delecin por apoptosis de los clones T especficos para el Ag administrado. La induccin de apoptosis por el sistema Fas/FasL desempeara un papel central en este fenmeno. Anergia clonal: los LT se anergizan si el reconocimiento antignico (seal 1) ocurre en ausencia de la seal 2 (coestimulacin). La presentacin de Ag a LT vrgenes por parte de los enterocitos o clulas dendrticas que no expresen un tenor coestimulatorio adecuado podra inducir este fenmeno. Induccin de LTreguladores (CD4+ CD25+), Tr1 y Th3. Resumen: El epitelio contribuye de modo crtico a la inmunidad innata en las mucosas. Cumple una funcin de barrera y reduce el ingreso de Ag desde la luz. Por otra parte, secreta diversos agentes que incrementan la resistencia a la invasin de la mucosa por patgenos. Estos factores pueden ser producidos en forma constitutiva o inducidos por el reconocimiento de PAMPs por RRP expresados en las clulas que integran el epitelio. Incluyen citoquinas, quemoquinas, glucoprotenas que forman el moco, y una variedad de pptidos antimicrobianos, como defensinas, lisozima, lactoferrina y lactoperoxidasa. La IgA es la Ig mayoritaria de las secreciones y constituye cerca del 80% del total en las lgrimas, la saliva, el calostro, la leche y las secreciones nasales e intestinales. Ms del 90% de las IgA de las secreciones se presenta en forma de dmero asociado con el componente secretorio (CS). La IgA secretoria acta, fundamentalmente, como Ac neutralizante. En el GALT (tejido linfoide asociado al tracto gastrointestinal) es posible diferenciar los sitios donde se genera la respuesta inmune adaptativa, llamados sitios inductores, de aquellos en donde los mecanismos efectores ejercen su accin, llamados sitios efectores. Las Placas de Peyer y los ganglios linfticos mesentricos son las principales estructuras organizadas que funcionan como sitios inductivos. En particular, en las placas de Peyer, el tejido linfoide est muy relacionado con el epitelio que lo separa de la luz y forma una unidad integrada llamada FAE (epitelio asociado con el folculo), en que el elememto distintivo es la clula M. Los sitios efectores de la mucosa intestinal comprende una amplia conexin de plasmocitos productores de IgA, clulas T efectoras CD4+ (Th1 y Th2) y CD8+ (citotxicas), macrfagos y clulas NK, dispuestas en forma difusa en la lmina propia. - 130 -

La induccin de la respuesta inmune adaptativa requiere que los Ag de la luz intestinal puedan ser reconocidos adecuadamente por LT y LB. Tres diferentes tipos celulares participan en la captura de Ag: clulas M, clulas dendrticas y los propios enterocitos. Las clulas M tienen alta capacidad endoctica y baja capacidad degradativa. Esto permite que los Ag endocitados sean pronto exocitados en la membrana basolateral, que se encuentra en intimo contacto con clulas dendrticas, macrfagos y linfocitos. Las clulas dendrticas inmaduras pueden capturar Ag presentes en la luz emitiendo prolongaciones llamadas dendritas, que pasan entre las uniones estrechas y acceden directamente a la luz. El epitelio que recubre el intestino est formado por una monocapa celular con espacios intercelulares sellados por estructuras denominadas uniones estrechas. En condiciones fisiolgicas esta capa celular permite, en forma limitada, el pasaje de molculas desde la luz por dos vas: paracelular (entre los enterocitos) y transcelular (endocitosis y trnsito transcelular). Los LT en el intestino se distribuyen en tres compartimentos anatmicos. Las placas de Peyer y los ganglios linfticos mesentricos presentan LT en estructuras linfoides organizadas. Estos linfocitos poseen caractersticas similares a los LT localizados en los ganglios linfticos perifricos. En los otros dos compartimentos los LT se distribuyen en forma difusa junto a clulas no linfoides e incluyen a los LT presentes en la lmina propia y los LT intraepiteliales (LIE), que se disponene en forma individual entre las clulas epiteliales. Los linfocitos del compartimento intraepitelial son, en su gran mayoria, clulas T. Ms del 80% son CD8+. Presentan marcadores fenotpicos propios de las clulas T de memoria. No constituyen una poblacin homogenea. Pueden distinguirse en funcin del TCR que expresan ( o ) o de las molculas correceptoras expresadas: TcR / CD4+, TcR / CD8+ y TcR CD8+. Los LT intraepiteliales TCR + CD8 + representan un tipo convencional de cllas T de memoria reactivas frente a Ag extraos, que provienen de rganos linfticos secundarios. En cambio, los linfocitos TCR + CD8 + migraran directamente desde el timo y parecen cumplir funciones asociadas con la modulacin (inhibicin) de la respuesta inmune local mediando efectos antiinflamatorios protectores de la integridad de la mucosa. Los LT , en particular los que expresan las cadenas 1/1, reconocen molculas de clase I del CMH no convencionales, como MIC A y MIC B, cuya expresin en el epitelio se incrementa en situaciones de estrs celular. Mediaran la eliminacin de clulas propias alteradas que comprometen la integridad de la barrera endotelial

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EL SISTEMA COMPLEMENTO

Para su mejor estudio, se ha separado la respuesta inmune en la respuesta innata y la adaptativa. Tanto una como la otra tienen elementos celulares y elementos solubles. La inmunidad innata es la primera que se dispara ante la presencia de cualquier agente microbiano. Su especificidad es muy acotada, reconoce estructuras compartidas que se encuentran en el grupo de patgenos, los PAMP o patrones moleculares altamente conservados, a travs de los lipopolisacridos. La especificidad en la respuesta adaptativa es ms amplia. La respuesta innata no tiene memoria. Sea el microorganismo que sea, y si es la misma va de ingreso, el mecanismo de accin de la respuesta innata es siempre el mismo. La adaptativa es especfica para cada microorganismo en particular, si el microbio entra por segunda vez la respuesta es mucho ms amplia, ms amplificada y con presencia de Ac de elevada afinidad y especificidad. La posibilidad de que la respuesta innata monte una respuesta contra algn componente propio es muy difcil. S ocurre con la adaptativa. De las protenas sanguneas, en la inmunidad innata hay factores solubles. Entre ellos est el complemento, los reactantes o protenas de fase aguda y los interferones , y . Las protenas del complemento son tambin llamados protenas de fase aguda. En la respuesta adaptativa los factores solubles son los Ac. El complemento es un sistema proteico, polimolecular, formado por varias protenas, aproximadamente ms de 30, en concentraciones diversas. Algunas estn en muy baja concentracin (g/ml) y otras en el orden de mg/ml. Mayer lo defini como un sistema reaccional citocida, es decir, el complemento tiene accin ltica, sobre un GR va a producir hemlisis, sobre una clula produce histlisis y sobre una bacteria, bacterilisis. Mayer dice que el complemento es un sistema reaccional citocida, que se activa en presencia de complejos Ag-Ac especficos, agregados de globulinas y otros materiales. El complemento complementa la accin del Ac. Acta como agente depurador de los complejos inmunes. En el estudio del complemento hay 4 principios rectores: a) En primer trmino el C aparece en el plasma y circula en forma inactiva. Est presente en casi todos los mamferos vertebrados. b) Se activan por protelisis enzimtica. La forma con que se activa involucra un potente mecanismo amplificatorio. c) Como es un sistema tan destructivo, con un potencial tan agresivo, requiere estar bajo estrictos mecanismos regulatorios. d) Durante la cascada enzimtica se van formando pptidos que tienen una importante funcin biolgica, aumentando notoriamente el potencial inflamatorio. El complemento se activa de tres formas: -va clsica -va alterna -va lectnica

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VA CLSICA Se activa por la presencia de inmunocomplejos Ag-Ac especficos. Por Ac solos no, requiere la interaccin in vivo de ese Ac con su correspondiente Ag. Adems no cualquier Ac: IgM, IgG1, IgG2 e IgG3. La primera porcin del complemento se va a fijar al dominio CH2 de la IgG, y al dominio CH3 de la IgM.

CH1 CH2

IgG dominio CH2 del Fc IgM dominio CH3 del Fc

CH3

Si no hay complejos Ag-Ac especficos, puede ocurrir fijacin del C al Ac, pero no hay activacin en cascada. Se han denominado a los componentes del C pertenecientes a la va clsica como: C1 unidad de reconocimiento C2, C3, C4 unidades de activacin C5, C6, C7, C8, C9 complejo de ataque a las membranas (MAC o CAM) C1 o unidad de reconocimiento tiene forma de ramillete de flores. Est constituido por tres tipos de polipptidos: C1q, dos C1r y dos C1s. C1q est formado por seis subunidades unidas, cada tres subunidades, a un tallo central. Las zonas estn bien diferenciadas: las cabezas globulares y la microfibrillas. Las microfibrillas son muy similares a las fibras de colgeno (son smil colgeno). Las cabezas globulares son las responsables de la unin al Ac. Por los tallos se transmite la seal de activacin a las restantes protenas. El C1r tiene movilidad electrofortica , est en concentracin srica del orden de los 70-80 g/ml, es termolbil, es decir se destruye con calor, incluso a temperatura ambiente. Contiene un 20% de hidratos de carbono y un 20% de aminocidos. Toda la estructura del C1 est estabilizada por puentes disulfuro. Las cabezas globulares tienen aproximadamente 200 residuos aminoacdicos. Cuando el Ac ya est fijado a la membrana, el C1q se une por las cabezas globulares al Fc. Eso induce un cambio conformacional al C1r. El C1r es una globulina, con movilidad electrofortica , tiene un PM aproximado a 85 KDa y una concentracin srica de 30-35 g/ml. El C1r produce la activacin del C1s y se forma el complejo C1 activado que se lo simboliza como C1. C1q y el C1s tienen actividad sernica de enzima, y acta frente a dos sustratos: C4 y C2.

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AgAc

C1q C1r C4 C1s C1 C4a C4b C2a C2b C2

El C1 va a clivar al C4. El C4 se sintetiza como precursor intracitoplasmtico. Se secreta al plasma, donde se degradan las regiones globulares y el C4 aparece formado por tres cadenas: , y . Cuando se cliva el C4 se forma el C4a y el C4b. El C4 es una globulina termoestable, tiene un peso de aproximadamente de 200 KDa y una concentracin srica de 200 g/ml. El C4b se ancla en la membrana. Indirectamente, por accin de C1 se cliva C2, que da C2a y C2b. C2a es un pequeo pptido vasoactivo que recibe el nombre de quinina. C2 es una 2 globulina y tiene una concentracin srica del orden de los 30 g/ml. Las porciones C4b y C2b se unen para formar una enzima que se llama CONVERTASA DE C3 (C4b2b). C3 es una globulina termoestable, tiene movilidad electrofortica , contiene 3% de hidrato de carbono y est en una concentracin srica de 1400-1500 g/ml. Tambin se sintetiza como un precursor citoplasmtico en forma de cadena nica. Se libera al plasma y por unin de la convertasa C3, que es la C4b2b se va a clivar en C3a y C3b. El C3a es una anafilotoxina quimioatractante. C3 C4b + C2b = C4b2b C3a C3b C3b se acopla a C4b2b y forma la CONVERTASA DE C5 (C4b2b3b). C4b2b3b acta sobre C5 clivndolo en C5a y C5b. C5a tiene potentes acciones biolgicas. El C5 es una 1 globulina y contiene un 20% de hidrato de carbono, la concentracin srica est en el orden de los 200 g/ml. El C5b se fija a la membrana, prximo a C4b2b3b. Ahora comienza una cascada donde se activan protenas y se pegan formando un macrocomplejo, primero C6, luego C7 y C8. El C8 tiene una cola hidrofbica que le permite anclarse en membrana. El complejo C5bC6C7 es bastante inestable, el C8 tiene una cadena , hidrofbica, que cuando se une le permite anclar el complejo. Cuando se forma el complejo C5bC6C7C8 comienza la activacin y polimerizacin de una protena integral que es la C9. Se acoplan muchas molculas de C9 que se van polimerizando hasta formar un canal transmembrana, que es un poro en la membrana plasmtica. Esto produce la salida de componentes celulares, la entrada de iones y agua, hasta producir la lisis. Es importante la presencia de Ca2+ y Mg2+ para la activacin de esta cascada.

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VA ALTERNA Tanto la va alterna como la lectnica son vas de activacin del C ms antiguas desde el punto de vista evolutivo. Ambas no requieren la presencia de Ac. Se desencadenan ni bien se detecta la presencia del microorganismo patgeno. A bajas tasas moduladas aparece C3b an cuando no hay inflamacin. Es decir, que normalmente en fase fluida acta como una opsonina, y se activa por presencia de ciertas estructuras que tienen los microorganismos patgenos: polisacridos, lipopolisacridos, manosas, los PAMPs. Entonces, la va alterna se activa en presencia de estructuras microbianas como lipopolisacridos, polisacridos, manosas, polisidos. La presencia de bajas concentraciones de C3b en fase fluida se debe a que existen proteasas especficas que actan sobre C3, dando protelisis. Si la va clsica se activa, obviamente habr niveles comprobables de C3b en plasma. En la accin de la va alterna hay factores que intervienen en la cascada. Los componentes del C que intervienen en la va alterna son: C3 protelisis inespecfica C3b Factor B: actividad serino proteasa Factor D: cliva el factor B que est unido a C3b Properdina El C3b que est unido a la pared de algn microorganismo se une al factor B. El factor B tiene una concentracin srica de 200 g/ml. El factor B se pega al C3b que estaba pegado a la pared de un microorganismo. Cuando se produce la interaccin de C3b con B, aparece una protena con actividad semiproteasa, el factor D, y cliva al Factor B, formando un pptido pequeo que an no tiene funcin conocida, el Ba, y el Bb. Queda entonces, en la membrana del microorganismo el complejo C3bBb. C3b unido a la membrana
Factor B

C3bB
Ba Factor D Estabilizado por properdina

C3bBb El complejo C3bBb recibe el nombre de CONVERTASA DE C3, sigue estabilizado por properdina. CONVERTASA DE C3 C4b2b (va clsica) C3bBb (va alterna)

C3bBb va a clivar a molculas de C3, y va a formar C3a y C3b. El C3b formado tambin se une al complejo C3bBb para producir un nuevo complejo C3bBb3b, siempre todo estabilizado por properdina. Se pueden unir varias molculas de C3b, es decir, puede ser (C3b)nBb. Esta nueva enzima recibe el nombre de CONVERTASA DE C5.

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CONVERTASA DE C5

C4b2b3b (va clsica) (C3b)nBb (va alterna)

Cmo hace el C3b que patrulla por el plasma para discriminar lo propio de lo ajeno? El C3b no produce la lisis de clulas propias debido a la presencia de ciertas protenas. Casi todas las clulas de los mamferos tienen unas protenas regulatorias. Evitan que el C3b se deposite en las membranas del husped: Factor H de los grupos sanguneos CR1 MCP DAF Son protenas integrales de membrana. Hay un elemento crtico a la hora de discriminar lo propio de lo ajeno. El nivel elevado de cido silico, presente en todas las clulas de mamferos, est unido al factor H. Si hay alta cantidad de cido silico, como est unido al factor H, el C3b no se deposita sobre las clulas. Entonces estas protenas regulatorias impiden que C3b se una; evitan la interaccin con el factor B, y aumentan la protelisis de C3b. La protelisis de C3b produce fragmentos de menor cuanta: C3bi, C3bd y C3bgd. Una funcin de C3b es actuar como opsonina. Se han clasificado los receptores de C3b en cuatro tipos: CR1, CR2, CR3 y CR4. El CR1 es la protena marcadora tpica de eritrocitos. Se denomina tambin CR35. Tiene la capacidad de ligar C3b, C4b y C1q. C4b no solamente activa el C por la va clsica, sino que es una opsonina, pero su poder opsonizante es menor que C3b. Cuando el CR1 + C3b estimulan a un monocito o un macrfago, potencia la fagocitosis. El eritrocito tiene CR1, capta el C3b unida a inmunocomplejos y lo llevan al hgado o al bazo. Descarga all el microorganismo o inmunocomplejo opsonizado por C3b y se va. El eritrocito se va intacto. Los productos de la protelisis de C3b tambin actan como opsoninas. El CR2 est solo en cd y LB. Entonces potencian la respuesta adaptativa. Provoca activacin de las cd. En ltima instancia, la va clsica y la va alterna se unen a nivel de la convertasa de C5 que cliva el C5 a C5a y C5b. El C3b por va alterna puede reconocer IgA e IgE humanas formando inmunocomplejos. C3a y C5a producen quimiotaxis y renen gran cantidad de clulas fagocticas en el foco infeccioso. Adems, son anafilotoxinas, producen algn fenmeno de hipesensibilidad. Tambin producen modificacin de la permeabilidad vascular. Importante: cuando se produce la lisis celular, se liberan fosfolipasas, y se activan, iniciando la va de las prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos, que potencian la inflamacin.

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La va clsica se activa por la presencia de inmunocomplejos tipo IgG e IgM, y la va alterna por la presencia de lipopolisacridos, polisacridos, agregados de IgA e IgE humanas, e IgG de cobayo. La va alterna del sistema complemento fuciona como un mecanismo de vigilancia inmunitaria a travs del cual los microorganismos son opsonizados por C3b en eusencia de Ac especficos. La activacin de esta va involucra cuatro protenas: -C3 -factor B -factor D -properdina (P) A diferencia de la va clsica, que suele requerir la presencia de Ac a fin de ser activada, la va alterna es activada, en forma directa, por ciertas estructuras presentes en la superficie de una amplia variedad de microorganismos. Conduce a la generacin de una actividad inflamatoria antimicrobiana, similar a la generada por la va clsica de activacin. En relacin con la va alterna deben considerarse dos marcos diferentes en los cuales puede transcurrir su activacin, segn se haya producido en forma previa o no, la activacin de la va clsica. En este sentido es necesario destacar que la activacin de la va clsica conduce a la activacin de la va alterna. La activacin de la va clsica conduce a la generacin de numerosas molculas C3b, que se unen de modo covalente a la superficie del blanco. En presencia de C3b, el factor B (estructural y funcionalmente homlogo al C2) se une a C3b y es escindido por el factor D (que expresa una actividad serinoproteasa). La escicin de B origina dos fragmentos: -uno de bajo peso molecular que es liberado a la fase soluble, llamado Ba -un fragmento mayor Bb, que permanece unido a C3b sobre la superficie de la clula diana y forma el complejo biomolecular C3bBb, convertasa de C3 de la va alterna. Su interaccin con properdina, conducente a la formacin de C3bBbP, potencia la actividad de la proteasa alterna de C3, al incrementar su estabilidad. La convertasa de C3 de la va alterna escinde numerosas molculas de C3 y genera cantidades adicionales de C3b, que contribuyen a la opsonizacin de la clula diana. Algunas de las molculas de C3b generadas se unen a la convertasa de C3 de la va alterna y dan lugar a la formacin de los complejos (C3b)nBb, convertasa de C5 de la va alterna. Estas convertasas escinden C5 y generan C5a y C5b, componente que inicia el ensamblado del complejo de ataque litico o complejo de ataque a la membrana (CAM). La convertasa C5 resulta tambin estabilizada merced a su interaccin con properdina. La activacin de la va alterna, secundaria a la activacin de la va clsica, contribuye a la inmunidad antimicrobiana ya que potencia los efectos inducidos por la activacin de la va clsica, es decir, funciona como un mecanismo amplificador. En condiciones normales, es decir en ausencia de procesos infecciosos, se generan de manera espontnea en fase fluida bajas concentraciones de C3b. Este proceso suele involucrar la accin de proteasas plasmticas, que con muy baja eficiencia escinden el componente C3 y/o la hidrlisis espontnea del grupo tioster localizado en C3. El C3b as generado puede permanecer en fase fluida y es rpidamente inactivado. Por otra parte, puede interactuar con la superficie de clulas propias o clulas extraas (microorganismos), lo que permite la formacin de la convertasa C3 de la va alterna.

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La eficiencia de la va alterna depende, en gran medida, de su capacidad de distinguir lo propio de lo que no lo es. En otras palabras, de permitir el ensamblado de la convertasa de C3 sobre la superficie de clulas extraas pero no sobre la superficie de clulas propias. La va clsica de activacin no enfrenta este problema, ya que sus activadores (Ac) no suelen reconocer a las clulas propias y confinan, por lo tanto, el ensamblado de su convertasa de C3 a la superficie de aquellas clulas reconocidas como extraas. El mecanismo discriminatorio que permite el ensamblado de la convertasa de C3 de la va laterna sobre la superficie de ciertos microorganismos, pero no sobre la superficie de clulas propias, es mediado bsicamente, por un cojunto de protenas reguladoras de la actividad de C3. Ellas incluyen una protena srica denominada factor H y tres protenas integrales de membrana: -CR1 (CD35) -MCP (protena cofactor de membrana, CD46) -DAF (factor acelerador de decaimiento o CD55) Todas pueden unirse a C3b y mediar dos actividades centrales: 1) inhiben su interaccin con el factor B y/o deplazan a los factores B y Bb del complejo formado con C3b. 2) tornan suceptible a C3b a la accin proteoltica del factor I, una serinoprotesa que circula en forma activa, escinde al C3b y origina C3bi y productos posteriores de degradacin. Por lo tanto, las protenas reguladoras de C3 actan inhibiendo la formacin de la convertasa de C3 de la va alterna. CR1, MCP y DAF se expresan en la superficie de clulas propias y no en la superficie de microorganismos. Por consiguiente, operan solo sobre las primeras. El factor H al ser una protena plasmtica, podra actuar en ambos casos. Sin embargo, no es as porque para actuar debe interactuar con la superficie celular. Tal interaccin se encuentra mediada por el reconocimiento de residuos de cido silico por parte de diferentes dominios expresados en el factor H. Las clulas de los mamferos suelen expresar un alto contenido de cido silico, mientras que en los microorganismos patgenos su expresin no es uniforme. Los microorganismos que expresan un alto contenido de cido silico unirn el factor H y por lo tanto, se vern protegidos de la accin de la va alterna del complemento. Por el contrario los microorganismos que expresen un bajo contenido de cido silico no lograrn unir el factor H y en consecuencia, permitirn el ensamblado de la convertasa de C3 de la va alterna, y procedern a la activacin del sistema del complemento. La incapacidad del factor H de asociarse con la superficie de un microorganismo constituye la condicin permisiva crtica que conduce a la activacin de la va alterna. En ausencia del factor H asociado con la sueprficie, el C3b podr interactuar con el factor B y dar lugar a la formacin de C3bB que, merced a la accin proteoltica del factor D dar lugar a la fomacin de C3bBb (convertasa de C3 de la va laterna), en primera instancia y BbC3b(n), convertasa de C5 de la va alterna. VA LECTNICA Se pone en marcha por accin de una protena conocida como MBL, de la familia de las colectinas. Es la Manosa Binding Lectin, es una lectina ligadora de manosa. Esta

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protena es una sern-proteasa, tiene una estructura muy parecida al C1q, y tiene las microfibrillas caractersticas del colgeno. Esta MBL tiene la propiedad de reconocer sobre las paredes celulares de los microorganismos los hidratos de carbono, entre ellos glucosa, manosa, fucosa, Nacetiglucosamida, manonas, y se va a acoplar producindose la interaccin de la protena ligadora con el hidrato de carbono, y eso induce la activacin de dos serinoproteasas que son la MASP-1 y la MASP-2. Estas tres protenas actan como complejo, es decir, la MBL est unida a MASP-1 y a MASP-2. Estas dos enzimas van a actuar sobre C4 y sobre C2, dando C4a y C4b, C2a y C2b. Esto pone en marcha la rpida activacin de todos los mecanismos para eliminar el patgeno.
MBL MASP-1/MASP-2

C4

C2

C4a

C4b

C2b

C2a

C4b2b C3

(convertasa de C3)

C3a

C3b

C4b2b3b

(convertasa de C5)

C5 C5a C5b

C5bC6C7C8(C9)n

(complejo de ataque a las membranas)

Entonces, el evento final luego de la activacin del complemento es la eliminacin del patgeno, la muerte por lisis. En la opsonizacin tienen un papel muy importante el C3b, C4b y los productos de degradacin del C3b: C3bi, C3bd y C3bdg, para producir la depuracin en el hgado o el bazo. El C3b participa en la neutralizacin de ciertos virus, en la inmovilizacin de treponemas.

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FORMACIN DE ANAFILOTOXINAS Durante la activacin del C se van generando pptidos de bajo PM que son vasoactivos: C3a y C5a. El C4a tambin es anafilotoxina, pero con una potencia menor. El C3a y el C5a, va receptor, producen efectos biolgicos sobre gran cantidad de clulas sanguneas, sobre todo en macrfagos, monocitos y polimorfonucleares. Se ha visto, en especial el C5a, que adems de efecto anafilotxico tienen accin quimioatractante o quimioatrayente, es decir, quimiotxis. Esto significa que reclutan las clulas inmunes hacia el lugar de la infeccin. El C5a sobre los neutrfilos produce un estallido respiratorio, el neutrfilo comienza a sintetizar numerosas sustancias: quemoquinas, citoquinas. As, el metabolismo celular se acelera y forma sustancias nocivas para el microbio, como los aniones superxido, perxidos, NO3. Si todo esto no est bien controlado, puede generar lesiones hsticas al husped. Los neutrfilos, basfilos y eosinfilos tienen vesculas con grnulos potencialmente txicos. En esta activacin ese contenido se descarga y colabora con el potencial microbicida. Sobre los macrfagos, y tambin neutrfilos, hay un aumento en la sntesis de molculas de adhesin. Esto permite que rueden por los capilares y, al estar aumentada la permeabilidad vascular, por diapdesis se trasladan al foco infeccioso. Tambin se incrementa la exposicin de MHC I y II, sobre todo en las CPA. Esto indica que hay un mejoramiento en la presentacin antignica. Sobre las clulas dendrticas, si estn en forma inmadura, favorece su maduracin. En el macrfago aumenta la produccin de distintos tipos de receptores, aumentando la fagocitosis. El macrfago sintetiza TNF-, IL-1, IL-12, IL-10. Cuando se produce la lisis celular, se rompe la membrana plasmtica, se liberan fosfolipasas y esto inicia la va de la PG (prostaglandinas), tromboxanos, leucotrienos e hidroxiderivados. Esto tiene un elevado potencial inflamatorio. Sobre los mastocitos y los basfilos, C3a y C5a actan como anafilotoxinas.

histamina serotonina bradquinina

Ca
2+

C3a C5a

El C3a y el C5a, va receptor especfico del mastocito basfilo, transmite una seal endoqumica al interior. Los basfilos y los mastocitos tienen vesculas en su interior que contienen grnulos de histamina, serotonina y bradiquinina, es decir, una serie de sustancias vasoactivas que normalmente estn dentro de las vesculas. Cuando hay interaccin del C3a o C5a con el receptor, en presencia de Ca2+ citoplasmtico, las vesculas se fusionan con la membrana plasmtica y liberan estas sustancias al exterior celular. Estas sustancias actan sobre los vasos sanguneos y capilares, son vasoactivos, aumentan la permeabilidad vascular. Esto hace que los capilares se hinchen. Sobre el

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endotelio van a permitir el aumento de su permeabilidad, aumento en la expresin y actividad de adhesinas y produccin de mediadores lipdicos de la inflamacin. Al aumentar la permeabilidad vascular, va a aumentar el flujo sanguneo al lugar de la inflamacin, y con ello numerosos monocitos, neutrfilos, etc. Sobre el msculo liso el C2a produce contraccin.

MECANISMOS REGULATORIOS Estos mecanismos aseguran que cuando se elimin el patgeno, el C deje de funcionar. El freno de la accin citotxica del C est dado por dos tipos de protenas: protenas sricas libres en el plasma y protenas asociadas a la membrana. Las protenas del C se estn sintetizando constantemente, circulan en forma inactiva, y cuando se cuantifican en el laboratorio se tiene una informacin esttica, porque luego de la extraccin de sangre el C se sigue sintetizando. De las protenas reguladoras sricas, una de las ms importantes es el C1 inhibidor (C1 Inh). Pertenece a la familia de las serpinas, es una serina proteasa. La familia de las serpinas la integran tambin la antitrombina 3 y la 1- antitripsina. El C1 inhibidor va a actuar sobre el C1, impidiendo que siga la cascada de activacin a travs de C1s y C1r. Esto frena la activacin por la va clsica. Otra protena srica importante es la C4BP (C4-binding protein), impide que el C4b se fije a la membrana celular. El factor o sustancia H es una protena que puede presentarse de forma libre en el plasma o como protena integral de membrana. Cuando est fija a la membrana plasmtica se une al cido silico e impide que el C3b se pegue a la clula y la opsonice. Otras protenas estn ancladas en la membrana. El DAF o Factor acelerador de decaimiento inhibe el ensamblaje de la convertasa de C3. El CR1 es un receptor que se encuentra en eritrocitos. El CD59 y el HRF (factor de restriccin homlogo) impiden la formacin del CAM o complejo de ataque a las membranas. Aparentemente se une a la cadena hidrofbica del C8 e impide el ensamblaje del complejo ltico.

DEFICIENCIAS DEL COMPLEMENTO Hay dos tipos: las genticas y las adquiridas. Las genticas se refieren a un dficit hereditario de algn componente del complemento. Son trastornos muy raros y generalmente autosmicos recesivos. Las deficiencias adquiridas pueden deberse a un consumo elevado del complemento, por ejemplo por aumento de activadores (microorganismos, patgenos), o tambin por dficit de protenas regulatorias. Tanto la persona que tiene un trastorno gentico como aquella que tiene un dficit de C de forma adquirida, las manifestaciones que posee son de tres tipos: Angioedemas (en personas con dficit de C1 inhibidor): aumenta C3a y C5a. Trastornos reumatolgicos. Infecciones a repeticin.

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VALORACIN DE LOS COMPONENTES DEL COMPLEMENTO Se utiliza una suspensin de GRc (de carnero) en un buffer. Para saber la cantidad de GRc que se dispone se realiza una curva de calibrado, que permite, tomando una alcuota determinada y haciendo una lectura espectrofotomtrica, saber la cantidad. La curva de calibrado para GRc sirve para determinar la concentracin o el porcentaje de GRc dentro de los rangos bien determinados y en cualquier momento. Luego de la extraccin de sangre hay que lavar los GRc. Este lavado tiene tres fines: Primero, eliminar el anticoagulante, ya que tiene citrato que secuestra Ca2+, el cual es necesario para la activacin del C. Elimina el C propio del carnero Permite ver el estado de los GRc en cuanto a su fragilidad osmtica. El ltimo sobrenadante del lavado debe estar lmpido e incoloro, si es rojizo significa que hubo hemlisis. Generalmente se hacen tres lavados en buffer C 1-5, se desecha el ltimo liquido de lavado, se resuspende en dos volmenes de buffer y se realiza un micro hematocrito, utilizando capilares. Luego de la centrifugacin se mide la columna total y la columna de GRc. As obtengo el porcentaje de suspensin de GRc. A partir de la suspensin obtenida, de GRc al 20%, se preparan otras tres suspensiones al 10%, al 5% y al 2,5%. Luego se preparan tres tubos de ensayo con el mismo grosor y altura, y se agrega a cada uno de ellos 9,8 ml de agua destilada, 200 l de la solucin correspondiente (a un tubo la de 10%, a otro la de 5% y al otro la de 2,5%). Se va a producir hemlisis. Se lee la Hb a 530 nm (ver la curva en la fotocopia). Si se grafica % de hemlisis vs. C agregado, se obtiene:

% hemlisis 100 75 50 25 Suero agregado

La curva tiene una mxima pendiente entre los 25%-75%, y en este sector se encuentra mayor sensibilidad porque con pequeas variaciones de suero, se puede hacer una disminucin del porcentaje de lisis. Von Krough determin la expresin matemtica de la curva: X=Kx Y 1-Y
1/n

X: cantidad de C expresado en ml de suero. Y: grado de lisis: 0,1; 0,25; 0,5 K: cantidad de complemento capaz de producir el 50% de lisis, es una constante.

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Cuando Y = 0,5 la expresin se reduce a LogX = LogK. Se prepara una batera de 7 tubos, donde 2 son controles. El tubo 6 contiene SH y tiene buffer, es el control de 0% de hemlisis. El tubo 7 contiene el SH y suero muy concentrado, es el control con 100% de hemlisis. Los otros cinco tubos tienen distintas diluciones del suero. Se incuba 1 hs a 37C, se centrifuga y se lee la oxihemoglobina a 541nm. Se lee primero el tubo 7, y su DO se corresponde al 100% de hemlisis. Los dems se sacarn por regla de tres simple. Con los valores de LogX y Log (Y/(1-y)) se grafica la recta. En el punto donde la recta corta al eje de los x, tiene un valor de 2,18, el Log 2,18 corresponde a una dilucin del suero 1:150, por lo tanto el suero tiene 150 unidades hemolticas 50%.

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AUTOINMUNIDAD

La autoinmunidad es una respuesta adaptativa contra Ag propios o autoantgenos. En ella participan los Ac y los LT. Esto ocurre porque se rompen los mecanismos de tolerancia o autotolerancia. Recordar que tambin existe tolerancia contra Ag externos, como los del alimento. La tolerancia se va a ejercer a dos niveles: a nivel central y a nivel perifrico. TOLERANCIA CENTRAL A nivel central se habla de tolerancia en aquellos rganos donde las clulas de los LB y LT se van generando y madurando. El proceso de tolerancia central de los LB ocurre en la mdula sea, para los LT ocurre en el timo. Durante la ontogenia B, los LB inmaduros expresan una IgM en su membrana, que es el receptor para el Ag (BCR), y en este estado impactan con Ag propios. Esos autoAg pueden estar en la superficie de las clulas del organismo. Si el LB recibe una seal contra esos Ag propios que estn en la superficie celular, alguna lipoprotena por ejemplo, ese LB va a morir por apoptosis. En ese momento puede ocurrir la edicin del BCR, donde el LB intenta generar un Ig de membrana que no reconozca un Ag propio y as seguir viviendo. Si no lo logra, muere por apoptosis. Si los LB reciben seales de Ag solubles, por ejemplo las protenas propias, el LB entra en un estado anrgico o de no respuesta. No muere, puede salir de la mdula sea, pero no va a responder. Si el LB no recibe ningn tipo de seal, contina su proceso de maduracin hasta llegar a ser un LB maduro. El proceso de tolerancia central para los LT ocurre en el timo. En la ontogenia T, los LT se pueden clasificar en dobles positivos y en dobles negativos. Eran dobles negativos cuando no expresan ni la molcula CD4 ni la molcula CD8. Despus empiezan a expresar las dos molculas, pasando al estado doble positivo, cuando llegan a la zona de la corteza tmica, experimentan el proceso de seleccin positiva. El proceso de seleccin positiva permite que sobrevivan solo aquellos LT capaces de reconocer a las MCH. Aquellos que reconocen a las MHC-I, dejan de expresar el marcador CD4 y solamente expresan el CD8, pasando a ser linfocitos citotxicos. Los LT que reconocen a las MHC-II dejan de expresar el marcador CD8, continan expresando el CD4 y pasan a ser los LTh. Todo esto ocurre en la corteza tmica. El proceso de maduracin de los LT contina cuando estos migran a la mdula tmica, donde experimentan el proceso de seleccin negativa, por el cual los LT que reconocen Ag propios mueren por apoptosis. Los que no lo hacen continan el proceso de maduracin. De este modo salen del timo LT que no reconocen Ag propios. TOLERANCIA PERIFRICA Puede ocurrir que algn linfocito escape de los procesos de regulacin y salga del timo o de la mdula sea y reconozca Ag propios. Un factor que participa en la activacin de los LB una vez que salen de la mdula sea es el factor BAFF. Se ha visto que este factor est aumentado en pacientes que tienen enfermedades autoinmunes. Cuando el factor BAFF est en gran concentracin puede activar a los LB anrgicos.

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Los procesos de tolerancia perifrica van a estar mediados por LT reguladores o supresores. La clula supresora o reguladora ejerce su accin a nivel tanto de la activacin de los LT como de la proliferacin. Las clulas T supresoras producen diferentes citoquinas, de las cuales las principales son la IL-10 y el TGF-. La IL-10 acta a nivel de la CPA e inhibe la produccin de IL-12 y de la expresin de la molcula B7. La interaccin B7-CD28 es esencial para que el LT se active. Por lo tanto, si hay menor expresin de B7, es menos probable que el LT se active. La IL-12 es muy importante para la activacin de los LTh1, entonces al haber menor cantidad de IL-12 el LTh1 va a recibir menor seal para activarse. El TGF- inhibe la proliferacin celular, entonces puede ser que el LT se haya activado pero va a haber menor cantidad de LT porque la proliferacin est disminuida. Otra interleuquina que producen las clulas T supresoras es la IL-4 que inhibe la accin del IFN-. El INF- es esencial para que se activen los macrfagos. Entonces se regula tanto la funcin de los LT como la funcin de otras clulas que participan en el proceso inflamatorio. Existen distintos tipos de clulas T reguladoras. Hay una poblacin que son CD8+ pero no son mayoritarias, las ms importantes son las CD4+. Dentro de estas ltimas estn aquellos que se generan como tal en el timo, son las clulas T reguladoras naturales. Se caracterizan por la expresin en su membrana de la molcula CD4, la CD25 y de FOXP3. El FOXP3 es un gen que codifica para la protena escurfina que inhibe la proliferacin celular. Otra poblacin de clulas T reguladoras se inducen en la periferia y son los LTh3 y la clulas T reguladoras tipo I. Los LTh3 son muy importantes en la mucosa intestinal y participan en los mecanismos de tolerancia hacia los Ag extraos de la dieta. Es importante resaltar que no solamente se van a controlar las respuestas autoinmunes, sino tambin toda respuesta inmune que se desencadene contra cualquier Ag. Si la respuesta no se regula, un exceso puede ser perjudicial para el organismo. Las clulas T reguladoras naturales liberan las citoquinas supresoras IL-10 y TGF-, inhiben a las CPA, LTCD4+ y LTCD8+. Estas clulas se activan con concentraciones muy pequeas de Ag, menores a las que se necesita para activar un LT comn. Las clulas T reguladoras inducibles producen las mismas citoquinas y aparentemente se inducen por unas clulas dendrticas que se denominan semimaduras o tolerognicas, que tienen una menor expresin de las molculas B7 y de IL-12. Tambin inhiben a todos los LT. Los LTh3 producen TGF- e inhiben toda respuesta, tanto de Th1 como Th2. Son muy importantes en la mucosa intestinal.

ENFERMEDADES AUTOINMUNES Se habla de una enfermedad autoinmune cuando la presencia de autoanticuerpos o de los LT sensibilizados ocasionan daos en los tejidos u rganos. Esos daos afectan a la funcin del rgano y es generalmente irreversible. Las enfermedades autoinmunes ms comunes son las de tiroides que prevalece en mujeres adultas, la artritis reumatoidea que afecta al 1% de la poblacin de mujeres, el lupus eritematoso sistmico que corresponde al 0,1% de las mujeres, la diabetes tipo I

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que afecta a nios, y la miastenia gravis que tambin se produce preferentemente en mujeres. Hay una tendencia de que estas enfermedades afecten a las mujeres, es decir, que uno de los factores que contribuye al desencadenamiento de la enfermedad es el factor hormonal. Las enfermedades autoinmunes son multifactoriales, juegan aspectos genticos, hormonales y ambientales. MECANISMOS PATOGNICOS Los mecanismos por los cuales se puede generar una respuesta autoinmune y causar un dao en el organismo son: La liberacin de antgenos recluidos: Hay Ag que estn secuestrados en el organismo, como por ejemplo los Ag del globo ocular. Estn detrs de una barrera y el organismo no necesita generar una tolerancia contra esos Ag porque no estn expuestos. Sin embargo, si un traumatismo libera esos Ag, van a ser reconocidos como extraos y el sistema inmune genera una respuesta adaptativa contra ellos en un ganglio cercano, y los LB que se generan, a travs de la sangre van a poder llegar hasta los ojos y ocasionar reacciones inflamatorias en ambos globos oculares. Autoinmunidad por epitopes crpticos: En una molcula proteica hay muchos epitopes que son dominantes, son los que se presentan ms fcilmente y contra los cuales se monta ms fcilmente una respuesta. Hay otros epitopes que estn ocultos, por lo que el organismo no necesita ejercer tolerancia contra ellos. Si por alguna razn esa protena es procesada de forma diferente y ese epitope crptico es expuesto, el organismo lo va a desconocer y va a montar una respuesta contra ellos. Induccin microbiana: Se tiene por ejemplo un Ag microbiano que tiene dos epitopes, uno que es un epitope extrao y otro que es un autoepitope, es decir, que es un epitope que tambin es propio del organismo. Este Ag es procesado por una clula dendrtica, esta presenta un determinado pptido en su MHC, y ese pptido impacta a un LT. Ese mismo Ag puede ser reconocido por un LB que tiene una Ig de membrana capaz de reconocer el epitope propio, lo procesa y presenta un pptido. Como el pptido presentado es el mismo que el mencionado anteriormente, el LT que haba sido activado por el Ag va a activar al LB que reconoci el autoepitope, por lo tanto este LB va a producir Ac contra el epitope propio, es decir autoAc. Dispersin de epitopes: Un autoAg, que tiene diferentes epitopes, es reconocido por un LB que tiene una Ig de membrana que reconoce a un epitope, es presentado a un LT, el cual se activa y genera una respuesta autoinmune. Este LT puede activar a otros LB, que reconocen del mismo Ag, otros epitopes diferentes. As, a partir de un mismo autoAg que tiene distintos epitopes, se pueden activar varios clones de LB. Mimetismo molecular: Este caso se da cuando las protenas comparten cierta homologa de secuencia lineal, y se da en algunos pptidos compartidos con microorganismos patgenos. Se puede llegar a montar una respuesta contra un microorganismo patgeno que despus reconocer en forma cruzada epitopes propios. Desconocimiento de lo propio debido a la presentacin antignica: Es un hecho que se ha experimentado en forma experimental. Habla de la importancia que tiene la presentacin del Ag para que un LT se active. Han hecho estudios con autoAg que se han presentado a los LT sin que la clula presentadora sea una CPA profesional, es decir, sin que la clula tenga todas las molculas co-estimulatorias necesarias para que el LT se active. Se vio que el Ag no activaba al LT. Sin embargo, si el Ag era presentado por una CPA profesional el LT se - 146 -

activa. En esto tiene mucha importancia la molcula CTLA-4 que est en el LT. Esta molcula es capaz de unirse a la molcula B7 de las CPA. Es equivalente a la CD28 pero con una funcin contraria. La CTLA-4 ejerce una accin inhibitoria, y la CD28 ejerce una funcin estimulatoria. La CTLA-4 tiene mayor afinidad por la molcula B7, esto significa que cuando hay menor cantidad de molculas B7, la molcula del LT que se va a unir va a ser la CTLA-4, y va a transmitir seales inhibitorias. Modificacin de lo propio: Un Ag propio modificado se denomina neoantgeno o neoepitope. Un Ag propio se puede modificar cuando se une alguna droga o algn hapteno, o cuando alguna protena propia es procesada de forma diferente. Un ejemplo son las inmunoglobulinas de los pacientes que tienen artritis reumatoidea. Estos pacientes tienen una IgG que tiene alterado el patrn de glicosilacin. Entonces, esta IgG ya no es reconocida como propia y se generan Ac contra ella. Defectos en la tolerancia central o perifrica: Si hay fallas en la apoptosis no se pueden eliminar las clulas B autorreactivas. Si hay fallas en la presentacin a nivel del timo tampoco se pueden presentar adecuadamente los pptidos para que los LT sean seleccionados o en forma positiva o en forma negativa. Desbalance entre las poblaciones de LTh1 y LTh2: Las citoquinas que produce una poblacin inhiben a la otra poblacin. Cuando hay deficiencia en los LTh1 se puede inducir la produccin de LT autorreactivos y pueden generar enfermedades organoespecficas. Si el desbalance es sobre los LTh2 se pueden generar enfermedades sistmicas por produccin de Ac. Activacin policlonal de LB y LT: Los SUPERANTGENOS son capaces de unirse al TCR pero solamente por la regin variable de la cadena. As pueden activar una gran cantidad de LT, aunque no sean especficos para ellos. De esta manera pueden activar LT autorreactivos que generarn una respuesta autoinmune. En el caso de LB, el LPS puede llegar a activar una gran cantidad de clones de LB. Esa activacin policlonal de LB por el LPS genera Ac del tipo IgM. Si bien en muchas de las enfermedades autoinmunes los Ac que se producen son del tipo IgG, existe la posibilidad de que las IgM tambin tengan un tipo de participacin. Predisposicin gentica: Hay ciertos alelos de las MHC (o HLA: Ag leucocitario humano) que se asocian a ciertas enfermedades. Generalmente las MHC que intervienen son las de clase II, porque los que tienen mayor participacin en las enfermedades autoinmunes son los LTCD4+. Otros genes que pueden estar involucrados son los del TCR, del BCR y los genes de Ig.

CLASIFICACIN DE LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES Se las puede clasificar en si son especficas de rgano o si son sistmicas. Dentro de las dos puede haber alguna sintomatologa que se interponga. Dentro de las enfermedades especficas de rgano las ms comunes son la diabetes tipo I, las enfermedades de tiroides y la miastenia gravis. Dentro de las enfermedades autoinmunes sistmicas est la artritis reumatoidea y el lupus eritematoso sistmico. Existe una clasificacin de acuerdo al tipo de respuesta que generen, y es: -TIPO II: enfermedades autoinmunes mediadas por Ac. -TIPO III: enfermedades autoinmunes mediadas por inmunocomplejos. -TIPO IV: enfermedades autoinmunes mediadas por clulas.

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Estos tres tipos de enfermedades autoinmunes tienen relacin con las reacciones de hipersensibilidad. Las que estn mediadas por Ac son Reacciones de hipersensibilidad de tipo II, y los Ac que participan en estas reacciones son de tipo IgM, IgG o IgA. Los Ac tipo IgE participan en Reacciones de hipersensibilidad de tipo I. Dentro de las enfermedades mediadas por Ac est la miastenia gravis, la anemia hemoltica, el sndrome de Goodpasture, la fiebre reumtica aguda. En la anemia hemoltica autoinmune el Ag es la molcula del factor Rh. La consecuencia de la presencia de Ac contra el factor Rh es la activacin del complemento y la destruccin del GR. En el caso de la miastenia gravis los Ac son contra el receptor de acetilcolina, y lo que se produce es fatiga muscular porque no se puede producir la transmisin nerviosa. En las enfermedades autoinmunes mediadas por inmunocomplejos est el LES: lupus eritematoso sistmico. Los inmunocomplejos se forman siempre en una respuesta inmune, estn formados por la unin del Ag al Ac especfico. Esos inmunocomplejos fijan el complemento y pueden ser depurados del organismo. En algunos casos, como en el LES, puede haber deficiencia en los componentes del complemento por lo que esos complejos Ag-Ac no se pueden eliminar y se depositan ocasionando problemas, por ejemplo en el rin. Las enfermedades autoinmunes mediadas por clulas responden a las Reacciones de hipersensibilidad tipo IV, y las clulas que en su mayor parte participan son los LTCD4+. Dentro de estas enfermedades est la artritis reumatoidea.

TRATAMIENTOS En muchos casos se hace un tratamiento a nivel de los rganos blanco, por ejemplo, en el caso de la diabetes, si se necesita insulina se administra insulina, en el caso de tiroides se administra tiroxina. En otros casos se trata de inyectar LT que sean especficos para un Ag de ese rgano pero que produzcan algn factor de crecimiento. As, cuando el LT se activa produce factores de crecimiento que tratan de hacer que las clulas de ese rgano blanco se recuperen. Este caso se da en una encefalitis autoinmune. Si no se controla el rgano blanco se pude tratar con frmacos anti-inflamatorios, como en la artritis, para disminuir las respuestas mediadas por clulas. Tambin se pueden usar frmacos inmunosupresores. En este caso, si bien pueden ser beneficiosos por un lado, pueden ser perjudiciales por otro. En otros casos se trata de controlar la respuesta inmune. Ese control se puede hacer a nivel de las clulas, por ejemplo se pueden inyectar Ac contra las MHC, se pueden inyectar Ac contra la molcula CD4. Es decir, bloquear de alguna forma la activacin de los LT. Se pueden inyectar Ac contra el receptor de IL-2 para aislar la proliferacin celular. Es decir, consiste en manipular la respuesta inmune de alguna forma para evitar el desencadenamiento de otras reacciones.

ARTRITIS REUMATOIDEA Es una reaccin de hipersensibilidad tipo IV y est mediada por clulas T. Esta enfermedad se produce frecuentemente en mujeres. Se caracteriza por dolores en las articulaciones, sobre todo en las articulaciones de las manos y de los pies. Una

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caracterstica tpica es la rigidez matutina y es simtrica, se produce en ambas manos y en ambos pies. En una radiografa se aprecia un estrechamiento entre las dos articulaciones, debido a la gran respuesta inflamatoria que se produce. Algunos investigadores sostienen que la generacin de esta enfermedad se puede deber a la presencia de ciertos microorganismos, porque se ha detectado a travs de PCR el ADN de algunos microorganismos en las articulaciones. Pero en realidad, el Ag que desencadena todo el fenmeno inflamatorio es desconocido, puede ser algn Ag propio de la articulacin, puede ser algn microorganismo, pero lo que se produce es una importante respuesta inflamatoria. En la articulacin, la membrana sinovial habitualmente est formada por una sola clula, esta comienza a engrosarse, aparecen hasta 5 clulas y se forma el pannus. Esa articulacin se empieza a poblar de un montn de clulas que participan en el montaje de una respuesta inmune. Dicen algunos autores que hasta puede aparecer un pequeo ganglio en la articulacin. Aparecen macrfagos, neutrfilos, linfocitos y hay Ac. Lo que se genera es una continua respuesta inflamatoria. En el mecanismo propuesto para la respuesta inmune continua de la artritis reumatoidea, una clula dendrtica presenta un Ag, hasta ahora desconocido, a un LT. Ese LT se activa, prolifera y va a impactar con un LB. Las citoquinas que se produzca van a favorecer la llegada de los polimorfonucleares neutrfilos y se va a desencadenar una fuerte respuesta inflamatoria. Los complejos inmunes que se producen van a ser fagocitados por ejemplo por los neutrfilos o macrfagos, se liberan las enzimas lisosomales y estas son las que ocasionan el dao en el cartlago y hasta su destruccin. Las citoquinas que producen los macrfagos que se activan por este proceso tambin son potentes agentes inflamatorios. En esto es importante la IL-1 y el TNF-. Entonces, la patologa es bsicamente la respuesta inflamatoria que se genera en la articulacin. Otra cosa que les ocurre a estos pacientes es que aparecen autoAc, que se conocen como Factor reumatoideo, que son IgM, IgG, e IgA, y se generan contra el fragmento Fc de las IgG. Se ha visto que este fragmento tiene un patrn de glicosilacin anormal, le falta molculas de galactosa. Esto hace que esa IgG sea reconocida como extraa y se generen Ac contra ella. Al estar alterado el Fc tambin puede estar alterada la funcin de estas IgG. Estas IgG adems tienen la capacidad de autoasociarse: una IgG a la cual le faltan residuos de galactosa en su Fc, es capaz de reconocer el Fc de otra IgG con las mismas caractersticas. Pero tambin estas IgG pueden tener especificidades para otros Ag. Por los tanto, hay factores reumatoideos que se asocian entre s, factores reumatoideos que tienen especificidad para otros Ag. Todos estos complejos son capaces de ser reconocidos por una IgM que reconoce el factor Fc alterado de la IgG. Se forman as inmunocomplejos que son capaces de fijar complemento. Se desencadena toda la cascada de activacin del complemento, se producen las anafilotoxinas que contribuyen a aumentar an ms la inflamacin. Muchas veces estos inmunocompejos tambin se pueden depositar en las articulaciones. El diagnstico de esta enfermedad se hace a travs de la clnica y se pueden emplear algunas pruebas para medir el factor reumatoideo. Una prueba que se utiliza se llama LAR y es simplemente una prueba de aglutinacin rpida en placa. Se usan partculas de latex recubiertas de IgG humana y se enfrentan con el suero del paciente. Si hay Ac que reconozcan al Fc de las IgG se va a producir una aglutinacin. Esto se puede ver a simple vista, o se puede leer en aparatos como el nefelmetro o el fluormetro. Pero esta determinacin no es exclusiva de la artritis, hay otras patologas reumticas que

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tambin producen este tipo de autoAc. As esta reaccin puede dar positiva y el paciente no tener artritis reumatoidea. Otra cosa que se puede hacer para llegar al diagnstico es la determinacin de la velocidad de sedimentacin globular o eritrosedimentacin, que va a estar aumentada porque se trata de un proceso inflamatorio, y la determinacin de la protena reactiva (pcr), que es una protena de fase aguda. En el tratamiento se utilizan frmacos de primera lnea, segunda lnea y tercera lnea. Loa antiinflamatorios de primera lnea puede ser la aspirina para disminuir la sntesis de prostaglandinas. Se pueden dar antirreumticos, lo que se administra son sales de oro que no se sabe exactamente cmo acta, pero disminuye mucho los sntomas. Los frmacos de tercera lnea que se administran son los corticoides. Estos ejercen una supresin del sistema inmune y ayudan a reducir el proceso inflamatorio.

MIASTENIA GRAVIS Es una enfermedad donde se produce debilidad muscular. Primero hay una debilidad en los prpados, despus la debilidad comienza a aumentar cada vez ms hasta que llega a los msculos respiratorios, producindose la parlisis respiratoria. En esta enfermedad aparecen Ac contra el receptor de acetilcolina. Son de tipo IgG y son especficos para la subunidad del receptor de Ach. Se demostr que esta enfermedad est mediada por Ac, porque si se inyecta sueros de pacientes con la enfermedad a animales, se produce toda la sintomatologa. Estos Ac pueden actuar de tres formas: pueden bloquear el receptor directamente e impedir que se una la Ach, pueden unirse a los receptores y hacen que estos complejos sean endocitados y degradados, o la unin a los receptores puede activar complemento y producir lisis. Hay alguna asociacin de esta enfermedad con algunos haplotipos de HLA y en otros casos se asocia a tumores de clulas B. Para el tratamiento se debe eliminar el timo, se puede hacer plasmafresis, es decir, liberar al plasma de los Ac, o si no, se pueden dar inhibidores de la proliferacin linfocitaria o mediadores anticolinesterasa. Esto es para evitar la degradacin de Ach, as permanece por ms tiempo en el terminal simptico y as favorecer la transmisin del impulso nervioso.

LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO Es de la categora III. Aparece preferentemente en mujeres y la caracterstica de esta enfermedad es que hay Ac contra componentes nucleares: anti-ADN, antiribonucleoprotenas. Se llam lupus porque los pacientes tienen un enrojecimiento en la cara que los asemeja a un lobo (lupus en latn). Esas manchas en la piel se producen por los depsitos de los complejos AgAc debido a la deficiencia de C3 y C4 del complemento, y se identifica mucho por la luz UV. El lupus tiene una gran variedad de presentaciones, vara mucho de un individuo a otro, tiene perodos de remisin y perodos de brote. La caracterstica es la produccin de Ac contra ADN. Por ejemplo, una clula B que tiene una Ig de membrana o BCR que es capaz de reconocer a una histona. El LB procesa esto y se lo presenta a un LT, que reconoce por ejemplo a las histonas. El LB se activa por accin del LT y empieza a producir Ac anti histona.

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Puede ser que el LB tenga un receptor BCR que reconozca al DNA. Entonces reconoce al mismo Ag (un nucleosoma) por el DNA, lo procesa, presenta los pptidos y aquellos pptidos que pertenecan a la histona van a ser reconocidos por el LT que reconoce histonas. El LB se activa pero, como el BCR reconoce al ADN, va a producir Ac antiADN. Este es un ejemplo de un mecanismo de dispersin de epitopes. Hay muchas enfermedades autoinmunes que pueden ser transmitidas al beb por placenta, sobre todo aquellas mediadas por Ac del tipo IgG. En la miastenia gravis y en la enfermedad de Graves, donde hay Ac contra la hormona estimulante de tiroides, los Ac pueden pasar a travs de la placenta y el beb puede sufrir la misma sintomatologa que la madre. Se mejora cuando se eliminan los Ac del organismo.

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INMUNOLOGA DE LOS TRANSLANTES

Clasificamos a los transplantes segn el origen del rgano o tejido que va a ser transplantado. Transplante o injerto es lo mismo. Un transplante autlogo o autotransplante es un transplante de tejido del mismo individuo. Se hace mucho en los casos de quemaduras. Un transplante singeneico es un transplante de tejidos de individuos de la misma especie y genticamente iguales. Esto se da en el caso de los gemelos. Estos dos tipos de transplante no generan ningn tipo de rechazo. Un transplante alogeneico es entre individuos de la misma especie genticamente diferentes. pero

Un transplante xenogeneico es entre individuos de distinta especie, son los que producen ms rechazo, los que se hacen de muy poca frecuencia. Las molculas que van a estar implicadas en los rechazos de transplantes van a ser las MCH. Las MCH tienen como principal funcin la presentacin de Ag. Estn las molculas del complejo mayor y las del complejo menor de histocompatibilidad, son las principales molculas que participan en el rechazo. CMH CmH Presentacin de pptidos Comunicacin entre clulas

Otras molculas son aquellas del sistema ABO, que definen el grupo sanguneo. La compatibilidad ABO es una barrera importante que puede producir un rechazo de transplantes, esto es porque estn no solamente en la superficie de los eritrocitos, sino tambin en las clulas del endotelio vascular.

ANTGENOS DEL SISTEMA ABO Los Ag del sistema ABO tienen una estructura comn pero con un hidrato de carbono diferente. Los GR pueden tener el Ag H, el Ag A o el Ag B. Los individuos que tienen en sus GR el Ag A, en su suero tienen Ac anti-B. Los que tienen GR B, en su suero tienen anti-A. Los que tienen GR O tienen anti-A y anti-B. Los que tienen GR AB no tienen Ac en su suero. La transfusin sangunea es un transplante, ya que se introducen clulas de un individuo a otro. Un donante potencial de un rgano del grupo O, y el receptor posible tambin es del grupo O, la transfusin es posible. El receptor O tiene en su suero Ac anti-A y anti-B, los cuales reaccionarn con clulas que tengan esos Ag en su membrana. Entonces el recetor O solo va a poder recibir un rgano que sea del grupo O. El mecanismo es el mismo que para las transfusiones sanguneas.

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Un donador del grupo A tiene el Ag A en su membrana, por lo tanto ese rgano lo podr recibir de individuos que no posean los Ac anti-A en el suero. Si no se producir la destruccin de las clulas por mecanismo mediado por el complemento. Recordar que estos Ac son naturales, los individuos no necesitan ser sensibilizados previamente para adquirirlos.

COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Estas molculas tienen caractersticas particulares, son polimrficas, es decir, son muy diferentes entre los distintos individuos. Se heredan en forma codominante, es decir, que hay una molcula materna y una molcula paterna, codificadas por un gen paterno y un gen materno. Adems son muy inmunognicas, es decir, son capaces de provocar respuesta inmune, la cual puede ser celular y humoral. En el genoma estn los locus para las MHC de clase I, clase II y tambin hay un locus clase II que codifica para las fracciones C2 y C3 del complemento y para el TNF-, que no estn relacionadas con la presentacin antignica, sino que participa en otros procesos inmunes. Las MHC-I estn ubicadas en todas las clulas nucleadas del organismo, excepto en los GR. Se denominan HLA-A, HLA-B y HLA-C. Su funcin es presentar Ag a los LTCD8+ citotxicos, y presentar pptidos que provienen del interior celular, que resultan del procesamiento de protenas endgenas o de microorganismos que viven dentro de la clula (intracelulares). Las MHC-II tienen una distribucin ms restringida, solo estn en los LT y LB activados, en las clulas dendrticas, en los macrfagos y en clulas del epitelio tmico. En los LT activados estn en baja proporcin. La funcin biolgica es presentar pptidos a los LTCD4+ o LTh, y presentan pptidos provenientes de Ag externos o extracelulares. Se denominan HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR. Las MHC-I tienen el sitio de unin al pptido cerrado en los extremos por lo que permite unir pptidos pequeos, con un promedio de 9 aminocidos. Las MHC-II tienen esos extremos abiertos, por lo que permiten unir pptidos ms largos, de hasta 22 aminocidos. Al ser tan inmunognicas, pueden producirse Ac contra las MHC. Esto ocurre en los embarazos, si el haplotipo del padre es diferente al de la madre, en el momento del parto de va a producir el intercambio sanguneo con clulas del beb y la madre quedar sensibilizada por las MHC diferentes. Tambin ocurre en las transfusiones, ya que no se realiza un estudio de histocompatibilidad, sino solamente de la presencia de los determinantes del grupo ABO. Entonces cuando se transfunde sangre, si las MHC son diferentes se puede llegar a generar Ac. Otro modo de sensibilizacin es por un transplante previo. El rechazo de los transplantes se produce porque el sistema inmune del receptor va a recibir clulas vivas de un donador que tiene MHC probablemente diferentes, y el sistema inmune las va a reconocer como extraas y va a generar una respuesta. Los LT que reconozcan a estos Ag extraos pueden actuar directamente, si son LTCD8+, o van a producir distintas citoquinas, si son LTCD4+.

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Se habla de rechazo del transplante cuando se trata de rganos slidos, como rin, hgado. Se habla de rechazo porque el receptor es quien rechaza el rgano que proviene del donador. En los casos de transplante de mdula sea no se habla de rechazo de transplante, sino de enfermedad injerto vs husped. Esto es porque cuando se hace un transplante de mdula sea se eliminan totalmente las clulas del sistema inmune del individuo que va a ser transplantado. As, el individuo que recibe un transplante de mdula sea no va a tener ningn LT o LB propio, entonces, el que va a producir el dao va a ser el sistema inmune del donador. Las clulas del donador atacan al receptor. Para que se produzca el rechazo de un transplante se necesita primeramente un reconocimiento. El reconocimiento de las MHC extraas puede ser un reconocimiento directo, donde los LT reconocen directamente las molculas HLA del donador que van a estar en las clulas dendrticas del tejido a transplantar. Los LT del receptor reconocen directamente las MHC en las clulas dendrticas del rgano donado. El otro mecanismo va a ser indirecto. En este son las propias clulas dendrticas del receptor las que van a presentar pptidos pertenecientes a las molculas HLA del donador. Las clulas dendrticas del receptor presentan pptidos que provienen de las HLA del donador. Estas clulas dendrticas que tenan MHC con pptidos cargados, pueden llegar a morir por apoptosis. Cuando las clulas dendrticas del donador mueren por apoptosis, quedan pedazos de las membranas de esas clulas que van a tener MHC. Estos pedazos de membrana con MHC van a ser captados por clulas dendrticas del receptor, las que las van a procesar como cualquier Ag extrao, y lo van a presentar a los LT en el contexto de las MHC-II. Otra forma de reconocimiento de un transplante es a travs de los receptores Kir de las clulas NK. Las clulas NK son citotxicas naturales. Estas molculas reconocidas son muy inmunognicas, pudiendo generar una respuesta humoral y celular. Los componentes celulares que participan en el rechazo son los LTCD4+. Los primeros que van a actuar son los LTh1 que producen las citoquinas inflamatorias. Despus va a actuar los LTh2 que van a activar los LB. Van a poder actuar los LTCD8+ directamente produciendo citotoxicidad. Van a actuar tambin las clulas NK produciendo citotoxicidad Ac dependiente cuando ya haya Ac contra esas molculas y adems van a poder actuar por un mecanismo de citotoxicidad directa. Esta respuestas celulares son las ms difciles de investigar, pero las que ms fcilmente responden a la inmunosupresin. Los componentes humorales que participan en el rechazo son los Ac, que pueden ser Ac preexistentes si el individuo haba sido sensibilizado previamente, o pueden ser Ac que se formaron por todo el proceso de activacin. Las respuestas humorales son las ms fciles de investigar, ya que es relativamente fcil saber si un individuo tiene o no Ac en un suero, pero son las ms difciles de manejar por inmunosupresin.

RECHAZO DE TRANSPLANTES EN FUNCIN DEL TIEMPO El rechazo hiperagudo es el que se puede producir an en la mesa de operacin. En este tipo de rechazo participan los Ac preexistentes, estos pueden ser del sistema ABO o

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aquellos que provienen de alguna sensibilizacin: embarazos, transfusiones o transplantes previos. Estos Ac se fijan al endotelio vascular y fijan complemento y toda la cascada de coagulacin. Se forman pequeos trombos en el tejido transplantado, se va a alterar la permeabilidad capilar y se van a producir hemorragias. De esta manera el tejido es rechazado. Solo se puede prevenir haciendo una adecuada tipificacin de las MHC y analizando bien si en el suero del paciente hay o no Ac. El rechazo agudo, que se produce de forma tarda, luego de algunas semanas, va a participar el reconocimiento directo que est mediado por clulas dendrticas del rgano que va a ser transplantado. Estas clulas dendrticas estn activadas porque el rgano fue sometido a una tensin muy importante de estrs, cuando fue extrado. Estas cd al estar activadas van a presentar una buena cantidad de molculas co-estimulatorias, y pueden, entonces, activar los LTCD4+ como los LTCD8+. Si se activan los CD8+ se va a producir la lisis de la clula, si se activan los LTCD4+ se van a activar todas las funciones de los LTh. En el reconocimiento indirecto, una cd del dador muere por apoptosis, deja pedazos de membrana con MHC, esto va a ser captado por cd del receptor, se procesan como cualquier Ag extrao y van a presentar esos Ag en el contexto de las MHC-II. Este rechazo agudo puede ser controlado por agentes inmunosupresores. El rechazo crnico es el que se produce muchos aos despus de realizado el transplante. Se puede producir despus de los 10 aos. Est fundamentalmente mediado por Ac. Los Ac van a pegarse a las clulas endoteliales, esa interaccin favorece la llegada de macrfagos, de PMN neutrfilos, generando todo un estado de inflamacin que provoca que se trate de regenerar el tejido inflamado. Al producirse esa regeneracin se va obstruyendo el vaso sanguneo y termina no permitiendo el paso de sangre. Por lo tanto, el dao en el rechazo crnico se produce por el mecanismo indirecto y por la presencia de Ac. Si bien un individuo puede saber si tiene Ac contra las MHC, no se puede saber si hay LB vrgenes que sean capaces de reconocer esas molculas y que todava no se hayan activado.

INMUNOSUPRESIN Para evitar el rechazo debe someterse a los pacientes a eventos de inmunosupresin. La inmunosupresin puede ser farmacolgica, usando frmacos que actan a distintos niveles, como los corticoides, drogas citostticas o citotxicas que actan a nivel de la regulacin del DNA e impiden la replicacin. Actan sobre cualquier tipo celular, no solo LT, por eso son sumamente txicos para rin e hgado. Hay otros productos que son de origen microbiano, son ms selectivos. Uno de ellos es la ciclosporina, que es de un hongo, otro es el tacrimus, y estos productos afectan a los LT fundamentalmente. Puede inhibir la transmisin de seales de los LT, entonces se suprimen las respuestas T y no se ven afectadas el resto de las clulas. Tambin se tratan de usar mecanismos de supresin mucho ms especficos. Esta el GAT o ALG, que son sueros que se obtienen de animales contra timocitos o contra LT. Son sueros policlonales que se obtiene en oveja o en caballo. La desventaja de estos sueros policlonales es que estn hechos en otras especies animales, entonces pueden ellos mismos inducir una respuesta y as disminuir su eficacia.

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Tambin se pueden utilizar anticuerpos monoclonales contra distintos receptores del LT, por ejemplo contra la molcula CD3, pero tienen la desventaja de que estn hechos en ratn y por la tanto pueden generar respuesta y disminuir su accin. Se est tratando de fabricar los Ac quimricos, que tengan la mayor parte humana y una pequea parte de ratn. Los Ac monoclonales se pueden conjugar a toxinas bacterianas, y tambin se pueden utilizar molculas que inactiven el complemento. En cuanto a las exigencias de histocompatibilidad, los transplantes que necesitan exigencias ms estrictas son las de rin. Se ha visto que para los transplantes de hgado y corazn no es tan necesaria la histocompatibilidad HLA. En el de corazn lo que ms dificulta es encontrar un rgano que pueda ser transplantado. Se ha visto que las tranfusiones de sangre previas pueden llegar a favorecer los transplantes porque se generan clulas T reguladoras, si la sangre tena algn alelo de histocompatibilidad compartido entre donante y receptor. Es un mecanismo que no est claro, por un lado se producira la sensibilizacin por la transfusin y por otro la generacin de clulas T reguladoras que lo favorecan.

PRUEBAS DE TIPIFICACIN DE LOS Ag DE HISTOCOMPATIBILIDAD Por un lado hay que ver cules son los CMH que hay en el donador. Se extraen las clulas mononucleadas, donde van a estar los linfocitos. Se usa un gradiente de picol para extraer la capa de clulas mononucleadas, y esta se va a enfrentar con distintos sueros que ya estn tipificados y que tienen un determinado Ac. Por ejemplo, un linfocito que tenga la MHC B7, se la enfrenta con un suero conocido. Se produce la reaccin Ag-Ac y se fijar el complemento y se va a activar por la va clsica, va a producir lesiones en la membrana y si despus se agrega un colorante la clula se va a teir. Si el Ac del suero no reconoce la MHC del linfocito, no se produce la interaccin AgAc, no se activa el complemento y por lo tanto al agregar el colorante la clula no se va a teir porque la membrana est intacta. Esta tcnica se denomina de microlinfocitotoxicidad, se realiza en policubetas y se utiliza complemento como componente de la reaccin. Otra tcnica es el cultivo mixto de linfocitos. Si los Ag de histocompatibilidad son diferentes hay proliferacin celular, si son iguales los linfocitos se mantienen en reposo. Esta tcnica tarda un par de das y necesita de donantes vivos, no puede realizarse con donantes cadavricos. Esto es porque demora das y despus de obtener el resultado recin se puede hacer el transplante. Las pruebas de cross-match se realizan con el suero del individuo que va a ser transplantado y el linfocito del presunto donador. Tambin en este caso es necesario que sean donantes vivos. Esta prueba detecta si en el suero hay Ac contra los linfocitos del donador. Esta prueba tambin se hace con complemento. Se enfrentan las clulas del rgano que va a ser donado con el suero del paciente, si hay Ac se forma complejo AgAc. Despus se puede agregar una anti--globulina. Se agrega el complemento, el cual se fija, y despus se agrega el colorante. Si haba Ac, el colorante va a penetrar en la

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clula y la va a teir porque el complemento debilit la membrana, y si no hay Ac la clula no se tie. Actualmente hay otras tcnicas mucho ms especficas y sofisticadas, que son las tcnicas de biologa molecular. En estos se detecta directamente la secuencia gentica de cada alelo. Son mucho ms costosas.

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REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD

Si se introduce un Ag extrao en el organismo, el organismo elabora una respuesta beneficiosa, porque ante una segunda entrada del microorganismo el organismo responder neutralizando el agente. Esto es un efecto bueno. Existen casos en los cuales esta segunda entrada del Ag no ocasiona efectos beneficiosos, sino que puede producir dao. Este es el caso de las reacciones de hipersensibilidad. Entonces, una reaccin de hipersensibilidad provoca dao en el organismo y se puede producir por alguna desregulacin en el sistema inmune. Estas reacciones de hipersensibilidad fueron clasificadas por dos investigadores, que se llamaban Gell y Coombs, por lo que se las conoce tambin como reacciones de Gell y Coombs. Se las clasific en cuatro tipos, y se necesita siempre una sensibilizacin previa o, en algunos casos, la presencia de autoantgenos que la desencadenen, como en las enfermedades autoinmunes. Se las clasifica de acuerdo a cual es el comportamiento inmunolgico que las desencadena y cual es el mecanismo que ocurre: TIPO I: Est mediada por IgE, la cual tiene la caracterstica de fijarse a clulas por el fragmento Fc. Se va a fijar a clulas que tengan el receptor para el Fc. Estas clulas son, por ejemplo, los mastocitos, eosinfilos y basfilos. Una primera entrada del Ag genera estos Ac tipo IgE. Estos Ac se fijan a las clulas: mastocitos, eosinfilos y basfilos, y cuando el Ag entre por segunda vez, se va a fijar a la IgE que est unida a la clula y va a desencadenar la liberacin de mediadores qumicos. El Ag debe ser soluble. La IgE puede estar hasta cuatro semanas fijada a las clulas y algunos ejemplos son la rinitis alrgica, el asma y la anafilaxia sistmica. TIPO II: Estn mediadas por la IgG y tambin por la IgM. El Ag en este caso est unido a la clula o a la matriz extracelular. El mecanismo que acta es la lisis por complemento, o la citotoxicidad por accin de las clulas NK, o la fagocitosis. Un Ag que produce este tipo de reaccin es la penicilina. TIPO III: Estn mediadas por IgG, el Ag es soluble y el mecanismo es el depsito de inmunocomplejos y la lisis a travs del complemento. Como ejemplo, la enfermedad del suero y la reaccin de Arthus. Estas tres son reacciones de hipersensibilidad inmediata, porque estn mediadas por Ac. TIPO IV: Se conocen como reacciones de hipersensibilidad retardada y estn mediadas por clulas: LTh1, LTh2 y LTc. En el caso del LTh1 y LTh2 el Ag es soluble. En el caso de los mediados por LTh1 el mecanismo es la activacin de los macrfagos, porque los LTh1 producen IFN- que contribuye a la activacin de los macrfagos. Un ejemplo tpico es la reaccin de la tuberculina. En el caso de los LTh2 el Ag es soluble y el mecanismo es la activacin de los eosinfilos. Este fenmeno es lo que ocurre en el asma crnico, que se inicia como una reaccin de hipersensibilidad tipo I.

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En los mediados por los LTc el Ag est asociado a clulas y se produce la lisis. El Ag es una molcula pequea que es capaz de meterse adentro de la clula, asociarse a una protena celular y despus expresarse como una protena extraa en el contexto de MHC-I. Los Ag o alergenos que pueden dar las reacciones de hipersensibilidad pueden encontrarse en muchos materiales. Por ejemplo, en el polen, en la caspa de los animales, en los excrementos de los caros, en materiales inyectables como drogas, medicamentos, vacunas, venenos de insectos, en los materiales ingeridos, en frmacos, en materiales que actan por contacto, los detergentes, metales, etc.

REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO I Son las ms comunes. Estn mediadas por Ac que tienen la capacidad de fijarse a clulas. Se denominan CITOTROPICOS. Estas recciones se conocen tambin como REACCIONES DE ANAFILAXIA. Los Ac que producen estas reacciones de forma espontnea son de la clase IgE, pero las reacciones de anafilaxia tambin pueden llevarse a cabo de forma experimental, y en ese caso va a estar mediada por otro tipo de Ac que es la IgG. Estas reacciones fueron muy estudiadas en animales, y as se descifr el mecanismo que las desencadena.

Anafilaxia Espontnea IgE Anafilaxia Experimental IgG La anafilaxia en animales se puede provocar de forma activa o pasiva: En la anafilaxia activa se usa el mismo animal para generar la respuesta de Ac y para desencadenar la reaccin. Entonces, se inyecta el Ag en un animal, este animal elabora los Ac, luego se inyecta nuevamente el Ag para desencadenar la reaccin. La primera etapa, donde se inocula el Ag para que se generen los Ac, se denomina fase de sensibilizacin. El Ag se puede inocular por va intradrmica o subcutnea. La etapa donde se inocula el Ag por segunda vez es la fase de desencadenamiento, y el Ag generalmente se inyecta de forma intravenosa. La anafilaxia pasiva consiste en inyectar el Ag en un animal para que elabore Ac, se inyectan esos Ac en otro animal y despus se inyecta el Ag desencadenante en el animal al que se le inyectaron los Ac. En un trabajo prctico se inmuniza un conejo con OA, por lo cual el conejo elabora Ac anti-OA. Se le extrae sangre, se separa el suero, el cual tendr Ac IgG fundamentalmente. Este suero se lo inyecta a un ratn. Luego en el ratn se produce el desencadenamiento con la OA. Esta es una anafilaxia pasiva. En vez de ratn puede utilizarse otro conejo, es decir, el animal puede ser de la misma o de distinta especie. Si el animal es de la misma especie el Ac que se va a fijar es homocitotrpico, y si es de distinta especie se llama heterocitotrpico. La IgG se puede fijar a clulas de animales de la misma o de distinta especie.

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IgEHOMOCITOTRPICA IgGHETEROCITOTRPICA

En el caso de la anafilaxia pasiva, es necesario esperar un tiempo para que los Ac se peguen a la clula, ese perodo se llama perodo de latencia. Luego de inyectar la dosis del Ag desencadenante, los fenmenos que se pueden observer son de dos maneras: puede producirse una anafilaxia generalizada o una anafilaxia local. En la anafilaxia generalizada estn implicados muchos rganos, y en la anafilaxia local est implicado un solo tejido. En la generalizada, una vez que se produce el desencadenamiento por la liberacin de todos los mediadores qumicos, se puede llegar a producir el shock anafilctico que lleva a la muerte del animal. Los sntomas que van a tener los animales van a depender de los mediadores qumicos que liberen. No son iguales para las distintas especies. En el cobayo se libera histamina y en el ratn serotonina. Entonces, tanto la anafilaxia generalizada como la local pueden ser activa o pasiva. Las reacciones de anafilaxia local se pueden detectar por tres mtodos: Mtodo de Schulz-Dale (mide la contraccin muscular y utiliza quimigrafos). Degranulacin de los mastocitos. Anafilaxia cutnea. Estos mtodos tienen una diferencia segn la reaccin sea activa o pasiva.

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ANAFILAXIA ACTIVA ANAFILAXIA PASIVA Se trabaja con un pedazo de tejido de intestino o Se trabaja con un tero de un animal intestino o un tero de un sensibilizado. Se supone animal virgen. Se que en el tejido ya estn agregan los Ac obtenidos los Ac pegados a la en otro animal, se espera clula. Se agrega el Ag el perodo de latencia, se que se us para agrega el Ag y se mide la sensibilizar y se mide la contraccin muscular. contraccin muscular.

Mtodo de SchulzDale

Tcnica de la degranulacin de mastocitos

Se trabaja con serosa, una porcin de mucosa de un Se trabaja son serosa de un animal virgen, se le animal sensibilizado que agregan los Ac, se espera ya tiene los Ac pegados. el perodo de latencia y Se agrega el Ag, se despus se agrega el Ag. produce la degranulacin Se fija y se colorea para de los mastocitos y mirar al microscopio despus se colorea y se observa al microscopio.

Anafilaxia cutnea

Se llama TEST DE A un animal sensibilizado OVARY. A un animal se se le inocula el Ag por le inocula en la piel Ac va intradrmica en forma de otro animal. Se espera local. Despus por va el perodo de latencia y intravenosa se le agrega despus por va el colorante de alto PM, intravenosa se inyecta el que es el Azul de Evans. Ag + el colorante de alto PM.

El colorante de alto PM queda en circulacin, pero en los puntos donde se produjo la degradacin de los mastocitos hay un aumento de la permeabilidad capilar y entonces el colorante sale y se observa una mancha azul.

En una reaccin de anafilaxia cutnea pasiva se inocula con un suero directo de conejo, que va a tener Ac heterocitotrficos porque provienen de otra especie animal, y es un suero de conejo que se inmunizo con OA. Se hace un control al cual se le inyecta solucin fisiolgica. En este tipo de prctico es muy importante tener cuidado al inocular al animal, ya que se pueden producir manchas azules por todas partes que van a ser inespecficas.

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Luego se espera un tiempo que corresponde al perodo de latencia, y despus se inyecta la dosis desencadenante por va intravenosa. Esta inoculacin se hace en el ojo, en el seno orbital, y se inyecta el Ag junto con el azul de Evans. El ratn se pone azul debido a la circulacin del colorante por el organismo. Se sacrifica al ratn y se extrae la piel, para comprobar las manchas. Esta tcnica sirve para determinar que Ac son capaces de fijarse a las clulas, para poder determinar la dosis sensibilizante, es decir, la cantidad de Ac que hay que agregar para que se produzca la reaccin; y para estudiar los mecanismos que producen la reaccin de anafilaxia. Las reacciones de hipersensibilidad tipo I en el hombre estn mediadas por IgE. La IgE se encuentra en muy bajas concentraciones en sangre, est en el orden de los g., y se encuentra fundamentalmente fijada a clulas. Tiene dos cadenas H y dos cadenas L, tiene cinco dominios de Ig, no tiene capacidad de fijar complemento ni tampoco de precipitar Ac, y si se calienta a 56C pierde la capacidad de unirse a los receptores. Para identificar IgE hay que utilizar tcnicas muy sensibles porque est en muy baja concentracin, entonces se usan mtodos de interaccin primaria con compuestos marcados con radioistopos. Estos mtodos son el PRIST y el RAST. El PRIST determina IgE total y el RAST determina IgE especfica para un determinado Ag. Este tipo de reaccin est mediada tambin por clulas. MASTOCITOS Los mastocitos se originan en la mdula sea. El nombre del mastocito viene del alemn mastzellen que significa clula obesa, ya que ese es su aspecto al microscopio. Son abundantes en todas las mucosas y los epitelios, y en los tejidos vascularizados, pero no estn ni en retina ni en el sistema nervioso. Cuando se producen en mdula sea no son granulados, adquieren los grnulos a medida que maduran en el tejido. Los mastocitos humanos se pueden clasificar en dos tipos, de acuerdo a las enzimas que tengan: los mastocitos de mucosa producen triptasa y los mastocitos de tejidos producen quimiotriptasa. Estas clulas tienen receptores para el Fc de IgE, y se las llama FcER1. Estos receptores tienen una afinidad muy alta por la IgE, es de 1010 M-1, y en particular mucha afinidad por la IgE libre. Es decir que la IgE no necesita estar unida a ningn Ag para poder fijarse al FcER1. Los mastocitos expresan el FcER1 en forma constitutiva. A una misma clula se pueden unir molculas de IgE de distinta especificidad, pero para que se desencadenen todos estos fenmenos se necesita el entrecruzamiento de receptores. Esto quiere decir que dos molculas de IgE adyacentes se tienen que unir al mismo Ag. Para esto el Ag debe tener epitopes mltiples, repetitivos, o dos molculas de distinta especificidad que estn muy cerca y un Ag que tenga dos epitopes distintos cercano uno del otro. Los grnulos de los mastocitos poseen mediadores qumicos, los cuales se producen de forma constitutiva, estas son las enzimas histamina y el TFN- que puede ser considrado como preformado. De las enzimas se sintetizan de forma constitutiva la triptasa, luego la histamina y el TNF-. Es decir que el mastocito no necesita estar activado para producirlos. Una vez que se produce la activacin sintetiza otros mediadores: IL-4, IL-13, leucotrienos, factor activador de plaquetas, y las prostaglandinas.

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Uno de los mediadores ms importantes es la histamina, que deriva del aminocido Hys y puede actuar por receptores celulares de tres tipos: H1, H2 y H3. De acuerdo a que interacte con uno u otro va a ejercer una funcin diferente. La accin que va a ejercer en estas funciones va a estar mediada por su unin al receptor H1. La histamina aumenta la permeabilidad capilar y produce la contraccin del msculo liso. Como este es un fenmeno de tipo inflamatorio se favorece el pasaje de clulas desde el sitio de activacin por el aumento de la permeabilidad capilar. El TFN- acta estimulando la expresin de molculas de adhesin en clulas endoteliales, esto favorece el pasaje de clulas desde la circulacin al tejido. La triptasa activa metaloproteasas que degradan la matriz extracelular. Estos fenmenos pueden llegar a ser beneficiosos en algunos momentos, como en algunas enfermedades parasitarias, pero en el caso de la alergia estos fenmenos producen dao. Dentro de los mediadores que se sintetizan despus, los leucotrienos son los ms importantes y tienen la misma accin que la histamina, con la diferencia de que son 100 veces ms potentes, pero se liberan ms tardamente. Todos estos mediadores son responsables del shock anafilctico que sufren los animales y que lleva a la muerte. EOSINFILOS Se encuentran en baja proporcin en la circulacin, son ms abundantes en el tejido conectivo de los tractos respiratorio, gastrointestinal y urogenital. Tienen granulaciones con un contenido extremadamente txico para las clulas, es por eso que la produccin de eosinfilos est muy bien controlada. Cuando se producen fenmenos inflamatorios se produce la IL-5 que favorece la produccin de eosinfilos por la mdula sea. Esta interleuquina se genera en estados de inflamacin . Los eosinfilos no expresan el FcER1 en forma constitutiva, pero s lo hacen cuando est presente la IL-5. Para migrar a los sitios de inflamacin los eosinfilos usan las quemoquinas. Las quemoquinas que participan son la CCL-5, CCL-9, CCL-11. La CCL-9 se conoce como eotaxina, es un factor que atrae a los eosinfilos. Los eosinfilos tienen un receptor para quemoquinas que es el CCR3. BASFILOS Los basfilos se parecen a los mastocitos pero tienen el mismo origen que los eosinfilos, el mismo precursor. Expresan el FcER1 solo cuando son estimulados y las citoquinas que favorecen la produccin de basfilos son las IL-3 y el TGF-. Parece ser que la produccin de eosinfilos y basfilos se autorregula. Para que un LB produzca IgE debe experimentar el switch o cambio. Una citoquina muy importante en la produccin del cambio de isotipo es la IL-4. Adems, el LB debe interactuar con un LT a travs de la molcula CD40 del LB con la molcula CD40L del LT, y la presencia de IL.4. Cuando los mastocitos se activan, por el entrecruzamiento de IgE unidas a la membrana por unin al Ag, comienzan a producir IL-4 y CD40L. Entonces, los mastocitos activados pueden contribuir a la produccin de ms IgE. Es una manera de incrementar la reaccin de hipersensibilidad. Los Ag que inducen la produccin de IgE son Ag proteicos, pequeos, de bajo PM; deben ser muy estables, ya que muchos de estos Ag se encuentran en el polvo, en los excrementos de los caros, por eso necesitan una alta resistencia. Adems, necesitan

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tener una alta solubilidad. Cuando el polvo o el excremento de los caros se introducen por va respiratoria, al estar en contacto con el moco se hidratan, por eso los alergenos deben ser solubles, para poder desprenderse de las partculas. Muchos tienen actividad proteasa, la que tambin favorece la salida del cmulo de sustancias y la entrada a la mucosa. ATOPIA: Es la predisposicin gentica que tienen ciertos individuos de padecer estos fenmenos de alergia o hipersensibilidad. Se asocia a algunos genes, por ejemplo a los genes de ciertas citoquinas que estn codificadas en el cromosoma 5 (IL-3, IL-4, IL-5, IL-12), a los genes que estn ubicados en el cromosoma 11, que son los que codifican para el receptor FcER1, y tambin se asocian a ciertos genes del CMH. Entonces, un alergeno que en un individuo normal no ocasionara ningn problema, en ciertas familias de ciertos genotipos puede causar problemas. Si bien estas reacciones de hipersensibilidad son inmediatas, igual se pueden distinguir en ellas dos fases: una fase inmediata, que se produce cuando se liberan las histaminas, y una fase tarda, donde el edema y la inflamacin son mayores, y es la que se produce cuando se liberan los leucotrienos. La fase temprana es la que se detecta cuando se hacen las pruebas cutneas para saber si un individuo es alrgico. Se introduce el alergeno en la piel y a los pocos minutos aparece una zona rojiza debido al aumento del flujo sanguneo y la alteracin de la permeabilidad capilar. Si a un individuo le hacen esta prueba y resulta ser alrgico, y se quiere saber si el alergeno esta afectando tambin la capacidad respiratoria, deben hacerse pruebas midiendo la capacidad respiratoria antes y despus de estar en contacto con el alergeno. Si resulta alrgico la capacidad respiratoria va a disminuir debido a los efectos de la histamina: contraccin del msculo liso, se cierran los bronquios. La clula principal que acta en todo el mecanismo es el mastocito. La liberacin de histamina produce la contraccin del msculo liso y el aumento de la permeabilidad capilar. Si esto ocurre, por ejemplo, en el tracto gastrointestinal se favorece el aumento de las secreciones, aumenta el peristaltismo y va a producir diarrea y vmitos. Si ocurre en las vas areas va a disminuir el dimetro de los bronquiolos y le va a costar al individuo respirar (se va a producir tos, sibilancias). Depende tambin en cual sitio del tracto respiratorio est actuando. Si la liberacin se produce en las fosas nasales va a haber estornudo, picazn. Si se produce a nivel de los vasos sanguneos se produce un aumento de la extravasacin de lquido, se produce edema y esto favorece que vayan ms clulas a los ganglios o a las zonas cercanas al sitio de entrada. Las reacciones mediadas por la IgE pueden ser: ANAFILAXIA SISTMICA: El Ag penetra por va sangunea. El individuo que fue previamente sensibilizado por el alergeno elabor la IgE, y la segunda entrada del Ag se produce por va sangunea. Esto se da en el caso de las picaduras de avispa o abeja, cuyos venenos pueden producir este tipo de reaccin. Tambin la penicilina. El ingreso del alergeno puede inducir un shock anafilctico que lleva a la muerte del individuo.

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Si acta sobre el corazn y el sistema vascular va a producir un aumento de la permeabilidad capilar, va a disminuir la presin arterial, disminuye el O2, disminuye la frecuencia cardiaca hasta producir la muerte. En el tracto respiratorio se produce la contraccin del msculo liso, se cierra la garganta, se puede producir edema de glotis. En el tracto gastrointestinal se producen clicos, dolores, vmitos. A un individuo que padece toda esta sintomatologa se le da epinefrina, para contrarrestar los efectos de la histamina. RINITIS ALRGICA O FIEBRE DEL HENO: Es la ms leve de todas las alergias. El alergeno entra por va nasal y la degranulacin de los mastocitos se produce en las fosas nasales. En estos casos hay picazn, estornudos, aumenta la secrecin que puede estar muy poblada de eosinfilos, y aparece lquido en los senos paranasales debido a la extravasacin de lquido que hay. Esto puede llegar a complicar tambin los odos y favorece las infecciones por virus o bacterias. Tambin puede afectar a los ojos, haber produccin de lgrimas, etc. ASMA ALRGICO: La liberacin de los mediadores se produce en los bronquiolos: un alergeno entra por va inhalatoria, se fija a los mastocitos que ya tienen la IgE y desencadenan la liberacin de los mediadores qumicos, lo cual altera la permeabilidad capilar y favorece la llegada de eosinfilos y LTh2. Este es un proceso agudo que luego se convierte en un proceso crnico, es decir, esta reaccin de hipersensibilidad de tipo I pasa a ser una reaccin de hipersensibilidad de tipo IV. En estas reacciones, si bien el Ag puede haber sido eliminado, se pueden favorecer en ambientes donde hay humo o algn otro componente que pueda estimular la reaccin inflamatoria. REACCIONES ALRGICAS CUTNEAS: La urticaria, que proviene del contacto con las ortigas (de ah su nombre), es una reaccin de liberacin de mediadores qumicos en la piel. Hay picazn, eritema, enrojecimiento. El edema angioneurtico es cuando la liberacin de los mediadores se produce en el tejido subcutneo. Estos dos casos se dan en alergias alimentarias, cuando el alergeno ingresa por va oral y rpidamente por circulacin llega a la piel. La dermatitis o exema atpico es parecida, pero las lesiones producidas tienen secreciones. Pican mucho, son eritematosas y con una cierta produccin de lquido. Este exema se produce en muchas personas que tienen asma o rinitis alrgica. ALERGIAS ALIMENTARIAS: Hay muchos componentes, protenas animales o vegetales, que en individuos normales no ocasionan nada, pero en individuos que tienen cierta predisposicin pueden causar estos fenmenos de alergia. El alergeno entra por va oral y se difunde rpidamente por va digestiva, por ello a veces puede producir urticaria.

TRATAMIENTOS Un tratamiento es el preventivo, es decir, no estar en contacto con el alergeno. Otro es el farmacolgico, por ejemplo, administrando los anti-histamnicos o los corticoides, atacando la sintomatologa.

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Otro tratamiento es el inmunolgico. Lo que ms se usa desde el ao 1911 es la desensibilizacin. Consiste en inyectar o administrar por va oral, cantidades crecientes de alergeno para tratar de polarizar la respuesta inmune hacia los LTh1. Es decir, se desva para que no haya tantos LTh2 y produzcan IgE. La respuesta se desva hacia los LTh1 o se trata que se produzca ms IgG. Estos mtodos son especficos del Ag. Otras estrategias incluyen un Ac monoclonal anti-IgE que se llama ruMBA-E25. Este Ac se une a la IgE que est libre, y as impide que se una a los mastocitos. Se los llama Ac inteligentes. Otra forma es tratar de estimular la respuesta de las clulas T reguladoras, que se puede hacer a travs de algunos probiticos. Hay vacunas de ADN con pequeas porciones de los alergenos. La idea general es tratar de modificar la respuesta para que no se produzca la IgE. Hay Ac que bloquean la IL-4, o al receptor de IL-4, as se evita que acte sobre los LB y produzcan IgE. PRUEBAS DE ALERGIAS CUTNEAS Se inoculan los alergenos conocidos y se observan las reacciones que se producen en la piel. Hay que tener cuidado con estas pruebas porque se pueden producir algunas reacciones no deseadas, por eso primero se hace una tcnica de PRICK que consiste en cubrir la piel con una solucin de alergeno, y luego se pincha la piel. Si no hay reaccin se administra la inyeccin ms grande.

RACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO II Estas reacciones estn medidas por Ac que pueden ser del tipo IgG o IgM. En estas reacciones el Ag est unido a una clula. El mecanismo por el cual se van a producir estas reacciones puede ser por activacin del complemento o por un mecanismo de citotoxicidad dependiente de Ac, como lo pueden efectuar las clulas NK; y tambin puede ser a travs de la fagocitosis mediada por los receptores para el fragmento Fc de la IgG, el FcR. Este tipo de reacciones la pueden producir algunos tipos de frmacos que se unen a las clulas y las alteran, como por ejemplo la penicilina, la metildopa y la quinidina. La metildopa es para la presin sangunea y la quinidina es para la arritmia. Algunos ejemplos son la anemia hemoltica que se puede producir por la incompatibilidad ABO y la eritroblastosis fetal. ANEMIA HEMOLTICA En la incompatibilidad ABO, tambien puede producirse en el rechazo de ingertos. Los individuos con GR A tienen en la membrana el Ag A y el Ac anti-B, los que tienen GR B tienen en su membrana el Ag B y el Ac anti A, los del grupo O tienen ambos Ac y los del grupo AB no tienen ningn Ac. Las isoaglutininas anti-A y anti-B son del tipo IgM y son los llamados Ac naturales. Parece que se originan por ciertos componentes que tienen en su membrana las bacterias comensales, que reaccionan en forma cruzada con los Ag de membrana. Si un individuo del grupo A recibe sangre que es del grupo B, las aglutininas del individuo van a destruir los GR B, y el mecanismo por el cual los destruye es por activacin del sistema complemento.

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ERITROBLASTOSIS FETAL Se produce por incompatibilidad Rh. Se llama eritroblastosis porque para compenzar la destruccin hay un aumento en la produccin de los GR, y aparecen muchas formas inmaduras. El grupo Rh se asocia a los Ag de membrana D. Los Ac anti-Rh no son naturales, se obtienen por sensibilizacin durante el embarazo, o por alguna transfusin incorrecta. Una madre Rh(-) no tiene Ag D ni Ac anti-D. Si tiene un hijo Rh(+), el cual s tiene Ag D, en el momento del parto, cuando se ponen en contacto la sangre fetal con la sangre materna, se puede producir la sensibilizacin de la madre. Esto quiere decir que esta mujer va a empezar a fabricar Ac anti-D. En un embarazo posterior, esos Ac anti-D pueden pasar al feto a travs de la placenta, ocacionando la anemia hemoltica en el beb. Algunos autores dicen que el mecanismo de destruccin de los GR del beb es a travs de la fagocitosis: se forman complejos Ag-Ac, que luego son captados por los macrfagos y de esa manera son destruidos. En este caso no se activa el complemento porque estos Ac son incompletos, o porque no hay una densidad adecuada de Ag D en la membrana del GR. Las mujeres Rh(-) que tuvieron un hijo Rh(+) tienen que recibir un tratamiento para evitar la produccin de estos Ac. Se les administra una vacuna llamada ROGHAM que consiste en inyectar Ac anti-D. El mecanismo por el cual actan estos Ac no est muy claro. Algunos proponen que estos Ac estn inactivando los LB vrgenes que sean capaces de reconocer al Ag D. PENICILINA La penicilina tiene la particularidad de poder unirse a ciertas protenas del hospedador y son capaces de poder unirse al GR. Si al mismo tiempo se liga la fraccin C3d del complemento, porque como el individuo estuvo infectado se activ todo el sistema complemento generando las distintas fracciones, estos eritrocitos pueden ser fagocitados por los macrfagos y los macrfagos pueden presentar en su membrana pptidos de todo el gran complejo que fagocitaron. Pueden as activar a los LT, que van a activar a su vez a los LB que reconozcan a la penicilina. Se van a generar as Ac anti-penicilina. Estos Ac van a poder actuar sobre los GR que haban sido modificados por la penicilina y los van a poder destruir por activacin del sistema complemento.

REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO III Estas reacciones estn mediadas por complejos inmunes Ag-Ac. Los Ac pueden ser del tipo IgG y tambin IgM, y el Ag debe ser soluble. Siempre que ingrese un Ag soluble que genera Ac, se formaran complejos Ag-Ac. Es un fenmeno normal que ocurre en todas las respuestas inmunes. En los primeros estados de la respuesta, es decir, cuando recin entra el Ag, se va a tener mucha cantidad de Ag y poco Ac. Los complejos inmunes Ag-Ac no tienen la conformacin suficiente como para fijar el complemento, por lo tanto no pueden ser eliminados. Cuando se est en la fase intermedia de la respuesta inmune, hay cantidades comparables de Ag y Ac, y los complejos inmunes que se forman pueden fijar complemento y as ser eliminados. En la fase final de la respuesta inmune, cuando hay ms Ac que Ag, los complejos que se forman tambin pueden fijar complemento y ser eliminados.

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Entonces, los complejos inmunes de los primeros estados pueden llegar a depositarse en algunos rganos, por ejemplo, en el glomrulo renal, en las articulaciones, y una vez que se depositan s pueden fijar el complemento, lo activan y se produce la liberacin de C3a y C5a, que estimulan respuestas inflamatorias. Dentro de estas reacciones mediadas por inmunocomplejos, hay algunas de tipo local, que se conocen como FENMENO DE ARTHUS. En un individuo que gener Ac IgG contra un Ag soluble, le inoculamos por va intradrmica o subcutnea el Ag. Estos Ac tipo IgG que se haban producido van a fijarse al Ag, y los complejos inmunes formados van a activar a mastocitos que tienen el FcR, se va a producir la liberacin de los mediadores qumicos y se va a producir una reaccin de tipo inflamatoria. Se va a caracterizar en la piel por enrojecimiento y formacin de edema. En este caso no se activa el complemento, pero se est produciendo un fenmeno inflamatorio. La activacin del mastocito no es por el entrecruzamiento de receptores, es el complejo inmune el que lo activa. Hay otra reaccin tipo III que es sistmica y se la llama ENFERMEDAD DEL SUERO. Hacia fines del siglo XIX, en algunas enfermedades infecciosas, como la escarlatina o el ttanos, se trataba a los individuos con una inyeccin de suero de caballo que haba sido inmunizado con toxina de estas bacterias. As se introduca una gran cantidad de protenas en el individuo, por lo que al cabo de 7 a 10 das experimentaba una reaccin de hipersensibilidad: fiebre, escalofros, artritis, trastornos renales; esto se deba a la formacin de inmunocomplejos. Entonces, en este caso se produce por la introduccin de una gran cantidad de Ag soluble proteico en un individuo (Ac antitoxina de caballo). Esta es una enfermedad que se autolimita, ya que los Ac van a ser finalmente eliminados por activacin del complemento y de respuestas secretoras mediadas por clulas fagocticas y mastocitos. Aparece entre los 7 y 10 das porque es el tiempo que se necesita para que se formen Ac contra estas protenas (Ac anti-antitoxina de caballo). Despus los complejos se van eliminando. En la actualidad prcticamente no se usan estos sueros. Se pueden dar en el caso de los sueros antiofdicos, que aun se preparan en animales, y en el caso de los transplantes, a veces para disminuir la respuesta inmune se les da a los individuos sueros antilinfocticos que fueron preparados en ovejas. La penicilina tambin puede causar este tipo de patologa.

REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV: HIPERSENSIBILIDAD RETARDADA Son reacciones mediadas por clulas. Las clulas que van a participar son los LTh y los LTc. Una de estas puede ser la reaccin de tuberculina, y otras las reacciones de hipersensibilidad de contacto, como la dermatitis por contacto. En este caso se necesitan entre 100 y 1000 veces ms Ag que para las otras reacciones de hipersensibilidad. REACCIN DE TUBERCULINA La reaccin consiste en introducir intradrmicamente un Ag que va a estar constitudo por protena y otros componentes del Micobacterium tuberculosis. Los Ag van a ser procesados por los macrfagos y van a impactar a LTh1 que ya haban sido previamente sensibilizados; son LT efectores. Los linfocitos van a liberar citoquinas inflamatorias, estas citoquinas van a alterar la permeabilidad capilar, van a llegar al sitio PMN y se va a producir al cabo de unas 72 hs la tpica reaccin de eritema, enrojecimiento y edema.

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Esta prueba se usa en pases desarrollados antes de vacunar contra la tuberculosis. En Argentina se vacuna directamente con BCG. Esta prueba nos dice si el individuo estuvo en contacto con el M. tuberculosis, por lo cual ya gener la suficiente cantidad de clulas de memoria como para poder defenderse. Entonces en este caso el Ag que participa es un Ag soluble. Los LTh1 pueden liberar: quemoquinas, para ayudar a la llegada de las otras clulas inflamatorias; el IFN-, que activa a los macrfagos y aumenta la fagocitosis; el TNF- y el TNF-, que producen lesiones titulares y favorecen la produccin de molculas de adhesin; y pueden producir citoquinas que van a actuar sobre mdula sea estimulando la producin tisular. DERMATITIS POR CONTACTO: La pueden provocar Ag solubles o Ag unidos a clulas. Un ejemplo tpico es la reaccin de un componente del veneno de la hiedra venenosa, que es un hapteno: pentadecacatecol. Puede unirse a protenas extracelulares pero como tambin tiene caractersticas lipdicas puede penetrar dentro de las clulas y unirse a protenas propias de esta. Entonces puede ser presentado en el contexto de la MHC-II y tambin MHC-I. En este caso la accin va a estar mediada por LTh1 cuando se une a protenas extracelulares, o por LTc, cuando son intracelulares, respectivamente. El primer contacto de un individuo con este hapteno no ocasiona grandes problemas. Aparecen reacciones imperceptibles. Pero el individuo se sensibiliza de tal manera que ante la segunda entrada se producen lesiones muy importantes en la piel, con un exudado caracterstico. Cada vez que se ponga en contacto este individuo con el Ag la reaccin ser ms fuerte y ms importante. Entonces, una clula de Langerhans puede captar una molcula extraa y se la puede presentar a los linfocitos que ya haban sido previamente sensibilizados. Estos linfocitos secretan INF-, se activan los queratinocitos y esto es perjudicial para el organismo: se altera la permeabilidad capilar por las citoquinas producidas por los queratinocitos y se favorece la llegada de ms clulas que incrementan la inflamacin.

REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO V: Estas reacciones estn mediadas por Ac contra receptores hormonales. Lo que hacen es ejercer un efecto estimulatorio. Algunos colocan a la enfermedad de Graves en este contexto.

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INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS

Son enfermedades poco frecuentes que afectan distintos componentes del sistema inmune. Pueden afectar al sistema B, que sera todo el sistema humoral, el sistema T o celular, el sistema de los fagocitos y el sistema del complemento. La incidencia es muy baja y la distribucin es: 65% deficiencias humorales, 5% a la inmunidad celular, un 10% para las clulas fagocticas y 5% para el complemento. Son enfermedades hereditarias que dan manifestaciones clnicas ya en la infancia temprana. Las infecciones son las manifestaciones clnicas ms frecuentes, es decir, estas personas tendrn una mayor susceptibilidad a los procesos infecciosos. Muchas de estas patologas son ligadas al cromosoma X, por lo que los ms afectados van a ser los varones. Entre los procesos infecciosos que se ven en estas personas pueden estar: otitis a repeticin, sinusitis que puede llegar a tener complicaciones pulmonares, neumonas, deficiencias respiratorias. Hay infecciones en la piel, en el tejido gastrointestinal, etc. Las clasificamos de acuerdo a cuales son las alteraciones que se presentan en cada una de ellas. Estos trastornos que estudiaremos son inmunodeficiencias primarias. Las inmunodeficiencias secundarias pueden deberse a trastornos metablicos, degradacin, etc. Se hace una clasificacin de la deficiencia de la respuesta inmune adaptativa o de la respuesta inmune innata.

DEFICIENCIAS DE LA RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA En la respuesta inmune adaptativa estn las inmunodeficiencias que tengan que ver con los Ac, y est comprometido el linaje B. Las inmunodeficiencias combinadas tienen deficiencia humoral y celular. En la parte celular estn comprometidos los LT, y por lo tanto tambin puede haber deficiencia de Ac debido a la colaboracin T-B. Con las tcnicas de biologa molecular se han podido detectar las alteraciones cromosmicas. Se hacen estudios prenatales para saber si hay alguna anormalidad en los cromosomas. Se hacen en los primeros meses con muestras de las vellosidades corinicas y cuando est aproximadamente en la semana 20 de gestacin, ya se puede hacer con sangre del cordn. Esto brinda un diagnstico prenatal. Esto es bueno para determinar el estado de portador, se pueden detectar mutaciones a nivel del cromosoma X que corresponderan a mujeres portadoras. Los varones portadores corresponderan a aquellos cuyas mutaciones estn en cromosomas somticos. Esta informacin permite tomar algn recaudo, sobre todo en los progenitores de personas que tienen inmunodeficiencias. Entre las inmunodeficiencias que tienen que ver con los Ac est la AGAMAGLOBULINEMIA LIGADA AL SEXO, que tambin se llama Enfermedad de Bruton. En esta hay une mutacin en un gen llamado tirosinquinasa de Bruton. Tiene que ver con la diferenciacin de las clulas pre-B, es decir, hay un freno en la maduracin de las clulas B, en el paso de pre-B a LB maduro. No hay seales para que el LB madure y queda en el estado pre-B. A nivel de la mdula sea no va a haber desarrollo de folculos linfoides, ni centros germinativos, y por supuesto va a haber

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deficiencias en todas las Igs; de ah el nombre agamaglobulinemia. El patrn de herencia es ligado al sexo y se advierte entre los 6 y 12 meses de vida: los recin nacidos tienen la proteccin de las IgG maternas, cerca de los 6 meses esas IgG fueron metabolizadas y comienza a manifestarse la inmunodeficiencia propia del beb. Van a predominar infecciones debido a grmenes como los pygenes, y todos aquellos patgenos que deben ser eliminados por Ac. Es necesario hacer un diagnstico precoz para instaurar un tratamiento preventivo rpido. El tratamiento es mediante dosis de -globulinas intravenosa, y es de por vida. Entonces, est disminuda toda la respuesta Ac-dependiente. Hay una forma de agamaglobulinemia que es autosmica recesiva, que puede presentar un defecto en la cadena o en la cadena . Queda frenado el pasaje a pre-B, queda en el estado pro-B. El fenotipo es el mismo que el anterior; estn disminudas las globulinas. Puede existir tambin dficit de algunas de las Ig. Seran trastornos en la diferenciacin final del LB. Puede haber dficit de IgA y dficit de algunas de las subclases de IgG. En el caso de la IgA es una de las ms frecuentes, y la parte ms comprometida es la parte pulmonar y la parte intestinal. En este caso hay niveles normales de IgM e IgG. Tambin se han visto dficit en algunas subclases de IgG. La IgG1 es la ms abundante, por lo que un nivel bajo de IgG1 afecta mucho el nivel de IgG total. Est tambin la inmunodeficiencia con exceso de IgM. En este caso el problema se da en el cambio de isotipo. Para que se produzca el switch debe haber una cooperacin TB. El CD40L del LT debe interactuar con el CD40 del LB, pero en este caso hay un defecto con el CD40L. No existen entonces colaboracin T-B y entonces no hay cambio de isotipo. Estn anuladas entonces las respuestas a Ag-T dependientes y el tratamiento es con globulinas endovenosas. La activacin de los macrfagos por la clulas T tambin depende de la interaccin CD40-CD40L, entonces la activacin de los macrfagos tambin va a estar alterada, por lo tanto va a haber deterioro en la respuesta inflamatoria, en la movilizacin de leucocitos, va a haber neutropenia. La forma de revertir esta neutropenia es suministrar factor estimulante de colonias de granulocitos y macrfagos por va endovenosa. Estos factores son los que produce normalmente el macrfago activado. La HIPOGAMAGLOBULINEMIA TRANSITORIA DE LA INFANCIA se debe a que, en un principio el lactante va a estar cubierto por la IgG que pasa a travs de la placenta. Esa IgG va a ir decayendo, y a partir de los tres meses comienza la sntesis propia de Ig, primero la IgM, luego la IgG, luego la IgA. Puede ocurrir que haya un retraso en la produccin de IgG propia hasta 36 meses. Se piensa que las clulas LB no reciben la ayuda necesaria de las LT para producir los Ac. Sera como una inmadurez en la colaboracin T; las LB van a ser normales. Esta patologa revierte. Las INMUNODEFICIENCIAS COMBINADAS poseen alteraciones tanto a nivel de la inmunidad humoral como de la inmunidad celular. Ac los defectos son a nivel de los LT. Las clulas B van a ser normales, pero como su normal funcionamiento depende de la colaboracin T, se ve afectada la respuesta celular y humoral. Estas son patologas ms severas, y la nica forma de revertirla es con un transplante de mdula sea. Una forma de poder clasificarla es de acuerdo al fenotipo que se presenta: estn las Inmunodeficiencias Combinadas Severas T(-) B(+) y las Inmunodeficiencias Combinadas Severas T(-) B(-).

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La respuesta inmune adaptativa est totalmente ausente, son las ms graves y si no hay transplante de mdula sea el paciente muere. En el primer caso de inmunodeficiencia combinada severa T(-) B(+), se describen dos entidades con alteraciones moleculares especficas, si bien desde el punto de vista clnico e inmunolgico van a se iguales. Una es ligada al cromosoma X, y la deficiencia es la cadena comn a un grupo de receptores de Ig. Otra es la autonmica recesiva, cuya alteracin es a nivel de JAK3. En las inmunodeficiencias ligadas al cromosoma X el efecto es en la comn que est presente en los receptores de todas las interleuquinas: IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL15R, IL-21R. La IL-2 tiene que ver con la homeostasis de los linfocitos, tambin hay afeccin de las clulas NK, ya que est afectado el IL-15R. Todo esto va a afectar el normal desarrollo de las LT y las clulas NK. La cadena se asocia a la JAK3 que es una proteinquinasa que se necesita para transmitir seales de activacin hacia el interior de las clulas. Si bien los LB no se ven disminudos, funcionalmente van a ser anormales porque no se va a ver un cambio en el isotipo de las Ig porque se necesita la colaboracin T. Estos pacientes que tienen inmunodeficiencia combinada severa tendrn ausencia de LT, clulas NK, presencia de LB con una respuesta proliferativa deficiente. La inmunodeficiencia combinada severa T(-) B(-) puede deberse a la deficiencia en RAG1 y RAG2. Esto se debe a que no hay una actividad endonucleasa en la formacin del receptor BCR y TCR, es decir, la recombinacin VDJ necesaria para crear estos receptores especficos est alterada. Tambin hay deficiencias en la enzima adenosindesaminasa o la purn nucleosido fosforilasa. Estas enzimas intervienen en el metabolismo de las purinas. Si hay deficiencia de la adenosindeaminasa o de la purn nucleosido fosforilasa va a haber acumulacin de ATP y GTP, que inhiben una ribonucletido reductasa y eso inhibe la sntesis de ADN y por lo tanto la replicacin celular. Tambin puede haber una deficiencia en la ZAP 70, que tiene que ver con la delecin + y en la maduracin tmica sobre todo aquellos timocitos que van a ser CD8+. Entonces va a haber una ausencia de LTCD8+. Tambin est la deficiencia en la expresin de MHC tipo II y tipo I. Si hay deficiencia en las molculas tipo II va a estar afectada la poblacin LThCD4+. Esto acarrea dficit de Ac. El defecto molecular no se encuentra en los genes que codifican a estas molculas, sino en los genes que codifican para las protenas promotoras, que regulan la transcripcin de esos genes. No hay respuesta proliferativa a aquellos Ag que necesitan ser procesados y presentados por MHC-II. Tambin puede existir deficiencia de TAP1 y TAP2, que seran defectos en los genes que codifican al transportador de pptidos Fas. Esto impide la captacin de pptidos por parte de los MHC-I. Va a haber menos concentracin de stas molculas en la superficie de las clulas. Va a estar afectada la parte citotxica. Puede haber una deficiencia en la cadena del IL-7R, entonces va a haber tambin una deficiencia de tipo T(-) B(+). Puede haber deficiencias en el CD3, entonces el complejo CD3-TCR va a estar defectuoso. Se han descrito otros sndromes con deficiencias bien definidas. En el sndrome de Di George hay defectos en la embriognesis del timo, es decir, que directamente no hay timo. Durante la embriognesis, el timo surge a partir de los arcos farngeos IV y V.

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Cuando hay defectos tambin en el arco VI puede haber cardiopatas. A nivel del I y II hay defectos faciales. En estas personas sin timo no hay respuesta adaptativa.

DEFICIENCIAS EN LA RESPUESTA INMUNE INNATA Hay deficiencias del complemento y deficiencias en los fagocitos. Se han descrito deficiencias para todos los componentes del complemento, y se pueden agrupar de acuerdo a cual est afectado. Si hay deficiencias en la activacin de C3 hay mayor susceptibilidad a aquellas infecciones donde se necesita el C3 como opsonina para promover la fagocitosis. Esto tambin se da cuando hay deficiencias en el factor I y el factor M. Cuando hay deficiencias en los componentes del complejo de ataque a las membranas, hay mayor susceptibilidad a infecciones por Neisseria, porque la forma de defensa contra esta bacteria es la lisis por complemento. Cuando hay deficiencia en los primeros dos componentes hay acumulacin de inmunocomplejos. Cuando hay deficiencia del inhibidor de C1 hay una activacin descontrolada de la va clsica, hay una entidad que se llama angioedema hereditario. Esto se debe a que hay una produccin excesiva de un fragmento que es vasoactivo, entonces produce edema por acumulacin de lquido, y si se produce en la epiglotis es edema lleva a la muerte. Puede haber deficiencias cuantitativas, o sea, en el nmero o funcin de fagocitos. Cuantitativas se refiere a los casos de neutropenia. Las primarias son excepcionales y se pueden deber a una deficiencia de produccin en la mdula sea. La neutropenia secundaria puede ser a causa de una infeccin en la mdula sea, que produce un freno y lleva a una neutropenia, o alguna enfermedad glucoproliferativa que disminuye la cantidad de fagocitos. Cuando son funcionales las alteraciones pueden estar en la movilidad o en la adherencia de los fagocitos, o bien a la capacidad de los fagocitos de poder ingerir los microorganismos. Puede haber deficiencia en la adhesin leucocitaria. Hay una alteracin en el gen que codifica para el CD18, es decir, las integrinas leucocitarias. Estas molculas son necesarias para que el fagocito abandone el torrente circulatorio y vaya a los tejidos. Est afectada la adherencia a las clulas fagocticas. Algunas de las integrinas son CR3, CR4, LFA1 (antgeno funcional leucocitario). En cuanto a la funcionalidad pueden ser defectos en la capacidad de poder destruir a los microorganismo. Una enfermedad tpica es la Enfermedad Granulomatosa Crnica, tambin puede haber deficiencias en la peroxidasa, o en grnulos secundarios, en la glucosa-6-fosfatasa, deshidrogenasas, que tienen que ver con la formacin de componentes que tienen actividad microbicida. La NADPH oxidasa es un complejo enzimtico formado por cuatro subunidades, dos de ellas son componente de la membana y dos son componentes citoslicos. Los componentes de membrana son la gp91 y la p22. Los componentes citoslicos estn formados por la p40-47 y la 67. Cuando se produce la fagocitosis esta provoca la translocacin de las subunidades citoslicas hacia la membrana. Se forma el complejo que es la NADPH oxidasa, que produce la transferencia de un e- a la molcula de O2 formando el anin superxido O2- que es inestable y puede transformarse por la superxido dismutasa (SOD) a H2O2, que por la mieloperoxidasa (MPO) puede

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transformarse en HClO. Son sustancias oxidantes que van a ayudar a destrur al microorganismo. En el caso de la enfermedad granulomatosa el defecto est en el gen que codifica para la cadena gp91. La unin de la cadena gp91 con la p22 forma el citocromo B558. Este defecto est en el cromosoma X. Las formas recesivas tienen los defectos en las otras cadenas. Los microorganismos en el interior de la clula no van a ser destrudos y van a dar lugar a la formacin de los granulomas. Est tambin el Defecto Microbactericida de los Leucocitos, donde hay deficiencias a nivel del receptor para el INF- y para la IL-12. Entonces se han descrito que micobacterias que generalmente son no patgenas pueden llevar a una infeccin sistmica. Un estudio clsico para poner en evidencia si est afectada la parte del estallido respiratorio es el estudio de la reduccin de un colorante que se llama nitoazul de tetrazolio. Este colorante es transparente y amarillo, y va a ser fagocitado junto con las partculas. Se va a reducir como consecuencia de la oxidacin del NADPH y va a dar lugar a un precipitado de color violeta oscuro. Esto en los pacientes con la enfermedad granulomatosa crnica no ocurre.

TRATAMIENTOS Son todos tratamientos sustitutivos: -globulinas en aquellas que son deficiencias predominantemente de Ac, transplante de mdula sea para aquellas combinadas y algunas tambin en el caso de deficiencias severas en los fagocitos. En el caso de las Igs, existen preparados para va intramuscular como endovenosa pero los ms usados son por va endovenosa. Los preparados contienen predominantemente IgG1 e IgG2. En el caso de transplantes de mdula sea se debe disponer de un donante compatible. En cuanto a la terapia enzimtica, para los casos de deficiencias de adenosindeaminasa, est en va de desarrollo. Se est buscando en el ambito de la terapia gnica. Los laboratorios se agrupan en niveles de acuerdo al grado de complejidad. NIVEL I son los menos complejos, NIVEL II son ya de alta complejidad.

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INMUNODEFICIENCIAS SECUNDARIAS

Las inmunodeficiencias primarias se deben a alguna causa gentica, por la alteracin a nivel de algn componente del sistema inmune, ya sea alguna molcula que no se expresa, alguna enzima, etc. De acuerdo a cual sea la deficiencia va a estar afectada una u otra rama de la respuesta inmune. En las inmunodeficiencias secundarias veremos el Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, y es secundaria porque se produce como consecuencia de otra causa. El hecho que provoca el SIDA es la infeccin por un virus llamado virus del HIV (Human Inmunodeficiency Virus). EL VIRUS DEL SIDA: HIV El SIDA se descubri por primera vez en el ao 1980 y se caracteriza porque hay una marcada disminucin en el nmero de LTCD4+. Esto conduce a que el individuo tenga una mayor susceptibilidad a infectarse con microorganismos que normalmente no producen enfermedad, tienen tendencia a sufrir formas muy graves del Sarcoma de Kaposi, y tambin tienen una mayor predisposicin a padecer linfomas de clulas B. ESTRUCTURA DEL HIV El agente que produce esta enfermedad es el HIV. Es un retrovirus, posee ARN como material gentico. El genoma del HIV est formado por dos molculas de ARN. Posee una cpside que va a encerrar al ARN y a la transcriptasa reversa, que es la enzima necesaria para pasar el ARN a ADNc, tiene una envoltura lipdica que proviene de la envoltura del hospedador, y tiene protenas de envoltura que son propias del virus: una es la gp120 y otra la gp41. Existen dos clases de HIV: el HIV-1 y el HIV-2. EL HIV-1 fue el primero que se descubri, en el ao 1983, y fue descubierto casi simultneamente por dos investigadores, GAGE y MONTANGIE. En el ao 1986 se descubri el HIV-2 en frica. La diferencia est en la protena gp41, que en el HIV-2 est reemplazada por la gp36. Adems el HIV-2 es menos virulento y la enfermedad progresa ms lentamente. GENOMA DEL HIV Tiene dos secuencias que se denominan LTR: Long Terminal Repeat. Estas secuencias sirven para poder insertarse en el genoma de la clula. Despus hay genes que codifican para las protenas de la envoltura, los env, que codifican para la gp120 y la gp41. Hay otros genes que codifican para la polimerasa, los pol, y codifican para la transcriptasa reversa. Despus estn los genes reguladores, como los nef, que es un regulatodor negativo que hace que se exprese menos MHC en las clulas infectadas y tambin reduce la replicacin viral, y el otro gen regulador es el tat, que es un regulador positivo de la transcripcin. Si bien hay pocos genes, alcanzan para que el individuo sintetice todas las protenas y enzimas que necesita. Esto es, porque se puede leer en tres marcos de lectura diferentes. TRANSCRIPTASA REVERSA DEL HIV No tiene capacidad de corregir los errores. Esta es una herramienta que el virus utiliza para poder evadir la respuesta inmune. Esto es, porque al irse modificando la cadena que se est expresando puede hacer que el sistema inmune no lo reconozca.

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CLULAS QUE PUEDE INFECTAR EL HIV El HIV va a infectar a clulas que tengan en su membrana el marcador CD4: los LTCD4+, los macrfagos y las clulas dendrticas. La simple presencia del CD4 no es condicin para que el HIV pueda infectar, necesita de co-receptores. Estos son el CCR5, el CXCR4, y recientemente se ha descrito uno ms que es el DC-SING de las clulas dendrticas. El CCR5 y el CXCR4 son receptores de quemoquinas, son receptores normales utilizados por el sistema inmune para montar una respuesta adecuada. es necesario la presencia de la molcula CD4 y de dos tipos de receptores: CCR5 y CXCR4. Se ha visto in vitro que los HIV pueden interactuar con distintos receptores, y de acuerdo a cual de esos dos receptores est involucrado, el HIV puede clasificarse en MACROFAGOTRPICO, que tiene predileccin por el CCR5 de los macrfagos, y el otro HIV se denomina LINFOTRPICO, que tiene predileccin por los CXCR4 de los LTh. Se cree que in vivo tambin existen estos dos tipos de HIV, los macrofagotrpicos predominan en las etapas tempranas de la infeccin, y los linfotrpicos actan en las etapas tardas, cuando se disminuye ms el nmero de LT. Como se ve el HIV afecta tanto lo innato como lo adaptativo. El HIV tiene una caracterstica particular que cuando afecta a los macrfagos, no los destruye. El efecto del HIV sobre el macrfago no es citoptico. El macrfago infectado acta como reservorio viral. Los LT que pueden ser infectados pueden ser LT vrgenes o LT activados. En el caso de que el HIV infecte un LT0, no se integra inmediatamente en el genoma. A partir del ARN se produce ADNc y queda latente, pudiendo ser degradado por la maquinaria celular. Sin embargo, si ese LTh0 se activa antes de que el ADNc sea degradado, se va a insertar en el genoma y el virus se va a empezar a replicar. Estos LTh0 tambin estarn constituyendo reservorios virales. INFECCIN Primero se produce la interaccin gp120-CD4. Adems hay interaccin con los coreceptores. Esto produce cambios conformacionales y la protena gp41 es la encargada de la fusin con la membrana de la clula husped. Despus de la fusin se produce la entrada de todo el genoma viral, se produce la accin de la transcriptasa reversa para pasar el ARN a ADN. El ADNc se integra al genoma, y cuando la clula lo activa y empieza a proliferar, comienza a actuar el factor de transcripcin NFK. Al replicarse la clula se replica el genoma viral, y se forman nuevos virus que van a emerger de la clula infectada. La clula infectada va a poder expresar en su membrana glicoprotenas del virus. VAS DE DISEMINACIN Se pueden encontrar virus que estn en lquidos corporales: semen, lquido cefaloraquideo y sangre, y virus que estn dentro de las clulas: linfocitos y macrfagos. Las vas de diseminacin ms comunes son: a travs de las relaciones sexuales, la administracin intravenosa de drogas con agujas contaminadas, la lactancia materna, ya que la mayora de los casos peditricos se producen por transmisin vertical, que es de

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la madre infectada al beb y se puede producir durante el embarazo, en el momento del parto (20 a 50 % de los casos) o durante la lactancia. Las transfusiones con derivados de sangre contaminada ya prcticamente no existira. PROGRESIN DE LA INFECCIN Cuando se produce la entrada del virus en el organismo, se va a producir un incremento en la replicacin viral. El individuo tendr un conteo de LT normales. En ese perodo de la infeccin la sintomatologa puede ser una simple gripe o que el individuo est asintomtico. Alrededor de al menos un mes se empiezan a producir los Ac contra los distintos componentes virales. En ese momento est actuando la respuesta inmune para tratar de controlar la infeccin. Se van a producir Ac contra componentes virales y ese momento en que aparecen los Ac se denomina Seroconversin. La seroconversin se refiere entonces a la aparicin de Ac anti-HIV en sangre. Luego hay un perodo de latencia que es asintomtico que puede durar de 2 a 10 aos, en los cuales el individuo no experimenta ninguna sintomatologa. Este es un momento donde hay una gran lucha entre el sistema inmune y el HIV. El nmero de LTCD4+ haba cado bastante cuando el virus se estaba replicando, luego sube un poco, aunque no alcanza los valores normales, pero se mantiene. Por ltimo, empieza a descender. Cuando el nmero de LTCD4+ es menor a 500/L el individuo comienza a padecer cierta sintomatologa como ciertas infecciones oportunistas. Dependiendo de cuales sean los componentes ms afectados va a predominar un tipo de germen u otro. Cuando el nmero de LTCD4+ llega a ser menor de 200/L se comienza a hablar de SIDA. El progreso dentro de la enfermedad puede deberse a todos los reservorios de clulas que pueden presentar el virus en forma latente sin que se est replicando. Existen individuos llamados no progresores, es decir, que estn infectados pero que no van a desarrollar la enfermedad, y se ha visto que en estos individuos hay una marcada respuesta de los LTCD8+. Los LTCD8+ son muy importantes para controlar las infecciones virales. Tambin hay otro grupo de individuos que si bien estn expuestos no desarrollan la enfermedad, y que tienen mutaciones en los genes que codifican para los co-receptores. Como se vio, en las primeras semanas se tiene una gran replicacin viral, a medida que empieza a actuar la respuesta inmune, la viremia va disminuyendo. En la etapa asintomtica o de latencia la curva se mantiene baja, y al final aumenta cuando se instaura el SIDA. Como se genera una respuesta inmune contra ese agente, se va a tener produccin de Ac contra protenas de envoltura y contra una protena del core que es la p24. Esta protena p24 es muy importante para el diagnstico. Tambin est la accin de los LTc que es muy importante al principio de la infeccin, luego disminuye lentamente pero se mantiene para decaer hacia la fase final. Esos Ac que se producen durante la infeccin no son del todo beneficiosos para el organismo. Los primeros que se producen no tienen capacidad de neutralizacin. Parecera ser que se generan contra epitopes de la gp120 que se encuentran hacia el interior del virus, es decir, epitopes ocultos. Adems estos Ac contribuyen a que la enfermedad se disemine. Si por ejemplo, se tiene un Ac contra la gp120, que se uni a un virus, aparece un macrfago que tiene un receptor para el Fc de ese Ac, y si ese macrfago no est infectado se puede infectar con esa unin.

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Tambin, la gp120 es fcilmente liberada de la membrana viral, por lo que va a haber mucha gp120 suelta en el plasma. Los Ac pueden unirse a esa gp120 suelta y no estar disponibles para unirse a la gp120 en el virin. Lo fundamental en la respuesta inmune contra el HIV son los LTCD8+ que van a eliminar a las clulas infectadas. INMUNOSUPRESIN PRODUCIDA POR EL HIV Altera la funcin de los macrfagos, incrementando la quimiotaxis cuando las protenas virales estn actuando, o los inhiben. Puede incrementar la produccin de las citoquinas inflamatorias, fenmeno muy importante en la demencia por HIV. Las clulas del SNC ms afectadas por el HIV son la microglia, que son macrfagos del SN que controlan las infecciones que llegan a este tejido. La presencia de HIV activa continuamente a la microglia y producen estas citoquinas. La presencia del virus inhibe la fagocitosis y por lo tanto tambin la presentacin antignica. Se inhibe la fusin fagosoma-lisosoma. Se inhiben todos los mecanismos internos que son necesarios para destruir el agente agresor una vez que es fagocitado. Tambin disminuye la produccin del receptor para Fc de las Igs. Los neutrfilos tambin son afectados. Si bien no tienen la molcula CD4 en su membrana tienen el CXCR4 en abundancia. Entonces, por interaccin directa entre el HIV y la membrana del neutrfilo lo pueden llegar a lesionar o destruir. Tambin en los neutrfilos est aumentada la apoptosis por la presencia de las molculas Fas. En cuanto a las alteraciones a nivel de los LT pueden ser fallas en las citoquinas que produzcan estos linfocitos, o disminucin en el nmero. Por ejemplo, si hay disminucin en la produccin de IL-2 va a estar afectada tambin la accin de los LB, y tambin la de los LTCD8+. En las alteraciones cuantitativas a nivel de los LT, hay una disminucin en el nmero que pude deberse a una accin citotxica directa del virus, por formacin de sincitios, que son clulas multinucleadas gigantes, y son producidas por las cepas linfotrpicas. Se produce una interaccin entre el CD4 de una clula no infectada y la glicoprotena gp120 que est expresando una molcula infectada. Tambin se pueden infectar las clulas del timo. Se ha visto que la involucin del timo se ve alterada en los individuos que son HIV +. Tambin se favorece la apoptosis de los LT, y a su vez los LT pueden actuar como reservorios virales, en el caso de los LT vrgenes y de memoria. A nivel de los LB se produce una activacin policlonal. Se va a generar una gran cantidad de Ac que no son especficos para el virus, y pueden producir fenmenos de autoinmunidad. El nmero de las clulas NK es normal, pero no son funcionales. Esto estara relacionado con las citoquinas: no hay citoquinas adecuadas para su activacin. Entre los mecanismos de escape a la respuesta inmune est la variacin antignica, que est producida por la incapacidad que tiene la transcriptasa reversa para poder corregir la insercin de nucletidos errneos. Regula la expresin de las MHC, disminuyndola, por lo cual hay menos presentacin antignica. Adems, el HIV se ubica en sitios inmunolgicamente privilegiados: ojos, SNC o testculos, que son lugares de difcil acceso para los Ac.

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TRATAMIENTO Se podra atacar a nivel de cuatro puntos. Un punto sera evitar la fusin entre el HIV y la clula a infectar: inhibidores de la fusin. No existen muchas drogas que puedan atacar este punto, hasta ahora hay una sola que se llama Fuzeon. Se intentaron utilizar Ac que bloqueaban a la CD4, pero no produjeron efectos positivos. Otro punto sera atacar a la transcriptsa reversa: inhibidores de transcriptasa inversa anlogos o no anlogos de los nuclesidos. Se puede hacer de dos formas, inhibiendo directamente a la enzima, o mediante nuclesidos anlogos a los nuclesidos verdaderos, ese medicamento es el AZT, que es anlogo a la timina. Otra forma sera utilizar inhibidores de proteasas para evitar que se produzca el ensamblaje del virus. El problema es que el virus adquiere resistencia contra ellos. Lo ideal es hacer un tratamiento combinado. TCNICAS DE DIAGNSTICO BIOQUMICO: Se pueden buscar Ac anti-HIV o directamente al HIV. Para diagnstico se utilizan TCNICAS DE TAMIZAJE que deben ser confirmadas. Se utiliza el ELISA de amplificacin indirecto para detectar Ac, y tambin tcnicas de aglutinacin que son ms baratas, en las cuales partculas de latex se recubren con Ag virales, que pueden ser protenas recombinantes o lisados virales. Para CONFIRMAR se hace Western blot, IFI, ensayo lineal (Doble blot), o RIPA: En el Western blot se hace correr un lisado viral en un gel de poliacrilamida, se traspasa a nitrocelulosa, se lo enfrenta con el suero del paciente y se observa cuantas bandas reconoce el suero. Existen distintos criterios de positividad, en la Argentina se considera positivo un suero cuando tiene la presencia de dos bandas pertenecientes a gp120, gp160, gp24 y gp41. Si aparecen dos de estas, entonces se considera al paciente HIV positivo. Si aparecen otras bandas pero no estas se lo considera indeterminado, y se le practica de nuevo la determinacin. Para IFI se trabaja con improntas de clulas infectadas. El inmunoensayo lineal es parecido al Western blot pero no se hace la corrida electrofortica, sino directamente, en una membrana de nitrocelulosa se siembran las distintas protenas virales, despus se procede como en el Western blot, se enfrenta con el suero. La tcnica RIPA utiliza nucletidos radiactivos. Se hacen cultivos del virus con nucletidos radiactivos, se obtienen los HIV de los sobrenadantes de esos cultivos, y eso se lo enfrenta con el suero del paciente. Se forma un inmunocomplejo entre el Ac del paciente y el HIV que tiene un componente radiactivo, y despus se agrega una protena A que se une al Fc del Ac unido al HIV marcado. Despus se hace una corrida electrofortica y se aprecia la marca por autorradiografa. La deteccin del virus es importante antes de la seroconversin para poder suministrar los anti-retrovirales y de esa manera ayudar al sistema inmune que est actuando para que pueda controlar la infeccin. En este perodo los ensayos para detectar Ac van a dar negativo pero el individuo est infectado. La deteccin de Ag se puede hacer de distintas formas. Se puede detectar el Ag gp24 por ELISA cuantitativo. Se utilizan cultivos de clulas mononucleares separadas por Ficall-Hypaque de un donador sano. Se hacen co-cultivos. Se cultivan las clulas mononucleares de un paciente que tiene una determinada MHC y se las enfrenta con clulas mononucleares de un donador sano, que tiene otro alelo del HLA diferente. Se va a producir la

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proliferacin celular y se va a replicar el virus, y en el sobrenadante de esos cultivos se va a obtener el HIV. Despus se lo identifica con algn tipo de Ac. Otra forma es por tcnicas de biologa molecular, que detectan el ARN viral. Esto es muy importante en las primeras etapas de la infeccin, cuando se puede detectar el p24 y el ARN viral. En las mujeres embarazadas el HIV se puede transmitir durante el embarazo, en el parto o durante la lactancia. En una mujer con serologa positiva para el HIV y una carga viral mayor a 1000 copias de ARN, se aconseja que esa mujer no tenga parto normal, sino que se haga una cesrea. Tambin es aconsejable que no amamante. Si el beb tiene menos de 18 meses, se investiga HIV por PCR, p24 y deteccin de ARN. Si da positivo es una presunta infeccin, y se pide una segunda muestra. Si da negativo se repite despus de dos a cuatro meses, si vuelve a dar negativo entonces no est infectado. Es importante que la muestra de sangre no provenga del cordn. Si el beb es mayor a 18 meses, se busca Ac a travs de la serologa. Si es negativo el beb es HIV negativo, si es positivo se debe confirmar. MARCADORES SUBROGANTES: controladores de la enfermedad Son marcadores que sirven para controlar la enfermedad y la accin de los medicamentos. Uno es el nmero de LTCD4+, y da una idea de cmo va progresando la enfermedad. En las ltimas etapas se tiene menos de 200/L y se declara el SIDA. Se utiliza IFI, citometra de flujo, etc. Es un mtodo subjetivo, vara entre los distintos laboratorios, pero sirve para tener una idea de cmo evoluciona el deterioro en el paciente. Otro marcador importante es la carga viral, que mide la cantidad de virus que hay en la sangre. Se mide por ARN. Hay otros marcadores que no son muy utilizados.

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