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Clulas madre: diferenciacin al linaje dopaminrgico para el tratamiento del Parkinson

Carol Johanna Diaz Gutierrez 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. cadia333@gmail.com Introduccin Qu son las clulas madre? Clasificacin segn su potencial de diferenciacin Los tipos de clulas madre Cmo se descubrieron las clulas madre? Qu es la enfermedad de Parkinson? Cmo se consigue un cultivo de clulas madre? Protocolo de diferenciacin de clulas madre al linaje dopaminrgico Bibliografa

INTRODUCCIN Las clulas madre son aquellas que tienen una gran capacidad de diferenciarse hacia cualquier tipo de clula, ya sea para formar un organismo completo, un rgano o un tejido. Dentro de ellas encontramos los siguientes tipos segn su potencial de diferenciacin; pluripotentes, totipotentes y multipotentes. Adems, dependiendo del origen que tengan como el embrionario, adulto o fetal, stas pueden tener diferentes propiedades. Estas clulas madre ofrecen una esperanza en el tratamiento de diferentes enfermedades neurodegenerativas, dentro de las cuales encontramos Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la Esclerosis, entre otras. Para esto es muy importante lograr la diferenciacin en el linaje deseado en este caso el dopaminrgico, ya que en el parkinson se ven afectadas de forma marcada las neuronas que producen el mediador qumico conocido como dopamina. Para esta diferenciacin se encuentran diversos protocolos, los cuales tienen en cuenta diversos factores como FGF2, FGF-8, Shh, cido ascrbico, monofosfato de adenosina cclico o BDNF ya que se trata de simular el proceso de desarrollo natural de estas neuronas pero in Vitro. Sin embargo existe un protocolo que utiliza las PA6 para la diferenciacin de dichas clulas. QUE SON LAS CLULAS MADRE? Las clulas madre son clulas primitivas capaces de dividirse indefinidamente, y originan clulas hijas de diferentes tipos, las cuales no son solamente diferentes morfolgicamente, sino tambin en su funcin. Este proceso es lo que se conoce como diferenciacin celular o transformacin. CLASIFICACIN SEGN SU POTENCIAL DE DIFERENCIACIN TOTIPOTENTES: Del ovulo fertilizado (el zigoto), esta puede formar un organismo completo, producen tejido embrionario y extraembrionario. Durante las primeras divisiones el embrin es una esfera compacta (mrula), en la que todas las clulas son totipotentes, y de hecho esto se refleja de modo natural en los gemelos monocigticos. A los pocos das comienza una primera especializacin, de modo que se produce un blastocisto, con una capa superficial que dar origen al trofoblasto, del que deriva la placenta, y una cavidad casi hueca (rellena de fluido) en la que est la masa celular interna (m.c.i.). PLURIPOTENTES: Capaces de dar lugar a clulas de las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo)1. pueden generar casi cualquier tipo celular, pero no pueden generar un organismo completo. MULTIPOTENTES: tienen un cierto grado de diferenciacin, es decir, tienen determinados rasgos de un tejido concreto. Un ejemplo son las clulas madre hematopoyticas que estn en la mdula sea y que se transforman en todas las clulas sanguneas, tanto glbulos rojos como glbulos 2 blancos y plaquetas. UNIPOTENTES: Son aquellas que nicamente son capaces de generar un tipo celular. Por ejemplo las clulas madre epidrmicas que solo dan lugar a clulas epiteliales escamosas queratinizadas. A lo largo de todo el proceso de desarrollo de un organismo podemos extraer diferentes tipos de clulas madre que podemos cultivar in Vitro. Dependiendo de su origen, obtendremos clulas con diferentes propiedades. Como regla general se puede establecer que cuanto ms primitiva sea la fuente de clulas madre mas potencialidad en cuanto a proliferacin y diferenciacin tendrn esas clulas. Cuanto mas 1 avanzado sea su origen, obtendremos clulas con capacidades mas restringidas.

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LOS TIPOS DE CLULAS MADRE Embrionarias: Se obtienen a partir del blastocisto. En este estadio, el embrin es una masa de unas 150 clulas con forma de esfera. Algunas de estas clulas forman la cubierta de la esfera, que en su interior est llena de lquido. Dentro de la esfera se localiza la masa celular interna, un conjunto de clulas donde se localizan las clulas madre. Adultas: Tambin se llaman rgano-especficas. Se originan por la divisin de las clulas madre embrionarias. Se encuentran repartidas por gran cantidad de tejidos del organismo como cerebro, mdula sea, msculo, piel, intestino, hgado, pncreas y retina. Su principal funcin es reemplazar las clulas que mueren dentro de un rgano o tejido. Su actividad vara mucho de unos rganos a otros: las que estn en la mdula sea y forma las clulas de la sangre son muy activas y se dividen continuamente mientras que las que estn, por ejemplo, en el intestino delgado son ms inactivas. Fetales: Se obtienen a partir del cordn umbilical y tienen caractersticas similares a las adultas. CMO SE DESCUBRIERON LAS CLULAS MADRE? Los cientficos descubrieron hace ms de 20 aos el modo de obtener clulas madre de embriones de ratones. Sin embargo, la primera vez que se obtuvieron clulas madre embrionarias humanas fue en 1994. Se aislaron a partir de un blastocisto procedente de fecundacin in vitro (FIV). Blastocisto es el nombre que recibe el embrin de entre una o dos semanas antes de implantarse en el tero materno. Pero no fue hasta finales del ao 1998 cuando un grupo de investigadores de la Universidad de Wisconsin (EEUU) consigui el primer cultivo en el laboratorio de clulas madre embrionarias humanas a partir de blastocistos. Un cultivo o lnea celular es un conjunto de clulas que se dividen continuamente en el laboratorio. El poder crecer y mantener estas clulas in vitro supuso el comienzo del boom de las clulas madre. A partir de ese momento, grupos de investigacin de todo el mundo han estudiado las caractersticas moleculares de estas clulas y han desarrollado sistemas ms eficaces para cultivarlas in vitro. Adems, se han hecho avances muy importantes a la hora de dirigir estas clulas hacia un tipo celular concreto. Esto ha originado que las clulas madre hayan adquirido un gran potencial teraputico por sus aplicaciones en la 3 regeneracin de tejidos daados y restablecimiento de funciones afectadas del cuerpo. QU ES LA ENFERMEDAD DE PARKINSON? La enfermedad de Parkinson se caracteriza por una degeneracin progresiva de neuronas en el sistema nervioso central, que afecta de forma marcada a las neuronas que producen el mediador qumico dopamina. El dficit en este neurotransmisor da lugar a una serie de sntomas que caracterizan a la enfermedad de 4 Parkinson, el temblor, la rigidez y la disminucin en los movimientos voluntarios. CMO SE CONSIGUE UN CULTIVO DE CLULAS MADRE? Existen varias estrategias pero en todos los casos es un proceso largo, complejo y, por el momento, con una tasa de xito baja. Para conseguirlo es necesario reproducir, en el laboratorio, el escenario en el que estas clulas actan en el organismo. Adems, estos modelos experimentales tienen que cumplir una serie de caractersticas: Tienen que reflejar de forma exacta la biologa de las clulas madre. Tienen que ser reproducibles, es decir, los experimentos se tienen que poder repetir en el laboratorio. Tienen que ser procesos de una duracin no muy larga, de modo que se puedan desarrollar, analizar y repetir en un periodo de tiempo razonable. Si se quiere obtener un cultivo o lnea celular de clulas madre embrionarias, el proceso comienza aislando, con tcnicas de microciruga, la masa celular interna del embrin. Esta masa de clulas se coloca sobre un soporte de vidrio o plstico donde existe un lquido rico en los nutrientes que necesitan las clulas para multiplicarse y crecer. Conforme las clulas van dividindose y aumenta su nmero, se va repitiendo el proceso. As al final se obtiene una lnea celular de clulas embrionarias. Este cultivo seguir dividindose siempre que se mantenga bajo control el ambiente y se aporten los nutrientes necesarios para crecer.

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Estrategia para obtener cultivos de clulas madre embrionarias a partir de un embrin. (Fuente: smartplanet) Hoy en da la mayora de las lneas de clulas madre embrionarias se generan a partir de embriones de ratn. Sin embargo, los investigadores estn explorando nuevas formas para obtener este tipo de clulas: A partir de embriones sobrantes de procesos de FIV: Se pueden generar lneas de clulas madre embrionarias humanas a partir de embriones creados mediante FIV. En este caso, como la fecundacin tiene lugar fuera del cuerpo de la mujer, es posible crecer estos embriones en el laboratorio. Mediante clonacin teraputica: Las clulas madre tambin se pueden obtener por el procedimiento empleado para generar clones enteros como la oveja Dolly. Sin embargo, al tener un uso estrictamente mdico, se denomina clonacin teraputica. En este proceso (ver imagen), se inserta el ncleo procedente de una clula adulta del donante en el interior de un vulo al que se le ha quitado el ncleo. As, el ncleo adulto aporta toda la informacin gentica (el ADN) necesaria para dividirse la clula y el vulo los nutrientes necesarios para que se lleve a cabo este proceso. Mediante un estmulo (por ejemplo una descarga qumica) se activa la multiplicacin de esta clula como si fuera un zigoto. A partir de aqu se obtendrn clulas madre embrionarias genticamente idnticas al donante adulto. Por ello esta tcnica podra suponer una aproximacin valiossima para generar tejidos sin riesgo de rechazo.

Estrategias para obtener cultivos de clulas madre embrionarias mediante clonacin teraputica. (Fuente: smartplanet) Para obtener una lnea de clulas madre adulta (imagen), en primer lugar hay que aislar estas clulas de los distintos rganos del cuerpo, por ejemplo de la mdula sea. A continuacin estas clulas se colocan en

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un soporte con el ambiente y los nutrientes necesarios para que empiecen a multiplicarse de forma equivalente a las embrionarias.

Estrategias para obtener cultivos de clulas madre embrionarias a partir de clulas madre adultas. (Fuente: smartplanet) En la diferenciacin hacia un fenotipo dopaminrgico, se deben de tener en cuenta diversos factores tales como FGF-2, FGF-8, Shh, cido ascrbico, monofosfato de adenosina cclico o BDNF ya que se trata de simular el proceso de desarrollo natural de estas neuronas pero in Vitro. Factores solubles de la familia de las Wnts secretadas por astrositos participan tambin en la diferenciacin de las clulas dopaminergicas. Otro punto en la diferenciacin dopaminergica de precursores del mesencfalo ventral incluye la eliminacin de mitgenos o adicin de factores solubles como el suero bovino fetal en combinacin con interleucinas (IL-1,IL-11), LIF, factor neurotrofico derivado de una lnea celular glial, un amezcla de FGF-8, GDNF y 1 Forskolin o el cido ascrbico. Tambin manipulaciones genticas como la del gen Nurr 1 el cual es esencial para la supervivencia de clulas precursoras dopaminergicas mesenfalicas, as como tambin para su diferenciacin en clulas productoras de dopamina. PROTOCOLO DE DIFERENCIACIN DE CLULAS MADRE AL LINAJE DOPAMINRGICO La diferenciacin de las clulas madre embrionarias se llevara a cabo mediante clulas estromales no diferenciadas hESCs de la lnea SA002.5 (Cellartis, Gothenburg) y se realizara la diferenciacin en el Laboratorio de Biotecnologa ME - CZH. Las clulas del ES sern sembradas en platos revestidos de gelatina y mantenidas en medio Glasgow MEM complementado con 2000 U/ml LIF, 20 g/ml blasticidina S, suero vacuno fetal al 1%, aminocidos no esenciales 0.1mM, Piruvato 1mM y 2- mercaptoetanol 0.1mM. Las clulas PA6 crecern en un medio esencial alfa, complementado con el 10% FBS, Penicilina 50 g/ml y estreptomicina 50 U/ml. Todas las clulas se cultivaran en una incubadora con CO2 al 95% a 37C. Las clulas madre embrionarias sern cultivadas usando PA6 CM para inducir la diferenciacin de los nervios. Para preparar PA6 CM, las clulas confluentes PA6 se lavaran tres veces con buffer fosfato salino, iones de calcio y de magnesio [PBS (+)] y los medios respectivos sern substituidos por G-MEM complementados con el 5% de KSR, aminocidos no esenciales 0.1mM, Piruvato 1mM y con o sin 2 mercaptoetanol 0.1mM y heparina (10 o 100 g/ml). Despus de 48 h, el sobrenadante se recoger y se filtrara con un filtro de 0.22 milmetros. El CM se recoger usando 10 g/ml de GMEM, y con 10 g/ml de heparina; estn referidos como CM-0H, CM-10H y CM-100H respectivamente. Las clulas embrionarias se pondrn sobre unas placas de cristal revestidas de poliornitina (sigma) /fibronectina con una densidad de 1250 clulas/cm2 en G-MEM complementadas con KSR 5%, aminocidos no esenciales a 0.1mM, Piruvato 1mM y 2-mercaptoetanol 0.1mM. Despus de 5 horas, CM0H, CM-10H (la concentracin final de heparina es 3.3 mg/ml) o CM-100H (concentracin final de heparina es 33 mg/ml) sern agregadas a la placa con una relacin de 1:3 volmenes de medio de cultivo y luego se 5 mezclaran bien. Todas las placas se mantendrn a 37 C con el 5% de CO2 por 16 das. ANLISIS INMUNO HISTOQUMICO: Los cultivos celulares preparados para el estudio de la diferenciacin de neuronas de DA mediante las clulas derivadas de la actividad estromal (SDIA) de hESCs, sern visualizados por un microscopio

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fluorescente de Zeiss (Carl Zeiss, Jena, Alemania, http://www.zeiss.com) con cmara digital. El nmero total de colonias positivas de tirosina hidroxilasa sern contadas. Para definir una colonia como inmunoreactiva aproximadamente el 10% de las clulas deben colorearse por efecto del marcador. Los nmeros de clulas fueron determinados usando un sistema de la Echar-Rejilla de Olympus (Olympus). Usando una tcnica sistemtica de muestreo al azar, los ncleos seran delineados por la accin de HNuc y de BrdU o neuronal (NeuN) - o las clulas TH-positivas sern determinadas en un % de 6 las reas. BIBLIOGRAFA 1. Caracterizacin de efectores de diferenciacin gabaergica en clulas madre como herramienta teraputica de enfermedades neurodegenerativas. Martin Ibez Raquel 2. Adult stem cells. F. Prsper, C.M. Verfaillie. Servicio de Hematologa y rea de Terapia Celular. 3. http://gslc.genetics.utah.edu/units/stemcells/scsuccess/ 4. CLULAS MADRE Y ENFERMEDAD DE PARKINSON. Ernest Arenas Laboratorio de 5 Neurobiologa Molecular, MBB, Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia . Prdida de las neuronas dopaminrgicas mesenceflicas por la inactivacin del gen Nurr1. Odila Saucedo Crdenas, Roberto Montes de Oca Luna. 5. YAMAZOE Hironori, IWATA Hiroo. Efficient generation of dopaminergic neurons from mouse embryonic stem cells enclosed in hollow fibers. 2006. 6. BREDERLAU, Anke et al. Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cells to a Rat Model of Parkinsons disease: Effect of In Vitro Differentiation on Graft Survival and Teratoma Formation. 2008.

Autores Carol Johanna Diaz Gutierrez cadia333@gmail.com Erika Viviana Diaz Aguirre Adriana Alejandra Marin Rodriguez Oscar Javier Peralta Quevedo ESTUDIANTES DE SEXTO SEMESTRE DE BIOLOGA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA

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