1- INTRODUO 2- GENTICA MICROBIANA 2.1- BACTRIAS 2.2- FUNGOS 3- MUTAO 3.1- MUTAO ESPONTNEA 3.2- MUTAO INDUZIDA 3.2.

1- Agentes fsicos 3.2.2- Agentes qumicos 3.3- MECANISMOS DE REPARO 3.4- SOBREVIVNCIA E SELEO DE MUTANTES 4- TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 4.1- PROBLEMAS 4.2- VETORES 4.4- REGULAMENTAO SOBRE OGM 5- EXEMPLOS DE MICRORGANISMOS MELHORADOS 6- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1- INTRODUO

2 3 4 8 12 13 14 15 17 21 23 24 24 27 32 37 38

4.3- PRODUO E DETECO DE CLONES RECOMBINANTES29

A utilizao de um microrganismo em um processo biotecnolgico envolve geralmente a produo de algum composto de interesse. No entanto, as espcies que so encontradas na natureza normalmente no produzem grandes quantidades de metablitos, somente o necessrio para a sobrevivncia. Por isso, cabe ao biotecnologista melhorar essa produo para poder aplic-la em escala industrial. Para atingir esse objetivo, podem-se utilizar dois mtodos. O primeiro seria definido como a biotecnologia convencional, ou seja, a otimizao das condies fisiolgicas e nutricionais do meio de cultivo onde o microrganismo cresce. Essa tcnica pode apresentar bons resultados, mas s vezes no suficiente, pois h a limitao da capacidade mxima de sntese do microrganismo. Poucas indstrias utilizam cepas silvestres nos seus processos de produo. A produo de mutantes mais adaptados para processos uma busca constante na pesquisa de melhoramento de microrganismos. Isso se deve principalmente ao valor econmico de aumento da produo, chegando s vezes at a 100 vezes mais. Processos que envolvem produtos oriundos de um ou poucos genes, como a produo de enzimas, podem ser incrementados somente com o aumento da dose gnica, ou seja, aumento da quantidade do mesmo gene presente na clula e aumento do seu nvel de expresso. J para metablitos secundrios, o processo de melhoramento j mais complicado, pois, como so produtos finais de vias biossintticas, envolve vrias etapas reacionais, e a modificao delas mais trabalhosa.

Algumas vezes o objetivo desejado no o melhoramento do produto, mas sim a capacidade de desenvolvimento do microrganismo em determinadas condies ambientais. Pode-se melhorar cepas de forma a obter microrganismos que necessitam tempos de fermentao mais curtos, que no produzam metablitos indesejveis (barateando o custo de recuperao do produto), que necessitam de menos oxignio ou que so capazes de utilizar determinados substratos como resduos agroindustriais. A manipulao gentica pode ser muito utilizada pela biotecnologia, pois uma ferramenta muito til para aumentar o rendimento da produo, melhorar a qualidade do processo de produo, melhorar as caractersticas do produto (como na melhoria de enzimas conferindo maior especificidade e termoestabilidade), produzir produtos j existentes por outras vias alternativas, e produtos novos produtos no encontrados na natureza. A modificao do material gentico pode ser feita de duas formas: ao de agentes mutagnicos ou a produo de DNA recombinante. A mutagnese de microrganismos permite a criao de gentipos diferentes da clula original atravs da alterao aleatria dos genes. J a recombinao permite um rearranjo de genes que permite a insero de material gentico de vrias fontes em um s microrganismo. A mudana qumica no DNA, independente de ser por mutagnese ou recombinao, um fator necessrio, mas muitas vezes insuficiente para a produo de um mutante, pois antes de se observar uma populao de clulas modificadas capazes de passar o novo material gentico para as futuras geraes necessrio lidar com os mecanismos de reparo da clula, a transcrio e traduo da informao, e tambm o enriquecimento do meio de cultura com os mutantes desejados. Mutaes favorveis para a produo de determinado produto muitas vezes podem acarretar na modificao das necessidades ambientais da clula. Portanto, aps a seleo de um mutante necessrio determinar os novos parmetros de cultivo necessrios para o melhor aproveitamento das potencialidades do microrganismo atravs da biotecnologia bsica. Ao mesmo tempo pode-se tentar melhorar ainda mais a cepa mutante atravs do outras mutaes, ou seja, o processo de melhoramento de uma cepa envolve a modificao gentica contnua da cultura e determinao dos novos parmetros operacionais. Esse trabalho visa mostrar em mais detalhes a utilizao de tcnicas de melhoramento gentico de cepas de microrganismos. Para ilustrar melhor esses princpios, esto em anexo dois artigo mostrando a aplicao dos conceitos. 2- GENTICA MICROBIANA A gentica microbiana comeou a ser elucidada com Fred Griffith em 1928, quando se observou a transferncia da virulncia de cepas de Streptococcus pneumoniae. Ele percebeu que quando uma cepa no virulenta da bactria entrava em contato com constituintes da clula inativada de uma cepa virulenta, havia a transformao da cepa no-virulenta, e esta passava tambm a causar a doena. Oswald T. Avery foi quem descobriu que a cepa se transformava devido incorporao de material gentico da bactria inativada, provando que o DNA carregava a informao gentica.

Em 1952, Alfred D. Hershey e Martha Chase mostraram que o DNA o material gentico de bacterifagos T2. Eles utilizaram fsforo radioativo para observar se era o material do DNA que penetrava na clula bacteriana e transferia as informaes do fago. Aps esses estudos, vrios outros foram feitos, o que contribuiu muito para o desenvolvimento da biologia molecular, propiciando a obteno de organismos mutantes e de recombinantes. 2.1- BACTRIAS A principal fonte de material gentico nas bactrias o cromossomo bacteriano, que consiste um uma dupla fita de DNA geralmente circular e contm todos os genes essenciais para a sobrevivncia em condies normais. As bases nuclicas podem apresentar ou no algumas metilaes que servem para identificar material gentico velho durante a replicao, proteger o DNA da ao de nucleases, e cronometrar certos eventos celulares. A maioria dos genes presentes no cromossomo das bactrias apresenta uma nica cpia, exceto os genes que codificam para RNA ribossomal. Aproximadamente 90% do DNA presente codifica para protenas e polipetdeos, e os 10% servem para o controle da expresso gnica. No h a presena de DNA sem funo aparente como acontece nas clulas eucariticas. Uma parte do DNA bacteriano est organizada na forma de operons, ou unidades transcricionais, que apresentam seqncias codificadoras para produtos correlatos e mesmo stio de regulao, como mostra a Figura 1. As seqncias ativadoras e repressoras controlam a sntese e a freqncia da transcrio. 5 Figura 1- Transcrio e traduo de um operon

Fonte: Ratledge & Kristiansen, 2006.

Alm do cromossomo, a bactria pode apresentar outros tipos de fontes de informaes genticas, como mostra a Tabela 1. Os plasmdeos so elementos circulares de DNA extracromossmico que geralmente contm gene de resistncia a algum antibitico. Os transpossons so seqncias de DNA capazes de se movimentar de uma regio para outra no genoma de uma clula. J os profagos so seqncias gnicas provenientes de bacterifagos e foram incorporadas no cromossomo da bactria. Tabela 1- Tamanho mdio dos elementos genticos encontrados em bactria

Fonte: Ratledge & Kristiansen, 2006. Para entender como modificar geneticamente uma bactria, primeiramente necessrio conhecer os mecanismos de transferncia do material gentico. O mais essencial a transferncia do DNA para as clulas filhas durante a diviso celular. Para isso ocorre uma duplicao do DNA circular a partir da origem de replicao oriC. Na forquilha de replicao formada, a duplicao ocorre nas duas direes ao mesmo tempo (Figura 2, esquerda). Como a replicao em bactrias ocorre muito rapidamente e muitas vezes inicia-se uma replicao sem que a anterior tenha terminado, acontece a formao de inmeras cpias durante a diviso, como mostra a Figura 1 direita. O cromossomo bacteriano est aderido a uma invaginao da membrana celular chamada mesossomo, e esse fato importante para que a cpia formada aps a replicao v para a clula filha. Figura 2- Replicao bacteriana

Fonte: Ratledge & Kristiansen, 2006.

Outro processo de transferncia de material gentico a conjugao, que consiste na transferncia de DNA plasmidial diretamente de uma clula doadora de material gentico para uma clula receptora desse material atravs de uma fmbria. O plasmdeo possui uma regio codificante para a fmbria. Logo, as clulas doadoras foram chamadas de clulas F+, e o receptor F-. Existem tambm as clulas que tm plasmdeo ligado ao cromossoma bacteriano, so as chamadas de Hfr (High Frequency of Recombination) e so elas que transferem genes cromossmicos de clulas doadoras para clulas receptoras. Na natureza a conjugao d-se entre espcies e, raramente ocorrem cruzamentos inespecficos entre gneros aparentados, como Escherichia e Shigella. O processo de transformao aquele que foi observado por Griffit em 1928 durante o experimento com pneumococos. O fenmeno foi chamado de transformao, pois no requer um contato entre duas clulas, mas sim a incorporao de um DNA exgeno no cromossomo da bactria e que sa pareia numa regio homloga do cromossomo da mesma. H a formao de recombinantes nas prximas duplicaes, pois, o seguimento incorporado vai tambm sofrer duplicao. Desta forma, pode haver modificao em uma ou mais caractersticas genticas de clulas descendentes. A transformao um timo sistema gentico para estudos. Por meio dela pode-se combinar genes de diferentes linhagens em uma mesma, fazer mapeamento gentico e construir mapas bastante detalhados de regies do genoma das espcies estudadas. A descoberta da transformao em outros organismos, como fungos filamentosos e leveduras e a utilizao em larga escala do mecanismo de tecnologia do DNA recombinante, faz com que esse sistema de recombinao tenha grande importncia econmica e biotecnolgica. O ltimo processo seria a transduo, que uma outra forma alternativa de recombinao usando bacterifagos. Pode tambm ser considerado um refinado processo de transformao. Foi descrito pela primeira vez em 1952 na bactria Salmonella typhimurium. Nesse caso, os fagos infectam as bactrias, lisam-na e podem ter um seguimento do DNA bacteriano substitudo pelo seu prprio DNA, ou mesmo ter alguns genes da bactria inserido no seu prprio genoma. Assim, ao infectar uma outra clula e injetar nela seu material gentico, desencadeado a transduo. Existem basicamente trs tipos distintos de transduo: a generalizada (ocorre quando uma clula, depois de infectada lisada e um ou poucos fagos contm no interior de sua capa protica DNA da bactria, no impedindo que o fago alterado infecte outra bactria), a especfica (ocorre com um tipo de fago de ciclo lisognico -fago - que no lisa a clula, mas picota o seu material gentico e o encapsula como se fosse seu), e a abortiva (quando o fago vetor carreia penetra na clula bacteriana receptora mas, por razes ainda no conhecidas, no integrado ao cromossomo bacteriano e, no tendo duplicao autnoma, tambm no se duplica dentro dela). Assim como a conjugao e a transformao, a transduo tambm pode ser usada para mapeamento de genes ao longo do cromossomo. Uma co-transduo, isto , duas caractersticas freqentemente sendo transduzidas, indicam ligao de genes.

A transferncia do material gentico nos fungos pode ocorrer de forma sexuada ou assexuada. A reproduo assexuada pode ser feita na forma de diviso binria da clula parental em duas clulas filhas, por brotamento (principalmente em leveduras), e pela produo de esporos assexuados. Os esporos assexuais podem ser formados por: Fragmentao da hifa formando clulas que se comportam com esporos, chamadas artroconidia ou artroesporos. Envolvimento da clula por uma espessa parede antes da separao, formando clamidoesporos. Formao de esporos dentro de um saco na ponta ponta da hifa, gerando esporangioesporos. Formao de esporos fora de um saco nos lados ou ponta da hifa, chamados conidioesporos. Produo de esporos durante o processo de brotamento, chamados blastoesporos. Alguns fungos que apresentam compatibilidade nuclica tm reproduo sexuada. Fungos haplides sofrem fuso das hifas e formao de uma clula dicaritica, onde h dois ncleos haplides separados. Em seguida ocorre a da fuso nuclear (cariogamia). Isso produz um estgio diplide, o zigoesporo, que sofrer vrias meioses e processos de recombinao para gerar esporos com combinaes dos gentipos parentais. Nos fungos existe tambm a reproduo parassexual, que pode ocorrer tanto em espcies que fazem reproduo sexuada como assexuada. Na reproduo parassexual h a fuso de hifas de igual ou diferente nmero de ncleos, formando um miclio heterocarioto de com ncleos de ambas as cepas parentais. O heterocarioto normalmente estvel pode ocorrer tambm a fuso dos ncleos. Para se obter recombinao dos genes necessrio produzir clulas haplides ou esporos. A haploidizao nesse caso pode ser induzida com a utilizao de pfluorofenilalanina. A formao dos haplides no acontece devido meiose, mas devido distribuio aleatria dos cromossomos s clulas filhas (Figura 3). Figura 3- Ciclo parassexual

Fonte: < http://www2.mcdaniel.edu/Biology/botf99/fungifromweb/fungiintro.html > O melhoramento gentico de fungos de importncia industrial aconteceu primeiramente atravs de tcnicas genticas clssicas, a qual buscava espcies naturais com as melhores qualidades e cruzava-se essas linhagens para obter uma nova cepa melhorada. Aps, surgiu tambm outras tecnologias de mutao, fuso de protoplastos e do DNA recombinante, as quais permitiram uma maior manipulao gentica dos fungos, resultando em novas caractersticas de valor biotecnolgico adicionadas s espcies. A Figura 4 mostra o aumento do rendimento na produo de penicilina utilizando mutao das cepas. Figura 4- Melhoramento gentico para a produo de penicilina pelo fungo filamentoso Penicillium chrysogenum

Fonte: < http://w.ufv.br/dbg/trab2002/MELHOR/MHR004.htm >

A fuso de protoplastos usada geralmente em leveduras e bolores. Protoplastos so clulas desprovidas de parede celular que podem ser obtidas em laboratrio e que permitem uma maior manipulao. A formao dos protoplastos realizada crescendo clulas em uma soluo isotnica contendo estabilizadores osmticos (como a sacarose) para evitar o rompimento da membrana e tratando as clulas com enzimas que degradam a parede celular. Aps a remoo da parede, a fuso de protoplastos pode ser ento realizada atravs da adio de agentes fusognicos como polietilenoglicol (PEG). Alm do PEG, pode ser utilizado o processo de fuso induzida por campo eltrico. Quando as clulas se encontram em um campo eltrico de corrente alternada aparecem orifcios na membrana plasmtica, os quais facilitam o processo de fuso celular. Os protoplastos fusionados no necessariamente so da mesma espcie, e essa uma das vantagens da tcnica. Por exemplo, protoplastos de Penicillium roquefortii podem ser fusionados com protoplastos de P. chrysogenum, e protoplastos de leveduras podem ser fusionados at com eritrcitos. MARTINS, HORII e PIZZIRANI-KLEINER (1998) estudaram a fuso de protoplastos da levedura Saccharomyces cerevisiae com o objetivo de obter linhagens de leveduras com caractersticas importantes na indstria vincula. Primeiramente as clulas foram cultivadas em meio YEPD lquido e aps crescimento foram lavadas vrias vezes de forma a separar os pellets. Uma das alquotas retiradas recebeu o tratamento da enzima ltica Novozym 234 e foi incubada 28C. O grau de formao de protoplastos foi feito como proposto por Gunge e Tamaru (1978), comparando o nmero de colnias produzidas pelo cultivo em meio slido YEPD das clulas que sofreram ao da enzima com o nmero de colnias formadas pelo cultivo sem a presena da enzima. Observou-se que em 30 minutos de exposio enzima j era suficiente para se ter praticamente 100% das clulas transformadas em protoplastos. Para a anlise da fuso dos protoplastos, utilizou-se duas linhagens com auxotrofias contrastantes (uma tinha deficincia para arginina e a outra para piridoxina). Fez-se uma mistura das duas linhagens, adicionou-se a soluo de 40% de PEG e incubou-se a mistura a 30C por 30 minutos. Depois de decorrido o tempo, lavou-se as clulas trs vezes com soluo tampo e semeou-as por pour-plate em trs meios para permitir a regenerao da parede celular: meio mnimo para regenerao (M), YEPD e YEPD-sorbitol. Aps crescimento nas placas, contou-se o nmero de colnias formadas nas placas. A freqncia de fuso citoplasmtica foi estimada como sendo: (n de colnias em M)/[(n de colnias em YEPDsorbitol)- (n de colnias em YEPD)]. A tcnica de protoplastos pode ser utilizada tanto para bactrias como para fungos, diferenciando que para o primeiro grupo sero utilizadas enzimas como a lisozima, enquanto que para o segundo seriam utilizadas quitinases e celulases. 3- MUTAO

A informao gentica dos microrganismos depende da ordem precisa dos nucleotdeos presentes no DNA, e essa ordem no deve ser muito alterada num indivduo para se manter a estabilidade. No entanto, muitas vezes ocorrem mudanas, as quais podem gerar fentipos variados, contribuindo para o processo evolutivo. A mutao em microrganismos de extrema importncia em pesquisa, pois permite a obteno de espcies variadas, as quais podem apresentar caractersticas desejadas. Pode haver mutaes condicionais em que o fentipo s expresso quando h uma determinada condio ambiental. Por exemplo, uma mutao letal em Escherichia coli pode no ser expressa em baixas temperaturas, mas em elevadas temperaturas observa-se a expresso do fentipo. As mutaes bioqumicas acarretam na mudana da bioqumica da clula, geralmente inativando uma via metablica ou favorecendo outra. A inativao de uma via pode formar um mutante auxotrfico, ou seja, o microrganismo no consegue crescer em meios mnimos e necessita de complementao nutricional. Alteraes bioqumicas tambm podem gerar mutantes resistentes, os quais no so inibidos pelos antibiticos usuais e possuem mecanismos de escape. Esses tipos de mutantes so bem fceis de isolar, e essa propriedade bastante usada pelos microbiologistas. As mutaes ocorridas podem envolver um cromossomo inteiro ou grande parte dele, constituindo uma mutao cromossomal, ou pode ser tambm a nvel de DNA, sendo uma mutao de cidos nuclicos. Mutaes que envolvem o rearranjo de grades pores do cromossomo so chamadas de mutaes cromossmicas (ou macroleses), e podem ser delees, adies, inverses e substituies. Em eucariotos essas modificaes podem ser analisadas citologicamente fazendo um mapeamento do cromossomo. J em procariotos a percepo dessas modificaes mais complicada. As delees geralmente so irreversveis, exceto em regies que apresentam vrias cpias. As adies, que podem ser tanto duplicaes de seqncias j existentes ou a insero de uma seqncia nova (mas geralmente sem sentido), podem ser revertidas no processo de recombinao. As inverses e substituies so raras em procariotos, sendo processos mais freqentes em eucariotos. As mutaes que afetam somente pequenas pores de nucleotdeos so chamadas de mutaes de ponto (ou microleses). Tem-se a substituio de pares, a deleo de pequenas pores de pares de bases (causando uma mudana no quadro de leitura dos codons). adio de (3n+1) ou a deleo de (3n+2) pares de base, sendo que n=0,1,2, A mudana do quadro de leitura para a esquerda ocorre quando h uma Mudanas de leitura para direita so resultados de delees de (3n+1) ou adies de (3n+2) pares de base. A adio ou deleo de exatamente 3n pares de base no ir alterar o quadro de leitura, mas pode produzir um fentipo alterado.

3.1- MUTAO ESPONTNEA Antigamente acreditava-se que as mutaes eram originadas como processo de adaptao ao ambiente, como, por exemplo, na presena de antibitico aparecem organismos resistentes a ele. Mas eles no sofreram mutao devido ao antibitico, mas sim organismos j mutados foram somente selecionados. Hoje em dia sabe-se que os mutantes podem ser gerados aleatoriante na natureza e so selecionados atravs das presses ambientais presentes. Tabela 2- Taxa de mutao espontnea em locus especficos para diferentes espcies

Fonte: REHM & REED, 1993. Todos os organismos sofrem mutaes espontneas atravs de vrios mecanismos. Isso ocorre devido a agentes fsicos e qumicos o ambiente em que as clulas geralmente se encontram. Elas tambm podem ocorrer devido erros de reparos do DNA aps a replicao. Por exemplo, a taxa de erro de reparo aps a replicao do cromossomo de E. coli de 1 a cada 1010. A taxa de mutao espontnea depender do locus do gene e da espcie, como mostra a Tabela 2. 3.2- MUTAO INDUZIDA A demonstrao da mutao induzida foi feita pela primeira vez em moscas do gnero Drosophila por Muller (1927) usando raios-X. A partir desse fato, vrios estudos comearam a ser feitos para demonstrar o efeito mutagnico de radiaes ionizantes. A primeira induo de mutao com agentes qumicos foi feita em 1946 por Auerbach e Robson, que utilizaram mostarda nitrogenada em Drosophila. A partir e ento vrios estudos foram feitos para detectar agentes fsicos e qumicos com ao mutagnica. Dependendo do agente mutagnico utilizado obtm-se um tipo de mutao em maior quantidade. A dose do agente tambm influencia o aparecimento de determinadas mutaes. Atravs da combinao desses dois fatores pode-se fazer uma mutao dirigida no microrganismo (Tabela 3). No entanto, a determinao deles difcil e seu estudo invivel na procura de determinado mutante.

Tabela 3- Freqncia de mutao em Neurospora obtida com vrios agentes mutagnicos

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004. O estudo dos agentes mutagenicos pode ser feito em cultivo de clulas humanas observando a substituio de aminocidos, estrutura terciria, e dano funcional em algumas das protenas mais estudadas, como a hemoglobina e outras protenas do sangue. No entanto, hoje em dia existe um grande nmero de modelos em bactrias e vrus disponveis. 3.2.1- Agentes fsicos Um dos agentes fsicos que provocam mutaes a radiao, a qual pode ser de duas formas: ionizante e excitante. A radiao ionizante consiste nos raios-X, alfa, beta e gama. Eles atuam na valncia qumica, retirando eltrons. A taxa de mutao geralmente proporcional dosagem de irradiao (Figura 5). As radiaes ionizantes so conhecidas por produzirem macroleses em cromossomos de eucariotos. Figura 5- Aumento da mutao com o aumento da dose de raios-X

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004. A outra forma de radiao a excitantes, que consiste no aumento do nvel de energia do tomo, tornando-o menos estvel. O exemplo tpico a ultravioleta que provoca dmeros de pirimidina atravs de ligaes covalentes. Os estudos da mutagenses por ultravioleta tambm revelaram que a luz tambm tem um papel no reparo de algumas leses, como ser discutido mais adiante. A luz ultravioleta (UV) induz mutaes de mudana de quadro e leitura e substituio de pares de bases (comumente GCAT ou transies CT) em vrios microrganismos como bacterifogos T4 e S1, E. coli e Neurospora. Delees tambm so induzidas por essa forma em bactrias, mas no em bacterifagos T4. Essa radiao produz dmeros de ciclobutano de pirimidina, o fotoproduto 6-4, alguns outros tipos de dmeros de pirimidina, dihidrotimina, hidrato de citosina, ligao cruzada entre cadeias complementares, ligao cruzada entre DNA-protena mediada por cistena, entre outros produtos. Os dmeros de pirimidina so responsveis principalmente nas mutaes de mudana no quadro de leitura, enquanto o hitrato de citosina gera mais transies de CT. O nico desses danos que pode ser reparado o dmero de pirimidina atravs da fotoreativao. Figura 6- Anel ciclobutano de pirimidina e o fotoproduto 6-4

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004. No s a radiao UV pode causar danos, mas tambm a luz visvel pode ser mutagnica, chamada mutagenese fotodinmica. A luz visvel pode geral vrios fotoprodutos, mas a sua ao pode ser potencializada com a utilizao de corantes como azul de metileno, tiopironina, e psoraleno. Nesse mtodo h a formao de duas classes de produtos. Os corantes azul de metileno e tiopironina iro fazer uma degradao oxidativa da guanina, podem raramente reagir

tambm com a timina. J o psoraleno ir reagir com nucleotdeos sem a necessidade do oxignio, formando dmeros de ciclobutano de pirimindina. Outro fator fsico capaz de gerar mutaes o calor. Elevadas temperaturas e temperaturas amenas em pH baixo podem ser altamente mutagnicos. H a substituio de pares de base, mas o mecanismo de ao especfico desconhecido. 3.2.2- Agentes qumicos Muitos agentes qumicos so capazes de induzir transio de bases, como as bases anlogas: 5-bromouracil e 2-aminopurina. O 5-fluoruracil pode ser utilizado na substituio de bases em RNA de vrus. A substituio de bases pode gerar transies ou transverses. As transies consistem na mudana de uma base por outra da mesma categoria qumica, ou seja, uma purina substituda por outra purina ou uma pirimidina substituda por outra pirimidina. J na transverso acontece o oposto, ou seja, a pirimidina substituda por purina e vice-versa (Figura7). Figura 7- Transies e transverses

Fonte: figura do autor. Cada uma das bases nitrogenadas presentes no DNA pode se apresentar de diferentes formas ismeras chamadas de tautmeros. A diferena entre as formas tautomricas keto, imino ou enol so somente a posio dos tomos e a ligao entre eles. A forma keto a que predomina no DNA normalmente e com ela acontece o pareamento adequado das bases. J as formas imino e enol promovem um pareamento errneo das bases, como mostra a Figura 8. 18 Figura 8- Pareamento correto das formas keto e incorreto das formas imino e enol

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004. Outra forma de ocorrer mal pareamento das bases com a utilizao de 5- bromouracil, que um anlogo da timina (Figura 9). Seu princpio de ao mutagenico atravs da enolizao e ionizao. O tomo de bromo presente no lugar do grupo CH3 da timina no consegue formar pontes de hidrognio durante o pareamento, portanto a forma keto do 5-bromouracil ir parear normalmente com a adenina. No entanto a presena do bromo altera a distribuio dos eltrons no anel da base, provocando uma mudana para a forma enol ou a forma ionizada. Essas duas formas pareiam com a guanina, causando uma transio durante a replicao. Figura 9- Ao do 5-bromouracil

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004. Outro agente mutagnico a 2-aminopurina, que anlogo da adenina que em estado normal pareia com timina (Figura 10). No entanto, quando a 2- aminopurina sofre uma protonao ela pareia com citosina, gerando na replicao transies de bases. Figura 10- Ao da 2-aminopurina

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

Outros agentes no causam mutao atravs de sua insero no DNA, mas sim atravs da modificao da base j presente. Esse o mecanismo de ao de agentes alquilantes como o etilmetanosulfonato (EMS) e a nitrosoguanidina (NG), que adicionam um grupo alquil (um grupo etil no caso do EMS e um grupo metil no caso da NG) a qualquer uma das quatro bases nitrogenadas. No entanto, mais provvel que ocorra uma mutao quando o grupo alquil adicionado no oxignio da posio 6 da guanina, formando a O-6-alquilguanina que ir parear com a timina, causando uma transio (Figura 1). J a alquilao de uma timina resultar no mal pareamento de com uma guanina. Figura 1- Mal pareamentos devido alquilao

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004. Existem tambm agentes que atuam intercalando-se no DNA, como a proflavina, e acridina alaranjada. Esses compostos so achatados de modo que podem se intercalar entre duas bases na dupla hlice, como mostra a Figura 12. Isso causar a insero de um par de nucleotdeos ou uma deleo. Figura 12- Ao de agentes intercalantes

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004. A aflotoxina tambm so mutagenicas, pois ela une-se guanina na posio N-7, gerando uma quebra da ligao entre a base nitrogenada e o acar e um stio apurnico, como mostra a Figura 13. O mecanismo de reparo muitas vezes inserem um resduo de adenina na fita complementar do stio apurnico, gerando futuramente uma transverso G-CTA. Figura 13- Ao da aflotoxina

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004. Espcies reativas de oxignio chamadas de radicais livres, como os radicais superxidos, perxido de hidrognio e radicais hidroxilas, podem causar danos oxidativos no DNA, resultando em mutao. A Figura 14 mostra dois produtos da oxidao do DNA, a timidina glicol e a 8-oxo-7-hidrodeoxiguanosina (8-oxo-dG). A 8- oxo-dG geralmente pareia com adenina, causando uma transverso. Figura 14- Bases nitrogenadas que sofreram oxidao

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004. Outros dois agentes qumicos mutagnicos so o cido nitroso (HNO2) e a hidroxilamina ((NH4)OH) atuam provocando substituio de bases. O cido nitroso principalmente indicado para induo de mutao em leveduras. 3.3- MECANISMOS DE REPARO Um fator importante para a propagao de uma mutao so os mecanismos de reparo do DNA presentes na clula, os quais podem ser de dois tipos: aqueles que restauram a seqncia de bases do DNA com fidelidade e aqueles que corrigem o dano, mas ao fazer isso podem gerar mudanas na seqncia de bases. Dependendo da clula ser utilizado um mecanismo ou outro, e isso ir afetar o rendimento da produo de mutantes durante a ao de um agente mutagnico. Os mecanismos de reparo tm sido estudados principalmente em E. coli, a qual apresenta mecanismos similares a de outros organismos.

O reparo de dmeros de timinas formados aps a irradiao de luz ultravioleta pode envolver quatro processos enzimticos diferentes. O primeiro deles a fotoreativao, que consiste na quebra dos dmeros pela enzima fotoliase na presena de luz. A enzima reconhece o local de dano e forma um complexo enzima- DNA que absorve luz visvel e utiliza essa energia para quebrar a ligao covalente que une o dmero. Esse o nico mecanismo que necessita de luz, os outros trs podem ser realizados no escuro e podem ser aplicados em outros tipos de mutao, no somente na induzida por UV. A exciso de pares consiste no reconhecimento da rea danificada, insero de endonucleases, exciso de pequenos pedaos do DNA danificados de somente uma fita do DNA, nova sntese da seqncia retirada, e finalmente ligao da ponta livre. Esse mecanismo envolve quatro genes, os quais foram identificados em E. coli e denominados uvrA, uvrB, uvrC e uvrD (sendo que uvr significa resistncia ultravioleta, devido ao estudo realizado em E. coli resistentes a essa radiao). Esses genes produzem as endonucleases necessrias para a exciso do DNA danificado. Pode ocorrer a reparao por exciso de DNA alquilado e desaminado. No caso da alquilao, uma N-glicosilase reconhece a presena de 3-metiladeninas no DNA e feito um corte entre a base nitrogenada e a desoxirribose, formando um stio apurnico. Esse local ento reconhecido por endonucleases AP especiais (AP: stio apurnico ou apirimidnico) que remove uma pequena seqncia e depois h uma nova sntese desse trecho. A formao de 7metilguaninas no reparada, pois essa alquilao tolerada pela maioria das clulas, e essa alterao no mutagnica. No reparo de DNA desaminado, so encontradas em vrias bactrias enzimas como a uracil glicosilase e a hipoxantina glicosidase. Os dois mecanismos apresentados so realizados antes da replicao do material danificado. Os prximos mecanismos acontecem aps ou durante a duplicao do material danificado. No processo de reparao por recombinao, a fita complementar no-danificada utilizada como molde na substituio do fragmento lesado. O ltimo mecanismo seria o reparo pelo mecanismo de SOS da clula. Quando um defeito severo o bastante a ponto de impedir a sntese de DNA est presente, so ativados os genes SOS e suas enzimas so sintetizadas como, por exemplo, endonucleases de exciso e helicases. Os dmeros de pirimidinas constituem um exemplo tpico desse tipo de dano. Quando a forquilha de replicao encontra um dmero, a sntese pra e s reiniciada a alguma distncia alm do dmero, ficando uma lacuna no DNA na qual a enzima de recombinao RecA se liga. Essa ligao ativa em RecA uma atividade enzimtica completamente independente da recombinao: ela destri o repressor dos genes SOS (repressor LexA). Dessa maneira, a protena RecA promove reparao do material gentico de duas formas: por recombinao, com troca das fitas, e por induo dos genes SOS.

3.4- SOBREVIVNCIA E SELEAO DE MUTANTES As mutaes so em sua maioria deletrias e no aumentam o rendimento de produo de determinado produto, mas h tambm uma minoria que apresenta uma produtividade muito maior que a parental. Essa minoria das clulas deve ser separada daquelas que produzem em pequenas quantidades atravs de meios de cultivo que promovam o enriquecimento do microrganismo dependendo de suas caractersticas. O agente mutagnico s vezes pode ser muito violento, e necessrio fazer uma curva de sobrevivncia dos mutantes em variadas doses do agente. Essa relao geralmente exponencial, e depende da quantidade de vezes em que o alvo sofre ao do agente. Em melhoramentos realizados em indstrias deve-se escolher uma condio que fornea alta freqncia de mutantes por clulas sobreviventes. Para achar o ponto exato so construdas curvas de mutantes efetivos por total de clulas sobreviventes. KAVA-CORDEIRO, LUNAALVES-LIMA e AZEVEDO (1995) estudaram a taxa de sobrevivncia de do fungo Metarhizium anisopliae quando submetido a diferentes agentes mutagnicos, como a radiao gama, a luz ultravioleta e o cido nitroso. Aps anlise dos sobreviventes, buscou-se aqueles que eram sobreviventes para determinar a taxa de mutao. Tabela 4- Porcentagem de sobreviventes de Metarhizium anisopliae

Fonte: KAVA-CORDEIRO, LUNA-ALVES-LIMA e AZEVEDO, 1995. O processo de seleo de mutantes muito semelhante ao isolamento de microrganismos do meio ambiente. Muitas vezes o tipo de mutao ocorrida possibilita a visualizao direta da caracterstica, como, por exemplo, nas mutaes ocorridas na morfologia, que podem ser diferenciadas atravs de uma simples observao das clulas ou do tipo de colnia. A deteco de mutantes auxotrficos pode ser feita atravs da observao de no-crescimento em meio mnimo, mas ocorre o crescimento em meio complementado. Outras vezes necessrio conhecer o mecanismo de sntese e controle do produto para poder-se elaborar um mecanismo de isolamento. Isso ocorre geralmente com produtos metablicos primrios, e a seleo pode ser feita atravs do ajuste das presses seletivas.

4- TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE Atravs da tecnologia do DNA recombinante foi possvel aumentar a quantidade de produtos resultantes da fermentao realizada por microrganismos. Por essa tcnica consegue-se induzir em um microrganismo a produo de uma protena heterloga que originalmente pertencia a outro organismo. Alguns exemplos bem sucedidos so a produo de insulina humana, de hormnio do crescimento e de interferon pela bactria Escherichia coli. 4.1- PROBLEMAS Tenta-se geralmente introduzir em bactrias como E. coli DNA de organismos taxonomicamente distantes, fazendo plasmdeos hbridos, mas geralmente a sua expresso no se d de forma adequada. Isso acontece porque existem algumas barreiras para a replicao de material gentico proveniente de outras fontes, as quais podem ser divididas em seis grupos: barreiras de nucleases, barreira da unidade de replicao, barreira da transcrio, barreira da traduo, e barreira de proteinases. A Tabela 5 mostra alguns trabalhos publicados que evidenciam as barreiras de utilizao de material gentico exgeno por um microrganismo. 25 Tabela 5- Barreiras entre as espcies

Fonte: SAKAGUCHI & OKANISHI, 1980. As barreiras de nuclease envolvem a degradao do material gentico introduzido no citoplasma bacteriano, no meio de cultivo ou na superfcie da clula. Bactrias como B. subtilis,

Actinomycetales e Clostridium, e tambm muitos fungos excretam nucleases no meio de cultivo, portanto, no possvel fazer uma transformao desses organismos sem algum ajuste prvio. Algumas clulas tambm apresentam nucleases em sua membrana, como a DNAse I em E. coli, para impedir a entrada de material gentico estranho a clula. Uma vez que se consegue introduzir o material gentico dentro da clula, ainda h o problema da degradao por nucleases intracelulares. Endonucleases de restrio previnem a invaso de DNA exgeno, permitindo somente a propagao do material original da clula. Para contornar esse problema pode-se utilizar cepas mutantes de bactria deficientes em algumas enzimas de restrio, como por exemplo a E. coli mutante para recB e C, que so dois genes essenciais para a produo de exonucleases. A barreira de replicao consiste no complexo mecanismo de duplicao do material gentico. Conseguindo-se introduzir o material na clula, necessrio fazer com que ele se propague para as outras clulas filhas. No entanto, a maquinaria de replicao envolve vrias enzimas, e necessrio que elas reconheam regies especficas da seqncia gentica. Isso inclui seqncias na origem de replicao do DNA que devem interagir com enzimas como DNA polimerases e girases. Com relao barreira de transcrio, existe a especificidade de promotores e regies operadoras. Essas seqncias podem variar de um organismo para outro, afetando a fora com que as RNA polimerases e outras protenas regulatrias interagem com o DNA. Por exemplo, o DNA de fago T7 possui uma seqncia gnica que s reconhecida pela sua prpria RNA polimerase. Quando se compara o sistema de atuao de RNA polimerases de microrganismos com o de eucariotos superiores, as barreiras so bem maiores, pois a forma com que a RNA polimerase une-se ao DNA varia, e a insero do material gentico de um em outro podem gerar somente interaes fracas. Tambm existe o problema do reconhecimento do cdon de terminao, o qual quando no reconhecido ir gerar protenas inativas. A barreira de traduo provavelmente um dos maiores. Primeiramente temse a diferena de eucariotos possurem seqncias de ntrons e xons e sistemas especficos de modificao do RNA ps-transcricional, enquanto os procariotos no possuem ntrons e, portanto, no fazem modificaes ps-trancricionais no RNA. As enzimas do spliceossomo no esto presentes em procariotos, e a introduo direta de genes eucariticos ir gerar protenas no-funcionais Outro obstculo seria a necessidade da subunidade ribossomal 16S interagir com uma seqncia especfica do mRNA para que a traduo se inicie. Os fatores de iniciao tambm variam de procariotos para eucariotos, e essas diferenas podem prejudicar o correto funcionamento da maquinaria de traduo. Deve-se lembrar tambm que h uma preferncia de utilizao de determinados codons dependendo do organismo (fenmeno chamado tambm de codon usage bias). Como o cdigo gentico degenerado e um mesmo aminocido pode corresponder at a trs codons diferentes, os organismos se desenvolveram utilizando preferencialmente alguns deles. O codon usage reflete o pool de tRNA disponveis no citoplasma da clula, pois assim obtm-se uma maior velocidade e preciso durante a traduo.

Aps da traduo, as proteinases tornam-se uma outra barreira. Existem vrias proteinases intracelulares que so inativas para protenas na conformao correta, mas ativas para conformaes incorretas ou estranhas clula. Isso pode ocorrer freqentemente com protenas oriundas de DNA exgeno, pois muitas vezes ocorre um dobramento incorreto devido falta de mecanismos ps-traducionais (como glicosilao) nas clulas bacterianas. A falta desses mecanismos pode gerar tambm protenas no-funcionais. 4.2- VETORES A introduo do material exgeno numa clula hospedeira feita atravs de vetores de expresso, ou vetores de clonagem. Ele pode ser de vrios tipos, como plasmdeos, fagos, cosmdeos, cromossomos artificiais de leveduras, entre outros. Os plasmdeos so pequenas molculas de DNA dupla fita extracromossomais que variam de 5 a 400 kilobases. Um bom plasmdeo deve possuir uma origem de replicao (que a seqncia de DNA que permite a replicao do vetor seja na clula hospedeira), apresentar dois ou mais stios de clivagem para endonucleases de restrio (como o stio mltiplo de clonagem, onde geralmente incorporado o gene exgeno), possuir um gene que codifica um produto que distingue a clula transformada da clula no transformada (como, por exemplo, a resistncia a algum antibitico). Aps a construo de um plasmdeo atravs do uso de enzimas de restrio e ligao dos pedaos de DNA, deve-se introduzir o plasmdeo na clula hospedeira atravs de tcnicas de transformao. Muitas vezes nas bactrias que receberam plasmdeos ocorre uma desvantagem seletiva da clula portadora do gene exgeno. Um microrganismo que recebeu um material gentico de outra fonte pode no conseguir predominar num meio de cultura porque eles so forados a produzir substncias desnecessrias ao seu metabolismo em grande quantidade, e isso pode acarretar na supresso da produo de substncias necessrias para o crescimento normal, gerando uma desvantagem seletiva. Outro tipo de vetor bastante utilizado o bacterifago , o qual comporta-se como um vrus da E.coli. O bacterifago injeta seu DNA na bactria hospedeira para que ocorra a sua multiplicao. Os genes do fago podem seguir dois caminhos dentro da clula: o ciclo ltico, em que o DNA do fago permanece na bactria como uma molcula independente, havendo a ativao de alguns genes do fago e replicao ativa do DNA produo de novos fagos; ou o ciclo lisognico, no qual o DNA do fago integrado no cromossomo da bactria passando a ser chamado profago e todos os genes do profago esto inativos com excesso do gene que produz uma protena repressora (a multiplicao do material gentico do fago juntamente com o da bactria, e transpassado para as clulas filhas passivamente). A escolha pelo ciclo ltico ou lisognico acontece de acordo com as condies do meio de cultivo, os fatores intracelulares da clula hospedeira e dos genes que o bacterifago carrega. Por exemplo, o fago na bactria E.coli em meios ricos em nutrientes segue o ciclo ltico, enquanto que em condies de poucos nutrientes h a preferncia pelo ciclo lisognico. Durante o ciclo ltico, os

genes envolvidos nos processos do ciclo lisognico so dispensveis e no seu lugar podem ser inseridos outros fragmentos de DNA que se deseja clonar. Em comparao com o processo de transformao bacteriana, a clonagem com bacterifago muito mais eficiente pois os bacterifagos empacotados sempre iro infectar a bactria hospedeira, enquanto a eficincia de transformao muito baixa. A desvantagem do fago o tamanho da seqncia clonada, a qual no ultrapassa cerca de 15 kb. Sempre que um bacterifago se desenvolve numa estirpe de Escherichia coli C, os fagos resultantes da lise deste hospedeiro multiplicam-se muito mal em outra estirpe, de tipo K. Dizse que o fago "restrito" pela segunda estirpe bacteriana. Por outro lado, os fagos que escaparam restrio so capazes de crescer normalmente se forem utilizados para re-infectar a estirpe K. No entanto, se estes mesmos fagos passarem primeiro por E. coli C, ficam de novo restritos por E. coli K. Portanto, a eficcia com a qual um fago se multiplica num hospedeiro depende da estirpe na qual ele se multiplicou anteriormente. Esta modificao no hereditria, conferida ao fago pela segunda estirpe (K) e que lhe permite voltar a multiplicar-se nesta estirpe sem ser de novo restrito, chama-se modificao. Os fagos restritos adsorvem-se sobre os hospedeiros restritores e injetam o seu DNA normalmente. No entanto, este DNA rapidamente degradado depois da injeco. A enzima responsvel por esta degradao uma endonuclease, tambm chamada endonuclease de restrio ou enzima de restrio. O hospedeiro restritor tem evidentemente que proteger o seu DNA dos efeitos das enzimas de restrio que ele prprio contm; esta proteo assegurada pela modificao do DNA. Mais precisamente, as modificaes resultam da metilao (por metilases) de certas bases num nmero reduzido de locais do DNA, que constituem as seqncias de reconhecimento para a enzima de restrio. , pois, compreensvel a razo pela qual um fago que escapa restrio num dado hospedeiro, pode em seguida reinfectar eficazmente o mesmo hospedeiro: o DNA do fago ter se replicado em presena da metilase de modificao e ser protegido, assim como o DNA do hospedeiro, contra os efeitos de restrio. como na seleo de plasmdeos, atravs da resistncia a um antibitico Para clonagem de genes maiores pode-se utilizar cosmdeos, que suportam seqncias de 35 40kb. Cosmdeos so plasmdeos que contm um fragmento de DNA do fago . Estes cosmdeos podem ser usados como veculos de clonagem molecular empregando o sistema de empacotamento in vitro, reconstituindo a estrutura do fago, o qual infectar uma clula hospedeira. Dentro da clula o DNA do cosmdeo circulariza-se e replica-se como se fosse um plasmdeo normal, sem haver expresso de nenhum dos genes do fago. A seleo das clulas infectadas ocorre Em leveduras o processo de clonagem pode ser realizado atravs de cromossomos artificiais denominados YACs (Yeast Artificial Chromosome). Eles contm seqncias centromricas e seqncias telomricas, permitindo a replicao dessas molculas dentro da levedura exatamente como nos outros cromossomos. Devido ao tamanho maior, nesses vetores possvel clonar seqncias maiores de DNA.

4.3- PRODUO E DETECO DE CLONES RECOMBINANTES A produo de organismos recombinates requer um DNA que se deseja expressar em outro organismo, um vector de clonagem adequado, enzimas de restrio, DNA ligase, e as clulas procariotas ou eucariotas que servem de hospedeiro. Depois da introduo no hospedeiro, as molculas recombinantes tm que ser isoladas e caracterizadas. Foi atravs deste processo de caracterizao, que o conhecimento do gene foi progredindo. O processo de clonagem em si, s fornece um meio de isolar e de identificar rapidamente os genes de interesse. J foram discutidos alguns exemplos de vetores anteriormente, e agora ser analisado o processo de juno do DNA inserido com o vetor. Para que isso ocorra, os dois segmentos de DNA devem ter extremidades complementares, e isso possvel atravs da utilizao de enzimas de restrio. Estas enzimas j foram isoladas a partir de mais de 200 estirpes bacterianas representando quase todos os grupos de procariotas. Esta diversidade de enzimas torna indispensvel a utilizao duma nomenclatura apropriada. Cada enzima representada por um cdigo de 3 letras derivado do nome do gnero e da espcie da bactria donde a enzima foi isolada. Hae por exemplo, significa que a enzima foi isolada de Haemophilus aegyptiens. As seqncias devem ento ser ligadas atravs da ao da ligase, a qual extrada de E.coli ou de clulas infectadas pelo fago T4. As molculas de DNA recombinante formadas in vitro por ligao s comeam a ter interesse depois de introduzidas num hospedeiro biolgico. De fato, a utilizao das novas molculas de DNA formadas por engenharia gentica depende da sua separao e propagao. Por isso, necessrio introduzi-las em clulas bacterianas, por exemplo, de maneira a poderem replicarse e serem preservadas e recuperadas facilmente. Um meio de o conseguir recorrer, como vimos, a vetores particulares recombinados com o gene que nos interessa, para o introduzir num hospedeiro biolgico em geral um colibacilo. Uma srie de mtodos foram desenvolvidos para assegurar a introduo eficaz de DNA no hospedeiro. Sabe-se que o DNA exgeno pode entrar nas bactrias naturalmente. Estas passam por um estado de competncia que as torna aptas para aceitar o DNA exgeno, fixando o DNA numa forma resistente s nucleases. O estado de competncia pode ser reproduzido artificialmente pela exposio das bactrias ao cloreto de clcio antes da adio do DNA exgeno (plasmdeo recombinante). Para manter o DNA recombinante nas clulas transformadas e evitar problemas de degradao pelo sistema hospedeiro, as bactrias receptoras so geralmente tornadas deficientes para o sistema de restrio e por vezes tambm para o sistema de modificao. A proliferao permite a obteno de bilhes de cpias idnticas do fragmento clonado. Aps a insero e expresso do gene de interesse, necessrio identificar os clones que o contm, e isso depende da sensibilidade e especificidade do sistema de deteco. Muitos mtodos utilizam sondas radioativas de grande especificidade, que contm seqncias complementares ao DNA de interesse. A identificao pode ser feita obtendo-se uma rplica

das colnias em um filtro, as quais so posteriormente lisadas, e o DNA fixado ao filtro e hibridizado com uma sonda. A deteco pode ser feita em seguida por autoradiografa. Em outros casos, pode-se utilizar um vetor de expresso dentro do qual se insere o DNA. No caso de lactose (lac), pode-se inserir o fragmento de DNA dentro do gene lac Z, obtendo-se, assim, uma protena de fuso da -galactosidade. Se a protena de interesse para produo txica para a clula, isto se resolve empregando clulas que elaboram repressores. Quando a concentrao celular do cultivo elevada, induz-se expresso com isopropil--Dtiogalactopiranosido (IPTG), detectando-se a presena da protena de interesse por mtodos imunolgicos. Finalmente, para aumentar a estabilidade da protena a ser produzida, a qual contribui a estrutura da -galactosidase, usam-se hospedeiros deficientes em proteases. Pode-se detectar clones que contm a seqncia de DNA desejada tambm atravs de tcnicas de engenharia gentica. A Hibridao in situ entre o DNA dos clones recombinantes e uma sonda de DNA radioactiva consiste em uma sonda radioativa (como um cDNA purificado, um RNA mensageiro purificado ou um oligonucleotdeo sinttico) marcadas in vitro com 32 P por nick translation (cDNA) ou por quinao (oligonucleotdeo de sntese, RNA poli (A)+ ) que ir se ligar ao DNA da bactria se o a sequencia tambm estiver presente. No mtodo de seleo do mensageiro especfico por hibridao com o DNA recombinante e traduo in vitro, o DNA plasmdico dos clones isolado e em seguida fixo num filtro de nitrocelulose. Em condies apropriadas de temperatura e de fora inica, hibrida-se com o RNA mensageiro total que serviu para a sntese do DNA complementar. S o RNA mensageiro, que possui seqncias complementares das do DNA imobilizado no suporte, permanecer associado a este. Pode-se assim isolar este RNA mensageiro, extrai-lo do suporte e traduzi-lo num sistema de traduo in vitro. O produto codificado pelo RNA mensageiro em seguida identificado por imunoprecipitao com um anticorpo dirigido contra a protena cujo mensageiro foi clonado. A tcnica de Southern Blotting serve para localizar seqncias particulares de DNA nos fragmentos de restrio, utiliza-se o mtodo desenvolvido por Southern. O DNA clivado em fragmentos, que so separados em gel de agarose e em seguida transferidos para uma folha de nitrato de celulose. O filtro depois hibridado com uma sonda radioativa apropriada. A autorradiografia da folha de nitrocelulose, depois de lavada, revela fragmentos contendo sequncias complementares das da sonda utilizada. Uma tcnica anloga existe para a caracterizao do RNA (chamada neste caso Northern blotting): os RNA totais ou mensageiros so separados em gel de agarose e depois transferidos para um suporte apropriado (nitrocelulose ou papel activado). A hibridao com uma sonda marcada permite em seguida conhecer o nmero e o comprimento dos RNA mensageiros complementares da sonda. 4.4- REGULAMENTAO SOBRE OGM

A utilizao de microrganismos bem controlada, e existem regras como a GILSP (Good Industrial Large-Scale Practice) que estipula que o organismo que ir receber a seqncia gnica exgena dever ser no patognico, no deve conter elementos patognicos como vrus, fagos e plasmdios, deve ter uma longa histria de uso seguro na indstria ou ter limitaes ambientais de crescimento (ou seja, ele necessita de uma condio ambiental controlada industrialmente para crescer, caso contrrio ela morrer). No caso de ser um organismo patognico ele deve ser manuseado com muita cautela e deve ser conhecido um tratamento eficiente para a doena caso haja algum escape. O local de manipulao desses microrganismos tambm deve ser observado de acordo com as caractersticas por ele apresentadas. Equipamentos, tcnicas de operao e local adequado para manipulao de determinados microrganismos esto presentes em Guideline for Industrial Application of Recombinant DNA Technology, que foi publicado pelo ministrio de troca internacional e indstria do Japo. No Brasil, a lei federal nmero 1.105 de maro de 2005 (mostrada em parte abaixo) estabelece normas de segurana, e mecanismos de fiscalizao de organismos geneticamente modificados (OGM). Art. 1o Esta Lei estabelece normas de segurana e mecanismos de fiscalizao sobre a construo, o cultivo, a produo, a manipulao, o transporte, a transferncia, a importao, a exportao, o armazenamento, a pesquisa, a comercializao, o consumo, a liberao no meio ambiente e o descarte de organismos geneticamente modificados OGM e seus derivados, tendo como diretrizes o estmulo ao avano cientfico na rea de biossegurana e biotecnologia, a proteo vida e sade humana, animal e vegetal, e a observncia do princpio da precauo para a proteo do meio ambiente. 1o Para os fins desta Lei, considera-se atividade de pesquisa a realizada em laboratrio, regime de conteno ou campo, como parte do processo de obteno de OGM e seus derivados ou de avaliao da biossegurana de OGM e seus derivados, o que engloba, no mbito experimental, a construo, o cultivo, a manipulao, o transporte, a transferncia, a importao, a exportao, o armazenamento, a liberao no meio ambiente e o descarte de OGM e seus derivados. 2o Para os fins desta Lei, considera-se atividade de uso comercial de OGM e seus derivados a que no se enquadra como atividade de pesquisa, e que trata do cultivo, da produo, da manipulao, do transporte, da transferncia, da comercializao, da importao, da exportao, do armazenamento, do consumo, da liberao e do descarte de OGM e seus derivados para fins comerciais. Art. 2o As atividades e projetos que envolvam OGM e seus derivados, relacionados ao ensino com manipulao de organismos vivos, pesquisa cientfica, ao desenvolvimento tecnolgico e produo industrial ficam restritos ao mbito de entidades de direito pblico ou privado, que

sero responsveis pela obedincia aos preceitos desta Lei e de sua regulamentao, bem como pelas eventuais conseqncias ou efeitos advindos de seu descumprimento. 1o Para os fins desta Lei, consideram-se atividades e projetos no mbito de entidade os conduzidos em instalaes prprias ou sob a responsabilidade administrativa, tcnica ou cientfica da entidade. 2o As atividades e projetos de que trata este artigo so vedados a pessoas fsicas em atuao autnoma e independente, ainda que mantenham vnculo empregatcio ou qualquer outro com pessoas jurdicas. 3o Os interessados em realizar atividade prevista nesta Lei devero requerer autorizao Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana CTNBio, que se manifestar no prazo fixado em regulamento. 4o As organizaes pblicas e privadas, nacionais, estrangeiras ou internacionais, financiadoras ou patrocinadoras de atividades ou de projetos referidos no caput deste artigo devem exigir a apresentao de Certificado de Qualidade em Biossegurana, emitido pela CTNBio, sob pena de se tornarem coresponsveis pelos eventuais efeitos decorrentes do descumprimento desta Lei ou de sua regulamentao. Art. 3o Para os efeitos desta Lei, considera-se: I organismo: toda entidade biolgica capaz de reproduzir ou transferir material gentico, inclusive vrus e outras classes que venham a ser conhecidas; I cido desoxirribonuclico - ADN, cido ribonuclico - ARN: material gentico que contm informaes determinantes dos caracteres hereditrios transmissveis descendncia; I molculas de ADN/ARN recombinante: as molculas manipuladas fora das clulas vivas mediante a modificao de segmentos de ADN/ARN natural ou sinttico e que possam multiplicar-se em uma clula viva, ou ainda as molculas de ADN/ARN resultantes dessa multiplicao; consideram-se tambm os segmentos de ADN/ARN sintticos equivalentes aos de ADN/ARN natural; IV engenharia gentica: atividade de produo e manipulao de molculas de ADN/ARN recombinante; V organismo geneticamente modificado - OGM: organismo cujo material gentico ADN/ARN tenha sido modificado por qualquer tcnica de engenharia gentica; VI derivado de OGM: produto obtido de OGM e que no possua capacidade autnoma de replicao ou que no contenha forma vivel de OGM;

VII clula germinal humana: clula-me responsvel pela formao de gametas presentes nas glndulas sexuais femininas e masculinas e suas descendentes diretas em qualquer grau de ploidia; VIII clonagem: processo de reproduo assexuada, produzida artificialmente, baseada em um nico patrimnio gentico, com ou sem utilizao de tcnicas de engenharia gentica; IX clonagem para fins reprodutivos: clonagem com a finalidade de obteno de um indivduo; X clonagem teraputica: clonagem com a finalidade de produo de clulastronco embrionrias para utilizao teraputica; XI clulas-tronco embrionrias: clulas de embrio que apresentam a capacidade de se transformar em clulas de qualquer tecido de um organismo. 1o No se inclui na categoria de OGM o resultante de tcnicas que impliquem a introduo direta, num organismo, de material hereditrio, desde que no envolvam a utilizao de molculas de ADN/ARN recombinante ou OGM, inclusive fecundao in vitro, conjugao, transduo, transformao, induo poliplide e qualquer outro processo natural. 2o No se inclui na categoria de derivado de OGM a substncia pura, quimicamente definida, obtida por meio de processos biolgicos e que no contenha OGM, protena heterloga ou ADN recombinante. Art. 4o Esta Lei no se aplica quando a modificao gentica for obtida por meio das seguintes tcnicas, desde que no impliquem a utilizao de OGM como receptor ou doador: I mutagnese; I formao e utilizao de clulas somticas de hibridoma animal; I fuso celular, inclusive a de protoplasma, de clulas vegetais, que possa ser produzida mediante mtodos tradicionais de cultivo; IV autoclonagem de organismos no-patognicos que se processe de maneira natural. Art. 5o permitida, para fins de pesquisa e terapia, a utilizao de clulastronco embrionrias obtidas de embries humanos produzidos por fertilizao in vitro e no utilizados no respectivo procedimento, atendidas as seguintes condies: I sejam embries inviveis; ou I sejam embries congelados h 3 (trs) anos ou mais, na data da publicao desta Lei, ou que, j congelados na data da publicao desta Lei, depois de completarem 3 (trs) anos, contados a partir da data de congelamento.

 1o Em qualquer caso, necessrio o consentimento dos genitores. 2o Instituies de pesquisa e servios de sade que realizem pesquisa ou terapia com clulas-tronco embrionrias humanas devero submeter seus projetos apreciao e aprovao dos respectivos comits de tica em pesquisa. 3o vedada a comercializao do material biolgico a que se refere este artigo e sua prtica implica o crime tipificado no art. 15 da Lei no 9.434, de 4 de fevereiro de 1997. Art. 6o Fica proibido: I implementao de projeto relativo a OGM sem a manuteno de registro de seu acompanhamento individual; I engenharia gentica em organismo vivo ou o manejo in vitro de ADN/ARN natural ou recombinante, realizado em desacordo com as normas previstas nesta Lei; I engenharia gentica em clula germinal humana, zigoto humano e embrio humano; IV clonagem humana; suaregulamentao; V destruio ou descarte no meio ambiente de OGM e seus derivados em desacordo com as normas estabelecidas pela CTNBio, pelos rgos e entidades de registro e fiscalizao, referidos no art. 16 desta Lei, e as constantes desta Lei e de VI liberao no meio ambiente de OGM ou seus derivados, no mbito de atividades de pesquisa, sem a deciso tcnica favorvel da CTNBio e, nos casos de liberao comercial, sem o parecer tcnico favorvel da CTNBio, ou sem o licenciamento do rgo ou entidade ambiental responsvel, quando a CTNBio considerar a atividade como potencialmente causadora de degradao ambiental, ou sem a aprovao do Conselho Nacional de Biossegurana CNBS, quando o processo tenha sido por ele avocado, na forma desta Lei e de sua regulamentao; VII a utilizao, a comercializao, o registro, o patenteamento e o licenciamento de tecnologias genticas de restrio do uso. Pargrafo nico. Para os efeitos desta Lei, entende-se por tecnologias genticas de restrio do uso qualquer processo de interveno humana para gerao ou multiplicao de plantas geneticamente modificadas para produzir estruturas reprodutivas estreis, bem como qualquer forma de manipulao gentica que vise ativao ou desativao de genes relacionados fertilidade das plantas por indutores qumicos externos.

Art. 7o So obrigatrias: I a investigao de acidentes ocorridos no curso de pesquisas e projetos na rea de engenharia gentica e o envio de relatrio respectivo autoridade competente no prazo mximo de 5 (cinco) dias a contar da data do evento; I a notificao imediata CTNBio e s autoridades da sade pblica, da defesa agropecuria e do meio ambiente sobre acidente que possa provocar a disseminao de OGM e seus derivados; I a adoo de meios necessrios para plenamente informar CTNBio, s autoridades da sade pblica, do meio ambiente, da defesa agropecuria, coletividade e aos demais empregados da instituio ou empresa sobre os riscos a que possam estar submetidos, bem como os procedimentos a serem tomados no caso de acidentes com OGM. 5- EXEMPLOS DE MICRORGANISMOS MELHORADOS Na produo de antibiticos o melhoramento dos fungos produtores foi de extrema importncia para o aumento da produtividade nessa indstria. Com relao produo de penicilina por Penicillium chrysogenum, a produo inicial era muito baixa, com 2mg de antibitico por litro de meio. Atravs de seleo das linhagens, foram obtidas cepas com produo de 60mg/litro. A utilizao de tcnicas mutagnicas propiciou um grande aumento da produo e das condies de cultivo, chegando a 7g/litro. Atualmente, estima-se que as linhagens industriais de Penicillium so capazes de produzir mais de 50g/litro, ou seja, houve um aumento de 25.0 vezes na produtividade. Alm da penicilina, vrios outros antibiticos tiveram a sua produo aumentada devido s tcnicas de meloramento de microrganismos. A produo de cidos orgnicos por fungos como Aspergillus niger, foi tambm melhorada devido manipulao gentica. No laboratrio do Setor de Gentica de Microrganismos do Instituto de Gentica da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz da USP, uma linhagem industrial utilizada para produo de cido ctrico em cultura de superfcie foi melhorada atravs de tcnicas de mutao, seleo e fuso de protoplastos, obtendo-se um aumento na produo de at 30% de cido em relao cultura original. Quando as linhagens melhoradas foram levadas indstria, ocorreram aumentos considerveis na produo de cido ctrico. No desenvolvimento de processos de produo de etanol, procura-se tambm melhorar as linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae utilizada. Cepas mais produtivas, com caractersticas desejveis para produo de etanol e com monitoramento na indstria por tcnicas de marcao molecular, foram desenvolvidas em vrios laboratrios. Por tecnologia do DNA recombinante, os laboratrios de pesquisa das universidades de Braslia e da USP desenvolveram em conjunto linhagens de leveduras contendo genes de amilases capazes de utilizar o amido de mandioca ou batata-doce durante a fermentao. Essas leveduras manipuladas geneticamente esto sendo aperfeioadas e podero desempenhar um importante papel na produo de etanol.

Na fabricao do vinho tambm se tem utilizado a fuso de protoplastos para o melhoramento das cepas. Os hbridos entre as leveduras Saccharomyces cerevisiae e Schizossaccharomyces pombe reunem caractersticas favorveis dos dois gneros de fungos em uma s clula. Esta, multiplicada e retrocruzada com a linhagem original de Saccharomyces cerevisiae, resultou em linhagem capaz de utilizar uvas cidas, como as que ocorrem em certas safras na regio Sul do pas, na produo de vinhos finos, sem necessidade de utilizao de fermentaes mistas ou a adio de acar. 6- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ADRIO, J. L.; DEMAIN, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol Rev 30, 187-214, 2006. ARAJO, W. L. Gentica e Melhoramento de fungos na Biotecnologia. Disponvel em: < http://w.ufv.br/dbg/trab2002/MELHOR/MHR004.htm > Acesso em: 19 de abril de 2008. BULOCK, J.; KRISTIANSEN, B. Biotecnologia bsica. Editorial Acribia, Zaragoza, 1991, 557 p. CRUEGER, W.; CRUEGER, A. Biotecnologa: Manual de microbiologia industrial. Editorial Acribia, Zaragoza, 1993, 413 p. DRAKE, J. W. Mutagenic Mechanisms. Annu. Rev. Genet. 3: 247-268, 1969. Fungi Introduction. Disponvel em :< http://www2.mcdaniel.edu/Biology/botf99/fungifromweb/fungiintro.html > Acesso em: 19 de abril de 2008. GRIFFITHS, A. J. F.; WESSLER, S. R.; LEWONTIN, R. C.; GELBART, W. M.; SUZUKI, D. T.; MILLER, J. H. Introduction to Genetic Analysis. 8th edition, W. H. Freeman, 2004, 800 p. GROSS, T. FAULL, J.; KETTERIDGE, S.; SPRINGHAM, D. Introductory Microbiology. Chapman & Hall, London, 1995, 414 p. KAVA-CORDEIRO, V.; LUNA-ALVES-LIMA, E. A.; AZEVEDO, J. L. Survival and mutant production induced by mutagenic agents in Metarhizium anisopliae. KRISTIANSEN, B.; RATLEDGE, C. Basic Biotechnology. Third Edition. Cambrige University Press, 2006, 6 p. MARTINS, C. V. B.; HORII, J.; PIZZIRANI-KLEINER, A. A. Fuso de protoplastos de Saccharomyces cerevisiae avaliada por floculao e produo de H2S. Sci. Agric. Vol. 5, N 1, Piracicaba, jan/apr 1998.

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