UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS, FSICAS, MATEMTICAS, FARMACIA E INFORMATICA

Proyecto de tesis DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA COLINESTERASA ERITROCITARIA EN TRABAJADORES DE LOS ALRREDEDORES DE LA CIUDAD DEL CUSCO EXPUESTOS, NO EXPUESTOS A ORGANOFOSFORADOS

PRESENTADO POR: ROSA MARINA CASAVERDE PUMACAYO JUAN JOEL QUISPE HUISA

ASESORES: o Q.F. CARLOS ALBERTO MOREYRA PACHAS o Blga LUZ MARINA CUSCO PER 2013

INDICE INTRODUCCION CAPITULO I 1. GENERALIDADES 1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.2. FORMULACION DEL PROBLEMA 1.3. OBJETIVOS 1.3.1. OBJETIVOS GENERALES 1.3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS 1.4. LIMITACIONES DE LA INVESTIGACION 1.5. JUSTIFICACION E IMPORTANCIA 1.5.1. JUSTIFICACION TEORICA 1.5.2. JUSTIFICACION METODICA 1.5.3. JUSTIFICACION PRACTICA 1.5.4. JUSTIFICACION LEGAL 1.6. HIPOTESIS CAPITULO II 2. MARCO TEORICO CONCEPTUAL 2.1. VISION HISTORICA 2.2. ANTECEDENTES 2.3. ESTADO DE LA CUESTION 2.4. BASES TEORICO CIENTIFICAS 2.5. MARCO CONCEPTUAL O DEFINICION DE TERMINOS BASICOS CAPITULO III 3. MATERIALES Y METODOS 3.1. MATERIALES 3.2. DISEO METODOLOGICO 3.2.1. NIVEL Y TIPO DE INVESTIGACION 3.2.2. DISEO DE LA INVESTIGACION 3.2.3. VARIABLES 3.2.4. POBLACION Y MUESTRA 3.2.5. CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION 3.2.6. TECNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS 3.2.7. TECNICAS PARA EL PROCESAMIENTO Y ANALISIS DE LA INFORMACION 3.3. PROCEDIMIENTO

CAPITULO IV

4. RECURSOS 4.1. HUMANOS 4.2. DE INFRAESTRUCTURA 4.3. ECONOMICOS CAPITULO V 5. PRESUPUESTO CAPITULO VI 6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES BIBLIOGRAFIA

INTRODUCCION

Organofosforados y carbamatos son los plaguicidas ms utilizados. Sus principales efectos en la salud son producidos por la inhibicin de la acetilcolinesterasa.

El diagnstico de intoxicacin se realiza comparando el porcentaje de disminucin en relacin a la concentracin basal.

Los plaguicidas son utilizados en actividades de salud pblica, comercio, uso domstico y principalmente en la agricultura, con el fin de prevenir, destruir, repeler o atenuar alguna plaga, que puede ir desde insectos, animales, hierba mala hasta microorganismos. Debido a su amplio uso, es posible que casi todos tengamos un antecedente de exposicin, pero, probablemente los trabajadores agrcolas son los ms expuestos a los plaguicidas. En el mercado mundial, existen un gran nmero de plaguicidas que pueden ser agrupados segn su origen qumico como: organofosforados, carbamatos, organoclorados, piretroides, etc. De estos los organofosforados y los carbamatos son los ms utilizados a nivel mundial y a su vez los ms txicos. Su toxicidad recae principalmente sobre el sistema nervioso, inhibiendo la acetilcolinesterasa neuronal, produciendo un incremento de la acetilcolina en la sinapsis desencadenando un sndrome colinrgico agudo va una neurotransmisin continua, que puede llevar a la muerte si no existe una apropiada y rpida intervencin. Los organofosforados considerados ms txicos que los carbamatos. Esto se debe a que los organofosforados inhiben la acetilcolinesterasa de manera irreversible mientras que los carbamantos lo hacen de manera reversible. Para la aplicacin de

plaguicidas se ha reportado que la exposicin crnica a organofosforados produce neurotoxicidad por lo mencionado anteriormente se puede deducir que entre los trabajadores agrcolas representan un mayor riesgo, este riesgo aumenta cuando no se tiene el entrenamiento adecuado.

La evaluacin de riesgo de toxicidad hacia plaguicidas organofosforados y carbamatos involucra la determinacin de indicadores biolgicos de exposicin, los cuales pueden servir como una alarma previa a la aparicin de las manifestaciones clnicas.

El presente trabajo tiene como objetivo conocer las medidas de proteccion utilizadas en la manipulacion deplaguicidas anticolinesterasicos asi como la actividad de la colinesterasa plasmatica.

CAPTULO I

CAPITULO I GENERALIDADES 1.1.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA: Los plaguicidas son sustancias qumicos que se han venido utilizando en gran escala en el mbito mundial. (Blanca de F, R. 1981). Simultneamente con el aumento del uso de plaguicidas, crecieron muy significativamente los accidentes y enfermedades asociadas. Segn datos de la OMS, anualmente se intoxican dos millones de personas por exposicin directa o indirecta a plaguicidas. De ese total, las 3/4 partes de afectados pertenecen a los pases subdesarrollados, donde nicamente se utiliza el 25% de la produccin mundial de plaguicidas. (Olivera B. y Rodrguez D). La exposicin a plaguicidas supone siempre un riesgo para la salud de las personas, por la posibilidad de que produzcan efectos o acciones perjudiciales. Eso quiere decir que aunque no todas las personas que estn en contacto con plaguicidas sufren daos en su salud, lo que si tienen son ms posibilidades de llegar a sufrirlos (Montiel, L. 2012.). El principal efecto txico de estos compuestos consiste en la inhibicin de las enzimas con actividad colinesterasa (ChE). (Guilhermino et al., 1998).Esta enzimatiene la facultad de desactivarla acetilcolina al dividirla en sus dos componentes: el cido actico y la colina. Cuando el organismo sufre los efectos txicos de estos pesticidas, esta actividad enzimtica, tiende a inhibirse de manera progresiva. De ah la importancia de hacer exmenes peridicos de laboratorio, para determinar la concentracin de la colinesterasa en sangre. (Virginia, T. 1992). La determinacin de las colinesterasas ha adquirido gran importancia clnica debido a la amplia aplicacin de plaguicidas organofosforados y carbamatos. Estos compuestos son potentes inhibidores de ambas enzimas, produciendo disminuciones de la actividad de la colinesterasa srica y eritroctica debido a inhalacin, ingestin a absorcin por piel. (Trundle D, Macial G. 1988).

El mtodo ms utilizado para la determinacin de colinesterasa es el de Ellman (Ellman et al., 1961) en sangre entera. Este mtodo detecta la aparicin de tiocolina tras la hidrlisis del sustrato acetiltiocolina (ATCh) por la colinesterasa. La tiocolina reacciona con el cromforo, el cido5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB), para producir un compuesto de color amarillo, el cido 5-tio-2-nitrobenzoico, que puede ser medido espectrofotomtricamente a una longitud de onda de 412 nm. Recientemente se ha recomendado el empleo de dos sustratos, acetiltiocolina y butiriltiocolina (BTCh), para analizar una misma muestra de sangre entera, ya que permite la monitorizacin tanto de AChE como de BChE, y por tanto una deteccin ms precisa de la exposicin a agentes inhibidores de la colinesterasa (Tecles y Cern, 2001). El presente trabajo, es muy importante para evaluar el riesgo sobre la salud (de los trabajadores agricolas) por la exposicin a estos productos inhibidores de la colinesterasa, considerndose para nuestro estudio la ciudad del Cuso. Dicho trabajo nos permitir conocer los niveles de actividad de la colinesterasa srica en estos pobladores.

1.2.- FORMULACION DEL PROBLEMA:

Cmo influir los compuestos organofosforados en la actividad de la colinesterasa eritrocitaria en trabajadores expuestos, en comparacin con personas no expuestos y consumidores de coca en la ciudad de cusco?

1.3.- OBJETIVOS 1.3.1.- OBJETIVO GENERAL: Determinar la actividad de la colinesterasa eritrocitaria en los trabajadores agrcolas de la ciudad de cusco expuestos, no expuestos a

organofosforados y consumidores de coca

1.3.2.- OBJETIVOS ESPECIFICOS:

Determinar los niveles de actividad de la enzima colinesterasa srica en muestras de sangre tomadas a un grupo de trabajadores expuestos a plaguicidas que contienen compuestos que inhiben esta enzima y a un grupo de control no expuesto a estos plaguicidas.

Evaluar los parmetros hematolgicos en trabajadores expuestos a Organofosforados.

Informar a la Direccin Regional de Salud (DIRESA) sobre los estudios realizados.

1.4.- JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION:

JUSTIFICACION TEORICA La finalidad de este estudio ser informar a los trabajadores y a las autoridades encargadas, como el SENASA (Servicio Nacional de Saneamiento Ambiental), ministerio de agricultura y afines, los resultados finales obtenidos y de los riesgos que implican su uso, as como los perjuicio que traen estos sobre la salud de pblico consumidor y poder de este modo controlar con mayor eficacia la utilizacin de estos insecticidas organofosforados.

JUSTIFICACION PRACTICA Los resultados obtenidos aportaran nuevas alternativas para mejorar el uso de insecticidas y evitar intoxicaciones crnicas Dar a conocer los efectos sobre la salud de estos productos

organofosforados en personas que expenden dichos productos.

La investigacin ser til para que se tomen medidas de seguridad para reducir la exposicin a estos productos.

JUSTIFICACIN LEGAL A las personas que son objeto de investigacin se les informa debidamente de lo que vamos ha hacer segn lo indica la ley de salud en su titulo I en el numero 3 de los deberes y responsabilidades concernientes a la salud individual ya que necesitamos de estas su consentimiento como brindndoles atencin medica caso que ocurra algn accidente ysobre todo informacin adecuada con practicas de salud e higiene

1.5.- LIMITACIONES

Se limita solo a una pequea poblacin a los trabajadores agrcolas de los alrededores de a la ciudad del cusco Se limita solo a la evaluacin de los niveles de colinesterasa eritrocitara mas no al tratamiento

1.6 HIPOTESIS La exposicin a organofosforados influye en la actividad de enzima colinesaterasa eritrositaria en los trabajadores expuestos en comparacion a los no expuestos causando intoxicacion crnica que puede afectar la salud de los pobladores

10

CAPTULO II

11

CAPITULO II

MARCO TEORICO

2.1.- VISION HISTORICA:

Comienzos de la Utilizacin de Plaguicidas en la Historia. Existe evidencia histrica que la primera civilizacin en utilizar plaguicidas, fueron los egipcios a orillas del Ro Nilo. Existen papiros que detallan el uso de soluciones de cobre para el control de hongos en cebada y el uso de soluciones acuosas de

compuestos arsenicales para el control de la langosta. (Agriculture, history of -www. Enciclopedia Britannica.com).

Desde pocas remotas el hombre a combatido a las plagas y , por lo tanto, a utilizado plaguicidas .la primera etapa de la historia de los plaguicidas abarco desde antes de cristo hasta mediados del siglo XIX y se le suele llamar era de los productos naturales homero escribi acerca de las propiedades purificadoras del azufre, pues se sabia que esta sustancia atacaba a los mohos otros datos son que el uso de las flores de piretro como insecticidas se remonta a los tiempos de jerjes, rey de Persia y que los chinos utilizaron los arsenitos para el control de roedores y otras plagas desde el ao 900 de nuestra era durante los dos ltimos siglos de esta etapa se utilizaron como plaguicidas sustancias mas complejas, como el jabn, pero que seguan siendo naturales.(Lilia A ,Albert1997)

Los plaguicidas organofosforados se desarrollaron en Alemania, a partir de las investigaciones sobre gases neurotxicos que se llevaron a cabo en ese pas para usar dichos gases como armas qumicas. Los plaguicidas que derivan de esteres carbamicos,tambin conocidos como carbamatos,se descubrieron en 1947. (Lilia A,Albert 1997)

12

Los insecticidas organofosforados son sustancias biodegradables en la naturaleza sin tendencia a acumularse en las grasas del organismo,que forman parte del grupo de insecticidas llamados de contacto,porabsorberse por intermedio de los lpidos del caparazn de los insectos. Son muy activos contra un gran numero de especies de insectos,todo lo cual hace de ellos los insecticidas mas ampliamente extendidos en la actualidad. Desde 1942 se ha sintetizado mas de 50000 derivados organofosforados,algunos de los cuales fueron con fines blicos (gas GB, gas nervino, trilones, sarn, tabun); no menos de 50 derivados han sido comercializados como insecticidas (Gisbert J.A)

Los insecticidas organofosforados (OP) son muy txicos y liposolubles y su frmula general deriva del cido fosfrico, como se aprecia en la estructura qumica del paratin. Pertenecen a diferentes familias: fosfatos, fosfonatos, fosforoamidotioatos, fosforodiamidatos, varias de ellas azufradas. (Ferrer A 2003)

2.2.- ANTECEDENTES Nacionales

Niveles de colinesterasa srica en agricultores de la localidad de Carapongo (Per) y determinacin de residuos de plagicidas inhibidores de la Acetilcolinesterasa en frutas y hortalizas cultivadas. Milla Cotos, Oscar Manuel; Palomino Horna, William Rodolfo Se realiz la determinacin de la actividad de la colinesterasa srica en 134 muestras biolgicas (109 muestras de agricultores que trabajan con pesticidas inhibidores de la colinesterasa y 25 de un grupo de control (grupo no expuesto a los pesticidas)) y el anlisis toxicolgico en 300 muestras de productos vegetales [coliflor (Brassicaoleraceavar. botrytis), tomate (Lycopersiconesculentum), apio (Apiumgraveolens), lechuga (Lactuca sativa L.), maracuy (Passifloraedulis)]

13

procedentes de la localidad de Carapongo, distrito de Lurigancho - Chosica, Lima Per. La cuantificacin de la actividad de la colinesterasa srica se realiz empleando la tcnica de Ellman modificada mediante espectrofotometra de luz ultra violeta. El anlisis de plaguicidas se realiz por cromatografa en capa fina (CCF). El valor promedio de actividad de la colinesterasa srica en los agricultores que trabajan con los pesticidas fue de 1827,18 mU/mL D.E. +/- 269,99 (valor mximo: 2540,09 mU/mL; valor mnimo: 1294,54 mU/mL) y en el grupo control fue de 2263,92 mU/mL D.E. +/- 216,40 (valor mximo: 2771,01 mU/mL; valor mnimo: 1959,30 mU/mL); Valor normal de actividad de la colinesterasa srica: 1800 - 3600 mU/mL. 55,05 % de los agricultores que trabajan con los pesticidas presentaron valores por debajo de los niveles normales de actividad de la colinesterasa srica (58,89 % de los varones y el 36,84 % de las mujeres). El grupo de agricultores cuyos tiempos de trabajo es superior a los 40 aos era el que tena el nivel promedio de actividad de colinesterasa srica ms bajo (1596,99 mU/mL). Los plaguicidas detectados en las muestras de productos vegetales antes de la cosecha fueron: metamidofos (24,67 %), clorpirifos (15,33 %), metomilo (14,67 %) y dimetoato (8,67 %), tambin %) se encontraron las combinaciones: (6,67 %),

metamidofos/metomilo

(11,33

dimetoato/metomilo

metamidofos/clorpirifos (11,99 %), metamidofos/dimetoato (6,67 %). http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtual/tesis/salud/milla_c_o/resumen.htm

14

Internacionales

Determinacin de niveles basales de colinesterasa en jornaleros agrcolas

Organofosforados y carbamatos son los plaguicidas ms utilizados. Sus principales efectos en la salud Son producidos por la inhibicin de la acetilcolinesterasa. El diagnstico de intoxicacin se realiza comparando el porcentaje de disminucin en relacin a la concentracin basal. No obstante, sta muy rara vez es realizada. Materialy mtodos: Se llev a cabo un estudio transversal con 463 trabajadores de una compaa agrcola en Sinaloa, Mxico. Se aplic un cuestionario y la concentracin de colinesterasa fue determinada con el mtodo Magnotti. Los criterios de exclusin fueron, exposicin a plaguicidas y/o hemorragia de tracto digestivo en los ltimos dos y seis meses respectivamente. Se utiliz prueba T para diferencia de medias entre dos grupos, anlisis de varianza para diversos grupos y prueba de Tukey para comparaciones mltiples. Resultados: El nivel promedio de colinesterasa fue de 4.22 U/mL .77; de hemoglobina, 12.9 g/dL 1.82, y colinesterasa ajustada 33.1 U/g 6.79. Colinesterasa y hemoglobina fueron ms altas en hombres que en mujeres, p = 0.000; colinesterasa ajustada fue ms alta en mujeres p = 0.005. Se detect anemia en 55% de mujeres, 51% de nios y 15% de hombres. Hubo diferencias significativas segn edad, p = 0.03 y lugar de origen de los trabajadores p = 0.001. Conclusiones: Los niveles basales de colinesterasa fueron ms altos que los reportados por el mtodo Magnotti. La alta prevalencia de anemia indica que es indispensable que todas las mediciones de colinesterasa incluyan el ajuste de acuerdo con el nivel de hemoglobina. Dada la frecuente imposibilidad de llevar a cabo determinaciones basales, este estudio podra ser utilizado como un referente.

15

AUTORES

Martha Edilia Palacios Nava,1 Guadalupe Silvia Garca de la Torre,1 Mara del Pilar Paz Romn1 1Departamento de Salud Pblica, Facultad de Medicina, UNAM Rev Medigraphic Artemisa Vol. 52 No. 2 Marzo-Abril, 2009

Valores de referencia de actividad colinestersica sangunea en Poblacin laboral activa no expuesta a plaguicidas inhibidores de colinesterasa

El uso extendido de plaguicidas inhibidores de colinesterasas obliga a disponer de valores de referencia en personas sanas para la correcta toma de decisiones clnicas y epidemiolgicas. En Colombia se carece de estos valores y por ello se decidi realizar este estudio. Se disearon estadsticamente dos muestras representativas de las poblaciones laborales activas, afiliadas al Seguro Social, residentes en el Valle de Aburr o en el cercano Oriente antioqueo. Se midi la actividad colinesterasa por seis tcnicas diferentes y aqu se informan los resultados con la tcnica Lovibond, que usa sangre total. Se estudiaron 827 personas, 415 en Aburr y 412 en Oriente, tanto hombres como mujeres, con edad entre 18 y 75 aos, pero slo para los menores de 50 aos se logr reunir la cantidad de personas exigidas por el diseo. El promedio de enzima es mayor en Aburr que en Oriente, pero sin diferencia estadsticamente significativa (d.e.s: p < 0.05): 92,55 y 91,72%, en su orden (F = 0,946; p = 0,3415). En ambas regiones la actividad enzimtica masculina es superior a la femenina: en Aburr 93,95 y 91,15%; en Oriente 94,15 y 89,31%; hay d.e.s. entre ellas en ambas zonas. En los menores de 50 aos, la variable edad no tiene efecto en el comportamiento del Lovibond. No hay d.e.s. entre nuestro promedio y los del fabricante ni en hombres ni en mujeres. Los estndares extranjeros del Lovibond concuerdan con los hallados por Henao y colaboradores en nios trabajadores de Antioquia y con los nuestros.

16

AUTORES

Jaime Carmona-Fonseca / Samuel Henao H. / Roco Garcs M.

Revista de la Facultad Nacional de Salud Pblica, ao/vol. 18, nmero 002 Universidad de Antioquia Medelln, Colombia

Diferencias en la ejecucin cognitiva y actividades colinesterasa en adolescentes con exposicin ambiental a plaguicidas en Jujuy (Argentina) Algunos estudios indican que los plaguicidas afectan la funcin neurolgic, aunque existen datos contradictorios. El objetivo de esta investigacin fue medir diferencias en la ejecucin motora y en actividad colinesterasa en adolescentes segn la exposicin a plaguicidas. La hiptesis es encontrar funciones motoras disminuidas en la poblacin ms expuesta a esta contaminacin ambiental. En este trabajo se han estudiado adolescentes procedentes de tres zonas con diferente grado de exposicin ambiental a plaguicidas. Se realizaron pruebas neuronconductuales para evaluar la ejecucin cognitiva y pruebas bioqumicas para cuantificar los niveles de Acetilcolinesterasa eritrocitaria y plasmtica. La evaluacin conductual se llev a cabo mediante una Historia clnica neurolgica estndar; la prueba de Dgitos (evala memoria a corto plazo) y la prueba de Dgitos y Smbolos de la Escala Wechsler de Inteligencia para Nios, (evala codificacin de las percepciones visuales y la prueba de Vigilancia de Dgitos de Lewis (evala atencin sostenida). Tanto en la prueba que meda memoria a corto plazo (dgitos), como la que meda codificacin de las percepciones visuales (dgitos-smbolos), los adolescentes de la zona de mayor exposicin mostraron una peor ejecucin que los alumnos de las localidades con menor exposicin. Los niveles de colinesterasa plasmtica (indicador de intoxicacin aguda) fueron similares en las tres poblaciones y en todas ellas se encontraba dentro del rango de normalidad. Por otra parte, la

17

colinesterasaeritrocitaria (indicador de intoxicacin crnica) se encontraba por debajo del lmite inferior de normalidad los adolescentes de las localidades con mayor exposicin en comparacin a los de menor exposicin, cuya

colinesterasaeritrocitaria se encontraba dentro del rango de normalidad. Estos resultados parecen corroborar la hiptesis de partida ya que la poblacin ms expuesta es la que peor rendimiento tuvo mientras que la menos expuesta present mejores puntuaciones. En conclusin, las diferencias observadas en la memoria a corto plazo y en la codificacin de las percepciones visuales podra deberse a un efecto precoz del plaguicida sobre el cerebro an inmaduro de los adolescentes. AUTORES A. J. Martos Mula, E. N. Figueroa, M. A. Ruggeri, S. A. Giunta, N. R. Wierna, M. Bonillo, M. G. Bovi

http://ojs.easyapps.es/index.php/revtoxicol/article/view/142 Actividad de las colinesterasas sanguneas en una poblacin de referencia costarricense

Se determina la actividad de las colinesterasas sanguneas, en una poblacin costarricense de 50 hombres y 50 mujeres, no expuesta a plaguicidas, utilizando el mtodo electromtrico de Michel. Se encuentra que hay relacin entre la actividad de las colinesterasas plasmticas y el sexo. Se estiman lmites de confianza al 95 por ciento para la actividad de las colinesterasas plasmticas y de glbulos rojos. La dispersin relativa (coeficiente de variacin) de los valores obtenidos en esta investigacin, estn en el mbito de los resultados encontrados en trabajos semejantes, e incluso en algunos casos, la diferencia entre dichos coeficientes no llega al 2 por ciento.

18

[Rev. Cost. Cienc. Md. 1984; 5(2):158-169].

Autores Sileny Vega S. *, Irma M. Maroto J. *, Claudia M. Ziga V. * Femando Ramrez H. *

Niveles de colinesterasa en manipuladores de plaguicidas de las Guaranas (San Francisco deMacors) y Colonia Kennedy (Constanza)

La colinesterasa son enzimas utilizados para medir los niveles de plaguicidas mediante la catalizacin de la hidrlisis de la acetilcolina en cido actico y colina. Paratales fines fue llevado a cabo un estudio descriptivo y prospectivo con el propsito de determinar dichos niveles en 105 manipuladores de plaguicidas mediante el mtodoLobivandR de los parajes Las Guranas (San Francisco de Macorls) y Colonia Kennedy (Constanza) durante el periodo Julio-Agosto del 2002. Encontrndose que 6 manipuladores (5.7%) tenlan niveles de colinesterasa entre 50-25%, compatible con intoxicacin por plaguicidas; 4 (66.7%) correspondieron al sexo masculino; 3 (50%) estaban comprendidos entre los 20-29 ar'los; 2 (33.3%); tenlan un nivel primario, 2 ms (33.3%) un nivel secundario y 3 (50%) laboraban como almacenistas.

Autores

YokastaMaria Delgado Nuez*, Rafel Reynoso*, Cruz Altagracia Robles Marrero*, Cecilia Miranda*, Ramon Emilio Diaz*

19

Validacin de la determinacin de acetilcolinesterasa eritroctica humana a 340 nm.

Introduccin. Se presenta la validacin de un mtodo de monitoreo continuo para la cuantificacin de acetilcolinesterasa eritroctica humana (EC. 3.1.1.7)

empleando cido 6-6- ditiodinicotnico (DTNA) como indicador.

Materiales y mtodos. Se emplearon muestras de sangre total recogida con EDTA como anticoagulante. En este mtodo la tiocolina liberada de la acetiltiocolina por la colinesterasa, reacciona con el DTNA liberando cido tionicotnico y el aumento de absorbancia a 340 nM es proporcional a la actividad de la enzima. La interferencia debida a colinesterasa plasmtica se elimina mediante el empleo de quinidina. Resultados. Las precisiones da a da para muestras con valores de colinesterasa bajos y altos mostraron coeficientes de variacin de 3,2 y 5,7 por ciento y en un mismo da de 2,9 y 1,5 por ciento respectivamente. La bilirrubina y la hemoglobina no presentan interferencia. El reactivo de DTNA almacenado en botella mbar es estable por al menos 6 meses a 4-8C. Al comparar los resultados con mtodos comerciales basados en la reaccin de Ellman se obtuvo una ecuacin de regresin lineal de Y = 0,987(X) + 222, con un coeficiente de correlacin (r) de 0,958 y una desviacin estndar sobre la lnea de regresin (Sy/x) de 359 U/L. Discusin. El mtodo evaluado constituye una alternativa precisa, sensible y conveniente para la determinacin de acetilcolinesterasa humana. Adems posee la gran ventaja sobre los mtodos con DTNB, de no sufrir interferencia por hemoglobina. Los datos obtenidos indican que el mtodo es lineal y reproducible dentro del intervalo en el que se espera encontrar los valores de las muestras. El estudio comparativo con mtodos comerciales mostr una buena correlacin. (Rev Biomed 2000; 11:161-168)

20

2.3.- ESTADO DE LA CUESTION El uso indiscriminado de los plaguicidas y el escaso conocimiento de sus efectos cronicos en las personas expuestas a sido motivo de numerosas investigaciones, una de las tecnicas mas utilizadas para medir el grado de afeccion en la salud es la medicion de los nivees de colinesterasa en sangre. Uno de los propositos de este trabajo es el de evaluar nosotros mismos la importancia que pueda tener las alteraciones de la colinestersasaserica trabajadores expuestos a organofosforados Se sabe a travez de la literatura mundial y de trabajos de investigacion que en algunos centros hospitalarios preferentemente quirurgicos han adoptado la conducta rutinaria de incluir la determinacio de colinesterasa serica como prueva preoperatoria, el otro proposito es el de cerciorarnos de la valida que en otros sitios se les da 2.4.- BASES TEORICO CIENTIFICAS PLAGUICIDAS El uso de los plaguicidas quimicos, con sus beneficios y sus efectos colaterales adversos, se ha convertido en un problema tanto emotivo como tecnico en todo el mundo. El gran numero de compuestos que se utilizan actualmente, la falta de control y registro adecuados, y la poca comprension de sus efectos colaterales, refleja el echo de que los productos agroquimicos, al igual que otras sustancias quimicas de origen industrial, se han usado en cantidades elevadas con base en las necesidaddes economicas de los paises, incluyendo en estas, la produccion de alimentos, fibras y materiales para la construccion destinados al consumo nacional y/o a la exportacion. (Arata A.) La Food and Agriculture Organization (FAO) de las Naciones Unidas establece que un plaguicida es la sustancia o mezcla de ellas, destinada a prevenir, destruir o controlar plagas, incluyendo los vectores de enfermedad humana o animal. (Ramrez, J. A. y Lacasaa, M. 2001) en

21

ORGANOFOSFORADOS Los insecticidas organofosforados son sustancias biodegradables en la naturaleza, sin tendencia a acumularseen las grasas del organismoo, que forman parte del grupo de insecticidas llamados de contacto, por absorverse por intermedio de los lipidos del caparazon de los insectos; son muy activos contra gran numero de de species de insectos. Todos ellos derivan de la molecula de acido fosforico. (Gisbert C) PROPIEDADES FISICOQUMICAS. Son steres del cido fosfrico, cuyo ncleo qumico es:

Existe una gran variedad de productos diferentes, debido a los diferentes radicales que se pueden presentar en las frmulas base. En general son fcilmente degradables a productos hidrosolubles, por lo que son fcilmente eliminados del organismo de los diferentes animales. Produciendo menos acumulacin de residuos que los organoclorados, por lo que su uso se ha extendido mucho. En cuanto al poder de disolucin, los hay de diferentes clases: (Junta de Andaluca, Espaa, 2005) Muy solubles en agua e insolubles en lpidos, resultan en productos de accin directa. Muy solubles en lpidos y poco solubles en agua, son productos que penetran bien en los tejidos pero no son transportados por va sistmica. Muy solubles en agua y solubilidad media en lpidos, son los que se difunden mejor por va sistmica.

22

PRINCIPALES ORGANOFOSFORADOS QUE AFECTAN AL HOMBRE Y OTROS SERES VIVOS Paratin Fenitrotin Diacinn Dimetoato Fentin Diclorvs Malatin Demetn

MECANISMO DE TOXICIDAD DE LOS ORGANOFOSFORADOS

Los agentes organofosforados actan al inhibir la accin de la acetilcolinesterasa sobre la sinapsis hstica (muscarinicas y nicotnicas), por deposito de un grupo fosforil en el centro de actividad de la enzima. Esta inhibicin favorece la

acumulacin excesiva de ACh y por ende, la sobreestimulacin de los receptores colinrgicos (Cabrera A. y Varela W. 2009)

MANIFESTACIONES CLNICAS

Sntomas y signos incluyen salivacin excesiva y lacrimacin, fasciculaciones y debilidad muscular, miosis, as como un olor caracterstico atribuido a los solventes hidrocarburos del pesticida. El paciente puede presentar

frecuentemente, depresin del estado de la conciencia e incluso convulsiones (Tabla 1). Otras manifestaciones de la inhibicin de la acetilcolinesterasa en el cerebro incluyen insomnio, cefalea, mareos y confusin. La intoxicacin severa con OP se asocia con disartria, coma y depresin respiratoria. Se describe clsicamente la bradicardia como una manifestacin tpica, pero algunos pacientes presentan taquicardia, atribuido a la estimulacin de receptores nicotnicos

23

preganglionares, sumado a un aumento de la secrecin de adrenalina y noradrenalina de las glndulas suprarrenales. Otro factor que puede contribuir con la taquicardia es la hipoxia por insuficiencia respiratoria.(Cabrera A. y Varela W. 2009)

Fuente: REVISTA MEDICA DE COSTA RICA Y CENTROAMERICA LXVI (588) 161-167; 2009 Cabrera A. y Varela W. 2009

FUENTES Y PATRONES DE EXPOSICIN

El medio ambiente es una fuente primordial de exposicin a plaguicidas, a partir de la actividad agrcola. Aproximadamente el 47% del producto aplicado se deposita en suelos y aguas colindantes o se dispersa en la atmsfera. Esta situacin depende de condiciones climticas como la lluvia y la direccin e intensidad del viento, de caractersticas geolgicas como el tipo de suelo y la presencia de corrientes de agua, y de otros factores como la frmula y la

24

presentacin del producto (lquido, polvo, gel, gas, etc.), as como de la tcnica de aplicacin (area, terrestre, etc.). Los vientos fuertes, las temperaturas altas y los terrenos poco estables favorecen el arrastre del producto, as como las presentaciones en polvo, aerosoles o humo y, por supuesto, las aplicaciones areas. (Ramrez, J. A. y Lacasaa, M.2001)

VAS DE ENTRADA

Las vas de entrada de los txicos ms frecuentes son la cutnea, incluida la exposicin a la ropa de trabajo, y la respiratoria (entre ambas el 77% de los casos) y la digestiva (14%). La va digestiva est muy asociada a comer, beber o fumar en el trabajo. (Cabanillas J. L. y Fernndez M. 1999)

DIAGNSTICO

El diagnstico de envenenamiento por organofosforado es primordialmente clnico, aunque idealmente podra ser confirmado con la medicin de la actividad de la butirilcolinesterasa plasmtica o acetilcolinesterasa de los glbulos rojos.6,14 La actividad de butirilcolinesterasa (pseudocolinesterasa) no est relacionada con la severidad del cuadro clnico, pero es un marcador de la exposicin a agentes organofosforados u otros inhibidores de colinesterasas y tambin es til para medir la eliminacin corporal del pesticida. Cuando la actividad de las

colinesterasas es menor del 80% del rango menor de referencia, es muy sugestivo de exposicin significativa a un organofosforado. Algunos estudios sugieren que la actividad de la acetilcolinesterasa de los hemates es un buen marcador de la funcin sinptica y las necesidades de atropina en un paciente intoxicado, y probablemente un marcador de severidad. Los pacientes con una actividad de acetilcolinesterasa mayor del 30% mantienen una funcin muscular normal y no requieren de la atropina. Cuando la actividad enzimtica desciende por debajo de 10% la actividad muscular empeora y requiere el uso de altas dosis de atropina.

25

La actividad enzimtica entre 10 y 30% se caracterizan por manifestaciones musculares moderadas y menor necesidad de atropina. (Cabrera A. y Varela W. 2009)

TRATAMIENTO

ELIMINACIN DEL TXICO Es necesario eliminar la mayor cantidad posible del txico para evitar su absorcin y contaminacin de personal sanitario. Va de entrada respiratoria: retirar al paciente de la zona contaminada Va de entrada cutneo-mucosa: Hay que desechar la ropa del paciente y lavar con abundante agua y jabn. Se recomienda que el personal que lo realice utilice sistemas de proteccin: guantes, mascarillas y gafas, as como una zona bien ventilada y rotacin del personal. Va de entrada digestiva: realizar lavado gstrico y administrar carbn activado a dosis de 1g/Kg. La eficacia es mayor si se inicia durante la primera hora tras la Ingestin (mejor 30 minutos). En medio

extrahospitalario se puede inducir el vmito si se va a demorar mucho la asistencia hospitalaria. Nunca administrar leche o aceite ya que al ser liposoluble aumenta su absorcin. (Pino A. y Brezmes M. 2012)

MEDICACIN

Atropina: Revierte los sntomas colinrgicos y mejora la funcin cardiaca y respiratoria. Cruza la barrera hematoenceflica por lo que al contrarrestar los efectos de Acetilcolina en SNC controla las convulsiones

Oximas(Pralidoxima): El uso de las oximas va dirigido a reactivar las colinesterasas inhibidas por el organofosforado. Eficaz para los sntomas

26

nicotnicos. Su administracin debe ser precoz en las primeras 6-24 h, siempre tras atropinizacin. Benzodiacepinas: lasconvulsiones. Se utilizan para el tratamiento de la agitacin y

Bicarbonato sdico 1M: En caso de intoxicaciones graves que cursen con acidosis.

Sulfato de Magnesio: Disminuye la toxicidad de los organofosforados al controlarla Hipertensin y taquicardia ventricular (torsaides) y corregir

lahipomagnesemia (resistencia a atropina). (Pino A. y Brezmes M. 2012)

ENZIMA COLINESTERASA

La acetilcolinesterasa (AChE) es la enzima que termina el efecto neurotransmisor de la acetilcolina y junto con la butirilcolinesterasa (BChE) pertenece al grupo de enzimas denominadas colinesterasas (ChEs), (Snchez G. y Salceda R. 2008)

La

acetilcolinesterasa

es una esterasa que

hidroliza

la

acetilcolina,

neurotransmisor en muchas sinapsis, especialmente en las placas neuromotoras.

Analicemos, en primer lugar, de qu manera la enzima acetilcolinesterasa acta sobre la acetilcolina, para luego estudiar la forma como los organofosforados y los carbamatos afectan la actividad de la colinesterasa, alterando de esta manera, la funcin de la acetilcolina en la transmisin de los impulsos nerviosos.

La acetilcolinesterasa es una enzima situada en las hendiduras sinpticas y all va a hidrolizar a la acetilcolina, despus de que sta haya realizado su funcin mediante la unin a sus receptores, permitiendo as que las sinapsis colinrgicas

27

transmitan los impulsos nerviosos. La reaccin catalizada es la hidrlisis de la acetilcolina hasta colina y acetato:

La acetilcolinesterasa es una esterasa tipo B y tiene un resto de SER en el centro activo y cursa con un mecanismo de accin cataltica del tipo "catlisis covalente", con la generacin de un intermediario covalente. (VIDAL C. J.) Un elevado nmero de esteres son hidrolizados por enzimas, genricamente denominados esterasas. La definicin y posterior clasificacin de las

colinesterasas tuvo su origen en el descubrimiento hechopor Galehr y Plattner (1927) de la distinta especificidad de sustrato que posean las esterasas de sangre completa y de suero. Posteriormente, Stedman y Easson (1932) prepararon un enzima de suero de caballo que se consider especfico para hidrolizar esteres de colina y se encontr que este enzima era capaz de hidrolizar a la butirilcolina ms rpidamente que a la acetilcolina. (VIDAL MORENO J.C.)

VIDAL MORENO J.C.

CENTRO ACTIVO Y MECANISMO DE ACCIN DE COLINESTERASAS

28

Las colinesterasas son sern-hidrolasas con ciertas propiedades catalticas parecidas a esterasas y peptidasas. El enzima cataliza la reaccin que se expresa en la figura (VIDAL MORENO J.C.)

VARIACIONES EN LA ACTIVIDAD DE LAS COLINESTERASAS

Se ha encontrado que stas pueden variar en una persona en intervalos de tiempo y existen tambin variaciones segn el sexo; las colinesterasas eritrocticas y las plasmticas varan independientemente, an en ausencia de inhibitorios exgenos. Las colinesterasas plasmticas disminuyen en los perodos menstruales, en hepatitis, desnutricin, enfermedades crnicas debilitantes, en las deficiencias de tiamina y de protenas. No parecen existir variaciones en los casos de ictericias obstructivas no complicadas, en miastenia gravis, hipertiroidismo, asma, hipertensin arterial, epilepsia, diabetes mellitus.(Crdoba D. y Cadavid S.)

VARIACIN EN LA INHIBICIN ENZIMTICA SEGN LOS COMPUESTOS

Estudios de varios autores muestran que existe diferencia en cuanto a la inhibicin de la actividad de las colinesterasas plasmticas y eritrocticas segn la naturaleza del compuesto inhibidor: as por ejemplo, inhiben ms las colinesterasas eritrocticas compuestos como el parathin, diclorvs, dimefox, metilparathin, schradn, malathin y en cambio, inhiben las plasmticas con mayor intensidad, el diazinn, mipafox y bromofox. (Crdoba D. y Cadavid S.) DETERMINACION DE LA COLINESTERASA PLASMATICA

29

La

actividad

de

la

colinesterasa

plasmtica

se

determina

espectrofotomtricamente segn el mtodo de Ellman y col, utilizando yoduro acetiltiocolina, como sustrato, 50L de plasma a 3 mL de una solucin de

ditiobismitrobenzoico. (Crdoba D. y Cadavid S.). Adems existen otros mtodos:

MTODOS BASADOS EN LA DETERMINACIN DEL CIDO ACTICO PRODUCIDO EN LA REACCIN Estos mtodos caen en dos categoras. En la primera se deja actuar al enzima sobre el sustrato, en un medio convenientemente tamponado, durante un tiempo suficientemente largo (1-2 horas) para que exista una variacin apreciable de pH. La variacin del pH (ApH/h) desde el principio al final del perodo de incubacin proporciona una medida de la actividad enzimtica (Michel, 1949). Los inconvenientes de este mtodo son su larga duracin y el efecto que la creciente acidez del medio tiene sobre la actividad del enzima. Las ventajas son su simplicidad, tanto por el instrumental (pH-metro) como por el grado depreparacin necesario para interpretar los resultados. Corrigiendo los resultados mediante tablas la variacin de actividad con el pH del medio, el mtodo se utiliza ampliamente en centros sanitarios como tcnica rutinaria para la determinacin de colinesterasa en eritrocitos y suero. Un segundo mtodo, ms sofisticado que el anterior, consiste en la valoracin continua del cido liberado en la hidrlisis del colnster con una disolucin alcalina estndar, de forma que a lo largo de todo el tiempo de reaccin el pH se mantiene constante (Wilson, 1954). (VIDAL MORENO J.C.) Para esta .tcnica se requiere un instrumental costoso (valorador automtico Radiometer, autobureta automtica y accesorios de valoracin), y si bien se utiliza frecuentemente para trabajos de investigacin dada su precisin y

reproducibilidad, no se utiliza como mtodo rutinario.

MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS

30

De entre los que utilizan esta tcnica, el ms utilizado es el de Ellman (1961). Empleando como sustrato acetiltiocolina, se produce un mercaptano tras la hidrlisis enzimtica, el cual reacciona con el cido 5,5'-ditiobis-nitrobenzoico, desdoblndolo en dos productos, uno de los cuales, el cido 5-tio-2-nitrobenzoico, absorbe a 412 nm. La reaccin que tiene lugar es

Este mtodo se ha aplicado ampliamente en la determinacin de colinesterasa de cualquier tejido y de plasma y es muy adaptable para anlisis de rutina mediante procedimientos automatizados. (VIDAL MORENO J.C.)

MTODOS RADIOMTRICOS

Se basan en el empleo de un sustrato marcado (acetil-1-C-colina o butiril-1-Ccolina), de suerte que el cido producido durante la hidrlisis enzimtica puede ser "evaluado mediante un contador de radiactividad (Siakotos, 1969). Estas tcnicas son muy caras, y naturalmente muy sensibles. Se reservan, por lo tanto, para microdeterminaciones de actividad en casos muy particulares.

2.5.- MARCO CONCEPTUAL ODEFINICION DE TERMINOS BASICOS

Agroqumicos: son sustancias qumicas muy utilizadas en la agricultura, cuyo objetivo principal es mantener y conservar los cultivos Aerosol: Suspensin de partculas muy finas de un lquido o un slido en un medio gaseoso

31

Efecto colateral: Parmetro distinto del efecto primario que se deriva de la accin farmacolgica primaria de un medicamento, o sea, aquella que produce su efecto teraputico.

Extrahospitalario: Referido a algo que no pertenece a un hospital o nosocomio Hendiduras sinpticas: El pequeo espacio entre dos clulas nerviosas a travs del cual los neurotransmisores acetilcolina se difunde. FAO: La Food and Agriculture Organization Biodegradables: Sustancia que puede ser descompuesta con cierta rapidez por organismos vivientes, los ms importantes de los cuales son bacterias aerobias. Sustancia que se descompone o desintegra con relativa rapidez en compuestos simples por alguna forma de vida como: bacterias, hongos, gusanos e insectos.

Funcion sinptica: Es la relacin funcional de contacto entre las terminaciones de las clulas nerviosas Muscarinicas: Que caracteriza los efectos colinrgicos posganglionares de muscarina en impulsos nerviosos parasimpticos. Nicotnicos: Que caracteriza el efecto de la nicotina y otras drogas en la estimulacin inicialmente y posteriormente, en altas dosis, la inhibicin de impulsos neuronales en los ganglios autnomos y la unin neuromuscular.

Bradicardia: disminucin del nmero de contracciones cardacas inferior a 60 por minuto. Pulso anormalmente lento. Taquicardia: Aumento del ritmo de los latidos del corazn. Puede producirse como un proceso puramente fisiolgico durante un esfuerzo fsico intenso, o por causas patolgicas, como en la enfermedad de Basedow* o en algunas insuficiencias cardacas

Hipoxia: Disminucin del aporte o contenido de oxgeno en el organismo. Es un estado que surge al no corresponderse la necesidad de oxgeno de la clula con el suministro del mismo a sta.

32

CAPTULO III

33

CAPITULO III MATERIALES Y METODOS 3.1. MATERIALES 3.1.1. MATERIAL DE LABORATORIO

Agujas descartables de # 20 x 1 . Bao Maria. Beaker de 10 mL, marca PYREX. Botella de vidrio 200 mL con tapn atornillable. Caja Tecnopor. Celdas de plstico cuadradas de 10mm de longitud de paso de luz (ancho), Glass Quartz, marca Cole Parmer, capacidad 3,5 mL. Cronmetro. Erlenmeyer de 10 y 200 mL, marca PYREX. Etanol 98. Fiolas de 10, 100, 200 mL, marca PYREX. Gradillas para tubos de ensayo. Micropipetas automticas de 20 y 50 mL. Ligaduras de goma Papel absorbente. Pipetas de 5 mL. Puntas amarillas para micropipetas. Termmetro. Tubos de ensayo, marca PYREX. Viales aproximadamente de 5 mL.

34

3.1.2. EQUIPOS Balanza analtica digital Centrifuga Espectrofotmetro Refrigerador.

3.1.3 REACTIVOS cido ditiobisnitrobenzoico DTNB 0,25 mM, pH final 7,7. (5,5 Dithiobis (2 - Nitrobenzoil acid)) SIGMA, lote 29H0951, fw. 396,3. Ioduro de acetiltiocolina 0,075 M, SIGMA, lote 1941067, fw. 286,2. Na2HPO4. 2 H2O al 99,5%, M=177,99 g/mol., Merck, KH2PO4 al 99,7%, Fisher Chemicals. Estable 1 mes a 4 C.

3.2. DISEO METODOLOGICO 3.2.1 NIVEL Y TIPO DE INVESTIGACIN

NIVEL.- Se realizara un estudio no experimental porque no se manipulara variables TIPO.- Estudio transversal, porque se recolectara datos en un solo momento, en un tiempo nico..

3.2.2. DISEO DE LA INVESTIGACIN

Se forman 3 grupos experimentales cada uno conformado por 20 para la determinacin de la actividad de la colinesterasa eritrocitaria en trabajadores de la ciudad de los cuscos expuestos, no expuestos a organofosforados.

35

3.2.3. VARIABLES VARIABLES DEPENDIENTES Determinacin de colinesterasa eritrocitaria

VARIABLES INDEPENDIENTES Nivel de la actividad de la colinesterasa eritrocitaria

VARIABLES INTERVINIENTES Edad

DETERMINACIN DE COLINESTERASA ERITROCITARIA Definicin Conceptual: Examen o prueba de laboratorio que determina el nivel de la actividad de la colinesterasa eritrocitaria en personas expuestas a plaguicidas.(VIDAL MORENO C .J.) Definicin Operacional: Esta variable se determina mediante tcnicas laboratoriales. Usando el mtodo de Ellman modificado y posterior lectura a travs de un espectrofotmetro Naturaleza de la Variable: Cuantitativa Medicin: indirecta Escala: Ordinal Instrumento: Espectrofotmetro. Se tomar, las muestras de sangre y se cuantificar usando el mtodo de Ellman modificado. Expresin Final: mU/mL

NIVEL DE LA ACTIVIDAD DE LA COLINESTERASA ERITROCITARIA Definicin conceptual: concentracin de colinesterasa eritrocitaria que cumple funcin de hidrolizar la acetilcolina en el organismo Definicin operacional: Se realizar a travs del clculo de la cantidad de colinesterasa mediante la siguiente formula.

36

Donde:

U: Representa la cantidad de enzima que convierte un micromol de sustrato por minuto en condiciones estndares. : Absortividad milimolar del 5 tio 2 nitrobenzoato. Factor calculado para cubetas de seccin cuadrada de un cm de paso de luz y cuyo valor a 405 nm es de 13,162. 103: Factor de correccin para pasar de milimol a micromol. |VT: Volumen total de la reaccin en mL. VM: Volumen de muestra sin diluir en mL. LCO: Longitud de camino ptico (1 cm).

. Naturaleza de la variable: Cuantitativa Medicin: indirecta Escala: ordinal Instrumento: espectrofotmetro Expresin final: mU/mL

EDAD Definicin Conceptual: Tiempo transcurrido en aos, desde el nacimiento hasta la extraccin sangunea para el examen de colinesterasa Definicin Operacional: Se determina haciendo interrogaciones a la persona.

37

 Naturaleza de la Variable: Cuantitativa Medicin: Directa Escala: Numeral Instrumento: En forma interrogativa, preguntas y cuestionario Expresin Final: En Aos: 18 - 29 aos 30 - 41 aos 42 - 53 aos 54 - 65 aos

3.2.4 POBLACION Y MUESTRA 3.2.4.1. POBLACION La parte experimental de la presente investigacin se realizara en la ciudad del Cusco a individuos, todos ellos dedicados a la agricultura y de un bajo nivel socio cultural y con pocos recursos econmicos, lo cual se pudo constatar por observacin y previa encuesta a los agricultores incluidos en el estudio. Entre los indicadores observados en los agricultores y sus familias se pueden mencionar: El bajo nivel cultural de los pobladores, quienes se ven obligados a trabajar a temprana edad descuidando su educacin. La mayora de ellos slo tiene estudios primarios. Precariedad de las viviendas en las que viven que apenas cuentan con servicio de luz en algunos casos, no existiendo servicios de agua y desage.

3.2.4.2 MUESTRA Suero o plasma de personas expuesta, no expuestas y consumidores de coca; 20 individuos por grupo.

38

3.2.5 CRITERIOS DE INCLUSION Y EXCLUSION 3.2.5.1.- CRITERIOS DE INCLUSION: Individuos mayores de 18 y 65 aos que declararen haber trabajado con plaguicidas en un periodo no mayor de 14 das antes de la toma de la muestra. Personas que firmen el consentimiento de participacin voluntaria en el presente estudio Sexo: ambos. Personas nacidas y residentes del Cusco.

3.2.5.2.- CRITERIOS DE EXCLUSIN:

Personas menores de 18 aos y mayores de 65 aos de edad. No se considera mujeres gestantes o en periodo menstrual ni individuos que seguan algn tratamiento farmacolgico. Personas que no acepten participar en el estudio. Personas que no firmen el consentimiento de participacin voluntaria en el presente estudio. Personas no nacidas ni residentes del Cusco.

3.2.6.- TECNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS INSTRUMENTO Se utilizaron fichas de investigacin o Formulario de consentimiento para su participacin voluntaria. o Ficha de investigacin para datos generales y variables estudio Extraccin de sangre venosa. de

39

Para la cuantificacin de las muestras se utiliz el espectrofotmetro, para el mtodo analtico colorimtrico, y el cromatografo de gases. ANEXO(6)

TECNICA DE RECOLECCIN DE DATOS La captacin de sujetos de estudio en el presente trabajo de investigacin se realiz mediante charlas informativas sobre mtodos para la determinacin de colinesterasa eritrocitaria. Se dio conocer el trabajo de investigacin y se consigui en consentimiento de las personas voluntarias para participar en el estudio, durante este proceso todas las personas fueron informadas del objetivo del estudio. Se realiz una explicacin oral y se absolvieron todas las inquietudes que tuvieron los sujetos de estudio

Para la obtencin de datos personales se utiliz la tcnica de entrevista y como instrumento una ficha estructurada, as se obtuvo: consumo de medicamentos, edad, talla, peso, etc

OBTENCIN DE LA MUESTRA DE LA MUESTRA BIOLOGICA (SANGRE) Para la toma de muestra se utiliza como tcnica la venopuncin. Para la recoleccin de la sangre previamente se realiza la desinfeccin de la piel. Para esto se utiliz algodn impregnado con alcohol. TCNICA PARA LA OBTENCIN DE DATOS DE NIVEL DE

COLINESTERASA

40

Para la obtencin de los datos de utilizaron como instrumentos el Espectrofotmetro

3.2.7.- TECNICAS PARA EL PROCESAMIENTO Y ANALISIS DE LA INFORMACION Previo al anlisis y procesamiento de la informacin obtenida se efecta la revisin de los datos contenidos en el instrumento, as tambin, se pasa al vaciado de la informacin SOFTWARE SPSS 11 para los anlisis respectivos.

3.3. PROCEDIMIENTO Determinacin cuantitativa de la actividad de la colinesterasa srica mtodo espectrofotomtrico (tcnica de Ellman modificado). Fundamento La enzima colinesterasa cataliza la hidrlisis de steres de colina, tal como la sbutiltiocolina, con mxima actividad a pH 7,7. (GOODMAN y GILMAN): Las bases farmacolgicas de la teraputicaComo sustrato se emplea el yoduro de acetiltiocolina que es escindido muy fcilmente por accin de la colinesterasa del plasma a tiocolina. La tiocolina liberada reacciona con el cido 5,5 ditiobis - 2 nitrobenzoico (DTNB) produciendo un compuesto de color amarillo, el ditiobisnitrobenzoato, el cual en medio alcalino genera compuestos resonantes de color amarillo (FIGURA). Hay que sealar que la acetilcolinesterasa de los eritrocitos, que es liberada ya en una hemlisis ligera, en este caso no interfiere. La velocidad de aparicin de la coloracin es proporcional a la actividad enzimtica y se mide a 405 nm a una temperatura fija de 25 C.

41

IOVINE, Enrique.: El laboratorio en la clnica. Buenos Aires. Editorial mdica. 1998, pp. 1353 - 1354. PREPARACIN DE LOS REACTIVOS a. Buffer fosfato 0.1 M. pH 8.0: Tomar 55,85 mL de solucin Na2HPO4. 2 H2O (17.800 g p/v en agua). Tomar 44,15 mL de solucin KH2PO4 (9.073 g p/v en agua). Mezclar ambas soluciones. Tomar 61,2 mL de solucin Na2HPO4.2 H2O (17.800 g p/v en agua). Tomar 38,8 mL de solucin KH2PO4 (9.073 g p/v en agua). Mezclar ambas soluciones.

b. Buffer fosfato 0.1 M. pH 7.0:

c. Sustrato yoduro de acetiltiocolina 0,075 M: Yoduro de acetiltiocolina Agua destilada Estable a 4 C durante 15 das. 217 mg. 10 mL.

d. Solucin madre de DTNB 10 mM:}

42

cido ditiobisnitrobenzoico (DTNB) Buffer fosfato 0,1 M. pH 7,0 Bicarbonato de sodio Estable 1 mes a 4 C.

39,6 mg. 10 mL. 15 mg.

e. Solucin hija de DTNB 0,25 mM: Por dilucin de la anterior en buffer fosfatos 0,1 M. pH 8,0: Solucin madre de DTNB Buffer fosfatos 0,1 M. pH 8,0 c.s.p. 0,2 mL. 8,0 mL.

TCNICA OPERATORIA Se procede en 2 tubos de ensayo, uno para la muestra y otro para el blanco, sometidos a bao Mara para mantener la temperatura a 25 C:

PRUEBA Reactivo DTNB (reactivo e) Suero Sustrato (reactivo c) 50 20 3 mL

BLANCO 3 mL

---20

Se ajusta la absorbancia del espectrofotmetro a cero (automtico). Se mezcla bien por inversin el contenido de los tubos de ensayo. Se determina la absorbancia a 405 nm cada minuto durante 3 minutos. Se calcula el promedio de los cambios de absorbancia por minuto de la muestra (DApm), es decir hallamos el promedio de las diferencias entre la segunda y primera lectura, y la tercera y segunda lectura, previa correccin de estas (restar la absorbancia de la muestra de la del blanco).

Clculos Tenemos:

43

Acm = (Am Ab) DApm = Promedio de los cambios de absorbancia por minuto (promedio de las diferencias de Acm).

Donde:

Am: Absorbancia de muestra. Ab: Absorbancia del blanco. Acm: Absorbancia corregida de la muestra.

Adems la formula para el clculo de la actividad de la colinesterasa srica en miliunidades por mililitro de muestra (ActCoSe (mU/mL)) es:

Donde:

U: Representa la cantidad de enzima que convierte un micromol de sustrato por minuto en condiciones estndares. : Absortividad milimolar del 5 tio 2 nitrobenzoato. Factor calculado para cubetas de seccin cuadrada de un cm de paso de luz y cuyo valor a 405 nm es de 13,162. 103: Factor de correccin para pasar de milimol a micromol. |VT: Volumen total de la reaccin en mL. VM: Volumen de muestra sin diluir en mL. LCO: Longitud de camino ptico (1 cm).

44

VALORES DEREFERENCIA

45

FLOJUGRAMA DEL PROCEDIMIENTO

Personas que cumplieran con los criterios de inclusin

Sujetos voluntarios, consentimiento informado se mide peso talla edad

Toma de muestra

1 Muestra sangunea 5 mL

Bao Mara

Centrifugar

2 Muestra suero 50 L

Resultados por espectrofotometria

ANLISIS DE LOS DATOS

46

CAPITULO IV

4.- RECURSOS 4.1.- HUMANOS ASESORES DEL PROYECTO Carlos Moreira Pachas: Docente principal del area de toxicologia del departamento de farmacia y bioqumica. UNSAAC Luz Marina : Docente principal del area de hematologa y serologa de la facultad de biologia. UNSAAC

INVESTIGADORES ROSA MARINA CASAVERDE PUMACAYO JUAN JOEL QUISPE HUISA

4.2.- INFRAESTRUCTURA Laboratorio de toxicologa de la carrera profesional de farmacia y bioqumica de la universidad nacional san Antonio abad del cusco Laboratorio de serologa y hematologa de la universidad nacional san Antonio abad del cusco 4.3.- ECONOMICOS Presupuesto propio de los tesistas

47

CAPITULO V PRESUPUESTO

Actividades Elaboracin del proyecto Revisin bibliogrfica :internet Impresin y fotocopia de revisin bibliografica Impresin y fotocopia del proyecto Tramite documentario Movilidad Determinacin de pruebas preliminares Compra de materiales de vidrio Realizacin del diseo metodolgico y experimetal compra de materiales quirrgicos materiales de escritorio guada polvos compra de reactivos compra de golosinas a base de nuez y otros Anlisis y conclusin del proyecto Impresiones y fotocopia de tesis concluida Tramite documentario Costo total del proyecto

Costos

100.00 100.00 30.00 100.00 100.00

200.00

100.00 50.00 60.00 800.00 100.00

100.00 70.00 1910.00

FUENTE: elaboracin propia

48

CAPITULO VI CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Ao actividades 2012

setiemb re octubre Noviem bre diciemb re

Ao 2013
enero febrero marzo abril mayo

Revisin bibliografica y ampliacion del teorico marco

XXXX

XXXX

XXXX

XXXX

XXXX

XXXX

XXXX

Elaboracion aprovacion del proyecto Realizacin de charlas para captar voluntarios XXXX XXXX XXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXX

XXXX Realizacin del proyecto Observacion y analisis Determinaicio n de los valores de colinesterasa Analisis y XX XX

XXX X

XX

XX

XX

discusion de

49

resultados

Redaccion y presentacion del informe FUENTE: elaboracin propia

XXX X

XXX X

BIBLIOGRAFIA

1. Agricultura, history of --- www.EnciclopediaBritanica.com

2. Arata A. perspectivas del uso de plaguicidas: historia situacin actual y necesidades futuras

3. Arquimbau E. Desarrollo de metodologa analtica para la determinacin de plaguicidas organofosforados y organoclorados en muestras biolgicas humanas- Tesis Doctoral. 2001

4. BRAIGHWAITE, R. BRONWS y FLANAGAN R.: Basic analytical Toxicology. International Programme on chemical safety. WHO. Gnova. 1998. pp.17.

5. CECILIO J. VIDAL MORENO, CECILIO J. Departamento latertacaltativo de Bioqumica Cientas-Medicina. Murcia 6. Crdoba Palacio D. Cadavid lsaza S. Ramos Jaramillo J. Inhibidores de Colinesterasas 7. Esparasa M. L. monitoreo biolgico de colinesterasa. 1997 8. GISBERT CALABUIG, S.A.: Medicina legal y Toxicologa. Barcelona.

50

9. Editorial Masson S.A. 5ta. Edicin. 1998. pp.807. 10. GOODMAN y GILMAN: Las bases farmacolgicas de la teraputica. 11. Mxico. Editorial Interamericana Mc. Graw-Hill, 1996, pp.179, 172, 181 12. INCAP/PLAGSDALUD/OPS.: Plaguicidas de tipo organofosforado y carbamato. Curso a distancia sobre diagnstico, tratamiento y prevencin de intoxicaciones agudas causadas por plaguicida. 1996. pp.3, 5. 13. Inventario Nacional de Plaguicidas COP en Nicaragua 14. IOVINE, Enrique.: El laboratorio en la clnica. Buenos Aires. Editorial mdica. 1998, pp. 1353 - 1354. 15. MARIN PEREZ, L.E. y RAMIREZ GUZMN, O.: Prevencin y Riesgo en el uso de agroqumicos en Toxicologa. Medelln. Editor D. Crdova pp.156, 524, 525, 158, 159. 16. Milla Cotos M, Palomino Horna W. Niveles De Colinesterasa Srica En Agricultores De La Localidad De Carapongo (Per) Y Determinacin De Residuos De Plaguicidas Inhibidores De La Acetilcolinesterasa En Frutas Y Hortalizas Cultivadas". Tesis Para Optar Al Ttulo Profesional De: Qumico Farmacutico

17. Molina G. control de riesgos causados por plaguicidas. 1987 18. Ramrez, J. A. y Lacasaa, M. Plaguicidas: clasificacin, uso, toxicologa y medicin de la exposicin. Arch Prev Riesgos Labor 2001 19. Vega S. , Maroto J. I ,. Ziga V. , Ramrez H. actividad de las colinesterasas sanguneas en una poblacion de referencia costarricenseTrabajo desarrollado en el Proyecto UNA -OEA Contaminacin Ambiental Asociada a la Produccin Agrcola. Escuela de Ciencias Ambientales, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica 1983. 20. Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 4th ed., 2001.

51

52