Conceptos generales y bases de operacin de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetal

Gmez Contreras G., Ramrez Miranda E., y Hernndez Elizalde L. A. Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Monterrey
A01180387@itesm.mx, A01181506@itesm.mx, A01180617@itesm.mx

Resumen - El tamao de un laboratorio de cultivo de tejidos y la extensin del mismo estn sujetos al tipo de proyectos a
realizar as como de los fondos econmicos con los que se cuenta. Un laboratorio de cultivo estndar debe poseer las siguientes instalaciones: rea de lavado y almacenamiento, rea de preparacin, esterilizacin y almacenamiento de medios de cultivo, rea asptica para manipulacin de material vegetal, rea de mantenimiento de cultivos, la cual debe tener condiciones controladas de temperatura, luz y de ser posible de humedad; rea de observacin de cultivos, rea de aclimatizacin de cultivos in vitro. Introduccin Si se planea la construccin de un nuevo laboratorio su ubicacin debe ser bien estudiada, preferentemente estar alejado de la ciudad o en caso contrario contar con precauciones para proteger el laboratorio de contaminacin y vibraciones vehiculares. El complejo debe estar protegido de vientos fuertes y lluvia, ya que estos suelen acarrear grandes cantidades de esporas, acaros o tisanpteros. El rea de crecimiento y transferencia debern estar adecuadamente insulada para conservar energa. Un complejo de cultivo de tejidos requiere un generador auxiliar, pues siempre debe proveerse, al menos para el rea de transferencia, crecimiento y equipo importante. Esto con la finalidad de prevenir contaminacin por el apagn de una campana de flujo horizontal, abruptos cambios de temperatura o dao a otros equipos elctricos. La organizacin para laboratorios de cultivo ha sido ampliamente descrita con diagramas por mltiples autores [1]. Estos deben ser tratados como lineamientos basados en el tamao, diseo, forma y terreno disponible. Si bien es cierto un laboratorio de cultivo de tejidos est compuesto por ms de mil cosas, su funcionamiento tambin es importante a la hora de trabajar en ellos. Prcticamente un laboratorio cuenta con reas especficas de trabajo. Dichas reas son: rea de preparacin del medio, rea de esterilizacin, rea de siembra o transferencia y el rea de incubacin. El rea de lavado en el cuarto de medios de cultivo debe estar provista de cepillos de mltiples tamaos y formas, una maquina lavadora de ser posible, una tarja grande resistente a agentes corrosivos, instalacin de agua fra y caliente. Por otra parte, se debe contar con un rea de secado, hornos de secado y reas para almacenar el material libre de polvo. Ya que el agua corriente no se puede utilizar para la preparacin de medios se deber contar con un sistema para su purificacin. El agua des-ionizada puede ser utilizada en laboratorios de enseanza comunes, sin embargo para propsitos de investigacin y/o comercializacin deber contarse con un aparato de destilacin, osmosis inversa o de agua milli-Q. Para un laboratorio de investigacin suele ser suficiente un equipo de destilacin con capacidad de 1.5 2 litros por hora. Tanques de almacenamiento adecuados debern ser instalados para el correcto almacenamiento del agua filtrada. Para mayores detalles acerca de la purificacin y almacenamiento se pueden consultar los textos de Gabler et al. (1983) y el de Callaghan (1988). Usualmente se requieren dentro de esta rea las siguientes amenidades: Mesas de trabajo a alturas cmodas de trabajo de pie. Refrigerador (-70C) para el almacenamiento de soluciones stock, soluciones enzimticas, etc. Refrigerador para almacenar qumicos varios, material de plantas, soluciones stock de cortos periodos de almacenamiento. Contenedores para almacenamiento de agua filtrada. Balanzas con bases apropiadas. Parrillas con agitadores magnticos. Un medidor de pH. Una bomba de vaco para los filtrados. Una vaporera para facilitar la disolucin de agar. Autoclave u olla de presin para la esterilizacin de medios. Materiales de cultivo Diferentes tipos de contenedores han sido utilizados en el cultivo de tejidos, en muchas ocasiones la eleccin de los contenedores esta dictaminado por la naturaleza del experimento. Para cultivo de tejidos tradicional los tubos de ensaye han sido ampliamente utilizados. Botellas de cuello amplio como las de leche han sido utilizadas especialmente para micropropagacin. En el cultivo de tejidos deben utilizarse materiales Pyrex o de borosilicato ya que un autor reporta que los contenedores de vidrio reutilizados pueden ser txicos para algunos tejidos especialmente bajo su uso repetido [1]. Hoy en da materiales plsticos desechables se venden en el mercado como una alternativa al trabajo de laboratorio de da

con da. Estos materiales se mercadean con tapas adecuadas, un problema comn de los materiales es la falta de tapas adecuadas, ya que el uso de algodones envueltos consume tiempo y puede conllevar problemas de contaminacin. Cuarto de cultivo El rea para incubar cultivos es controlado electrnicamente para mantener una temperatura de alrededor de 25 2. Esto se hace con aires acondicionados especiales y calefaccin. Para tratamientos especficos con temperaturas mayores o menores se utilizan incubadoras especiales con luces fluorescentes integradas. Los cultivos generalmente crecen en luz difusa menor a 1 klux, sin embargo se debe prevenir por cultivos con altos requerimientos de intensidad de luz (5-10 klux) e inclusive obscuridad total. El control de la iluminacin se hace de manera automtica con timmers. La pintura en las paredes y el suelo deben soportar la limpieza repetida. Preferiblemente los vrtices de las paredes debern ser redondeadas para prevenir la acumulacin de polvo al facilitar su limpieza. De ser posible se debe contar con un control de humedad, ya que si la humedad cae del 50% el medio de cultivo puede secarse rpidamente. Por otro lado si la humedad es muy alta los tapones de algodn pueden humedecerse y las probabilidades de contaminacin incrementan. El rea de cultivo debe tener estantes especialmente diseados para sostener los cultivos. Algunos ejemplos se muestran en la Figura 1 y la Figura 2.

Los muebles debern tener llantas para una utilizacin ms efectiva del espacio, cada estante tendr sets separados de focos fluorescentes, as como insolacin entre las lmparas y los cultivos arriba de las mismas, esto con la intencin de que la temperatura no afecte a los cultivos. Otro punto importante para mencionar es el calor generado por las balastras. El cuarto de cultivo deber tener una maquina agitadora, tanto horizontal como rotatoria para el crecimiento de clulas en suspensin. Los agitadores con control de temperatura y luz tambin estn disponibles en el mercado. Es recomendable tener un generador de emergencia para mantener la temperatura y luz en todo momento dentro de esta rea, as tambin se evita el riesgo de perder los cultivos en suspensin debido a falta de poder en los agitadores. Invernaderos Para poder crecer plantas madre y aclimatizar las plantas producidas in vitro, se recomienda tener un invernadero aunado al complejo del laboratorio. El invernadero podra variar en sofisticacin dependiendo de los recursos econmicos disponibles. El invernadero deber tener controles para mantener una alta humedad, ventilacin, control de luz, entre otros. Como parte importante de un laboratorio se debe considerar la asepsia, pues una buena asepsia conlleva al xito del crecimiento de los tejidos vegetales. Es por eso que las reas ms especficas de asepsia son el rea de siembra y de incubacin. Asimismo se tiene un control especfico en cuanto al ingreso de personal en las reas de trabajo. A continuacin se muestra la Figura 3 que nos permite ver el grado de limpieza que requiere cada rea del laboratorio. [1]

Figura 3.Niveles de limpieza de un laboratorio. Figura 1. Diseo de estantes encimados. Discusin La correcta distribucin de las reas dentro de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales es de suma importancia, pues influyen directamente en la obtencin de resultados. Sin embargo, no es lo nico que los determina sino el manejo adecuado de lo que ah encontramos y las prcticas personales de cada uno. En general se considera que las instalaciones de un laboratorio son adecuadas cuando se obtiene ms del 85% de buenos resultados, esto de acuerdo con los encargados de INIFAP, Toluca. Conclusin Figura 2. Diseo de estantes con soporte para recipientes especializados. El conocer cada rea de trabajo dentro del laboratorio es de suma importancia, ya que nos permite identificar y al mismo tiempo visualizar los aparatos, los reactivos y los instrumentos

con los que se trabajarn en el laboratorio. Si bien es claro, el uso del laboratorio nos permitir adquirir una mayor experiencia a la hora de realizar nuestras prcticas, es importante hacer buen uso tanto del material que se nos brinde como de todo el equipo que vallamos a utilizar. Un punto importante a destacar es el hecho de tomar las medidas necesarias cuando se realice cada prctica, pues hay reas de peligro hacia nosotros como personas. Finalmente, se puede decir que conocer cada rea de trabajo, ya sea de preparacin de medios, esterilizacin, siembra y hasta de incubacin nos permite saber cmo vamos a trabajar, qu instrumentos necesitaremos y tambin qu actividad se realizar dentro de cada rea. Bibliografa [1 ]Bhojwani, S., & Razdan, M. (1996). Plant Tissue Culture: Theory and Practice, a Revised Edition (Vol. 5). Amsterdam, The Netherlands: Elsevier. INFORMACIN DE AUTORES Emmanuel Ramrez Miranda, Ingeniero en Biotecnologa, Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Monterrey, A01181506@itesm.mx Guadalupe Gmez Contreras, Ingeniero en Biotecnologa, Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Monterrey, A01180387@itesm.mx Luis Angel Hernndez Elizalde, Ingeniero en Biotecnologa, Instituto Tecnolgico y de Estudios Superiores de Monterrey, A01180617@itesm.mx