Tesis PDF Por DR Rigalli10

Efecto del tratamiento con MFP y NaF sobre el proceso de reparacin sea en ratas.
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INSTITUTO ITALIANO DE ROSARIO
Escuela de Medicina
EFECTO DEL TRATAMIENTO CON MONOFLUOROFOSFATO Y FLUORURO DE SODIO SOBRE EL PROCESO DE REPARACIN SEA EN RATAS
TESIS DOCTORAL
Autora: Sandra Patricia Meja Delgado
Director: Dr. Alfredo Rigalli.
2011
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DEDICATORIAS
Especialmente a Dios por los dones que ha puesto en m. Todo lo aqu hecho lo hizo L, a travs mo.
A la memoria de mi madre Licho quien entreg su vida a mi formacin y su amor a los principios morales para guiarme hacia el mejor de los caminos: el conocimiento fundamentado en el respeto por la vida, la honestidad y la entrega a los dems.
A mi madre Gabriela, quien llen mis das de amor, dulzura y comprensin para no desfallecer en el esfuerzo y acompaarme hasta el final con su elocuente silencio y su total entrega.
A Jos Luis, ejemplo de vida, de lucha y de amor. Su inmensurable apoyo y contencin en los momentos crticos de mi carrera doctoral han sido el cimiento para construir sobre una slida base un nuevo mundo para m y para mis hijos. A ellos, Daniela y Sebastin, guerreros incansables e incondicionales. Por su irrestricto apoyo, amor y compromiso con esta meta que, an sintindola ma, es de ellos.
A mis hermanas Gaby, Cristina y Gloria. A mis hermanos Carlos, Javier y Beto, quienes nunca dejaron de creer en m y siempre desde lejos me apoyaron y sintieron conmigo los buenos y los no tan buenos momentos. A todos aquellos de mi familia que sin juzgar, simplemente creyeron y callaron.
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AGRADECIMIENTOS
Al ilustre, bien reconocido, gran Maestro y Director de esta tesis, Doctor Alfredo Rigalli. Sus enseanzas en el conocimiento cientfico aplicadas al ser vivo, me ensearon a re-pensar la vida como un momento transformante del cual yo puedo ser el artfice del cambio. Con sus consejos, su firmeza y exigencia sembr en m la semilla del verdadero sentido de Ser Humano, al ensearme a confrontar los invaluables aportes de la vida animal con los adelantos cientficos que pueden extenderse para el bienestar y el mejoramiento de la salud humana.
A todo el Grupo de Investigacin del Laboratorio de Biologa sea por abrir desde un principio las puertas de sus corazones para ayudarme a cumplir con todos mis propsitos. Por escuchar y soportar las exposiciones en mi extrao lenguaje y a pesar de todo, continuar a mi lado como mis mejores puntos de apoyo.
Al Grupo GITCO por ser el artfice de tantos sueos conjuntos y tantas metas concretadas. Al bien reconocido Doctor Ivn Daro Vlez Bernal, por haber credo siempre en m y en este proyecto. Su apoyo y sabidura han sido de alta trascendencia para los logros que hoy se han cumplido.
A los profesores del Departamento de Morfologa de la Universidad de Antioquia quienes creyeron en m y tambin a quienes no. A todos los amigos, compaeros y colegas argentinos quienes en todas sus formas contribuyeron a la construccin y materializacin de este sueo.
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RESUMEN
El fluoruro (F) ya sea como monofluorofosfato (MFP) o como fluoruro de sodio (NaF) tiene efecto osteognico. Su accin radica en el estmulo de la proliferacin de osteoblastos. No existe informacin del efecto de estas drogas en la velocidad de reparacin de defectos no crticos a nivel seo. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del tratamiento con NaF y MFP sobre la velocidad de reparacin de un defecto seo no crtico. Se utilizaron ratas hembras IIM/FM sublnea e de 7 semanas. Se hizo un defecto seo de 2mm de dimetro en la difisis proximal de ambas tibias hasta llegar a la cavidad medular. La ciruga se llev a cabo bajo anestesia general y condiciones de esterilidad y recibieron antibioticoterapia y analgesia. Luego de la ciruga fueron divididos en tres grupos. MPF, NaF, (recibieron 80 mol/da de MFP y NaF, respectivamente) y CONTROL: (recibieron 1 ml de agua). Las administracines se realizaron por sonda orogstrica. Al inicio del tratamiento y a los 10, 20 y 30 das se tomaron muestras de sangre y se determin la densidad mineral sea (DMO). En plasma se determin calcio, fosfato y fosfatasa alcalina. Al finalizar el tratamiento se determin fluoremia y fluoruria, flor fecal y calcio fecal. A los 30 das se sacrificaron, se obtuvieron las tibias y se sometieron a estudio histolgico. Los tratamientos aplicados no modificaron el peso, la DMO del hueso sano, calcemina y fosfatemia. La fosfatasa alcalina plasmtica se increment significativamente a lo largo del tratamiento en los grupos NaF y MFP. La DMO de la zona del defecto fue significativamente mayor en el grupo tratado con MFP. El estudio histolgico de la zona del defecto indica que luego de 30 das de tratamiento el hueso formado en presencia de MFP es de buena organizacin histolgica. Se concluye que la reparacin sea de un defecto no crtico es acelerada por la presencia de NaF o MFP y que la mineralizacin del defecto es ms
______________________________________________________________________ rpida en presencia de MFP que se refleja en el aumento de DMO del defecto a los 10 das de tratamiento.
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ndice de contenido
DEDICATORIAS..............................................................................................................2 AGRADECIMIENTOS.....................................................................................................3 RESUMEN........................................................................................................................4 CAPITULO 1....................................................................................................................8 INTRODUCCION........................................................................................................8 CAPITULO 2..................................................................................................................10 OBJETIVOS...............................................................................................................10 Objetivo General....................................................................................................10 Objetivos Especficos.............................................................................................10 Definicin de rea y del problema ........................................................................10 CAPITULO 3..................................................................................................................12 MARCO TERICO....................................................................................................12 Generalidades del tejido seo.................................................................................12 Clulas del tejido seo...........................................................................................20 Osteognesis ..........................................................................................................32 Remodelacin sea................................................................................................37 El defecto seo y el proceso de reparacin............................................................40 Flor y su efecto sobre el tejido seo ....................................................................43 CAPITULO 4..................................................................................................................47 HIPOTESIS.................................................................................................................47 Justificacin............................................................................................................47 Viabilidad...............................................................................................................51 CAPITULO 5..................................................................................................................51 MATERIALES Y METODOS...................................................................................52 Animal para experimentacin................................................................................52 Esterilizacin .........................................................................................................53 Anestesia general...................................................................................................53 Analgesia y antibioticoterapia................................................................................53 Cirugas..................................................................................................................54 Eutanasia ...............................................................................................................54 Administracin del NaF y del MFP.......................................................................54 Determinacin de la Concentracin de Fluoruro Urinario.....................................55 Determinacin de la concentracin de flor plasmtico........................................56 Preparacin de muestra histolgica........................................................................57 Determinacin de fosfatasa alcalina plasmtica.....................................................57 Determinacin de fsforo inorgnico.....................................................................58 Determinacin de clcio plasmtico........................................................................58 Medicin de Densidad Mineral sea.....................................................................59 Consideraciones sobre el efecto estrognico en la rata..........................................59 CAPITULO 6..................................................................................................................60 RESULTADOS...........................................................................................................60 Efecto del tratamiento sobre el crecimiento de las ratas........................................60 Efecto del tratamiento sobre la densidad mineral del hueso sano..........................60 Densidad mineral sea de la zona del defecto ......................................................60 Fosfatasa alcalina plasmtica.................................................................................62 Calcio fecal.............................................................................................................62 Calcemia.................................................................................................................63
______________________________________________________________________ Fosfatemia..............................................................................................................64 Fluoruria ................................................................................................................64 Fluoremia...............................................................................................................65 Anlisis histolgico................................................................................................66 CAPITULO 7..................................................................................................................73 DISCUSIN...............................................................................................................73 CAPITULO 8..................................................................................................................77 CONCLUSIONES......................................................................................................77 CAPITULO 9..................................................................................................................78 ANEXOS....................................................................................................................78 ANEXO 1. Tablas de registro de variables y valores............................................78 CAPITULO 10................................................................................................................82 DEFINICIN DE TRMINOS..................................................................................82 CAPITULO 11................................................................................................................84 BIBLIOGRAFIA........................................................................................................84 BIBLIOGRAFA CONSULTADA............................................................................92 WEBGRAFA.............................................................................................................96
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CAPITULO 1
INTRODUCCION
El tejido seo es un complejo y amplio sistema del organismo. Sus componentes matriciales, minerales y celulares hacen de ste un campo de interaccin entre los elementos orgnicos e inorgnicos que le proveen compleja funcionalidad. Su integracin con otros sistemas como el sanguneo, el muscular y tejidos conectivos blandos le confieren propiedades para el soporte y el movimiento. El calcio y el fosfato son dos iones utilizados en la formacin del cristal de hidroxiapatita, responsable de la calcificacin del hueso1. Adems tiene un importante rol en la preservacin y funcionalidad de la mdula sea.
El tejido seo est sometido a lesiones de origen metablico o traumtico. Entre estas ltimas tenemos las lesiones que producen defectos crticos y no crticos. Mientras los primeros de estos defectos requieren de aporte de estructuras de sostn que permitan la regeneracin, los segundos se reparan sin la necesidad de agregados de matrices seas o no seas.
Las sales que contienen flor tienen efecto estimulador de la formacin de tejido seo y dicha accin ha sido validadas en diferentes modelos animales, entre ellos en la rata en crecimiento2. En ste trabajo se demostr un efecto osteoformador tanto
administrando monofluorofosfato de sodio (MFP) y fluoruro de sodio (NaF).
No se ha hallado informacin respecto de la accin del fluoruro sobre el mecanismo de reparacin de defectos no crticos. Por lo tanto, esta investigacin tiene
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Ross. M. Gordon I. Wojciech P. 2004. Histologa Texto y Atlas Color con Biologa Celular y Molecular. Ed. Panamericana. 4a ed. 9: 182-215. 2 Brun L, Pera L, Rigalli. A. Bone Morphometry and differences in bone fluorine containing compounds in rats treated with NaF and MFP. Biomed Pharmacother. 64(1):1-6. 2010
______________________________________________________________________ como objetivo determinar el efecto del MFP y del NaF en el proceso de reparacin sea y la calidad del hueso formado en tibias de rata con un defecto seo no crtico. El efecto se evaluar a travs de la velocidad de mineralizacin y la calidad del hueso formado.
Se trata de un modelo experimental aleatorizado controlado en 18 ratas IIM/FM sublnea e, que reciben MFP, NaF o placebo y se pretende demostrar que los animales tratados con NaF y MFP tendrn una velocidad de reparacin mayor. La estructura histolgica y la densidad mineral sea (DMO) sern las variables estudiadas para evaluar el efecto de los tratamientos.
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CAPITULO 2
OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar el efecto de la administracin oral de MFP y de NaF sobre el proceso de reparacin sea en la rata.
Objetivos Especficos
Evaluar el efecto de la administracin de MFP y NaF sobre la velocidad de reparacin sea.
Determinar el efecto de la administracin de MFP o NaF sobre la calidad del hueso neoformado mediante el anlisis histolgico y la microestructura sea.
Evaluar el efecto del tratamiento con MFP y NaF sobre la velocidad del proceso de mineralizacin en el sitio de la lesin y en el hueso adyacente a travs de mediciones radiolgicas.
Evaluar el contenido de flor en orina y plasma y su relacin con la velocidad de reparacin y calidad del hueso reparado.
Definicin de rea y del problema

Los defectos crticos seos por trauma, presentan alteraciones morfofuncionales para su reparacin en tiempo y reorganizacin tisular y generan cambios morfolgicos, metablicos y biomecnicos por no contar con el componente celular y mineral ptimo para una buena y rpida reparacin debido a la gran prdida tisular local y de las
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______________________________________________________________________ molculas indispensables para lograr dicha reparacin. Estos cambios conducen a la disfuncin del miembro afectado dejando serias consecuencias en la movilidad y la funcionalidad. Por otra parte lo defectos no crticos se reparan sin necesidad de
utilizacin de materiales de relleno, pero la inmovilidad durante tiempos prolongados es un problema para los individuos y la sociedad.
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CAPITULO 3
MARCO TERICO
Generalidades del tejido seo
El tejido seo es un tejido conjuntivo que se caracteriza por tener una matriz extracelular mineralizada que lo distingue de otros tejidos conectivos. Por ser un tejido duro es capaz de proveer sostn y proteccin. El mineral es fosfato de calcio en la forma de cristales de hidroxiapatita: Ca10(PO4)6(OH)2. Por su contenido mineral sirve como depsito de calcio (Ca2+) y fosfato, que pueden ser movilizados de la matriz sea a la sangre segn sea necesario para mantener la calcemia y la fosfatemia dentro de valores normales.
La matriz sea orgnica contiene principalmente colgeno de tipo I, que constituye alrededor del 90% de estra matriz. Tambin contiene sustancia fundamental en la forma de glucosaminoglucanos (hialuronato, condroitinsulfato y queratansulfato), pequeas glucoprotenas (osteocalcina, osteonectina y osteopontina) y varias sialoprotenas. Las glucoprotenas y las sialoprotenas de la sustancia fundamental desempean un papel en la fijacin del calcio durante el proceso de mineralizacin. Tanto el colgeno como los componentes de la sustancia fundamental se mineralizan para formar el tejido seo. Cuando esta matriz no est calcificada se conoce como osteoide y constituye la matriz extracelular sea recin sintetizada por los osteoblastos. El osteoide se deposita en forma de lminas, quedando los osteoblastos atrapados dentro de l y convirtindose en osteocitos cuando se calcifica.
La matriz orgnica representa un tercio del peso seo y juega un papel importante en el conjunto del sistema seo, siendo evidente este hecho cuando aparecen
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______________________________________________________________________ enfermedades del colgeno como la osteognesis imperfecta. Sin embargo, actualmente debe considerarse a la matriz mineralizada extracelular como algo ms que un reservorio de calcio y fsforo. Ya que constituye una reserva de protenas que participan en la regulacin de la diferenciacin celular y en la integridad y funcin del tejido seo.
Adems del colgeno tipo I contiene pequeas cantidades colgeno III, V y XII. Es caracterstico de la molcula de colgeno la presencia de regiones RGD de secuencia aminocidica especfica, la cual es reconocida por las integrinas de la superficie de las clulas seas. Contiene adems los aminocidos hidroxilisina e hidroxiprolina siendo, este ltimo, un marcador especfico de todos los tipos de colgeno y estando sus valores de excrecin urinaria en relacin directa con la taza de resorcin sea. Las fibras de colgeno se estabilizan mediante los puentes de hidrgeno, entre aminocidos y a travs de la formacin de puentes de piridinolina, entre las hidroxilisinas y lisinas. Sin embargo, el colgeno no tiene gran afinidad por el calcio, por lo que son otras las protenas implicadas en el depsito mineral. La mineralizacin comprende la liberacin de vesculas matriciales hacia la matriz sea. En los sitios donde se inicia la mineralizacin de hueso, cartlago, dentina y cemento, la concentracin local de iones de Ca2+ y fosfato debe superar el nivel umbral normal. Los procesos que llevan a la mineralizacin son varios: La fijacin de Ca 2+ extracelular por la osteocalcina y otras sialoprotenas crea una concentracin local alta de este in. La concentracin alta de Ca2+ estimula los osteoblastos para que secreten fosfatasa alcalina, que aumenta la concentracin local de iones de fosfato. La concentracin alta de fosfato, a su vez, estimula el aumento adicional de la concentracin de Ca2+ en donde se iniciar la mineralizacin. La concentraciones altas de Ca2+ y fosfato inducen a que los osteoblastos liberen pequeas vesculas matriciales (de 50 a 200 nm de dimetro) hacia la matriz sea. Estas vesculas contienen fosfatasa alcalina y pirofosfatasa que escinden
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______________________________________________________________________ iones de fosfato de otras molculas de la matriz. Estas vesculas matriciales inducen la cristalizacin de Ca3(PO4)2 en vesculas matriciales circundantes. Los cristales de Ca3(PO4)2 inician la mineralizacin de la matriz por formacin y depsito de cristales de hidroxiapatita, en la matriz que rodea los osteoblastos. Las vesculas matriciales derivadas de los osteoblastos son los factores esenciales que controlan el sitio donde se inicia el depsito de mineral en el osteoide. Una vez que se han precipitado los primeros cristales de hidroxiapatita, estos crecen con rapidez por acrecin hasta que se unen con los cristales vecinos producidos alrededor de otras vesculas matriciales. De esta manera, una onda de mineralizacin recorre el osteoide. Otras clulas que producen osteoide son los ameloblastos y los odontoblastos de los dientes en desarrollo. El hueso es considerado un tejido reservorio para el Ca2+. El mantenimiento de una concentracin sangunea de Ca2+ es decisivo para la salud y la vida. El Ca 2+ puede ser llevado desde la matriz sea hasta la sangre si la calcemia disminuye por de bajo de un punto critico (la concentracin fisiolgica del Ca2+ en el ser humano oscila entre 8,9 y 10,1 mg/dl). Por el contrario, el exceso de Ca2+ sanguneo puede ser extrado de la sangre, almacenado en el hueso o excretado por rin. Estos procesos son regulados por la hormona paratiroidea (PTH), secretada por las glndulas paratiroides, y la calcitonina, secretada por las clulas parafoliculares de la glndula tiroides. La PTH acta sobre el hueso para elevar la calcemia hasta alcanzar la normalidad. La calcitonina acta disminuyendo la calcemia elevada hasta normalizar sus niveles.3
El hueso puede tener una estructura madura laminar o una forma inmadura o plexiforme, estando este ltimo menos mineralizado que el hueso laminar. Por su parte el osteoide constituye menos del 1% del volumen del total y se puede observarse en
Ross. M. Gordon I. Wojciech P. 2004. Histologa Texto y Atlas Color con Biologa Celular y Molecular. Ed. Panamericana. 4a ed. 9:188-192
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______________________________________________________________________ forma de finos ribetes de unas 10 micras de espesor que revisten la superficie de algunas trabculas y tapizan algunas cavidades intracorticales4.
La matriz sea es la responsable de las extraordinarias propiedades biomecnicas del hueso. Las fibras colgenas le proporcionan flexibilidad y resistencia a la tensin mientras que las sales minerales le confieren dureza, rigidez y resistencia a la compresin5.
En la matriz sea, hay espacios llamados lagunas u osteoplastos, cada uno de los cuales contiene un osteocito. El osteocito extiende una gran cantidad de prolongaciones en estrechos tneles denominados canalculos, los que atraviesan la matriz mineralizada para conectar las lagunas contiguas y permitir el contacto entre las prolongaciones de osteocitos vecinos. De esta manera se forma una red continua de canalculos y lagunas con clulas y sus prolongaciones en toda la masa del tejido mineralizado. El tejido seo depende en gran medida de los osteocitos para mantener su viabilidad.
En la Figura 1 se observa la disposicin de los osteocitos de manera concntrica entre las laminillas sea, interconectados por prolongaciones celulares que se comunican por uniones en hendidura o nexos. Estas uniones permiten el transporte metablico y de seales a lo largo de las prolongaciones celulares. Estas disposiciones concntricas son caractersticas del hueso compacto y se conocen como sistemas de Havers u osteonas.
S. Serrano, 1998. II Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatoma Patolgica. Estructura y Funcin del Hueso Normal. http://www.conganat.org/iicongreso/conf/018/osteocl.htm 5 http://www.conganat.org/iicongreso/conf/018/osteocl.htm
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Figura 1: Estructura del hueso compacto, donde se observan osteonas y osteocitos
El sistema de Havers contiene un vaso sanguneo (Figura 2) que proporciona los nutrientes a los osteocitos. Los nutrientes se transportan a travs de una cadena de prolongaciones celulares alejndose del canal de Havers hacia los osteocitos localizados lejos del canal. El transporte del sistema canaliculares est limitado a una distancia aproximada de 100 m.
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Figura 2: Osteocitos y sus comunicaciones intercelulares
Microscpicamente el tejido seo est constituido por dos tipos de hueso: 80% de hueso cortical (compacto) y 20% de hueso trabecular (esponjoso). El hueso tiene una organizacin laminillar que le confiere la dureza que lo caracteriza. El hueso compacto aparece como una masa slida, mientras que el esponjoso consiste en una red de trabculas seas que delimitan los espacios ocupados por la medula sea.
Tanto el tejido seo compacto como el esponjoso forman parte de los diferentes tipos de huesos que podemos hallar en el organismo: huesos largos, cortos y planos. Los huesos largos tiene dos epfisis y una difisis que estn separadas por las metfisis donde se halla el cartlago hialino llamado cartlago de crecimiento (Figura 3). En el adulto se puede reconocer la posicin del cartlago de crecimiento radiolgicamente como la lnea epifisiaria. La placa epifisiaria es responsable de la elongacin del hueso largo. En los huesos largos como el fmur o la tibia, la difisis est constituida por tejido seo compacto que forma un cilindro hueco con un espacio medular central,
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______________________________________________________________________ denominado cavidad medular. Los extremos de dichos huesos son llamados epfisis, corresponden a tejido esponjoso cubierto por una fina capa de hueso compacto 6
Figura 3: Partes de un hueso largo y tipos de tejidos seos que lo componen
Las superficies articulares en los extremos de los huesos largos estn revestidas por cartlago hialino, denominado cartlago articular. Salvo en las superficies articulares y en los lugares de insercin de los tendones y ligamentos, la mayor parte de los huesos se rodean por el periostio que cubre la superficie externa y contiene vasos y clulas osteoprogenitoras. Por ello se considera un tejido conjuntivo especializado con capacidad osteognica.
La cavidad medular de la difisis y los espacios dentro del hueso esponjoso estn revestidos por endostio, el cual esta formado por clulas que pertenecen al estroma de la mdula o derivan de osteoblastos en reposo y son la principal fuente de clulas de
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Modelo tomado de Kierszenbaum: Histology & Cell Biology: An introduction to Pathology 2da. Ed. Pg.128-130
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______________________________________________________________________ revestimiento en los canales de Havers corticales. El endostio tambin tiene capacidad osteognica.
El hueso compacto forma su estructura alrededor de los conductos de Havers, los cuales son rodeados por laminillas concntricas que contienen osteocitos dispuestos entre las laminillas. Como estructura relevante en el tejido seo se encuentran las osteonas formadas por fibrillas de colgeno que alternan con orientaciones helicoidales en laminillas sucesivas del sistema de Havers (Figura 4)7. Los diferentes sistemas de Havers se comunican entre si por conductos de Volkmann.
Figura 4: Estructura del hueso cortical formado por sistemas de Havers y sistemas intersticiales
El hueso esponjoso por su parte, est tambin conformado por osteonas pero estas se disponen en una red trabecular que respeta ciertos espacios que contienen en su interior medula sea 8. Consta de una red de trabculas siendo ms dependiente de los
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Modelo tomado de Kierszenbaum, Abraham. Histologa y Biologa Celular. Introduccin a la Patologa. 2a. ed; Ed. ELSEIVER. Espaa. 2008. Pg.130-134. 8 Ross. Histologa Texto y Atlas Color con Biologa Celular y Molecular. 4a ed. Cap. 8. pgs: 182-193. Buenos Aires, Ed. Medica Panamericana. 2005.
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______________________________________________________________________ cambios hormonales, especialmente a la PTH, calcitonina, hormona de crecimiento y el factor de crecimiento insulino-smil I (IGF-I). El hueso esponjoso consiste en laminillas que no tienen un canal central, esto es hueso laminar sin sistemas de Havers. Las epfisis de los huesos largos estn constituidas por hueso esponjoso cubierto por una delgada capa de hueso compacto. Los espacios dentro del hueso esponjoso estn revestidos por endstio con capacidad osteognica.9
El periostio est formado por dos capas:
La externa con abundantes fibras colgenas y vasos sanguneos que entran en los canales de Volkmann. La fibras que salen de esta parte del periostio se denominan fibras de Sharpey y se proyectan al sistema circunferencial externo.
La interna que contiene clulas osteoprogenitoras que se convierten en osteoblastos durante los procesos que requieren reparacin, como las fracturas. 10
Clulas del tejido seo

En el tejido seo se encuentran diferentes tipos celulares involucrados en el proceso de generacin de clulas especficas, en la formacin y resorcin sea y en la nutricin del tejido.
Clulas del mesnquima: Por su parte las clulas del mesnquima tienen un rol importante en la formacin del tejido seo. Las clulas mesenquimales pluripotentes indiferenciadas pueden dar origen a cinco estirpes celulares distintas: fibroblastos, osteoblastos, condroblastos, mioblastos y adipocitos, en respuesta a diferentes seales
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Op. Cit.4. Pg.15 Kierszenbaum, Abraham. Histologa y Biologa Celular. Introduccin a la Patologa. 2a. ed; pp. 131164. Ed. ELSEIVER. Espaa. 2008.
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______________________________________________________________________ moleculares. Existe un gran nmero de estudios que han demostrado la capacidad de estas clulas de reparar daos en tejidos in vivo.11
Las clulas madre del mesnquima se caracterizan morfolgicamente por ser clulas pequeas, largas y estrechas con pocos procesos celulares. En el interior se encuentra un ncleo grande y redondo con un nuclolo prominente, rodeado de finas partculas de cromatina que delimitan y diferencian el ncleo claramente. El cuerpo celular contiene adems compartimentos celulares como el aparato de Golgi, retculo endoplsmico rugoso, mitocondrias y polirribosomas. Las clulas madre del mesnquima del tejido embrionario son clulas precursoras del tejido conjuntivo en general. La capacidad de diferenciacin y especializacin de estas clulas pluripotenciales da lugar a los diferentes tipos de tejidos conectivos especializados (tejidos adiposo, cartilaginoso, seo y hematopoytico). Tienen adems la capacidad de transformarse en un tejido diferente del que formaba parte y adaptarse a las nuevas condiciones del medio.
Clulas Osteoprogenitoras: Las clulas osteoprogenitoras son clulas en reposo que pueden transformarse en osteoblastos y secretar matriz osteoide. Su ubicacin est confinada a la superficie interna y externa de los huesos. Reciben la denominacin de clulas peristicas cuando forman la capa ms interna del periostio y clulas endsticas cuando tapizan las cavidades medulares, los conductos de Havers y de Volkmann (perforantes).
Las clulas osteoprogenitoras tienen las propiedades de dividirse y proliferar, lo cual se logra tras un estmulo adecuado transformndola en osteoblastos. Durante esta
11
http://www.analesranf.com/index.php/mono/article/viewFile/946/934 pp. 197-198 (Friedenstein, 1976). Damin Garca Olmo y Mariano Garca Arranz
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______________________________________________________________________ transformacin se producen cambios de su retculo endoplsmico rugoso, ribosomas libres y aparato de Golgi. Estas microestructuras que el estadio de clula
osteoprogenitora se encuentran poco desarrolladas y escasamente visibles. Estas clulas tapizan el tejido seo que no est en remodelacin. No obstante, cuando el hueso no est creciendo, stas clulas permanecen en estado latente. Se cree que participan en la nutricin y mantenimiento de los osteocitos que se encuentran incluidos en la matriz sea subyacente, pues se ha visto que tienen prolongaciones citoplasmticas que se extienden dentro de los canalculos y se comunican a travs de nexos con las prolongaciones de los osteocitos.
El grado de diferenciacin de la clula osteoprogenitora no est del todo dilucidado. Su origen en clulas mesenquimales y su aparente capacidad de diferenciarse en varios tipos de clulas diferentes de los osteoblastos (adipocitos, condroblastos, musculares y fibroblastos) indican que estas clulas, lo mismo que los fibroblastos, pueden modificar sus caractersticas morfolgicas y funcionales en respuesta a estmulos especficos. Esto es importante porque la reparacin de fracturas seas comprende la formacin de nuevo tejido conjuntivo y cartlago en el callo que aparece alrededor del hueso durante le proceso reparativo.12
La diferenciacin del osteoblasto viene regulada por factores de crecimiento y transcripcin. Varios miembros de la familia de las protenas morfogenticas seas (BMP) y del factor de crecimiento transformante (TGF) pueden regular el desarrollo embrionario y la diferenciacin del osteoblasto.
12
Ross. M. Gordon I. Wojciech P. 2004. Histologa Texto y Atlas Color con Biologa Celular y Molecular. Ed. Panamericana. 4a ed. 9: 188-192.
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______________________________________________________________________ Ciertos genes especficos de los osteoblastos regulan la diferenciacin de la progenie. El gen Cbfa1/Runx2 codifica un factor de transcripcin que induce la diferenciacin de los osteoblastos y controla la expresin de osteocalcina. Cbfa1/Runx2 es el indicador ms precoz y especfico de la osteognesis y su expresin se induce por BMP7. Los ratones con dficit de Cbfa1/Runx2 llegan a trmino y tienen un esqueleto constituido por cartlago. No se encuentran evidencia de formacin o diferenciacin de osteoblastos en estos ratones (Figura 6).
13,14
Figura 5: Diferenciacin de clulas pluripotentes a diferentes tipos celulares
Un tipo de clulas de aspecto fibroblstico cercanas a las superficies seas pero separadas de estas por otros tipos celulares se conocen como preosteoblastos (Figura 6), derivan de clulas osteoprogenitoras y seran estados previos a la diferenciacin a osteoblastos. 15
13 14
Op. Cit.4 pp.135-136. Pg.15 Op. Cit.4 pp.136-137. Pg. 15 15 Op.Cit.4 pp.5. Pg. 15
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______________________________________________________________________ Osteoblastos: Son clulas de forma cbica, citoplasma basfilo y ricas en una isoenzima especfica de la fosfatasa alcalina. Derivan de los preosteoblastos y suelen considerarse clulas con diferenciacin terminal y por tanto incapaces de dividirse. Los osteoblastos se hallan en contacto directo con las superficies seas formando grupos compactos de una sola capa de espesor (Figura 6).
Figura 6: Preosteoblastos fusiformes adyacentes a osteoblastos cbicos que revisten un ribete de osteoide
De manera caracterstica el ncleo de estas clulas se sita en el extremo que se halla ms alejado de la superficie sea sobre la que asientan (Figura 7).
Figura 7: Microscopa electrnica de un osteoblasto x3400
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______________________________________________________________________ Los osteoblastos poseen retculo endoplsmico rugoso y aparato de Golgi16 muy desarrollados. Sintetizan el componente orgnico de la matriz sea y controlan el depsito de minerales. Por otra parte, expresan receptores para PTH, IGF1 y vitamina D, fosfatasa alcalina y RANKL entre otros 17 (Figura 8).
Figura 8: Microfotografia electrnica de un osteoblasto y protenas de membrana ms importantes
En la medida en que los osteoblastos sintetiza su propia matriz extracelular, tambin producen y secretan una protena denominada osteoprotegerina (OPG), que es un receptor seuelo que se une a RANKL, una protena ubicada en la membrana de los osteoblastos. Por su parte RANKL se une al receptor RANK de precursores osteoclsticos e inicia la osteoclastognesis. As, la OPG inhibe la osteoclastognesis y evita la resorcin sea.
Tanto in vivo como in vitro, los osteoblastos pasan sucesivamente por tres estadios funcionales:
Proliferacin celular y sntesis de los componente orgnicos de la matriz sea.
16 17
Op. Cit.4. pp.41. Pg.15 Op. Cit.4. pp.135. Pg.15
25
______________________________________________________________________ Maduracin de la matriz sea (cambios en la composicin y organizacin de la matriz que la hacen competente para ser mineralizada).
Depsito de mineral. In vitro se ha comprobado que estos estadios coinciden con la activacin sucesiva de una serie de genes. Los genes c-fos, c-jun, histona H4, colgeno tipo I, fibronectina y factor transformante que participan en la proliferacin y sntesis de los componente orgnicos de la matriz sea. La expresin de fosfatasa alcalina en membrana participa en la maduracin de la matriz. La expresin de los genes que codifican sialoproteina sea, osteopontina y osteocalcina participan en el depsito de mineral.18 La fosfatasa alcalina es una isoenzima que hidroliza steres de monofosfato a pH alcalino. Esta enzima deja de expresarse cuando el osteoblasto deja de sintetizar protenas. La osteocalcina es necesaria para la mineralizacin sea y la osteopontina interviene en la formacin de la zona de sellado. Por su parte la sialoprotena sea interviene en la unin de los osteoblastos con la matriz extracelular a travs de las integrinas.
El osteoblasto tambin tiene a su cargo la calcificacin de la matriz. El proceso de calcificacin parece que es iniciado por el osteoblasto mediante la secrecin hacia la matriz de las vesculas matriciales como se explic anteriormente.
Los osteoblastos median en la reabsorcin, llevada a cabo por los osteoclastos a travs de la sntesis de citoquinas especficas y sintetizan factores de crecimiento. La vida media de los osteoblastos humanos es de 1 a 10 semanas, al trmino de las cuales pueden desaparecer por mecanismos de apoptosis, transformarse en clulas de revestimiento o quedar includos en la matriz sea en forma de osteocitos19 .
18
19
Op. Cit.4 pp.134. Pg.15 Op. Cit.4. pp.190 y 202. Pg. 15.
26
______________________________________________________________________ Clulas de revestimiento: Cuando los osteoblastos que han permanecido en la superficie finalizan la sntesis de matriz, se aplanan y se convierten en clulas de revestimiento. Estas clulas a travs de la produccin de factores locales como interleukina-6, interleukina-11 parecen desarrollar un importante papel en el control del remodelado seo. En contraste con los osteoblastos que se ubican donde hay depsito activo de matriz, las clulas de revestimiento son clulas aplanadas o adelgazadas que revisten la superficie sea. Estas clulas se parecen a las clulas osteoprogenitoras.
Osteocitos: son las clulas ms abundantes del hueso, existen diez veces ms que los osteoblastos. De esta forma los osteocitos se organizan formando un sincitio de clulas interconectadas que representan una nica estructura con la ventaja de que existe una gran superficie de contacto en el interior y hacia la superficie sea, para asegurarse oxgeno y nutrientes 20.
Figura 9: Microfotografa electrnica de un osteocito y sus prolongaciones citoplasmticas
La cavidad de la matriz sea que contiene el cuerpo celular del osteocito se denomina laguna osteocitaria y los diminutos canalculos que albergan sus
20
Op. Cit.4. pp.133. Pg. 15
27
______________________________________________________________________ prolongaciones citoplsmicas reciben el nombre de conductos calcforos (Figura 9). Los osteocitos son clulas con una escasa actividad metablica pero su preservacin parece necesaria para que el tejido seo mantenga sus propiedades biomecnicas.
Los osteocitos hacen parte del estadio final desde la lnea osteoblstica y son incapaces de renovarse. Comparten algunos marcadores con los osteoblastos, pero tienen como marcador especifico el CD44, receptor de la membrana que se expresa fuertemente en osteocitos y es negativo en osteoblastos y clulas de revestimiento.
Osteoclastos: Son clulas gigantes multinucleadas de citoplasma acidfilo, encargadas de la resorcin sea. Sus ncleos se sitan en el extremo ms alejado de la superficie sea sobre la que asientan (Figura 10)21. Tiene en su membrana dos especializaciones: un borde en cepillo, que es donde tiene lugar la reabsorcin y una zona clara, rica en microfilamentos, con integrinas que sirven de anclaje a la matriz. La adhesin de los precursores de los osteoclastos a la matriz sea ocurre luego que la superficie sea queda libre de osteoblastos y clulas de revestimiento.
Figura 10: imagen microscpica de osteoclastos

21
Op. Cit.4 Pg. 15
28
______________________________________________________________________ Derivan de la clula madre hematopoytica a travs de clulas formadoras de colonias de granulocitos y macrfagos (CFU-GM). Su proliferacin es activada por el factor estimulante de colonias de macrfagos (M-CSF) y el reclutamiento de los preosteoclastos se inicia a partir de las CFU-MG. El papel de las citokinas sigue siendo controvertido, explicando la interaccin de las clulas de la mdula sea con las clulas de la lnea osteoblstica; as la IL-1, IL-6, TNF y prostaglandina E2 parecen incrementar la activacin osteoclstica; sin embargo el TGF reducira la prdida sea, incrementando la apoptosis de los osteoclastos.
Para ejercer su accin en el proceso de resorcin, los osteoclastos se movilizan hacia la zona a resorber y se adhieren a la superficie sea mineralizada por el ribete en cepillo sellando los bordes del rea mediante las integrinas. La integrina del osteoclasto, particularmente v3, reconoce la secuencia RGD existente en el colgeno. A este nivel el pH cido, y enzimas proteolticas colagenasa, proteasas, como metalocatepsina K,
glucuronidasa, etc., van a producir la reabsorcin del hueso mediante
solubilizacin de la matriz orgnica (Figura 11).

Figura 11: Esquema de los mecanismos implicados en la reabsorcin sea por parte de los osteoclastos
mineral22
22
Op. Cit.4. pp.147-149. Pg. 15
29
______________________________________________________________________ Un canal de cloro impide que aumente en exceso el pH intracelular. Se intercambia bicarbonato (HCO3) por cloro que posteriormente es transportado por un canal de cloro a la laguna de Howship. El intercambiador bicarbonato/cloruro garantiza que el citoplasma se mantenga neutro a nivel elctrico. La anhidrasa carbnica II genera protones (H) a partir de CO2 y H2O, y los H se liberan hacia la laguna de Howship por intermedio de una bomba de ATPasa para generar un entorno cido (pH aprox. 4,5) y solubilizar as el hueso mineralizado.
Entre los plegamientos de la membrana y la matriz sea existe un estrecho espacio poco denso a los electrones. A ambos lados de la zona de plegamiento la membrana se aplana y se adhiere ms ntimamente a la matriz. El espacio comprendido entre la membrana y la matriz sea queda convertido en un microambiente que se halla aislado del intersticio medular. El segmento de citoplasma adyacente a esta zona aplanada se halla libre de organelas por lo que se denomina zona clara. Esta zona contiene abundantes microfilamentos de actina que probablemente se relacionan con la capacidad de traslacin de la clula. El territorio sobre el que se desplaza un osteoclasto durante el proceso de reabsorcin es varias veces superior al de la superficie de la clula y se denomina dominio osteoclstico.
Expresan diferentes protenas, algunas caractersticas de estas clulas. La fosfatasa cida tartrato resistente, cuya actividad es aprovechada para su identificacin, tanto in vivo, como in vitro. La TRAP es capaz de desfosforilar la osteopontina y la sialoprotena sea por lo que podra facilitar los movimientos de la clula al separarla de estas protenas de la matriz.23. Adems cuenta con receptores para la calcitonina.
23
Fisiologa y fisiopatologa sea. Physiology and bone physiopathology. http://www.cfnavarra.es/salud/anales/textos/vol26/sup3/suple2a.html.Pgs.7-9 Servicio de Endocrinologa. Centro de Consultas Externas Prncipe de Viana. Pamplona
30
______________________________________________________________________ Las hormonas sistmicas, que estimulan la resorcin sea, no actan directamente sobre los precursores de clulas osteoclsticas, sino sobre los osteoblatos. Tanto la PTH, 1,25-dihidroxivitamina D3 y las hormonas tiroideas (HT), incrementan la expresin de RANKL en estas clulas, pudiendo en algunos casos inhibir la sntesis de OPG con un efecto neto de incremento de la resorcin sea. El efecto de los estrgenos parece ser indirecto, a travs de la regulacin de diversos mediadores, ya que su papel de control en el sistema RANKL-RANK, se lleva a cabo exclusivamente incrementando los niveles de OPG efecto que se potencia con su papel supresor sobre la sntesis de: IL1, IL-6, PGE2, GM-CSF y TNF, frenando la diferenciacin y activacin de los preosteoclastos. Los estrgenos tambin actan sobre los osteoclastos ya activados, incrementando su apoptosis, tanto directamente como potenciando la sntesis de TGF-. La otra hormona que influye sobre la resorcin sea, la calcitonina, inhibe directamente la actividad osteoclstica, si bien de forma transitoria, por un fenmeno rpido de regulacin de sus receptores expresados en los osteoclastos.
Existen otros factores locales que pueden condicionar el nivel de resorcin sea. Por ejemplo, una concentracin elevada de calcio, en el borde en cepillo de los osteoclastos, es capaz de inducir su apoptosis.24
Respecto a la osteoclastognesis, se sabe que los osteoblastos son fundamentales para la formacin de osteoclastos. As, el factor estimulante de las colonias de macrfagos (M-CSF) producido por los osteoblastos es requerido en las primeras fases de la osteoclastognesis. Los conocimientos actuales acerca de la regulacin de la osteoclastognesis se basan en la existencia de 3 molculas clave: el receptor seuelo OPG, la protena de membrana del osteoblasto RANKL, y el receptor de precursores
24
Op. Cit.4 . pp.41. Pg.15
31
______________________________________________________________________ osteoclsticos RANK. El RANKL es una citoquina transmembrana perteneciente a la familia del factor de necrosis tumoral (TNF). La interaccin entre RANKL y su receptor RANK produce la activacin de la diferenciacin y de la actividad osteoclstica. Cuando se unen OPG y RANKL se inhibe la unin de RANKL a RANK y se inhibe la diferenciacin osteoclstica.
Osteognesis
El hueso se desarrolla por la sustitucin de un tejido conectivo preexistente. Los dos procesos de formacin de hueso u osteognesis son: osificacin intramembranosa y osificacin endocondral. La diferencia entre ambos tipos de osificacin es que durante la osificacin endocondral el cartlago se sustituir por matriz sea, mientras que en la osificacin intramembranosa la matriz sea se sintetiza directamente de las clulas provenientes del tejido embrionario con linaje osteoblstico.25
Osificacin intramembranosa: En la figura 12 cuadro 1, se observan clulas mesenquimales que se agregan26. Este proceso se controla por seales de los polipptidos de las familias Wnt, hedgehog, del factor de crecimiento fibroblstico y del TGF. En el cuadro 2, las clulas mesenquimales se diferencian a osteoblastos. Las clulas mesenquimales se diferencian osteoblasto cuando se expresan los factores de transcripcin Cbfa1/Runx2 y Osterix. La diferenciacin de osteoblastos a osteocitos tambin necesita de la expresin de estos factores.
Los osteoblastos revisten la superficie del blastema seo. En el cuadro 3, se observa el osteoide depositado por los osteoblastos. Posteriormente, se utiliza Ca en el proceso de mineralizacin y los osteoclastos inician el remodelado del tejido seo.
25 26
Op. Cit.4. pp.128-130. Pg 15 Op. Cit.4. pp.147-149. Pg.15
32
______________________________________________________________________
Figura 12: Proceso de osificacin intramembranosa a partir de mesnquima
Muchas trabculas individuales aumentan de tamao mediante crecimiento por aposicin y al final se fusionan para formar un centro de osificacin primaria, organizado durante el primer estadio de la osificacin intramembranosa. Aunque la formacin del tejido seo primario empieza como un proceso intersticial, pronto se vuelve un proceso aposicional. Los osteoblatos quedan atrapados dentro del osteoide calcificado, transformndose en osteocitos27. En la superficie del osteoide los osteoblastos siguen depositando matriz por aposicin (Figura 13).
Figura 13: Proceso de Osificacin Intramembranosa

27
Op.Cit.4.pp.147. Pg.15
33
______________________________________________________________________ El depsito continuado de hueso en las superficies trabeculares determina la oclusin de los espacios intertrabeculares y se forma el hueso compacto. En otras zonas no se produce el engrosamiento de las trabculas y el tejido conjuntivo del espacio intertrabecular se diferencia a tejido hematopoytico. Los huesos frontal y parietal y parte de los huesos temporal, occipital, mandibular y maxilar se desarrollan mediante osificacin membranosa. En la figura 13 se observa un tejido conjuntivo primario bien vascularizado; agregados de clulas mesenquimales y osteoblastos que producen delgadas trabculas de hueso esponjoso, dando lugar a una red irregular llamada esponjosa primaria.
Osificacin endocondral: El hueso se forma reemplazando el cartlago hialino preexistente. El mecanismo de la deposicin de matriz sea durante la osificacin intramembranosa y la osificacin endocondral es esencialmente el mismo. Se establece una red trabecular principal y, a continuacin, se transforma en hueso maduro.28
La formacin de hueso endocondral es caracterstica de los huesos largos, la columna vertebral y la pelvis. Se observa la siguiente secuencia:
Los condrocitos del centro de la estructura de cartlago hialino se vuelven hipertrficos y empiezan a sintetizar el colgeno de tipo X y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
Los vasos del pericondrio invaden el centro de cartlago hipertrfico cuya matriz se calcifica: es el establecimiento del centro de osificacin primaria (Figura 14)29.
28
29
Op. Cit.4; pp.149-150. Pg.15 Op. Cit.4. pp.149. Pg.15
34
______________________________________________________________________ Las clulas pericndricas forman un delgado collarn peristico en el tercio medio de la difisis. El collarn peristico forma hueso trabecular mediante un proceso de formacin de hueso intramembranoso, por debajo del futuro periostio.
Figura 14: Osificacin endocondral, formacin de centro de osificacin primario
Los vasos invaden el espacio que antes estaba ocupado por los condrocitos hipertrficos y las clulas osteoprogenitoras y hematopoyticas llegan a travs del tejido perivascular.
Las clulas osteoprogenitoras se diferencian en osteoblastos, que se alinean a lo largo de la matriz de cartlago calcificado y empiezan a depositar osteoide. En este momento el centro de osificacin primaria comprende dos componentes: el collarn peristico y el centro de osificacin en el interior de la estructura de cartlago. A continuacin suceden dos pasos: uno, el crecimiento en longitud del futuro hueso largo y el otro, el desarrollo de los segundos centros de osificacin en las epfisis (Figura 15)30.
El crecimiento en longitud de los huesos largos depende del crecimiento intersticial del cartlago hialino mientras que el centro del cartlago se sustituye por hueso. Los
30
Op. Cit.4. pp.150. Pg.15.
35
______________________________________________________________________ centros de osificacin secundarios se producen por la sustitucin del cartlago hialino por hueso esponjoso, salvo en el cartlago articular y en un delgado disco, el cartlago de crecimiento epifisiario de las metfisis que une las difisis con las epfisis.
Figura 15: Osificacin Endocondral, Formacin de Centros de Osificacin Secundario
El cartlago de crecimiento conserva la capacidad de condrognesis y, tras la pubertad, se sustituye por la lnea epifisiaria. La condrognesis del cartlago de crecimiento y la formacin del collarn peristico estn reguladas por la protena Indian hedgehog mediante un mecanismo paracrino.31
Remodelacin sea
El hueso es capaz de regenerarse, permitiendo su restitucin integral tras un trauma. Por considerarse un tejido dinmico en constante formacin y reabsorcin,
31
Op. Cit.4. pp.163-164. Pg.15
36
______________________________________________________________________ mantiene un equilibrio conocido como proceso de remodelado seo en el cual se consigue renovar el hueso, entre un 5 y un 15% en un ao en condiciones normales. El remodelado seo es un proceso llevado a cabo los osteoclastos y por los osteoblastos. La actividad conjunta de ambas las hace ser reconocidas como la Unidad Bsica de Remodelado seo.
La remodelacin sea consiste en el reemplazo del hueso antiguo por uno recin formado bajo las condiciones de formacin resorcin y con la participacin de osteoclastos y osteoblastos. Es un proceso continuo a lo largo de la vida y el propsito de la remodelacin es fortalecer la calidad sea mediante la reparacin de las microfracturas y mantener la homeostasis del calcio.
En condiciones normales, la misma cantidad de hueso reabsorbida es reemplazada por el mismo volumen de hueso nuevo. Si el volumen de hueso reabsorbido no es completamente reemplazado por hueso nuevo el tejido se debilita y se plantea un riesgo de fracturas espontneas.
Hay dos formas de remodelacin sea: Remodelacin cortical y Remodelacin trabecular.32
La remodelacin del hueso cortical implica la resorcin de un sistema haversiano antiguo seguido por la organizacin de un nuevo sistema haversiano. Los osteoclastos forman un tnel de resorcin centrifuga que es rellenado centrpetamente por osteoblastos. Para que ocurra este fenmeno, deben ocurrir cuatro fases de actividad celular:
32
Op. Cit.4.pp.158-160. Pg.15
37
______________________________________________________________________ Activacin: Los precursores de los osteoclastos son reclutados al canal de Havers y se diferencian a osteoclastos, los cuales revisten la laminilla sea que afronta el canal y empiezan el proceso de resorcin sea de la laminilla interna y las consecutivas en direccin a la laminilla externa.
Resorcin: Se reclutan ms precursores de osteoclastos conforme progresa ligeramente la resorcin de las laminillas ms all del lmite de la osteona original.
Inversin: Los osteoblastos invierten el proceso de resorcin organizando una capa dentro de la cavidad de resorcin y empezando a secretar osteoide. La lnea de cementacin indica el lmite de laminillas recin organizadas. Se siguen depositando nuevas laminillas seas hacia el centro de la osteona.
Formacin: Los osteoblastos continan depositando hueso y al final quedan atrapados dentro de la matriz sea mineralizada para convertirse en osteocitos. Se forma una nueva osteona o sistema de Havers. Las lneas de cementacin no slo son el marcador del inicio de la remodelacin. Las fuerzas externas que actan sobre las osteonas pueden producir microfracturas las cuales pueden ser neutralizadas por la lnea de cementacin y por la disposicin y orientacin alternante de las fibras de colgeno mineralizadas en el hueso laminar. Las microfracturas limitadas a la regin de la osteona se pueden reparar mediante el proceso de remodelacin osteoblastoosteoclasto. Cuando existe un defecto en la arquitectura de la osteona, la microfractura se extiende y puede producir una fractura sea completa33.
Por otra su parte la remodelacin del hueso trabecular tiene lugar en la superficie sea a diferencia de la remodelacin del hueso cortical, que se produce en forma de
33
Op. Cit.4. pp.164. Pg.15
38
______________________________________________________________________ tneles. La superficie endstica de las trabculas se remodela por este mecanismo, cuyos pasos son parecidos a los de la remodelacin del hueso cortical.34
El proceso de resorcin puede llegar a incrementar la fragilidad sea, ms all de lo esperable simplemente por la disminucin de la densidad mineral. En las trabculas del hueso esponjoso se producen erosiones, durante la resorcin as como aumento de porosidad en el hueso cortical. Si el fenmeno se repite varias veces en el mismo territorio, el resultado ser de prdida de la estructura sobre la que debera sustentarse el fenmeno acoplado de formacin sea. Adems, el proceso de formacin sea requiere ms tiempo que el de resorcin, por lo que si el recambio seo est muy acelerado, se compromete la mineralizacin, con posterior incremento de la fragilidad del hueso. Todo ello explicara la asociacin, independiente de otros factores de riesgo de fracturas con una tasa elevada de resorcin sea.35
Reparacin del Hueso La regeneracin tisular es la respuesta que consigue la restitutio ad-integrum del tejido tras un trauma, a diferencia de la reparacin, donde el tejido que se forma es un tejido cicatricial, con caractersticas diferentes al original. En este sentido el hueso es el nico tejido del organismo, a excepcin del tejido embrionario, que se restituye totalmente tras una lesin. La regeneracin sea origina una respuesta en la que estn involucrados los vasos sanguneos, las clulas y la matriz extracelular.
Es conocida la importancia de los vasos sanguneos en la osteognesis 36. Tras un trauma, se produce una respuesta inflamatoria y un hematoma inicial, con hemates, plaquetas y fibrina. Las clulas del cogulo liberan interleukinas y factores de
34 35
Op. Cit.4. pp.164. Pg.15 Op. Cit4.. pp.130. Pg.15 36 Trueta J. The role of blood vessels in osteogenesis. J Bone Joint Surg Br 1963;45:402.
39
______________________________________________________________________ crecimiento, originando la migracin de linfocitos, macrfagos, precursores de osteoclastos y clulas mesenquimales pluripotenciales. Estas seales moleculares promueven la diferenciacin hacia clulas endoteliales, fibroblastos, condroblastos y osteoblastos, dando origen a un nuevo tejido fibrovascular, que reemplazar al cogulo. Todo ello est regido por una serie de complejas interacciones entre factores de crecimiento, hormonas y citoquinas. En este proceso va a ser fundamental el aporte vascular, la sntesis proteica y la mineralizacin.37, 38, 39
El defecto seo y el proceso de reparacin

La Orthopaedic Trauma Association ha creado una clasificacin de defectos seos que describe la magnitud del defecto resultante pero no delimita la zona
anatmica, un factor fundamental para el proceso de reparacin sea40.
El tipo de fractura obliga a valorar cada caso con sus particularidades, donde no solo se involucran el tejido seo sino la vascularizacin del mismo, las partes blandas que le rodean y el estado endocrino-metablico del individuo. En dependencia de la localizacin de la injuria y su magnitud ser el pronstico de cicatrizacin41.
37
Gehron Robey P, Fedarko NS, Hefferan TE, Bianco P, Vetter UK, Grzesik W et al. Structure and molecular regulation of bone matrix proteins. J Bone Miner Res 1993;8:483-7. 38 Schonau E, Rauch F. Markers of bone and collagen metabolism. Problems and perspectives in Pediatrics. Horm Res 1997;48:50-9. 39 Canalis E, Economides AN, Gazzerro E. Bone morphogenetic proteins, their antagonists, and the skeleton. Endocr Rev 2003;24:218-35. 40 Crenshan, A. CAMPBELL. Ciruga Ortopdical. 8 Ed. Mdica Panamericana, Buenos Aires. T2: 12111267, 1992 41 Escarpenter, JC: Seudoartrosis Diafisiarias. Diagnstico morfolgico funcional y consideraciones teraputicas. Ed. Ciencias Mdicas. La Habana, 2005.
40
______________________________________________________________________ Se ha planteado el uso de injerto seo autlogo o heterlogo en aquellas fracturas que presenten un defecto seo. Los implantes de hidroxiapatita empleados como sustitutos de injerto seo aumentan considerablemente su resistencia mecnica al quedar invadidos por la proliferacin del tejido seo de neoformacin42 43
44
La vascularizacin y las caractersticas histolgicas que rodean la lesin sern fundamentales para su recuperacin. La tibia, un hueso desprovisto de masa muscular en la mayor parte de su cara anterointerna, depende en grado supremo del aporte vascular de sus tres fuentes de irrigacin: la arteria nutricia que proviene de la arteria tibial posterior, las ramas metafisarias que se anastomosan en la cavidad metafisaria con ramas de la nutricia y las arterias peristicas que se orientan perpendicularmente respecto al eje mayor del hueso. Aquellas fracturas que tengan una localizacin en el tercio medio o por debajo de los agujeros nutricios tendrn un aporte vascular limitado y dificultarn el aporte sanguneo endstico distal. Un periostio intacto es un elemento que favorece el pronstico, su defecto requiere de un tejido puente que aporte una neovascularizacin.
La localizacin anatmica y el defecto seo proporcionan el valor pronstico de la lesin

45
. Para clasificar las lesiones se realizaron radiografas en los planos
anteroposterior y lateral, con traccin manual de la pierna afectada, que incluyera las articulaciones proximal y distal. Se tom como referencia los criterios propuestos por la Orthopaedic Trauma Association, a los que se aadieron modificaciones para tener en
42
Ferrer Lozano. 2008. Evaluacin anatomo-funcional de defectos seos en fracturas de tibia. http://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/1163/4/Evaluacion-anatomo-funcional-dedefectos-oseos-en-fracturas-de-tibia 43 Cambras R, Ceballos A. Tratado de Ciruga Ortopedia y Traumatologa. Tomo 1. Ed. Pueblo y Educacin, La Habana, 1985: 94-100. 44 Pereda, O. Metodologa de empleo de hidroxiapatita coralina HAP-200 en Ortopedia y Traumatologa. Rev. Cubana Ortop Traumatol 2005; 19(1): 35-40. 45 Op.Cit.42 pp.3. Pg.41
41
______________________________________________________________________ cuenta la localizacin anatmica y vascularizacin de los fragmentos, as como evitar errores de apreciacin en la medicin del defecto seo.
Figura 16: Divisin a nivel de tibia para considerar el tipo de defecto.
Se traz una lnea media a la tibia en ambas vistas radiogrficas en sentido cefalocaudal, tomando como referencia la espina anterointerna en la vista anteroposterior (Figura 16) 46. Defectos seos que sobrepasen en una y otra vista esta lnea se consideran mayores del 50%. Esto se relaciona con el mecanismo de produccin y el nmero de fragmentos de la lesin. Para el anlisis se propuso una clasificacin anatomofuncional del defecto seo que tiene en cuenta la localizacin anatmica del defecto y la vascularizacin. Estas consideraciones se tuvieron en cuenta en la evaluacin de los rayos X de cada extremidad tratada y permiti tener un concepto ms claro del defecto, as como las implicaciones del mismo en la extremidad en esta investigacin.
46
Op.Cit.42. pp.3.Pg.41
42
______________________________________________________________________
Flor y su efecto sobre el tejido seo
El flor se encuentra en la naturaleza y constituye aproximadamente el 0.03% P/P de la corteza terrestre. El flor ingresa al organismo de manera crnica, ya sea en forma espontnea o como recurso teraputico bajo la frma qumica de fluoruro. La forma ms comn de ingestin de fluoruro es con el agua de bebida. El contenido de flor en el agua puede variar desde valores menores a 10-6 mol/L y alcanzar hasta 0.15 mol/L47. Algunos alimentos poseen elevado contenido de flor, como ciertos peces, el t48 y vegetales de zonas con suelos con alto contenido de flor 49. Tambin puede existir exposicin a grandes cantidades de fluoruro en trabajadores de industrias metalrgicas, del aluminio, del vidrio o farmacuticas. El fluoruro es utilizado en distintas terapias farmacolgicas, en las formas de NaF50 y el monofluorofosfato (MFP)51.
El fluoruro es un mitgeno de las clulas seas que produce incremento de la masa sea52. El mecanismo de accin sobre el osteoblasto es parcialmente conocido y la hiptesis con mayor sustento experimental se basa en su actividad inhibitoria sobre la tirosin fosfatasa cida del osteoblasto53 encargada de defosforilar protenas involucradas en la transduccin de seales.
47
WHO: World Health Organization. 1969. Fluoride: Guidelines for drinking water quality. Vol 2. Health Criteria and other supporting information. Geneva. 1985. 48 Cook HA. Fluoride and tea. Lancet 2:329. 49 Kramer L, Osis D, Wiatrowski E, Spencer H. 1974. Dietary fluoride in different areas in the United States. Am J. Clin. Nutr. 27:590-594. 50 Aloia, J.F; Zange, I; Vaswarri, A; Ellis, D; Cohn, S.H. 1982. Combination therapy for osteoporosis with estrogen, fluorides and calcium. J. Am. Geriatr. Soc 30:13 17. 51 Resch, H; Libanati, C; Talbot, J, Tabuenca, M; Farley, S; Bettica, P; Tritthart, W; Baylink,D. 1994. Pharmacokinetic profile of a new fluoride preparation: sustained-release monofluorophosphate. Calcif.Tissue Int 54:7-11. 52 Lau, K.H; Farley, J.R; Freeman, T.K; Baylink, D.J. 1989. A proposed mechanism of the mitogenic action of fluoride on bone cells inhibition of the activity of an osteoblastic acid phosphatase. Metabolism 38: 858-868. 53 Farley, J.R; Tarbaux, N; Hall, S and Baylink, D.J. 1990. Mitogenic Action(s) Of Fluoride On Osteoblast Line Cells; Determinants Of The Response In Vitro. J. Bone Miner. Res. 5, Supp 1: S107 113.
43
______________________________________________________________________ Los parmetros farmacocinticos del MFP son diferentes de los obtenidos para el NaF54. A igualdad de dosis de F-, el hueso de ratas tratadas con MFP presenta un contenido de flor seo superior al de las ratas tratadas con NaF. Hallazgos ms recientes demostraron que el mayor contenido de flor seo no se debe al in fluoruro sino a protenas con flor ligado por enlaces resistentes a los cidos 55. La biodisponibilidad de flor cuando se administra MFP es el doble que si se utiliza NaF en dosis equimolares. Al administrar NaF en plasma se encuentra al anin fluoruro como especie predominante. En cambio, luego de la administracin oral de una dosis de MFP, adems del anin, se encuentra en plasma una fraccin de flor ligado a protenas. Hemos demostrado que el flor ligado a protenas se origina en el plasma como consecuencia de una pequea fraccin de MFP que se absorbe en el estmago sin sufrir hidrlisis y se liga a las alfa-macroglobulinas (AM). La fraccin de protenas con flor ligado tambin se encuentra presente en el plasma de seres humanos tratados con MFP56.
Las AM son antiproteasas del plasma a las que se liga el MFP. Estas protenas pierden su actividad biolgica cuando se ligan al MFP in vitro e in vivo57. La absorcin de MFP y la formacin del complejo AM-MFP se encuentra aumentada en ratas tratadas con MFP y calcio, situacin en la que aumenta la absorcin intestinal del MFP debido a inhibicin de la enzima fosfatasa alcalina58. El complejo AM-MFP es biolgicamente
54
Rigalli, A; Cabrerizo, M; Beinlich, A; Puche, R.C. 1994. Gastric and intestinal absorption of monofluorphosphate and fluoride in the rat. Arzneimittel Forschung. Drug Research 44(I), 651 655. 55 Pera LI, Brun LRM, Rigalli A, Puche RC. 2003. Identificacin de protenas derivadas de la alfa2macroglobulina en el hueso de ratas tratadas con monofluorofosfato de sodio. Rol de estas protenas en la biodisponibilidad de flor. Rev. Med. Rosario. 69: 36-43. 56 Rigalli, A; Morosano M; Puche.RC. 1996. Biovailability of fluoride administered as sodium fluoride or sodium monofluorophosphate to human volunteers. Arzneimittel Foschung. Drug Research. 46(I),531533. 57 Rigalli,A; Esteban,L; Pera,L. Puche,R.C. 1997. Binding of monofluorophosphate to alpha-2macroglobulin and C3. Calcified Tissue International 60(I) 86-89. 58 Beinlich A, Brun L, Rigalli A, Puche RC. 2003. Intestinal absorption of disodium monofluorophosphate in rat as affected by concurrent adminstration of calcium. Arzneim Forschung. Drug Research. 53(8) 584-589.
44
______________________________________________________________________ activo con respecto al metabolismo seo, debido a que su catabolismo genera fluoruro que vuelve al espacio extracelular. En seres humanos tratados crnicamente con MFP, luego de 10 hs de una dosis de MFP, slo se encuentra elevada la fraccin de flor ligada a las protenas59. Una ventaja adicional del MFP es que la fraccin de F ligada a las protenas no produce efectos adversos que si produce el NaF60
El complejo AM-MFP es captado in vitro e in vivo por receptores presentes en hgado y hueso de rata61,62. La diferenciacin y proliferacin de osteoblastos a partir de clulas pluripotentes del estroma de la mdula sea involucra a las cascadas de sealizacin del sistema Wnt/beta-catenina. Los precursores de osteoblastos poseen expresin del receptor LRP en sus isoformas LRP5 y LRP6, receptores de las protenas Wnt63. Algunas isoformas del receptor LRP reconoce a la AM luego de su inactivacin, proceso que puede ser llevado a cabo por la unin a proteinasas o a molculas como el MFP. El complejo AM-MFP como los pptidos son captados por el tejido seo,
indicando que los receptores de estos tejidos podran reconocer el complejo AM-MFP.
El efecto del MFP sobre el hueso podra en parte, atribuirse al fluoruro liberado por su hidrlisis. Sin embargo el mecanismo no parece ser igual al ejercido por el fluoruro, ya que al suspender el tratamiento la masa sea de los animales se mantiene elevada, respecto de los controles y los animales tratados con NaF, en los que la masa
59
Rigalli, A, Laura Pera, Mario Morosano, Ana Masoni, Roberto Bocanera, Roberto Tozzini, Rodolfo C. Puche. 1999. In postmenopausal osteoporosis the bone increasing effect of monofluorophosphate is not depending of serun fluoride. Medicina (Buenos Aires) 59:157-161. 60 Rigalli, A; Ballina,J.C; Roveri, E; Puche, R.C. 1990. Inhibitory effect of fluoride on the secretion of insulin. Calcif.Tissue Int. 46:333 338. 61 Esteban L, Rigalli A, Puche RC. 1999. Metabolism of the complex monofluorophosphate- a2macroglobulin in the rat. Medicina (Buenos Aires) 59:151-156. 62 Pera LI. Tesis doctoral: Identificacin de las especies Qumicas con flor presente en hueso de ratas tratadas con monofluorfosfato de sodio (MFP) . Doctorado en Ciencias Biomdicas Facultad de Ciencias Medicas. Doctorado Acreditado CONEAU resol 592/99 63 Krishnan V, Bryant HU, MacDougald A. 2006. Regulation of bone mass by Wnt signaling. J. Clin. Invest. 226 (5) 1202-1209.
45
______________________________________________________________________ sea se asemeja a los controles luego de 30 das64. Los resultados mencionados sugieren una posible interaccin del complejo AM-MFP con el receptor LRP5/6 de precursores osteoblsticos. Esta interaccin podra aumentar la afinidad entre LRP5/6 y el receptor Frizzled, disminuir la accin de protenas inhibidoras del receptor LRP5/6 como las protenas Dkk y Esclerostina o, la relacin del receptor LRP con el co-receptor Kremen. En cualquiera de estas situaciones la accin de Wnt sobre los niveles de beta-catenina no fosforilada seran mayores.
64
Op. Cit.55. pp38. Pg.44
46
______________________________________________________________________
CAPITULO 4
HIPOTESIS
Se ha demostrado que el MFP y el NaF producen un aumento del tejido seo trabecular en ratas normales, evidenciado a travs de un aumento del nmero de trabculas y de su grosor. Adems el MFP tendra un efecto adicional aumentando el hueso cortical. La biodisponibilidad de flor del MFP es el doble de la NaF, por lo que se plantea la hiptesis que la reparacin de un defecto seo en presencia de ambas sales ser mayor que en animales controles y que el efecto ser ms rpido en animales tratados con MFP. Todava con las ventajas mencionadas, la calidad del hueso formado no est comprobada
Justificacin
Este estudio de tipo experimental aleatorizado controlado est motivado por las diferentes revisiones realizadas tanto en Ortopedia como en Odontologa sobre mecanismos de reparacin de defectos seos65,66,67. Sus revisiones debaten la confiabilidad cientfica de los procedimientos realizados para aumento seo, sugiriendo que hace falta ms estudios clnicos de tipo aleatorios para su validacin 68. Asimismo, no existe informacin sobre el efecto del MFP y del NaF en la reparacin de lesiones o defectos seos en animales de experimentacin. Investigaciones previas han sido enfocadas a los estudios metablicos en animales sanos, especialmente en ratas en
65
Esposito, M., M. G. Grusovin, et al. 2006. "The efficacy of various bone augmentation procedures for dental implants: a Cochrane systematic review of randomized controlled clinical trials." Int J Oral Maxillofac Implants 21(5): 696-710. 66 Aghaloo, L. 2007. Which Hard Tissue Augmentation Techniques Are the Most Successful in Furnishing Bony Support for Implant Placement?. Int J of Oral Maxillofacial Implants. 67 Gielkens, P. F., R. R. Bos, et al. 2007. Is there evidence that barrier membranes prevent bone resorption in autologous bone grafts during the healing period? A systematic review. Int J Oral Maxillofac Implants 22(3): 390-8. 68 Op. Cit. 23. Pg.30
47
______________________________________________________________________ crecimiento y en las cuales se indican que tanto el tratamiento con NaF o MFP podra aumentar la masa sea, estimulando la formacin69.
La amplia poblacin afectada por diversas lesiones seas que requieren de reparacin intrnseca al tejido, sufre las limitaciones en su calidad de vida en cuanto a movilidad y salud oral entre otros. En la recuperacin del tejido seo postrauma es necesario el mejoramiento en el volumen y densidad sea en el sitio de la lesin para proveer firmeza, estabilidad y funcionalidad procurando adems que perduren en el tiempo.
El dficit de hueso en algunas zonas del esqueleto supone un mayor problema que en otras zonas. As, la prdida de gran cantidad de tejido seo tanto en
extremidades superiores como inferiores, constituye una problemtica actual que aumenta a causa de la actividad diaria. Uno de los elementos esenciales para la reparacin de este tipo de lesiones es la presencia de osteoblastos y factores
osteognicos necesarios para la osteoinduccin. Otro elemento es la estructura para lograr la reparacin, es decir la 70.
La participacin del tejido seo en tan diversas funciones debe estar soportada por el buen desarrollo y calidad de la masa sea y de su propia microestructura las cuales estn condicionadas por el depsito de colgeno, el remodelado, la interaccin e integracin con el microambiente extracelular y el almacenamiento de minerales que le dan la dureza nica a este tejido. Cualquier alteracin de una o ms de estas funciones y/o estructuras inducen a un desequilibrio que a su vez puede terminar en un
69 70
Op. Cit.2. Pg.8 Muoz S., Rodriguez M. , Fernndez C. 2005. Estudio de la regeneracin sea mediante la implantacin endomedular de biomateriales Patologa del Aparato Locomotor. 3 (1): 24-30
48
______________________________________________________________________ rompimiento tisular cuya reparacin depender de las ptimas condiciones del propio sistema y de la biodisponibilidad de minerales circulantes o almacenados previamente para recuperar el defecto seo lo mejor posible y en el menor tiempo.
Ante el problema del dficit seo en reas en las que se requiere restaurar una superficie se deben potenciar tres funciones bsicas:
osteoconduccin: crecimiento seo por aposicin sobre una superficie.
osteoinduccin: estimulacin de clulas pluripotenciales indiferenciadas que estimulan el desarrollo de clulas formadoras de estirpe sea.
osteognesis: crecimiento seo por clulas procedentes del injerto71. En esta bsqueda se ha empleado gran variedad de sustitutos seos y mecanismos de estimulacin celular, ante la imposibilidad de la respuesta innata del tejido, en aras de inducir una sntesis de tejido seo local. El hueso comprometido deber recuperar su arquitectura, su celularidad y procurar la reparacin en defectos o atrofia sea, sin intervenir en el proceso de cicatrizacin natural que concomitantemente ejercen los tejidos blandos circundantes. Adems debe inducir la migracin celular y mejorar los resultados de los injertos seos72.
La reparacin osea primaria (ROP) se caracteriza por una serie de acontecimientos que son identificados por cuadros histolgicos que son
patognomnicos de la reparacin y que es observable entre otros, en las fracturas de los

71
Velasco Ortega E, Pato Mourelo J, Segura Egea J J, Prez Prez O, Medel Soteras R. 2007. La utilizacin de betafosfato tricalcico como biomaterial en implantologa oral. Av Periodon Implantol. 19,3:141-149. 72 Montero Briceo M. Ucero Bravo C. 2007. Evaluacin de la Satisfaccin de los Adultos Mayores en Relacin al Uso de Sobre-Dentaduras Mandibulares Retenidas por Implantes Dentales Intermentonianos. Ciencia Odontolgica. 4 (2): 149-158.
49
______________________________________________________________________ huesos largos. La ROP se inicia con la aparicin de una trama vascular activada por factores de crecimiento contenidos en las plaquetas, y por una capa de clulas osteoblsticas sobre las paredes del defecto73.
En la reparacin de los huesos largos y define la activacin del callo primario, como la activacin de las clulas dormidas del periostio que ocurre como consecuencia de traumas.
Actualmente, existe an debate sobre los mtodos para la reparacin de defectos seos crticos y no crticos, entendiendo estos como: defecto crtico, aquel que carece de la capacidad de regeneracin espontnea y defecto no crtico, aquel que s la tiene. Al respecto se han publicado innumerables trabajos en los cuales se han utilizado no slo sustitutos seos sino tambin hueso autlogo. Estos sustitutos predispone al tejido a una reabsorcin obligada y al individuo a una morbilidad concomitante desencadenada por la extraccin del hueso autlogo74. El hueso que llena cavidades lo hace de manera ms lenta y la vascularizacin y las caractersticas histolgicas que rodean la lesin sern fundamentales para su recuperacin75. Algunas investigaciones se refieren a los procesos de regeneracin sea sin haber un consenso. Algunos autores consideran que las ventajas que aporta la regeneracin con hueso autlogo o biomateriales eran las ms rpidas y completas para una rehabilitacin ms precoz y ms exitosa y minimizaba el riesgo de fracturas. La idea que subyace en la literatura es que la presencia del injerto a base del hueso del propio paciente o un sustituto seo, no slo refuerza biomecnicamente el hueso sino que adems acelera la velocidad de regeneracin76. Se
73
Reparacin sea Primaria. Pressing. Principios de la seo Conexin y los implantes TMI. Dental(Espaa. (http://www.pressingdental.com/MODULOS/_GLOBAL/publico/interfe 74 Caicoya O. 2007. Relleno de cavidades seas en ciruga maxillofacial con materials aloplasticos. Rev. Ciruga Oral y Maxilofacial. 29,1(enero-febrero):21-32. 75 Ferrer L. J. 2008. Evaluacin anatomo-funcional de defectos seos en fracturas de tibia. Revista Electrnica de Portales Mdicos.com. 76 Op.Cit.4.pp.28. Pg.15
50
______________________________________________________________________ conoce que las clulas del injerto autlogo mueren cuando estn a ms de 100 micrmetros de una fuente vascular transformndose en tejido no vital y lo mismo ocurre con el sustituto seo. Ambos materiales deben ser, en primer lugar reabsorbidos para luego aponer nuevo hueso y este proceso de reabsorcin de tejido no vital para la posterior aposicin del hueso neoformado no supone ninguna ventaja biomecnica y lgicamente retraza mucho el periodo de regeneracin. Por lo tanto se puede concluir que los defectos no crticos se pueden regenerar espontneamente por s mismos bajo condiciones adecuadas.
Se consider entonces que el fluoruro contribuira a una mejor produccin de masa sea y depsito mineral por su efecto estimulante sobre los osteoblastos. Por otra parte el fluoruro aumentara la velocidad de reparacin del defecto no crtico.
Viabilidad
La investigacin se realiz en el Laboratorio de Biologa sea de la Facultad de Ciencias Mdicas de la Universidad Nacional de Rosario. El Laboratorio cuenta con un equipo interdisciplinario de profesionales de las reas de Qumica, Bioqumica, Biotecnologa y Medicina y los equipos necesarios tales como el equipo para rayos X, determinaciones bioqumicas y moleculares, sala de ciruga para ratas, equipamiento para procesamiento de muestras y diagnstico histolgico. El grupo cuenta con treinta aos de experiencia en el tema en estudio. Los procesos con animales se realizan siguiendo normas internacionales 77,78
CAPITULO 5
77 78
Guide for the care and use laboratory animals. 1985. National Institute of Health. Publication N 86-23. Guide to the care and use of experimental animal. 1993. Volume 1. Olfert ED, Cross BM, McWilliam AA, Eds. Canadian Council on animal care Guidelines.
51
______________________________________________________________________
MATERIALES Y METODOS
A continuacin se hace una breve descripcin del trabajo experimental. Las ratas fueron sometidas a ciruga durante la cual se produjo un defecto seo no crtico en la epfisis proximal de las tibias. Se dividieron los animales en tres grupos: controles, tratados con NaF y tratados con MFP. Los tratamientos se administraron durante 30 das. Al inicio, 10, 20 y 30 das se obtuvo sangre para determinaciones bioqumicas (calcemia, fosfatemia, fosfatasemia, fluoremia), se registr el peso corporal y se obtuvieron radiografias de las tibias para medida de densidad mineral sea (DMO) del hueso sano y de la zona del defecto. A los 30 das, luego de la eutanasia se obtuvieron las tibias en las que se realiz el anlisis histolgico de la zona del defecto. El efecto de los tratamientos sobre la velocidad de reparacin del defecto y la calidad del huesor formado se evalu por la DMO y las caractersticas del hueso formado en la zona del defecto. Las variables bioqumicas fueron utilizadas como controles adicionales del xito de los tratamientos.
A continuacin se describen de manera detallada los procedimientos y materiales utilizados.
Animal para experimentacin

Se utilizaron ratas de la lnea IIM/FM Sublnea e de 7 semanas. Los animales se manipularon de acuerdo a las normas internacionales de cuidado y tratamiento de animales de experimentacin.
Los animales se alojaron en jaulas colectivas (hasta 6 animales por jaula) o individuales, segn el momento del experimento. Las ratas tuvieron acceso a agua y alimento ad libitum. El bioterio fue controlado automticamente para mantener la
52
______________________________________________________________________ temperatura entre 23-25C, circular y filtrar el aire y mantener el ciclo luz oscuridad 12h-12h. La limpieza y controles se realizaron diariamente por personal del laboratorio.
Esterilizacin
El material quirrgico de acero inoxidable fue esterilizado en estufa durante 3 horas a temperatura de 140 C. El material a esterilizarse en calor hmedo fue llevado al autoclave durante 30 minutos a 120C.
Anestesia general
Se realiz preanestesia por inyeccin subcutnea de una mezcla de 1,2mg de xilazina/100g peso corporal y 3mg ketamina/100g de peso corporal. Luego de alcanzado un grado adecuado de narcosis y sedacin se inyectaron por va intramuscular clorhidrato de lidocana y 5 minutos despus en el mismo sitio se inyectaron 3mg ketamina /100 de peso corporal79.
Analgesia y antibioticoterapia
Despus de la ciruga o procedimiento experimental potencialmente doloroso para el animal se inyectaron por va subcutnea 2.5 mg diclofenac/100 g de peso corporal. Se evalu el dolor a travs del estado de movilidad, agresividad y reaccin al contacto y se repiti la dosis a intervalos requeridos. Durante las intervenciones quirrgicas se realiz antibioticoterapia con ceftriaxona, realizando la inyeccin intramuscular de 3 mg del antibitico/100g de peso corporal disuelto en 0.1 ml de solucin fisiolgica estril. La inyeccin se realiz 30 minutos antes de la ciruga80.
79
De Candia F, Rigalli A, Di Loreto V. 2009. Anesthesia and Analgesia. En Experimental Surgical Models in the Laboratory rat. Rigalli A, Di Loreto V Eds. CRC Press. Taylor & Francis Group. Boca Ratn. USA. Pag 21-30. 80 Di Loreto V, Rigalli A. 2009. Antibiotics. En Experimental Surgical Models in the Laboratory rat. Rigalli A, Di Loreto V Eds. CRC Press. Taylor & Francis Group. Boca Ratn. USA. Pag 33.
53
______________________________________________________________________
Cirugas
Se llevaron a cabo en un quirfano para ratas. El ambiente quirrgico fue esterilizado por medio de lmparas de luz ultravioleta dos horas previas a la ciruga. El cirujano y asistentes utilizaron vestimenta descartable y las condiciones de asepsia adecuada.
Se rasur la zona a incidir en las patas traseras del animal. Previa asepsia del campo quirrgico con iodopovidona, se realiz con bistur N 15 una incisin longitudinal en ambas tibias y se decol la fascia hasta llegar a exponer el hueso. Se realiz una cavidad en la regin anteropatelar de cada tibia hasta llegar al hueso medular, utilizando una mecha acerada de 2mm, con rotacin manual para no producir necrosis sea por sobrecalentamiento de la zona. Dicha cavidad no se rellen con ningn material. Luego de realizada las intervencin quirrgica se sutur por planos con hilo reabsorbible.
Eutanasia
Se realiz sometiendo en primer trmino al animal a anestesia general hasta obtener una profunda anestesia y analgesia. Luego se realiz una inyeccin intracardaca de KCl saturado para producir un paro cardiorrespiratorio instantneo81.
Administracin del NaF y del MFP

El NaF o MFP se administraron por sonda orogstrica. La dosis utilizada fue de 80 mol de F- en una solucin 80 mM de NaF o MFP. Se utiliz sonda de polietileno K35 con jeringa descartable de 5 ml.
81
Rigalli A. Euthanasia. 2009. En Experimental Surgical Models in the Laboratory rat. Rigalli A, Di Loreto V Eds. CRC Press. Taylor & Francis Group. Boca Ratn. USA. Pag. 31
54
______________________________________________________________________
Determinacin de la Concentracin de Fluoruro Urinario
La medicin de la concentracin de fluoruro en orina se realiz por potenciometra directa82 utilizando un electrodo de ion especfico ORION 94-09 y un electrodo de referencia de Ag/AgCl conectados a un conversor analgico digital (Figura 17). La determinacin se basa en la relacin lineal existente entre los mV desarrollados por los electrodos y el logaritmo de la concentracin de flor en las muestras o patrones utilizados.
Figura 17: Electrodo de in especfico para la determinacin de fluoruro
Simultneamente con las muestras se procesaron soluciones patrones de NaF de 10-3M - 10-6. A las muestras y las soluciones patrn se les adicion un 10% de buffer cido actico/acetato de sodio 2M para ajustar pH a 5-5.5 y homogeneizar la fuerza inica de las soluciones. La tcnica requiri muestras de orina de 50 l o ms.
82
Rigalli A, Pera LI, Di Loreto V, Brun LR. Determinacin de la concentracin de flor en muestras biolgicas. 1 Ed. Editorial de la Universidad Nacional de Rosario. Rosario. Argentina. 2007. ISBN 978950-673-616-3
55
______________________________________________________________________
Determinacin de la concentracin de flor plasmtico
La medicin de la concentracin de flor plasmtico se realiz por potenciometra directa utilizando un electrodo de ion especfico ORION 94-09 y un electrodo de referencia de Ag/AgCl conectados a un conversor analgico digital. La determinacin se basa en la relacin lineal existente entre los mV desarrollados por los electrodos y el logaritmo de la concentracin de flor en las muestras o patrones utilizados. Previo a la determinacin potenciomtrica, el flor se aisl de las muestras por microdifusin isotrmica (Figura 18), tratando la muestra con cido fosfrico concentrado durante 1 da a 60 C y recuperando el cido fluorhdrico desprendido de la muestra sobre NaOH slido depositado en la tapa de la cmara de destilacin.
Figura 18: Cmara de destilacin para microdifusin isomtrica y determinacin de flor plasmtico
Luego de la destilacin isotrmica, la trampa de NaOH se ajusta a pH 5.5 con cido actico diluido 1/120 y ajustar a un volumen final de 60 l. Este procedimiento requiere muestras de plasma o suero de 20-100l y simultneamente con las muestras se procesan testigos de NaF de concentraciones 10-3 M - 10-6 M .
56
______________________________________________________________________
Preparacin de muestra histolgica
Se realiz la descalcificacin de las tibias siguiendo los pasos que se detallan a continuacin:
Diseccin de tibias y eliminacin de tejidos blandos.
Corte transversal al 40% desde parte proximal con la ayuda de un micrtorno.
Descalcificacin en EDTA 10%, pH 7 a 4C. A los 15-20 das se cambi el EDTA y se cortaron los huesos longitudinalmente, colocando las dos porciones obtenidas de dicho corte en una solucin nueva de EDTA, durante 20 das adicionales. Luego de asegurar una completa descalcificacin, se procedi de manera similar a los tejidos blandos, teniendo la precaucin de dejarlo al menos 60 minutos por frasco en la deshidratacin y aclaracin previa a la preparacin del taco.
En el proceso de coloracin con Hematoxilina Eosina se siguieron los pasos de rutina usados para los tejidos blandos y los tiempos de permanencia de las muestras dentro de los reactivos fueron estandarizados para cada proceso. De esta manera se colorearon los preparados del tejido seo que cubri y repar el defecto en la tibia y sobre ste se hizo el anlisis histolgico.
Determinacin de fosfatasa alcalina plasmtica

La actividad de la fosfatasa alcalina plasmtica se realiz utilizando un equipo comercial ALP 405 lnea lquida (Laboratorio Wiener, Rosario, Argentina). La tcnica se fundamenta en la medida del cambio de absorbancia a 405 nm, generado por la hidrlisis del p-nitrofenilfosfato en medio alcalino por la enzima fosfatasa alcalina. Los
57
______________________________________________________________________ resultados se obtienen en unidades/litro (U/l) y las medidas de absorbancia se realizaron en un espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 11.
Determinacin de fsforo inorgnico

El fsforo inorgnico se midi utilizando el kit comercial FOSFATEMIA UV AA (Laboratorio Wiener Lab, Rosario, Argentina). El mtodo se fundamenta en la reaccin del fsforo con el molibdato en medio cido y la formacin de un complejo fosfomolbdico. La determinacin utiliz 5 ul de plasma y simultneamente se proces una solucin patrn de 4 mg/dl de fosfato, con la que se construy una curva de calibracin. La absorbancia a 340 nm es proporcional a la concentracin de fsforo inorgnico en la muestra, la que se determin utilizando un espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 11.
Determinacin de clcio plasmtico

La calcemia se midi con un equipo comercial CaColor AA (Wiener Laboratorio, Rosario, Argentina). El mtodo se fundamenta en la reaccin del calcio con o-cresolftaleina complexona a pH 10.8, dando un complejo de color magenta que se mide espectrofotomtricamente a 570 nm. La determinacin utiliza 5-15 l de muestra y simultneamente se construye una curva de calibracin utilizando una solucin patrn de 10 mg Ca/dl. La medicin de la absorbancia es proporcional a la concentracin de calcio en la solucin, la que se determin utilizando un espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 11.
58
______________________________________________________________________
Medicin de Densidad Mineral sea
La medida de densidad mineral se realiz por anlisis de las radiografas de la tibia simultneamente, con un patrn conteniendo escalas de concentraciones de calcio de 51,9; 40,7; 28,6; 18,7 y 7,9 mg Ca/cm2 (Figura 19) Las mediciones se realizaron con el software de procesamiento de imgenes digitales ImageJ 1.40 (National Institutes of Health, Maryland, USA). Para el anlisis se utilizaron imgenes digitales de las radiografas obtenidas con un equipo de rayos X de 70KV83.
Figura 19: Radiografa de una tibia y el patrn con concentraciones de calcio conocidas
Consideraciones sobre el efecto estrognico en la rata

Teniendo en cuenta que el ciclo estral de la rata tiene una duracin de 5 das y que cada una de las etapas dura tan slo unas horas (estro 12h, metaestro 21h, diestro 65h, proestro 12h), no se consider la etapa en que cada rata se encontraba al inicio del experimento, considerando que en el experimento total (30 das), se incluiran aproximadamente 6 ciclos.
83
Moreno H, Lombarte M, Di Loreto V. 2009. Bones and Bone Tissue. En Experimental Surgical Models in the Laboratory rat. Rigalli A, Di Loreto V Eds. CRC Press. Taylor & Francis Group. Boca Ratn. USA. Pg. 229-232.
59
______________________________________________________________________
CAPITULO 6
RESULTADOS
Efecto del tratamiento sobre el crecimiento de las ratas

El tratamiento no afect el crecimiento de los animales en ninguno de los grupos experimentales. A los 30 das todos alcanzaron el peso correspondiente a la edad. El crecimiento (g/da) fue significativamente diferente de cero (regresin lineal p<0.05) para los tres grupos experimentales, controles: 1.40.2 g/da, NaF: 1.00.2 g/da, MFP: 1.20.3 g/da, y no difiri entre los grupos experimentales, regresin lineal, p>0.05.
Conclusin parcial: el crecimiento similar en todos los grupos permite descartar posibles efectos adversos de la medicacin sobre el crecimiento.
Efecto del tratamiento sobre la densidad mineral del hueso sano

La DMO del hueso sano no se modific a lo largo del tratamiento, como lo evidencia la pendiente de la regresin lineal de la DMO en funcin del tiempo (p>0.05). Controles: 0.160.12 g Ca/cm2.da; NaF: -0.130.11 g Ca/cm2.da; MFP: 0.080.16 g Ca/cm2.da.
Conclusin parcial: la constancia de la DMO en zonas de hueso no expuestas a ciruga de creacin del defecto garantiza que los tratamientos no tienen efecto adverso sobre el hueso ya formado.
Densidad mineral sea de la zona del defecto
60
______________________________________________________________________ La densidad mineral sea (DMO) del hueso que rellen el defecto, mostr un aumento significativo en el grupo tratado con MFP respecto del grupo control a los 10 das de tratamiento (Error: No se encuentra la fuente de referencia28). Esta diferencia se fue reduciendo con el transcurso del tratamiento no siendo significativa a los 20 y 30 das. Este resultado indica un incremento en la velocidad de mineralizacin en presencia de MFP. Por otra parte el tratamiento con NaF, si bien produjo mayor valor medio en la DMO respecto del grupo control, esta diferencia no alcanz a ser significativa. Cabe mencionar que el anlisis de DMO en la zona del defecto carece de valor basal, dado que al inicio del tratamiento no exista hueso en esa zona.
45 40
2
CONTROL NaF MFP
35 30 25 20 10 0
DMO, mg/cm
10
20
30
DIAS DE TRATAMIENTO
Figura 20: Densidad mineral de la zona del defecto seo. Los datos se muestran como mediaSD. * indica diferencias significativa respecto del grupo control, p<0.05, ANOVA a un criterio de clasificacin, post test Newman Keuls.
61
______________________________________________________________________ Conclusin parcial: El aumento de DMO a los 10 das en los grupos tratados con MFP y NaF indica una mayor velocidad de mineralizacin del defecto. La disminucin de esta diferencia a lo largo del tratamiento confirma que un defecto no crtico se repara sin necesidad de intervencin, pero que el tratamiento con MFP acortara en al menos 10 das dicho proceso.
Fosfatasa alcalina plasmtica

La fosfatasa alcalina plasmtica (FAL) aument significativamente a lo largo del tiempo en los grupos tratados con NaF y con MFP, siendo an mayor en ste ltimo (p<0.05, regresin lineal), Tabla 1. El grupo Control no mostr aumento significativo de esta enzima (regresin lineal, p>0.01)
Tabla 1: variacin de la actividad de fosfatasa alcalina por da (U/l.da). * indica diferencias significativas respecto de cero, p<0.05 regresin lineal. CONTROL U/L.da 1.141.82 NaF 3.390.87 * MFP 4.011.19 *
Conclusin parcial: El aumento significativo de la actividad de fosfatasa alcalina plasmtica en los grupos NaF y MFP confirma la existencia de un estmulo osteoformador.
Calcio fecal
La excrecin fecal de calcio fue significativamente menor en el grupo MFP respecto de NaF y controles (Figura 21), ANOVA a un criterio, post test de Newman Keuls p<0.05. Estos resultados indican una mayor absorcin de Ca++ en este grupo.
62
______________________________________________________________________
Figura 21: Excrecin fecal de calcio. * indica diferencias significativas respecto del grupo control, ANOVA, post test de Newman Keuls, p<0.05)
Conclusin parcial: la menor excrecin de calcio fecal en el grupo tratado con MFP estara indicando una mayor retencin del in en el organismo, resultado coincidente con la mayor DMO de dicho grupo
Calcemia
La calcemia no se modific a lo largo del tratamiento en ninguno de los grupos experimentales. En los tres grupos experimentales la pendiente de la regresin lineal de la calcemia en funcin del tiempo (mg/dl.da) no discrepo de cero. Controles: -0.054 0.063; NaF: -0.014 0.046; MFP: 0.089 0.061, regresin lineal, P0,05).
Conclusin parcial: la constancia de la calcemia permite descartar importantes alteraciones del metabolismo fosfoclcico, asociadas a los tratamientos.
63
______________________________________________________________________
Fosfatemia
La fosfatemia no se modific a lo largo del tratamiento en ninguo de los grupos experimentales. En los tres grupos experimentales la pendiente de la regresin lineal de la fosfatemia en funcin del tiempo (mg/dl.da) no discreparon de cero. Controles: -0.270.22; NaF: 0.080.04; MFP: 0.110.07, regresin lineal, P0,05).
Conclusin parcial: la constancia de la fosfatemia permite descartar importantes alteraciones del metabolismo fosfoclcico, asociadas a los tratamientos.
Fluoruria
La excrecin urinaria de fluoruro en 24 horas post-tratamiento, no difiri entre los grupos experimentales, Figura 22 (ANOVA a un criterio, P0,05).
5 4
CONTROL NaF MFP
mol/24h
3 2 1 0 CONTROL NaF MFP
Figura 31
Figura 22: excrecin urinaria de fluoruro durante 24 hs en los grupos experimentales al finalizar el tratamiento
Conclusin parcial: la semejanza en la fluoruria luego de 30 das de tratamiento est indicando una buena captacin de iones por el tejido seo.
64
______________________________________________________________________
Fluoremia
La concentracin de flor en plasma fue significativamente mayor a los 10 das en los animales tratados con NaF y MFP. A los 30 das de tratamiento no exist diferencias entre las fluoremias de los tres grupos (Figura 23).
Conclusin parcial: el aumento de la fluoremia al inicio del tratamiento garantiza la aplicacin de los tratamiento. Por otra parte la disminucin de la
fluoremia en los grupos tratados con MFP y NaF al finalizar el tratamiento indica que los tratamientos tuvieron estmulo osteognico y el hueso aument su capacidad de incorporacin de minerales. El resultado a los 30 das es coincidente con la falta de diferencias en la fluoruria a ese mismo tiempo.
Figura 23: Concentracin de flor en plasma en los tres grupos experimentales a lo largo del tratamiento.
65
______________________________________________________________________
Anlisis histolgico
Grupo control: Histolgicamente se observa en el grupo control en la zona del defecto tejido seo sin una organizacin laminar que permita la formacin de osteonas. Se destaca tambin la presencia de tejido cartilaginoso, escasa presencia de osteocitos y osteoblastos activos (Figura 24).
Figura 24: Corte histolgico de tejido seo de ratas controles. La flecha marca abundante tejido cartilaginoso. H&E. 10X
Se observa bordes irregulares y presencia de vasos sanguneos en los espacios medulares. Abundante tejido cartilaginoso en mayor cantidad que el tejido seo. En la zona de hueso no estn bien definidas las trabculas.
66
______________________________________________________________________
Figura 25: Corte histolgico de tejido seo de ratas controles. La flecha muestras zonas de trabculas sin buena definicin. H&E.10X
La figura 26 correspondiente a la zona del defecto en ratas controles, muestra formacin de hueso trabecular bien delimitado respecto del tejido adiposo que se observa entre las trabculas. Estas ltimas no muestran buena conexin entre ellas y el tejido adiposo es muy abundante respecto al tejido seo. Se observan pequeas zonas de mineralizacin en la sustancia circundante pero no representa un hueso mineralizado en su totalidad, observndose aun zonas de cartlago.
67
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Figura 26: Corte histolgico de tejido seo de ratas controles. La flecha muestra cartlago y el asterisco tejido adiposo. H&E. 10X
Grupo NaF: La observacin histolgica de las zonas del defecto de ratas tratadas con NaF revela la presencia de hueso cortical con presencia de sistemas haversianos en algunas partes y presencia de osteocitos. Se detecta la presencia de depsito de osteoide y actividad celular. Se destaca zonas de mineralizacin, trabculas que no presentan la mejor disposicin morfoestructural y espacios medulares ocupados por clulas adiposas. No se observa buena conexin trabecular.
68
______________________________________________________________________
<
*
Figura 27: Corte histolgico de tejido seo de ratas tratadas con NaF. La flecha marca sistemas de Havers, la punta de flecha (<) marca un osteocito y el asterisco tejido adiposo. H&E. 10X
A pesar que la organizacin es mejor que en el grupo control, se observa la presencia de cartlago hialino, por lo que se considera que la formacin del callo seo no se consolid adecuadamente.
Figura 28: Corte histolgico de tejido seo de ratas tratadas con NaF, mostrando abundante cartlago hialino. H&E. 10X
69
______________________________________________________________________ Grupo MFP: La observacin histolgica del hueso formado en la zona del defecto, en ratas tratadas con MFP muestra la formacin de sistemas haversianos alrededor de vaso sanguneo (Figura 29). Se observa tejido seo con borde bien establecido. Se observan osteocitos en sus osteoplastos. La disposicin del tejido seo es de manera organizada con aspecto laminillar.
<
Figura 29: Corte histolgico de tejido seo de ratas tratadas con MFP. La flecha marca sistema de Havers y la punta de flecha (<) osteocitos. H&E. 10X
Se observa buena organizacin celular y laminar de la sustancia osteoide. Es clara la presencia de clulas osteoblsticas en el borde del hueso plexiforme cortical, las cuales presentan mayor altura y redondez que las de revestimiento. El espacio medular est bien diferenciado y las clulas cercanas al hueso muestran ya diferenciacin al linaje seo (Figura 30).
70
______________________________________________________________________
Figura 30: Corte histolgico de tejido seo de ratas tratadas con MFP. La flecha muestra clulas de revestimiento y la punta de flecha (<) osteoblatosH&E. 10X
El hueso formado en presencia de tratamiento con MFP muestra una distribucin morfocelular coinciden con hueso cortical bien formado con osteocitos en sus osteoplastos. El borde cortical muestra un importante engrosamiento que corresponde al depsito laminillar del colgeno (Error: No se encuentra la fuente de referencia).
Conclusin parcial:la organizacin histolgica del tejido seo formado en ratas tratadas con MFP revela una mejor organizacin estructural, sin la presencia de cartlago hialino.
71
______________________________________________________________________
Figura 31: Corte histolgico de tejido seo de ratas tratadas con MFP. H&E. 10X
72
______________________________________________________________________
CAPITULO 7
DISCUSIN
Los resultados de las variables medidas a nivel del hueso neoformado, producido como respuesta al defecto no crtico, se han interpretado en correlacin con los valores obtenidos de las distintas mediciones en plasma.
El peso de los animales en los tres grupos tuvo un comportamiento uniforme en lo que se refiere a la ganancia de peso. Estos valores muestran que no hay diferencias significativas entre los 3 grupos, lo que significa que el suministro farmacolgico de MFP y NaF no alter el crecimiento en los grupos tratados.
Los niveles de fosfatasa alcalina,
valores que fueron utilizados como un
marcador de formacin sea indic un aumento a lo largo del tratamiento en los grupos que recibieron la administracin de MFP y de NaF. Por su parte este marcador en el grupo Control no mostr un aumento significativo. Si bien en este trabajo se ha medido fosfatasa alcalina total, se puede interpretar que no existiendo problemas hepticos, el incremento en sus valores se deberan a la isoenzima sea. Estos resultados son coincidentes con la presencia del fenmeno protoplsico observado en los cortes histolgicos de los grupos con tratamiento farmacolgico. El incremento ms marcado a lo largo del tiempo observado en el grupo tratado con MFP sera coincidente con una mayor actividad osteoblstica, cuyo resultado sera el aumento de DMO observado a los 10 das y la mejor arquitectura sea observada en cortes histolgicos.
Los resultados de DMO en el grupo MFP a los 10 das, significativamente mayor que el grupo control, es un resultado esperado en funcin de los estudios previos realizados con el MFP como droga osteoformadora. El aumento de la DMO habra
73
______________________________________________________________________ incorporado mayores cantidades de calcio en la matriz sea neoformada, produciendo un dficit del catin a nivel del lquido extracelular. Este dficit en la calcemia podra haber inducido liberacin de PTH y aumento de la sntesis de 1,25(OH)2Vitamina D3. Este ltimo metabolito habra actuado a nivel intestinal aumentado la absorcin de calcio. El aumento de los mecanismos descriptos estn en concordancia con la menor excrecin fecal de calcio observada en el grupo tratado con MFP. La integridad de los mecanismos involucrados en el mantenimiento de la calcemia queda en evidencia por la constancia de este parmetro a lo largo del tratamiento. El aumento del proceso de formacin sea en el grupo tratado con MFP, evidenciado por el aumento de la DMO, ha requerido ms calcio. La falta de cambios a nivel de la DMO del hueso normal, indica que el organismo no ha producido aumentos de remodelacin en otros sitios, con prdida de DMO. La constancia de los valores de la fosfatemia a lo largo del tratamiento tambin est indicando un mecanismo homeosttico conservado aun en presencia de tratamientos que tiene ciertos efectos sobre el metabolismo del fosfato. Se ha demostrado que el tratamiento con NaF produce un aumento de la fosfatemia, debido principalmente a una prdida de fosfato seo84. Los resultados de esta tesis estaran indicando que con las dosis utilizadas, no habra sido un fenmeno observable.
La fluoremia mostr un aumento significativo en las mediciones realizadas el das 10 del tratamiento en el grupo MFP con respecto al grupo control. Este aumento que tambin se observ en el grupo tratado con NaF sin llegar a ser significativo. Los resultados son coincidentes con la mayor biodisponibilidad de flor obtenida a partir del MFP con respecto al NaF, por la absorcin a nivel gstrico y la unin a las AM85,86.
84
Di Loreto V, Rigalli A, Puche RC. Effect of sodium fluoride administration to rats on bone phosphorous content and phosphatemia. Arzneimittelforschung. 56, 760-766. 2006. 85 Rigalli A, Cabrerizo M, Beinlich A, Puche RC. 1994 Gastric and intestinal absorption of monofluorphosphate and fluoride in the rat. Arzneimittelforschung 44(I), 651-655. 86 Rigalli A, Esteban L, Pera L, Puche RC. 1997. Binding of monofluorophosphate to a2-macroglobulin and C3. Calcif Tissue Int. 60(I) 86-89.
74
______________________________________________________________________ Contrariamente a lo observado a los 10 das no se observaron diferencias significativas en los valores de fluoremia entre los tres grupos. Este resultado que podra ser llamativo, ya que en lo grupos MFP y NaF se sigui administrando tratamiento es perfectamente explicado por experimentos anteriores. Se ha demostrado que cuando el hueso responde osteognicamente a los tratamientos con sales de flor, comienza la sntesis de matriz y su calcificacin, fenmeno durante el cual no solo se incorpora Ca2+ y fosfato sino tambin fluoruro. En estas circunstancias la fluoremia de los animales tratados puede ser inclusive menor que en el grupo control87 . Se ha demostrado que cuando existe una buena respuesta al tratamiento la fluoremia disminuye marcadamente. La fluoruria medida a los 30 das es coincidente con los valores de fluoremia, al no hallarse diferencias significativas entre los grupos. Los valores de fluoremia confirman la hiptesis que la reduccin en la fluoremia se debe a una mayor captacin del in por el tejido seo.
Es conocido que unos de los efectos adversos de la administracin de NaF es la resistencia a la insulina88,89 y la falta de secrecin de esta 90. Los resultados de esta tesis estaran indicando que la respuesta osteognica compensara dicho efecto, disminuyendo la fluoremia a valores normales. El efecto mencionado del flor sobre la secrecin de insulina se observa cuando la fluoremia es elevada y se normaliza cuando la fluoremia alcanza valores normales91.
87
Rigalli A, Ballina JC, Puche RC. 1992. Bone mass increase and glucose tolerance in rats chronically treated with sodium fluoride. Bone and Mineral, 16:101-108. 88 Menoyo I, Rigalli A, Puche RC.2005. Effect of fluoride on the secretion of insulin in the rat. Arzneimittelforschung 55(8) 455-460. 89 Menoyo I, Puche RC, Rigalli A. 2008 Fluoride-induced resistance to insulin in the rat. Fluoride. 41(4) 260-269. 2008 90 Rigalli A, Ballina JC, Roveri E, Puche RC. 1990. Inhibitory effect of fluoride on the secretion of insulin. Calcif Tissue Int. 46: 433-438. 91 Op Cit 87. Pag 75
75
______________________________________________________________________ Quedan pendientes para futuras investigaciones la comprobacin de las propiedes biomecnicas del hueso neoformado para relleno del defecto. Los resultados histolgicos permiten anticipar que al menos el comportamiento sera similar o mejor en los grupos tratados con NaF y MFP con respecto al grupo control.
76
______________________________________________________________________
CAPITULO 8
CONCLUSIONES
Concluimos que la hiptesis planteada para esta investigacin se comprob con los resultados obtenidos mediante las pruebas experimentales realizadas.
El MONOFLUOROFOSFATO contribuye a la reparacin del hueso con lesiones no crticas, en menor tiempo que los no tratados con este compuesto, disminuyendo en aproximadamente 10 das del tiempo normal la reparacin.
77
______________________________________________________________________
CAPITULO 9
ANEXOS
ANEXO 1. Tablas de registro de variables y valores
TABLA 1. Matriz de datos en SPSS
78
______________________________________________________________________ TABLA 2. Registro de valores de variables en SPSS
79
80
81
______________________________________________________________________
CAPITULO 10
DEFINICIN DE TRMINOS
Osteoblasto: Clula encargada de la formacin de tejido seo que se forman a partir de precursores de linaje seo. Secretan colgeno y otros materiales utilizados para la construccin del hueso. Se encuentran en las superficies trabeculares y a medida que secretan osteoide, este los va envolviendo, convirtindolos en osteocitos.
Osteocitos: Clulas que se forman a partir de osteoblastos al quedar atrapados en la matriz sea.
Monofluorofosfato de sodio: (MFP) Sustancia de frmula Na2FPO3 y peso molecular 143.95.
Densidad Mineral sea: (DMO) cantidad de calcio por cm2 de hueso. Se mide por absorcin de rayos X.
Osteopenia: Prdida de DMO sin aumento en el riesgo de fractura.. La osteopenia es generalmente considerada como el primer paso en el camino a la osteoporosis.
Osteoporosis: Prdida de DMO, alteraciones de la microarquitectura sea y aumento del riesgo de fractura.
Calcio: componente mineral que se encuentra principalmente en el tejido seo. El calcio adems, participa en la contraccin muscular, accin cardiaca, mantenimiento del sistema nervioso y en la coagulacin sangunea normal.
82
______________________________________________________________________ Resorcin sea: Remocin de hueso durante el proceso de remodelado seo. Los osteoclastos son las clulas responsables de la resorcin del hueso.
Lagunas de Howship: Espacio entre el borde en cepillo del osteoclasto y la matriz sea. Tiene pH menor a 7 y contenido enzimtico apto para degradar la matriz sea calcificada.
Hidroxiapatita: Cristal mineral de los huesos y los dientes que les proporciona alta dureza, formado por calcio y fosfato.
Sistema de Havers: Unidad estructural en hueso maduro que consiste en capas concntricas de laminillas de hueso alrededor del canal central.
Matriz Extracelular: Material depositado en el espacio por fuera de las clulas.
Osteoclastos: Clulas multinucleadas responsables de la resorcin sea durante el proceso de remodelado seo.
Endostio: Revestimiento interno de los huesos.
Periostio: Tejido conectivo que cubre externamente los huesos.
Osteoide: Matriz sea sin calcificar.
Colgeno: Protena del tejido conectivo presente en piel, tendones, huesos y cartlagos.
Protoplasia: Estado proliferativo celular normal en procesos de reparacin tisular.
Retroplasia: Estado de degradacin celular anormal o en procesos apoptticos.
83
______________________________________________________________________
CAPITULO 11
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Efecto del tratamiento con MFP y NaF sobre el proceso de reparacin sea en ratas.

INSTITUTO ITALIANO DE ROSARIO

Autora: Sandra Patricia Meja Delgado

Director: Dr. Alfredo Rigalli.

administrando monofluorofosfato de sodio (MFP) y fluoruro de sodio (NaF).

Definicin de rea y del problema

Figura 1: Estructura del hueso compacto, donde se observan osteonas y osteocitos

Figura 2: Osteocitos y sus comunicaciones intercelulares

Figura 3: Partes de un hueso largo y tipos de tejidos seos que lo componen

El periostio est formado por dos capas:

Clulas del tejido seo

Figura 5: Diferenciacin de clulas pluripotentes a diferentes tipos celulares

Figura 7: Microscopa electrnica de un osteoblasto x3400

Figura 8: Microfotografia electrnica de un osteoblasto y protenas de membrana ms importantes

Proliferacin celular y sntesis de los componente orgnicos de la matriz sea.

Op. Cit.4. pp.41. Pg.15 Op. Cit.4. pp.135. Pg.15

Figura 9: Microfotografa electrnica de un osteocito y sus prolongaciones citoplasmticas

Op. Cit.4. pp.133. Pg. 15

Figura 10: imagen microscpica de osteoclastos

Op. Cit.4 Pg. 15

glucuronidasa, etc., van a producir la reabsorcin del hueso mediante

solubilizacin de la matriz orgnica (Figura 11).

Op. Cit.4. pp.147-149. Pg. 15

Op. Cit.4 . pp.41. Pg.15

Op. Cit.4. pp.128-130. Pg 15 Op. Cit.4. pp.147-149. Pg.15

Figura 12: Proceso de osificacin intramembranosa a partir de mesnquima

Figura 13: Proceso de Osificacin Intramembranosa

Op. Cit.4; pp.149-150. Pg.15 Op. Cit.4. pp.149. Pg.15

Figura 14: Osificacin endocondral, formacin de centro de osificacin primario

Op. Cit.4. pp.150. Pg.15.

Figura 15: Osificacin Endocondral, Formacin de Centros de Osificacin Secundario

Op. Cit.4. pp.163-164. Pg.15

Hay dos formas de remodelacin sea: Remodelacin cortical y Remodelacin trabecular.32

Op. Cit.4.pp.158-160. Pg.15

Op. Cit.4. pp.164. Pg.15

El defecto seo y el proceso de reparacin

anatmica, un factor fundamental para el proceso de reparacin sea40.

La localizacin anatmica y el defecto seo proporcionan el valor pronstico de la lesin

. Para clasificar las lesiones se realizaron radiografas en los planos

Figura 16: Divisin a nivel de tibia para considerar el tipo de defecto.

Flor y su efecto sobre el tejido seo

Op. Cit.55. pp38. Pg.44

osteoconduccin: crecimiento seo por aposicin sobre una superficie.

patognomnicos de la reparacin y que es observable entre otros, en las fracturas de los

A continuacin se describen de manera detallada los procedimientos y materiales utilizados.

Animal para experimentacin

Administracin del NaF y del MFP

Determinacin de la Concentracin de Fluoruro Urinario

Figura 17: Electrodo de in especfico para la determinacin de fluoruro

Determinacin de la concentracin de flor plasmtico

Preparacin de muestra histolgica

Diseccin de tibias y eliminacin de tejidos blandos.

Corte transversal al 40% desde parte proximal con la ayuda de un micrtorno.

Determinacin de fosfatasa alcalina plasmtica

Determinacin de fsforo inorgnico

Determinacin de clcio plasmtico

Medicin de Densidad Mineral sea

Consideraciones sobre el efecto estrognico en la rata

Efecto del tratamiento sobre el crecimiento de las ratas

Efecto del tratamiento sobre la densidad mineral del hueso sano

Densidad mineral sea de la zona del defecto

CONTROL NaF MFP

Fosfatasa alcalina plasmtica