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3(1):25-30, 1998 Printed in Brazil ASPECTOS ETIOLGICOS E EPIDEMIOLGICOS DO ABORTO EQINO*

NEI MOREIRA1; ERNESTO RENATO KRGER2; JOS FRANCISCO G. WARTH3; SNIA MARIA BIESDORF2; MARIELA M.M. GOULARTE2; ROMILDO ROMUALDO WEISS4
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Departamento de Fisiologia, Campus Palotina, Universidade Federal do Paran, Curso de Ps-Graduao em Zoologia SCB-UFPR. 2Centro de Diagnstico Marcos Enriette: Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento. 3Departamento de Patologia Bsica, Setor de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Paran. 4Departamento de Medicina Veterinria, Setor de Cincias Agrrias, UFPR.

ASTRACT - This research was undertaken with the aim of establishing the main causes of equine abortion in the Curitiba area. It has been established that during the period of three years occurred a total of 9.2 per cent abortions among 674 gestations studied. From 50 aborted fetuses, different biological material was collected for bacteriology, virus and histopathology analysis. A total of 4.5 per cent of twin abortions were observed among 132 cases of abortions studied. The equine Herpesvirus type 1 has been successfully isolated from 4 cases, among 21 fetuses studied. On the other hand, 44.7 per cent from 38 fetuses studied were considered positive for bacteriological testing. The most frequent bacteria recovered were Streptococcus spp., Klebsiella spp., Escherichia coli, Pseudomonas spp. and Staphylococcus spp. The alterations found in the histological examination of the majority of bacteriological and virological abortion cases were desccribed. Key Words: Equine abortion, reproduction, equine Herpesvirus. RESUMO - Para a investigao das causas de aborto eqino na regio de Curitiba, realizou-se a coleta e processamento do material de casos de aborto para bacteriologia, virologia e histologia; e um levantamento estatstico geral dos casos de aborto. Durante trs anos, foram acompanhadas 674 gestaes, das quais 9,2% resultaram em aborto. Com relao a abortos gemelares, verificou-se um ndice de 4,5% em um total de 132 casos analisados. O material de 21 fetos foi processado com o intuito de isolar-se o Herpesvrus eqino tipo 1, obtendo-se o isolamento em 4 casos (19,0%). Foram examinados para bacteriologia um total de 38 fetos, dos quais 44,7% foram considerados bacteriologicamente positivos. As bactrias isoladas com maior freqncia foram: Streptococcus spp., Klebsiella spp., Escherichia coli, Pseudomonas spp. e Staphylococcus spp.. Foram descritas as alteraes encontradas no exame histolgico da maioria dos casos de aborto de origem bacteriana e viral. Palavras-Chave: Aborto eqino, reproduo, Herpesvrus eqino. Introduo O aborto em guas fonte de srios prejuzos econmicos, sendo que a taxa em criaes de Puro Sangue Ingls tem sido estimada como superior a 12%. O tema  aborto eqino tem sido bastante revisado, o que uma evidncia de que este problema apresenta-se de forma constante para veterinrios, que so consultados, na tentativa de encontrar-se a causa e para a preveno de ocorrncias subseqentes (ACLAND, 1987). Segundo WITHERSPOON (1984), o aborto e a mortalidade perinatal representam expressivas perdas devido ao grande valor comercial dos potros. Apenas com o conhecimento completo das * Extrato de Tese de Mestrado de Nei Moreira, Curso de PsGraduao em Cincias Veterinrias, UFPR. Com auxlios da Coordenao do Aperfeioamento do Pessoal de Ensino Superior - CAPES - e do Conselho Nacional do Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico - CNPq. Correspondncia para Prof. Nei Moreira Caixa Postal, 54 85.950-000 Palotina, PR. E-mail: moreira@ bio ufpr br

causas de aborto, pode o clnico ajudar a reduzir as perdas de seu cliente ou ajud-lo a aceitar e compreender aquelas perdas que ocorrem, inevitavelmente, a qualquer criador (PRICKETT, 1970). A probabilidade da causa de um aborto ser determinada sempre maior se ambos, o feto e a placenta, forem examinados em uma necropsia facilitada. Devido s restries de tempo, dinheiro e disponibilidade dos servios, o veterinrio , freqentemente, obrigado a realizar uma necropsia a campo (ACLAND, 1987). nfase tem sido dada aos ltimos estgios de gestao, com achados patolgicos no feto ou suas membranas, que variam com seus mecanismos de resistncia (PRICKETT, 1970). Numerosos fatores etiolgicos so responsveis por doena fetal e aborto subseqente. Estes fatores podem ser divididos em dois grupos: infecciosos e no infecciosos. Entretanto, em alguns casos, pode-se encontrar a confluncia desses fatores no mesmo feto. Muitos fatores no infecciosos podem predispor a gua e o feto a doenas infecciosas e algumas doenas infecciosas podem predispor a

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gua e o feto a microrganismos oportunistas (SWERCZEK, 1991a). No Brasil, em 1966, NILSON e CORRA isolaram pela primeira vez o vrus do aborto eqino em hamsters lactentes, a partir do fgado de feto abortado. O aborto eqino devido ao Herpesvrus eqino na Regio Sul do Brasil foi tambm relatado por WEIBLEN et al., em 1994. A prevalncia encontrada de anticorpos contra Herpesvrus eqino tipo 1 (HVE 1) em eqinos tem sido descrita para algumas regies do Brasil, como o trabalho de MODOLO et al. (1989), em que encontraram 17,6% de soropositividade trabalhando com eqinos da regio noroeste do Estado de So Paulo, atravs da prova de fixao de complemento. Alm do percentual observado por VARGAS (1989) no Estado do Rio Grande do Sul (84,7%) e por FERNANDES (1988) no Estado de So Paulo (57,3%) em animais no vacinados registra-se tambm a freqncia de eqinos com anticorpos anti Herpesvrus eqino tipo 1, equivalente a 17,7%, encontrada por MOREIRA (1992) na regio de Curitiba, Estado do Paran. Devido aos elevados prejuzos econmicos decorrentes dos episdios de aborto eqino e a inexistncia de pesquisa etiolgica nesta rea no Estado do Paran, os objetivos principais do presente trabalho foram os seguintes: determinao dos principais agentes causadores de aborto eqino de origem infecciosa; tentativa de isolamento do Herpesvrus eqino tipo 1 (EHV-1) a partir de rgos fetais; e estudo da freqncia dos casos de aborto na regio de Curitiba. Material e Mtodos Os fetos foram coletados em haras prximos a Curitiba, em um raio de 70 km, sendo a raa predominante o Puro Sangue Ingls (PSI). O manejo dos animais foi o habitualmente empregado nessas criaes, com ateno maior a possveis sinais premonitrios e indicativos de aborto. Aps a ocorrncia do aborto e no menor espao de tempo possvel, a coleta do material foi realizada obedecendo-se a seqncia abaixo: a) exame cuidadoso da placenta e colheita de fragmentos da mesma para exames histolgico e bacteriolgico; b) exame do cordo umbilical e colheita de fragmentos para histologia; e c) necropsia do feto e colheita de material para bacteriologia, virologia e histologia. Ao mesmo tempo era preenchido o protocolo de questes, composto dos seguintes tens: municpio (localizao), propriedade, nome da gua, idade, raa, alimentao, data e hora do aborto, hora da colheita, perodo de gestao, aborto gemelar ou nico, garanho pelo qual foi coberta, histrico reprodutivo, histrico de vacinao, outros abortos no haras, total de guas

prenhes, histrico de adubao e calagem nos piquetes, observaes e resultado do exame do feto e placenta. Para bacteriologia, foram colhidos fragmentos de pulmo, fgado e o contedo estomacal. Para virologia, foram colhidos fragmentos de timo, pulmo e fgado. Para histologia, foram colhidos fragmentos de timo, pulmo, fgado, bao, rim, intestino e corao; fixados em soluo de Bouin ou formol a 10%. O material colhido para bacteriologia e virologia foi acondicionado em recipientes estreis e transportado at o laboratrio em caixa de isopor com gelo. O material colhido para virologia foi armazenado em freezer a -80 oC, at o momento do processamento. O material colhido para bacteriologia foi semeado no menor espao de tempo possvel aps a chegada ao laboratrio, nos seguintes meios: ASA (gar Sangue) CO2 10%, MacConkey, Tetrationato, Sabouraud (para fungos) e Caldo BHI; do Tetrationato o material era repicado para Mac Conkey e do Caldo BHI repicado para Asa e Mac Conkey. Para o diagnstico laboratorial do Herpesvrus eqino tipo 1 foram utilizadas as seguintes tcnicas: impresso de lminas para imunofluorescncia, inoculao em cultivo celular e inoculao em camundongos. Culturas Celulares - a linhagem celular utilizada foi a VERO, proveniente do Instituto Adolfo Lutz, So Paulo. As clulas foram repicadas em meio mnimo de Eagle contendo 10% de soro bovino adulto precipitado com polietilenoglicol. Amostras de Campo. Foram processados timo, pulmo e fgado de fetos abortados, provenientes da regio de Curitiba. Animais de Laboratrio. Foram utilizados, para a inoculao de amostras suspeitas, camundongos com 21 dias de idade e camundongos lactentes com 2 a 4 dias de idade. Vrus Padro. Foi utilizada a amostra A4/72, isolada na Seo de Raiva e Encefalomielite do Instituto Biolgico de So Paulo, em 1972, a partir de rgos de feto abortado, proveniente do municpio de Campinas, e adaptada cultura de clulas VERO. Soro Padro. Foi preparado em cobaias, atravs de inoculaes, por via subcutnea, de 1000 DICT 50%, da cepa A4/72. Uma semana aps a ltima inoculao as cobaias foram sangradas, por puno cardaca, e seu soro titulado pela tcnica de fixao de complemento, segundo OSLER (1952). Conjugado Fluorescente. O soro hiperimune foi submetido precipitao com sulfato de sdio, dialisado em soluo salina, sendo posteriormente feita a dosagem da protena pelo mtodo do biureto, a purificao de IgG por cromatografia, o teste de especificidade pela imunoeletroforese e a marcao da IgG com isotiocianato de fluorescena, segundo tcnica preconizada por CAMARGO (1973). Preparo de

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Amostras. O conjunto dos 3 fragmentos de rgos fetais (timo, pulmo e fgado) foi pesado, objetivando-se calcular a quantidade necessria de meio de Eagle para o preparo de uma suspenso a 20%. Com a utilizao de um pistilo e pequena quantidade de areia estril, procedeu-se macerao do material e preparo da suspenso, que foi em seguida centrifugada a 3.000 r.p.m., durante 15 minutos em centrfuga refrigerada, para inoculao em sistemas sensveis. Inoculao em cultivo celular. Clulas VERO, cultivadas em garrafas plsticas da marca COSTAR e tambm em lamnulas colocadas em tubos de Leigthon, foram inoculadas com o sobrenadante da suspenso centrifugada. A seqncia do processo apresentada a seguir: a) aps a retirada do meio de Eagle foi inoculado nas garrafas 1 ml de suspenso a 20% e nos tubos 0,2 ml; b) incubao a 37 oC, durante 1 hora, para que ocorra adsoro do vrus; c) o inculo era dispensado; d) lavagem com Meio Mnimo de Eagle (MEM) sem soro bovino; e) colocao de MEM com 2% de soro bovino: 5 ml nas garrafas e 1 ml nos tubos; e f) incubao em estufa a 37oC durante 18 horas. Tcnica de Imunofluorescncia Direta (KOTAIT et al., 1989). As lminas preparadas a partir da impresso de rgos e as lamnulas dos tubos de Leigthon, aps fixao em acetona, durante 30 minutos, foram coradas com conjugado fluorescente e a leitura foi feita em microscpio de epiiluminao CARL ZEISS, com aumento de 400X. Observe-se a descrio detalhada da tcnica utilizada para as lminas preparadas a partir da impresso de rgos: a) aps 17 horas de freezer a -20oC as lminas foram delimitadas com esmalte na regio da impresso; b) em seguida, foram colocadas duas gotas da mistura 1 gota do conjugado preso + 6 gotas de PBS com azul de Evans em cada lmina (foram feitas duas lminas de cada rgo); c) Incubao em estufa a 37oC durante 45 minutos, em cmara mida; d) as lminas foram retiradas da estufa e imersas em PBS pH 7,7 durante 10 minutos; e) as lminas foram lavadas em gua destilada trs vezes e colocadas em estufa a 37 oC para secagem durante 20 minutos; e f) a parte de baixo das lminas foi limpa com ter, em seguida
Tabela 1. Etiologia dos casos examinados de aborto eqino.

foi colocada uma gota de glicerina tamponada em cada lmina e, aps isto, foram colocadas as lamnulas. Observao. Controles positivos: crebro, pulmo e fgado de Gerbil infectado com Herpesvrus eqino tipo 1. Controles negativos: crebros de cobaias. Inoculao de Animais. Cada suspenso de rgos de feto abortado foi inoculada em 8 camundongos adultos e 8 camundongos lactentes. A inoculao foi via intra-cerebral, utilizando-se seringas descartveis para insulina. Os camundongos adultos foram inoculados com 0,03 ml de suspenso e os camundongos lactentes, com 0,01 ml. Mtodo histolgico. Os fragmentos de rgos fetais e placenta, aps fixao em formol a 10% ou soluo de Bouin, foram recortados para processamento histolgico de rotina. O material foi processado em um processador automtico de tecidos-histotcnico OMAPV85, includo em parafina, seccionado a 5 Pm de espessura e corado pela tcnica da Hematoxilina de Harris-Eosina. Os cortes foram examinados ao microscpio ptico sob os aumentos de 40X, 100X, 400X e, sempre que necessrio, 1000X sob imerso. Resultados e Discusso ndice de abortos. Durante os trs anos do presente estudo foram acompanhadas 674 gestaes, das quais 62 resultaram em aborto, o que equivale a 9,2%, bastante prximo aos valores descritos na literatura. Trabalhos prvios de BAIN (1969), DU PLESSIS (1964) e SULLIVAN et al., (1975) tm indicado perdas na gestao aps 45 dias variando de 11 a 19%. Foram examinados 50 casos de aborto, sendo que em 23 a causa foi determinada, conforme se nota pelos resultados agrupados na Tab. 1. Incidncia de abortos por propriedade. As propriedades que apresentaram um nmero mnimo de 25 guas gestantes por ano foram avaliadas individualmente, verificando-se uma variao de 2 a 25% na incidncia de abortos por propriedade, em relao ao nmero de guas gestantes.

% ETIOLOGIA CASOS (N) No Identificada* 27 54 Bacteriana 17 34 Viral (Ehv-1) 4 8 Gestao Gemelar 2 4 50 100 TOTAL * Incluindo casos de autlise avanada, quando no foi colhido material para bacteriologia e virologia. Idade mdia das guas que abortaram. Analisou-se a idade de 52 guas no momento do aborto e obteve-se uma mdia de 8,25 anos. Abortos gemelares. Foram analisados 132 casos

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de aborto, incluindo casos de aborto em que as gestaes no estavam sendo acompanhadas (propriedades no controladas), dos quais 6 foram gemelares, o que equivale a 4,5%. Tais casos ocorreram, nos seguintes meses de gestao: 5o, 6o, 7o, 8o e 10o (2 casos). Considerando a taxa encontrada de abortos de 9,2%, o percentual encontrado de guas prenhes que abortam gmeos foi de 0,4%. A literatura consultada (SWERCZEK, 1991b) afirma que entre 0,5 a 1% das guas Puro Sangue Ingls abortam gmeos ou, raramente, ambos vivos a termo. Os abortos gemelares geralmente so observados aps o 8o ms de gestao, apesar de que j foram descritos casos com 88 dias (JEFFCOTT e WHITWELL, 1974; WHITWELL, 1980). Isolamento do Herpesvrus eqino tipo 1. O material de 21 fetos foi processado com o intuito de isolar-se o Herpesvrus eqino tipo 1, obtendo-se o isolamento em 4 casos, atravs da utilizao da tcnica de inoculao em cultivo celular da linhagem VERO e de provas de imunofluorescncia. Com relao ao perodo de gestao, estes abortos ocorreram no 5o, 6o, 8o e 9o
Tabela 2. Casos de aborto de origem bacteriana em eqinos.

ms. Bactrias isoladas dos fetos abortados. Foram processados para bacteriologia um total de 38 fetos, dos quais 17 foram considerados positivos. Os critrios adotados para considerar-se um feto, bacteriologicamente positivo foram aqueles sugeridos por ROSSDALE e RICKETTS (1976). As bactrias isoladas dos casos positivos esto descritas na Tab. 2. Verificou-se que as bactrias isoladas nesta pesquisa nos casos de aborto de origem bacteriana, correspondem quelas comumente citadas na literatura (ACLAND, 1987; MAHAFFEY, 1968; PRICKETT, 1970; LANGFORD, 1974; DIMOCK et al., 1947). Prevalncia mensal dos casos de aborto. Para melhor visualizao, os resultados da freqncia de abortos em relao ao ms do ano, foram distribudos na Fig. 1. Os meses em que foi observada maior incidncia de casos de aborto (maro a agosto), correspondem aos meses em que as guas apresentam-se no tero final da gestao, em decorrncia da estao de monta definida para a raa Puro Sangue Ingls, que compreende o perodo de 15 de agosto a 15 de janeiro. No CASOS 3 1 1 2 2 2 2 1 1 1 1 17 % 17,6 5,9 5,9 11,8 11,8 11,8 11,8 5,9 5,9 5,9 5,9 100,0

AGENTE Streptococcus spp. E - hemoltico Streptococcus spp. D - hemoltico Streptococcus spp. no hemoltico Escherichia coli Pseudomonas spp. Staphylococcus spp. Klebsiella spp. Klebsiella pneumoniae Actinobacillus equuli Enterobacter cloacae Bacillus spp. TOTAL
F r e q n c i a %

25 20 15 10 5 0
n Fe v M ar A br M ai Ju n l A go Se t O ut N ov D ez Ja Ju

Freqncia % Nmero de abortos

Ms
Fig. 1. Prevalncia mensal dos casos de aborto eqino.

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Prevalncia dos casos de aborto segundo o perodo de gestao. Para melhor visualizao, os resultados da freqncia de abortos em relao ao perodo de gestao, foram distribudos na Fig. 2. Na anlise do perodo de gestao (tero final), que

apresentou maior prevalncia de casos de aborto, verificou-se que coincide com o citado por MACRUZ (1991), em fetos examinados no Jockey Club de So Paulo e no Instituto Biolgico de So Paulo.

F r e q n c i a %

25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ms de Gestao

Nmero de abortos Freqncia %

Fig. 2. Freqncia de abortos em relao ao perodo de gestao em eqinos.

Exame histolgico. As alteraes encontradas no exame histolgico dos casos de aborto esto resumidas a seguir: Casos de origem bacteriana: Placenta: edema, hiperemia, infiltrao por polimorfonucleares, dilataes csticas, placentite purulenta. Fgado: hiperemia acentuada, autlise, fibrose periductal nos espaos porta com infiltrao por polimorfonucleares. Intestino: edema na submucosa, algumas vezes com infiltrao leucocitria. Casos de origem viral (Herpesvrus eqino tipo 1): Fgado: desarranjo e tumefao das trabculas hepticas, leve megalocitose, infiltrao por monomorfonucleares e raros polimorfonucleares. Rins: edema intersticial. Pulmo: hiperemia intensa. Placenta: infiltrao por monomorfonucleares e polimorfonucleares, placentite subaguda. Cordo umbilical: onfaloflebite aguda com infiltrao eosinoflica e presena de alguns neutrfilos. Tais alteraes no estavam presentes em todos os casos, mas, sim, representam um compilado das alteraes encontradas com relativa freqncia. Por outro lado, o exame histolgico foi algumas vezes prejudicado por certo grau de autlise intra ou extra-uterina. Concluses Dos casos processados para bacteriologia, 44,7% resultaram positivos. As bactrias isoladas como agentes etiolgicos de abortos foram as mesmas freqentemente isoladas em casos de endometrite

na gua, sugerindo ento a via ascendente de contaminao. Por outro lado, 19,0% dos casos processados para virologia resultaram positivos. Os casos de isolamento do Herpesvrus eqino tipo 1, a partir de rgos fetais, vieram a comprovar sua participao como agente etiolgico de abortos na populao estudada. Em relao aos casos de aborto relatados neste trabalho, 4,5% foram identificados como gemelares. Com o objetivo de evitar-se, tanto quanto possvel, os casos de aborto eqino, so propostas as seguintes sugestes: a) todo caso de aborto deve ser considerado como uma possvel fonte de infeco; b) o feto e a placenta, aps a necropsia e colheita de material, devem ser incinerados e, se possvel, enterrados; c) as reas de cocheira contaminadas por sangue ou fluidos fetais devem ser desinfetadas e a cama incinerada; d) o posterior da gua deve ser limpo com uma soluo desinfetante; e) a gua que abortou deve ser isolada das outras guas prenhes. O contato indireto, seja atravs de pessoal ou de utenslios, deve ser evitado; f) a introduo de novos animais no grupo de guas prenhes deve ser evitada; g) os exames vaginais e cervicais devem ser feitos com espculo tubular que possua o menor dimetro possvel. Com relao a esta sugesto cita-se como exemplo o trabalho de MAHAFFEY (1968) onde afirma nunca ter encontrado aborto fngico em pneis que nunca foram submetidas a exames ginecolgicos; h) atentar para as condies bsicas de nutrio, manejo e sanidade; e, finalmente, i) a metodologia

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utilizada neste trabalho poder servir como referncia na investigao dos casos de aborto eqino e no aprimoramento das tcnicas de diagnstico. Agradecimentos Ao Instituto Biolgico de So Paulo, pela colaborao no estudo virolgico dos casos de aborto.
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