Livro de Cultura de Tecidos

TEXTOS ACADMICOS
CULTURA DE TECIDOS
Renato Paiva Patrcia Duarte de Oliveira Paiva
CURSO DE PS-GRADUAO LATO S E N S U " (ESPECIALIZAO) A DISTNCIA BIOTECNOLOGIA: FUNDAMENTOS TCNICOS, APLICAES E PERSPECTIVAS
CULTURA DE TECIDOS
Renato Paiva Patrcia Duarte de Oliveira Paiva
UFLA - Universidade Federal de Lavras - Fundao de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Extenso Lavras - MG
SUMRIO
1. CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS 2. LABORATRIO DE CULTURA DE TECIDOS 2.1. INTRODUO 2.2. ESTRUTURA FSICA 2.2.1. Sala de limpeza 2.2.2. Sala de preparo 2.2.3. Sala de transferncia 2.2.4. Sala de cultura ou sala de crescimento 2.2.5. Instalaes de apoio 2.3. EQUIPAMENTOS NECESSRIOS 2.4. VIDRARIAS UTILIZADAS 3. MEIOS DE CULTURA 3.1. INTRODUO 3.2. COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA 3.2.1. gua 3.2.2. Nutrio mineral 3.2.3. Nutrio orgnica 3.2.4. Materiais de suporte 3.2.5. Qualidades fsicas do meio de cultura 3.2.6. pH 3.2.7. Quantidade de meio 3.2.8. Condies de incubao 3.2.9. Esterilizao do meio de cultura 4. TCNICAS DE ESTABELECIMENTO IN VITRO 4.1. INTRODUO 4 2. CALOGNESE 4.2.1. Aplicao da cultura de calos 4.2.2. Tcnicas para estabelecimento de calos 4.2.3. Tipos de calos 4.2.4. Tamanho, tempo de repicagem e manuteno de calos na subcultura 7 9 9 10 11 12 12 12 12 12 18 22 22 22 23 23 25 30 31 31 31 32 34 36 36 36 38 38 38 38
4.3. SUSPENSO CELULAR 4.3.1. Aplicaes da suspenso celular: 4.3.2. Mtodos mais utilizados para medir o crescimento celular: 4.3.3. Importncia da curva de crescimento 4.4. CULTURA DE ANTERAS 4.4.1. Protocolo para a obteno de haploides 4.4.2. Fatores que influenciam a andrognese 4.4.3. Identificao de haploides 4.4.4. Problemas 4.4.5. Utilizao de plantas haplides 4.5.; CULTURA DE ESTRUTURAS ORGANIZADAS 4.5.1.,Cultura de Meristemas 4.5.2. Cultura de Embries 5. MULTIPLICAO 5.1. INTRODUO 5.2. FASES DA MICROPROPAGAO 5.2.1. Fase preparativa (Estdio 0) 5.2.2. Incio do cultivo (Estgio 1) 5.2.3. Multiplicao (Estgio 2) 5.2.4. Alongamento de brotaes e induo de raiz (Estgio 3): 5.2.5. Transferncia para as condies de casa de vegetao (Estgio 4): 5.3. PRODUO DE MUDAS LIVRES DE ENFERMIDADES 5.3.1. Termoterapia 5.3.2. Cultura de meristema 5.3.3. Termoterapia seguida de cultura de meristema 5.3.4. Microenxertia 6. ENRAIZAMENTO 6.1. INTRODUO 6.2. ENRAIZAMENTO IN VITRO 6.3. ENRAIZAMENTO EX VITRO 7. ACLIMATIZAO 7.1. INTRODUO 7.2. ESTRESSE HDRICO 7.3. FOTOSSNTESE
39 39 39 41 41 42 42 43 43 43 44 44 46 50 50 51 51 52 53 54 55 55 55 55 56
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7.4. ABSORO DE NUTRIENTES 7.5. FITOSSANIDADE 7.6. CONDIES PARA A ACLIMATIZAO 8. FOTOMORFOGNESE IN VITRO 8.1. INTRODUO 8.2. LUZ E LMPADAS 8.3. RESPOSTAS DA PLANTA LUZ 8.4. FOTOMORFOGNESE E CULTURA DE TECIDOS 8.4.1. Comprimento de onda 8.4.2. Intensidade de luz (irradincia) 8.4.3. Comprimento do dia (fotoperodo) 9. PROBLEMAS NO CULTIVO IN VITRO 9.1. INTRODUO 9.2. OXIDAO 9.3. DECLNIO NO VIGOR 9.3.1. Declnio na taxa de proliferao 9.3.2. Habituao 9.4. NECROSES 9.4.1. Necrose apical em brotaes 9.4.2. Como evitar a necrose 9.5. VITRIFICAO (HIPERHIDRICIDADE) 9.5.1. Ocorrncia 9.5.2. Fatores que influenciam a vitrificao 9.5.3. Preveno da vitrificao 10. PRINCIPAIS APLICAES DA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS 10.1. INTRODUO 10.2. APLICAES DA CULTURA DE TECIDOS NA PROPAGAO ASSEXUADA 10.3. APLICAES EM FITOPATOLOGIA 10.4. APLICAES NO MELHORAMENTO GENTICO 11. ALGUNS CONCEITOS EM CULTURA DE TECIDOS REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
Renato Paiva
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Patrcia Duarte de Oliveira Paiva
O desenvolvimento de tcnicas de cultura de tecidos tem sido, indubitavelmente, uma das contribuies mais significativas para as possibilidades de manipulao dos biolgica. A cultura de tecidos um processo atravs do qual &~ pequenos fragmentos de tecido vivo (explantes) so isolados de um organismo e cultivados assepticamente por perodos indefinidos em um meio nutritivo semidefinido ou definido. Esta definio original deve ser, no entanto, ampliada no caso das plantas, para incluir toda uma gama de explantes como plntulas e rgos (tais como culturas de vulos ou de embries), clulas isoladas e protoplastos. Tais avanos tm aumentado as perspectivas de operaes possveis de serem utilizadas, em diversos campos da biotecnologia de plantas. Wtav>O0 J j ^ ^ P Um marco importante nesta area ocorreu em 1958 atravs de dois grupos independentes de pesquisadores, os quais conseguiram induzir embries somticos ^^0^ a partir do calo de cenoura, com subsequente desenvolvimento de plantas. Nos anos seguintes, foi observado em outras espcies a capacidade de formar embries somticos in vitro. Os fenmenos morfogenticos observados in vitro resultam da diferenciao, desdiferenciao ou rediferenciao do explante inicial e podem ser agrupados, conforme a sua natureza, de duas formas diferentes: morfogenese por via direta ou por via indireta. As tcnicas por via indireta podem ser empregadas, quando so desejadas variaes genticas nos descendentes, em virtude da possibilidade de obteno de variantes em clulas provenientes do calo. Em contrapartida, a tcnica direta pode ser empregada quando se deseja manter a identidade gentica do gentipo propagado.
Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras (UFLA) Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA.
EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos
A utilizao da cultura de tecidos para fins de propagao de plantas comumente dividida nos seguintes estgios: estgio 0 (seleo e preparo da planta matriz), estgio 1 (estabelecimento de uma cultura assptica), estgio 2 (produo de propgulos adequados), estgio 3 (preparao para o crescimento em meio natural) e estgio 4 (aclimatizao). > Normalmente, explantes retirados de plantas jovens ou plntulas, apresentam melhores respostas de crescimento in vitro em relao a explantes obtidos de plantas adultas. O desenvolvimento de clulas individuais em complexos rgos e tecidos multicelulares um processo comum a todas as formas superiores de vida. Isto significa que todo um espectro de desenvolvimento conhecido como diferenciao, se constitui em uma srie de processos altamente coordenados e determinados geneticamente, atravs dos quais, gmetas isolados ou fundidos (esporos e zigotos, respectivamente, em plantas) e primrdios somticos derivados de clulas individuais se desenvolvem em plantas inteiras. As vias de diferenciao envolvidas na maturao da planta so, em ltima anlise, determinadas pela natureza constitutiva dos genes herdados, sendo que a expresso dos mesmos modulada por interaes celulares e ambientais. Os padres de desenvolvimento da planta so razoavelmente consistentes dentro de limites definveis de gentipo, ou seja, grupos taxonmicos, de maneira que os constituintes genticos da clula germinativa original teoricamente contm todos os elementos determinantes dos padres de diferenciao. O conceito de totipotncia surgiu baseado neste contexto. Os tecidos somticos de uma planta so essencialmente os produtos de divises mitticas, sendo que cada clula dentro do organismo capaz de regenerar novas rplicas do mesmo organismo, sob condies apropriadas. Por definio, totipotncia a capacidade de uma clula regenerar o fentipo do organismo completo e diferenciado, do qual ela derivada. Nas plantas, a maioria das divises celulares coordenadas ocorrem em reas concentradas conhecidas como meristemas os quais esto distribudos em vrios pontos do organismo, durante o seu desenvolvimento. O funcionamento dos meristemas pode ser ativado ou suprimido, de acordo com os padres de diferenciao ditados por mecanismos de controles gentico ou ambiental.
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LABORATRIO DE CULTURA DE TECIDOS
Gustavo de Arajo Soares Renato Paiva Patrcia Duarte de Oliveira Paiva Jos Raniere Ferreira de Santana Edson Jos Artiaga de Santiago
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2.1. INTRODUO As atividades em um laboratrio de cultura de tecidos devem ser realizadas e m \ ^ Q ^ y um ambiente assptico, com'temperatura e iluminao controladas. Dependendo do <tf cf tipo de trabalho que se pretende realizar, tanto a luz quanto a temperatura so ..^ fatores importantes, que podem alterar os resultados. Deste modo, a padronizao das condies ambientais em um laboratrio proporciona uma maior confiabilidade nos resultados obtidos e uma menor porcentagem de perda de material, j que estes fatores podem ser regulados para que se obtenha uma condio tima, onde ocorre rpido crescimento e melhor desenvolvimento do material. A assepsia outro fator muito importante que deve ser considerado no trabalho de cultura de tecidos. Como o meio de cultura possui nutrientes essenciais para o crescimento de clulas, ele est sujeito a contaminao por fungos e bactrias presentes no ar, nos materiais utilizados nos procedimentos ou, at mesmo, no corpo da pessoa que est executando a inoculao. Geralmente esses microrganismos *^ 3 contaminantes proliferam mais rapidamente que o material de interesse, levando morte do mesmo.
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Mestrando em Fisiologia Vegetal, Universidade Federal de Lavras (UFLA) Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, UFLA Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA Professor Assistente, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA.
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Para evitar a contaminao importante se ter no laboratrio instalaes com caractersticas apropriadas, trabalhar somente com equjpamentos_JjmQ_e esterilizados e seguir normas de trabalho que possibilitem a criao de um ambiente com elevado nvel de assepsia. A compartimentalizao das atividades dentro do laboratrio um dos cuidados que deve ser tomado para se evitar a contaminao. Atividades que lidam com material contaminado e sujo devem ser separadas das atividades com materiais esterilizados e que necessitam de ambiente assptico. Assim, as atividades no laboratrio devem seguir uma sequncia natural pelas instalaes, de tal forma que procedimentos sucessivos sejam realizados lado a lado. Dessa forma, economiza-se tempo e trabalho, resultando tambm em economia financeira.
2.2. ESTRUTURA FSICA Recomenda-se que as atividades dentro de um laboratrio de cultura de tecidos vegetais sejam distribudas em salas, na ordem em que forem realizadas. Assim, a sala de limpeza o primeiro cmodo, destinado limpeza e esterilizao de materiais. Em seguida, vem a sala de preparo, onde todo material e solues utilizadas e os meios de culturas so preparados. Na sala de transferncia, ocorre a manipulao assptica e inoculao do tecido vegetal nos meios de cultura e na sala de cultura, todo material inoculado incubado em condies ambientais controladas. As salas de preparo, transferncia e cultura podem ficar juntas. A sala de transferncia, por exigir condies extremamente asspticas, no pode ser dividida com nenhuma outra. Existe basicamente duas maneiras de se distribuir o espao fsico do laboratrio. Na primeira, as salas so dispostas de acordo com a sequncia de atividades em forma de um crculo imaginrio. Assim, a ltima fase fica espacialmente prxima primeira. Na segunda, as salas tambm so dispostas de acordo com a sequncia de atividades, porm em linha reta (Figura 1).
Laboratrio de Cultura de Tecidos
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Sala de Transferencia
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Sala de Limpeza
Condicionador de ar
Sala de Preparo
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Figura 1: Exemplo de uma planta baixa de um laboratrio de cultura de tecidos vegetais. 2.2.1. Sala de limpeza o local para descarte de meios de cultura, lavagem de vidraria, utenslios diversos e autoclavagem de gua. Deve ser dotada de bancada, armrios e prateleiras para estocagem de material, pias fundas, autoclave, destilador, deionizadori lavador de pipetas, forno de microondas, estufa de secagem de vidrarias, escorredor de vidrarias e eletricidade para 110 e 220 volts. A assepsia desta sala baixa, devido as suas atividades. Por isso, recomenda-se que esta sala fique distante da sala de transferncia.
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2.2.2. Sala de preparo Local para preparo de meios de cultura e de solues. a sala de maior circulao de pessoal, por ser onde se realizam as principais atividades do laboratrio. Deve estar equipada com armrios, estante para estocagem de vidraria, pia, geladeira, freezer, balana, peagmetro, agitador magntico, autoclave e eletricidade para 110 e 220 volts. 2.2.3. Sala de transferncia Local onde se manipula assepticamente o material vegetal, sendo exclusivo para a capela de fluxo laminar e estantes que auxiliam na estocagem temporria dos meios de cultura e outros materiais j autoclavados, destinados ao uso imediato. A circulao de pessoas deve ser restrita, sendo que uma pequena janela de vidro na porta interessante para visualizao, evitando sua abertura frequente por motivos diversos. 2.2.4. Sala de cultura ou sala de crescimento Local destinado ao crescimento in vitro do material inoculado. Necessita de estantes com prateleiras (uma sugesto que possuam 50 cm de largura, distanciadas entre si de 40-45 cm, num total de 5 prateleiras por estante). Cada prateleira deve ser iluminada individualmente por 2 fileiras de lmpadas fluorescentes. Um armrio ou um simples pano preto til, tambm, para as culturas que precisam se desenvolver no escuro. 2.2.5. Instalaes de apoio O ltimo passo na cultura de tecidos vegetais a adimatizao das plantas, ou seja, a etapa na qual as plantas tm de se adaptar ao ambiente externo ao laboratrio. Para isso, necessrio uma rea externa, como cmara de nebulizao^ ou telado apenas, onde as plantas tero um ambiente controlado e que pode ser modificado, para que o material vegetal se adapte vagarosamente ao ambiente natural.
2.3. EQUIPAMENTOS NECESSRIOS a) Autoclave: utilizada para esterilizao de meios de cultura, vidraria, gua e outros materiais. Este aparelho pode produzir calor seco ou calor mido, que mais eficiente para esterilizao. A temperatura ideal de trabalho fica em 121C. Pode ser horizontal ou vertical. Em laboratrios menores, pode ser substituda por panelas de presso domsticas dotadas de manmetro (Figura 2).
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Figura 2: Autoclave horizontal.
b) Destilador: utilizado para eliminao de sais minerais da gua. Para uma maior pureza da gua, recomenda-se sua utilizao juntamente com o deionizador. c) Deionizador: deve ser instalado logo aps o destilador. Auxilia na eliminao de ons. d) Estufa de secagem: destina-se a secagem de vidraria e outros materiais. Funciona como um forno eltrico comum, produzindo calor seco. Estes podem tambm ser utilizados para esterilizao desde que produzam temperaturas de no mnimo 160C (Figura 3).
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Figura 3: Estufa de secagem de materiais.
e) Forno de microondas: usado para fuso de gar. Este equipamento pode ser substitudo por um ebulidor.. f) Mquina de lavar vidraria: Funciona como uma mquina de lavar pratos e utilizada para lavagem mecnica de vidrarias. g) Aparelho de banho-maria: substitui o forno de microondas para a fuso de gar. h) Aquecedor de gua: utilizado para lavagem de frascos com meio de cultura. i) Lavador de pipetas: destina-se lavagem de pipetas. j) Geladeira: armazenamento de solues-estoque, reagentes e reguladores de crescimento. k) Freezer: armazenamento de reagentes que necessitem temperaturas abaixo de zero graus centgrados. I) Balana: imprescindvel para pesagem de reagentes, no preparo de solues e dos meios de cultura. Para quantidades menores h a
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necessidade de uma balana de preciso. Um laboratrio de cultura de tecidos vegetais, mesmo que pequeno, necessita de uma balana de preciso (Figura 4).
Figura 4: Balana analtica.
m) Medidor de pH: extremamente til na determinao do pH de solues e dos meios de cultura. Pode ser substitudo por papis-indicadores, porm apresentam menor preciso (Figura 5).
Figura 5: Medidor de pH.
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n) Agitador magntico: auxilia no processo de dissoluo de reagentes (Figura 6).
Figura 6: Agitador magntico. o) Capela de fluxo laminar: utilizada para realizar trabalhos de manipulao assptica. Funciona forando a passagem de ar por meio de um filtro bacteriolgico, de modo que seja criado um ambiente estril no interior da capela. No deve ser colocada em frente de porta, ventilador ou aparelho de ar condicionado, para evitar entrada de ar contaminado durante o uso. Algumas capelas possuem lmpadas ultravioleta, que, ligadas cerca de 20 minutos antes de se iniciar o trabalho, esterilizam o ambiente (Figura 7).
Figura 7: Capela de fluxo laminar.
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p) Dispensador de meios de cultura: bomba aspirante que auxilia na distribuio do meio de cultura nos frascos, de uma s vez, no volume desejado. muito til quando se trabalha com grandes quantidades de meio de cultura, aumentando o rendimento da operao. q) Bico-de-bunsen: equipamento essencial no interior da capela de fluxo laminar, pois esteriliza os instrumentos cirrgicos (pinas e bisturis) utilizados e a boca dos frascos. Produz uma chama de fogo pela queima de gs. Pode ser substitudo por lamparina a lcool (Figura 8).
Figura 8: Aspecto visual de um bico-de-bunsen. r) Microscpio estereoscpio: muito utilizado em laboratrios que realizam limpeza clonal. s) Desumidificador ou umidificador. aparelhos utilizados para controlar a umidade relativa do ar dentro do laboratrio, diminuindo-a ou aumentandoa respectivamente. t) Agitador orbital: necessrio para cultivos em meios lquidos que necessitem ficar sob agitao constante. u) Esterilizadores de ar: reduz a populao de microorganismos nos ambientes. v) Mquina para lavagem de vidrarias.
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2.4. VIDRARIAS UTILIZADAS Alm dos equipamentos e da infra-estrutura citada acima, outros utenslios como vidrarias e materiais so muito utilizados dentro de um laboratrio de cultura de tecidos vegetais. Os frascos para o cultivo in vitro so essenciais para a manuteno das condies asspticas do ambiente. Esses frascos tm que ser transparentes e autoclavveis, de vidro ou plstico. Podem ser utilizados desde tubos de ensaio e frascos prprios para a cultura de tecidos (250 a 500 mL) at frascos de alimento e conserva, reutilizados, de tamanhos e formatos variados. importante que os frascos possuam tampas que permitam trocas gasosas entre o ambiente interno e o externo ao tubo de ensaio. Porm, deve-se certificar de que as tampas no permitam a contaminao do meio nutritivo (Figura 9).
Figura 9: Aspecto visual de um tubo de ensaio (A) e um frasco de vidro (B) para cultivo in vitro. w
Para o preparo das solues, so utilizados beckers, erlenmeyers, provetas, buretas, pipetas, placas de Petri e bastes de vidro. aconselhvel que se tenha beckers e erlenmeyers com capacidade variando entre 25 a 2000 mL e provetas de 10 a 1000 mL (Figura 10).
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As buretas so usadas para despejar o meio nutritivo nos recipientes de cultura, porm laboratrios maiores utilizam dispensadores automticos de meio de cultura para este fim (Figura 11).
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Figura 11: Aspecto visual de uma bureta. As pipetas graduadas e as provetas so usadas para medies mais precisas de volumes. O laboratrio deve dispor de um bom nmero de pipetas de 1, 2, 5, 10 e 25 mL. Existem ainda as pipetas automticas, que, apesar de mais caras, facilitam e agilizam o trabalho. Depois do preparo das solues-estoque, estas devem ser guardadas em frascos de vidro de capacidade de 250 a 500 mL, de boca estreita e de cor mbar para os reagentes sensveis luz (Figura 12).
Figura 12: Aspecto visual de frascos de vidro para armazenamento de solues.
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Para facilitar o manuseio e o trabalho com os tubos de ensaio, utiliza-se um suporte, geralmente de plstico autoclavvel, onde os tubos de ensaio so mantidos em posio inclinada de 45, para aproveitarem a melhor a luz na sala de cultura. Ainda na sala de cultura, termmetros de mxima e mnima so indispensveis para o eficaz controle da temperatura neste ambiente. Bandejas de material autoclavvel, funil, papel-toalha, algodo, papel alumnio, filmes plsticos, pinas, bisturis com lminas, etiquetas, vasos para plantas, sacos plsticos de mudas, detergentes e caixas gerbox para aclimatizao so apenas mais alguns utenslios usados em um laboratrio de cultura de tecidos vegetais.
MEIOS DE CULTURA
Edson Jos Artiaga de Santiago Renato Paiva

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Patrcia Duarte de Oliveira Paiva Jos Raniere Ferreira de Santana Guilherme Augusto Canela Gomes
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3.1. INTRODUO Os meios nutritivos fornecem as substncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padro do desenvolvimento in vitro. A constituio do meio baseada nas exigncias das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificaes para atender em necessidades especficas. Um dos primeiros meios de cultura desenvolvidos foi o de White. Esse meio apresenta baixo nvel de nitrognio e de potssio, restringindo assim o seu uso para muitas clulas; entretanto, esta formulao baixa em sais, usada em muitas situaes. O meio MS foi uma das primeiras formulaes melhoradas usadas em cultura de tecidos de plantas, apresentando altos nveis de nitrato, potssio e amnio. Atualmente o meio de cultura amplamente utilizado em trabalhos de cultura de tecidos vegetais.
3.2. COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA Os meios nutritivos so formados de mltiplos componentes, sendo bastante variveis em funo da espcie vegetal e da origem do explante.
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Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras (UFLA) Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA Professor Assistente, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) Doutorando em Fitotecnia, Departamento de Agricultura, UFLA.
Meios de Cultura
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O meio de cultura constitudo de componentes essenciais e opcionais. Os essenciais compreendem a gua, os sais_inprjgnjps a fonte de carbono e energia, vitaminas e substncias reguladoras de crescimento. Entre os componentes adicionais esto includos osjaminocidos e_amjdas, cidoj orgnicos e substncias naturais complexas. Os componentes bsicos do meio nutritivo o fazem um substrato excelente para o crescimento de bactrias e fungos. Para evitar a contaminao dos meios por impurezas minerais, todos os sais utilizados na sua preparao devem ser de qualidade analtica ("p.a"). A incluso de fungicidas e bactericidas no meio no aconselhvel, podendo ter efeito txico para o explante.
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Os principais componentes de uso mais frequente nos meios de cultura so: 3.2.1. gua A qualidade da gua muito importante em cultura de tecidos vegetais, uma vez que este o componente que entra em maior proporo na preparao do meio. Para melhor controle deve-se usar gua destilada, bidestilada e deionizada. A utilizao de gua de torneira pode comprometer o desenvolvimento da cultura. 3.2.2. Nutrio mineral Os nutrientes empregados nos meios de cultura so os mesmo estabelecidos para a nutrio mineral bsica das plantas no campo. So eles: a) Nitrognio um dos nutrientes mais estudados da constituio dos meios de cultura, pois pode ser suplementado na forma d e ^ m n j c ^ j ^ o n ^ nitrato (nion), ou ainda na forma de compostos orgnicos, dependendo do material em cultura. constituinte de aminocidos, nucleotdeos e coenzimas, tendo importncia na sntese proteica. Meios enriquecidos com nitrognio fundamental para a induo de embriognese somtica, bem como diferenciao de parte area. b) Fsforo adicionado ao meio, principalmente, como fosfato de potssio monobsico (H P0 ). absorvido pelas plantas na forma de ons H P0 ". Desempenha papel importante no metabolismo energtico, na regulao de processos enzimticos e na ativao de enzimas. Necessrio para a sntese do ATP; na organognese est envolvido na diferenciao da parte area, pois reverte o efeito das auxinas.
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c) Potssio usado na forma de nitrato, fosfato ou cloreto. Ativador de vrias enzimas do metabolismo de carboidratos e protenas. Uma das mais importantes a quinase do piruvato, enzima envolvida nos processos de gliclise e respirao. necessrio para a embriognese somtica. Esta necessidade distinta daquela para o crescimento de clulas. Enquanto que 1mM suficiente para proliferao celular, uma concentrao de 20mM utilizada para a produo tima de embries somticos em cenoura, A deficincia no meio de cultura conduz, segundo alguns autores, a hiperhidricidade e decrscimo na taxa de absoro de fosfato.
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d) Enxofre incorporado ao meio, principalmente, na forma de sulfato, outra possibilidade na forma de aminocidos (cistina, cistena e metionina). Envolvido no metabolismo energrtico na formao do fosfosulfato de adenosina, constituinte da tiamina, biotina e coenzima A. Sua absoro relacionada assimilao do nitrognio e, independentemente do pH. e) Clcio adicionado, principalmente, na forma de cloreto ou nitrato. Possui papel importante no metabolismo da planta. Envolvido na diviso celular, uma vez que um dos componentes da lamela mdia o pectato de clcio, m a n t m " ^ integridade da membrana celular e importante para a germinao de gros de plen. um agente quimiotrfico para o direcionamento do tubo polnico. Altas concentraes de clcio (6 a 9 mM) so necessrias para controle da necrose do pice caulinar. f) Magnsio mais usado na forma de sulfato de magnsio. um dos componentes da clorofila; co-fator importante para vrias reaes enzimticas que atuam sobre substratos fosforilados. g) Hidrognio exerce papel importante no metabolismo da planta. Com exceo do C0 , todos os compostos orgnicos tm hidrognio. Na sua forma oxidada um prton.
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h) Carbono forma o esqueleto de todos os compostos orgnicos. i) Oxignio similar ao carbono, tambm um dos componentes de todos os compostos orgnicos do organismo vivo: carboidratos, lipdios, cidos nuclicos, produtos naturais. O papel do oxignio livre receptor de eltrons na respirao. j) Ferro adicionado na forma de Fe-EDTA. Envolvido nas reaes de oxireduo nos organismos vivos. H muitos matablitos contendo ferro. Essencial para a sntese da clorofila, integrante do grupo proteico (heme) das porfirinas. k) Boro usado na forma de cido brico. Envolvido no metabolismo de carboidratos e cidos nuclicos. Importante na germinao de gros de plen e crescimento do tubo polnico. I) Molibidnio adicionado na forma de molibidato de sdio (Na Mo0 ). Cofator da redutase do nitrato.
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m) Cobre usado como sulfato de cobre. Constituinte da enzima plastocianina que importante componente do transporte de eltrons. n) Cloro essencial para a fotossntese, sendo requerido durante a reao de Hill. o) Zinco usado como sulfato de zinco. Importante nas reaes de oxi-reduo das plantas. Co-fator de enzimas anidrase carbnica. p) Mangans adicionado como sulfato de mangans. Essencial para a reao de Hill na fotossntese, quando a molcula de gua quebrada produzindo eltrons e oxignio.
Meios de Cultura
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q) Cobalto usado como cloreto de cobalto e est envolvido na expanso foliar. 3.2.3. Nutrio orgnica Os compostos orgnicos importantes so os carboidratos, substncias reguladoras de crescimento, vitaminas, aminocidos e amidas, certas purinas e pirimidinas, hexitis e cidos orgnicos. a) Fonte de carbono e energia Ao se excisar parte da planta e cultiv-la in vitro, as clulas no so fotossinteticamente ativas e necessitam de carboidratos para crescimento e desenvolvimento. A escolha de determinado acar depende do processo em questo. Muitas vezes, acares que so inefetivos na manuteno do crescimento do calo, sustentam a iniciao de brotaes adventcias e a embriognese somtica. Os carboidratos mais usados so a sacarose, glicose e frutose nos nveis de 2_ a 5% (p/p). A concentrao de 3% a mais usada. Concentraes de sacarose entre ^_ 6 a 12% podem ser usadas em determinadas situaes, por exemplo, em cultura de embries, frutos e anteras, enquanto que o nvel de 1,5% usado em cultura de protoplastos.
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O acar pode caramelizar se o tempo de autoclavagem for excessivo, formando em sua degradao hidroxiacetonas, dihidroxiacetona, furano, 2metilfurano, 2,5-dimetilfurano e maltol. Estes compostos formam meladoidinas que so compostos de colorao amarronzada, de alto peso molecular, podendo inibir o crescimento celular. O acar purificado com acetato, para precipitar impurezas e pode conter alto nvel de zinco que txico para o tecido. Glicose e frutose devem ser esterilizadas a frio. b) Substncias reguladoras de crescimento
O controle qumico da diferenciao da parte area foi primeiramente observado em cultura de calo de Nicotiana. Foi observado, inibio na formao de gemas por auxinas, e reverso deste efeito estimulando brotaes utilizando-se adenina bem como o fosfato inorgnico. Esta foi a constatao de que o processo de organognese in vitro controlado por substncias hormonais sendo que o desenvolvimento de parte area, raiz ou calo determinado pelo balano entre auxinas e citocininas. Concentraes relativamente altas de auxina e baixas de citocinina favorecem o enraizamento e o balano inverso promove a formao de parte area. No entanto, concentraes iguais promovem a produo de calos. Por esta razo as auxinas e citocininas so componentes importantes no controle da morfogenese in vitro.
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As concentraes das auxinas nos meios variam de 0,01 a 10 mg/L. As auxinas mais usadas so AIA (cido indol-3-actico), AIB (cido indol-3-butrico), ANA, 2,4-D, 2,4,5-T, 4-CPA e picloran. A auxina 2,4-D bastante usada para a induo de calos in vitro e tem o efeito de supresso da morfogenese. O 4-CPA uma das auxinas menos txicas para o tecido e, talvez, a que tenha o efeito menos detrimental na morfogenese. A auxina 2,4,5-triclorofenoxiactico (2,4,5-T) e o picloran induzem a formao de calos em monocotiledneas. As auxinas so termo-estveis, no decompondo quando autoclavadas. O AIA a auxina natural e a menos estvel, sendo destrudo em pH baixo. As auxinas 2,4-D e ANA so sintticas e tm efeitos semelhantes s auxinas de ocorrncias naturais, sendo mais estveis degradao. As solues estoque de AIA no devem ser usadas aps uma semana de seu preparo, enquanto solues estoque de 2,4-D e ANA podem ser armazenadas at 12 meses sem ocorrer decomposio. A dissoluo das auxinas feita em NaOH 1N. Utiliza-se 0,3 mL desta base para dissolver 10 mg de auxina (3 gotas dessa base, em pipeta Pasteur). As citocininas so derivadas da adenina (aminopurina) e tm um papel fundamental na diferenciao e regenerao de plantas na maioria das espcies. Induzem a diviso celular, proliferao e morfogenese da parte area. As citocininas mais usadas em cultura de tecidos so a cinetina (CIN), benziladenina (BA), zeatina (Zea), isopentenil adenina (2ip) e thidiazuron (TDZ). As concentraes recomendadas destas substncias variam de 0,03 a 30 mg/L. Cinetina, zeatina e isopenteniladenina so considerados termo-estveis, uma vez que nenhum produto de sua decomposio foi observado aps sua autoclavagem a 120C, durante 1 hora. A benziladenina permanece estvel quando autoclavada a 110C, durante 20 minutos, mas a degradao fotoqumica pode ocorrer. A dissoluo das citocininas feita em HCI 1N, levemente aquecido. Utiliza-se 0,3 mL deste cido para dissolver 10 mg de citocinina. O cido gibelrico (GA3) usado, algumas vezes, em cultura de meristemas, na recuperao de plantas livres de vrus. O GA3 deve ser dissolvido em gua com pH ajustado a 5,7 ou em base (NaOH 1N). As solues de GA3 devem ser esterilizadas em filtro bacteriolgico uma vez que esta substncia se decompe por autoclavagem. As solues estoques devem ser preparadas na hora. O cido abscsico (ABA) um fitormnio envolvido no processo de dormncia e absciso de folhas e frutos. Na cultura de tecidos o papel deste composto ainda no est bem definido, embora tenha efeito na embriognese somtica. Embora este composto seja termo-estvel e fotossensvel, recomenda-se sua esterilizao a frio. O ABA dissolvido em gua ou base. Os hormnios e as substncias reguladoras de crescimento no devem ser dissolvidas em lcool, pois este produto tem efeito inibidor na morfogenese.
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A relao de hormnios e substncias reguladoras de crescimento mais comumente usados em cultura de tecidos so observados na Tabela 1. Tabela 1: Hormnios e reguladores de crescimento mais utilizados em cultura de tecidos. AUXINAS cido lndol-3-actico cido lndol-3-butrico cido naftalenoactico cido 2,4-diclorofenoxiactico cido 4-clorofenoxiactico cido 4-amino-3,5,6-tricloropicolnico cido2,4,5-triclorofenoxiactico cido-naftoxiactico CITOCININAS 6-Furfurilaminopurina ou Cinetina 6-Benzilaminopurina ou 6-benziladenina N -(4-hidroxi-3-metilbut-2enil) aminopurina ou zeatina
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ABREVIATURA AIA AIB ANA 2,4-D 4-CPA Picloram 2,4,5-T NOA CIN BA, BAP ZEA PBA 2ip TDZ GA
3
PESO MOLECULAR 175,2 203,23 186,2 221,04 184,5 241,46 255,49 202,21 215,2 225,2 219,2 300 203,3 220,2 346,4
(6-benzilamino)-9-(2-tetrahidrooiranil) purina N -3-dimetil-2-butilaminopurina ou Isopentenilladenina

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9H-
Thidiazuron (1-fenil-3-(1,2,3-thiadi-azol-5yl)) ureia GIBERELINAS cido giberlico OUTROS cido 2-(cloroetil) fosfnico ou Ethephon ou Ethrel cido abscsico c) Vitaminas
CEPA ABA
144,5 264,31
Vitaminas so compostos orgnicos que, em baixas concentraes, desempenham funes reguladoras catalticas no metabolismo celular. A maioria das plantas superiores so capazes de sintetizar a totalidade das vitaminas necessrias para seu crescimento normal, embora os animais no apresentem esta propriedade. A vitamina mais comumente usada em cultura de tecidos a tiamina (Bi). A tiamina solvel em gua. Outras vitaminas utilizadas incluem cido nicotnico (B ) e
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6
piridoxina (B ). Embora as vitaminas sejam adicionadas ao meio antes da autoclavagem, a esterilizao a frio recomendada para estudos especficos dessas substncias. O estudo dos efeitos das vitaminas em plantas dificultado uma vez que muitas destas so produzidas pelos vegetais. (Nos animais, basta eliminar a vitamina da dieta para observar seu efeito). ^ Vitamina A: ainda no foi ainda encontrada nas plantas. Tiamina (Vit. Bi): sua importncia no metabolismo celular devido funo como coenzima na descarboxilao dos cetocidos. Ex: Piruvato e cetoglutarato. Riboflavina (Vit. B ): Constituinte da coenzima FMN (Flavina mononucleotdeo) e o FAD (Flavina-adenina-dinucleotdeo) que atuam em oxidaes biolgicas. Na fotossntese FMN participa do transporte de eltrons.
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cido nicotnico (Niacina ou Vitamina B ): um componente das coenzimas NAD e NADP importantes na transferncia de hidrognio, Piridoxina, Piridoxal e Piridoxamina (complexo vit. B ): Fazem parte do piridoxalfosfato, coenzima importante no metabolismo de aminocidos. Estas vitaminas tm papel importante nas reaes de transaminao e descarboxilao.
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cido pantotnico: No encontrado na sua forma livre. um dos componentes da coenzima A e exerce papel importante no metabolismo de lipdios. Esta substncia deve ser dissolvida em hidrxido de clcio. Biotina: influncia no metabolismo do cido asprtico, especialmente, nas reaes do ciclo de Krebs que levam formao do cido. cido ascrbico (vitamina C): Catalisador de fosforilizao fotossinttica devido ao poder de oxidar e reduzir facilmente.
d) Aminocidos e amidas Os amonocidos e amidas tm importncia na amplificao das respostas morfogenticas, proporcionando maior crescimento e facilitando a diferenciao no sentido da regenerao. A necessidade de sua suplementao pode ser determinada pela incluso de uma protena hidrolisada ao meio. Qualquer efeito benfico pode ser avaliado pela substituio desta protena por uma mistura de aminocidos e amidas. As formas "L" dos aminocidos so de ocorrncia natural. ir* A L-trosina apresenta influencia na iniciao de parte area em cultura de calos, L-arginina no enraizamento e L-serina na obteno de embries haploides mediante o cultivo de micrsporo.
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As amidas L-glutamina e L-arpagarina so benficas na obteno de embries somticos, e a cistena includa, s vezes, como agente redutor. e) Outros suplementos orgnicos Hexitis: O mais usado o inositol, myo-inositol a forma inativa e i-inositol a ativa. O meso-inositol uma mistura das formas d e I. O inositol considerado estimulador de processos de crescimento in vitro e pode servir jsomo fonte de carboidrato. Desempenha papel importante na biossntese do ciclitol? rio armazenamento de compostos polihdricos como reserva, na germinao de sementes, no transporte de acar, na nutrio mineral, no metabolismo de carboidratos, na estrutura de membranas, formao de parede celular, homeostase de hormnios e no estresse fisiolgico. - Purinas e Pirimidinas: de. btotAel^
A adenina ou o sulfato de adenina estimulam o crescimento de brotaes in vitro. A concentrao mais usada varia de 40 a 160 mg/L. As bases nitrogenadas citosina e guanina podem tambm promover o crescimento de cultura de calo. C i T o S i N % PrM , r ) A ~ P f c f r > o U - cidos orgnicos: A adio de cidos de compostos intermedirios do ciclo de Krebs, tais como malato ou citrato, comum em meio destinado cultura de protoplasto. Estes compostos parecem estar envolvidos na minimizao do efeito inibitor da amnia. A concentrao de at 10 mM de sais de potssio recomendada. Ojicido ascrbico e o cido ctrico so usados para prevenir o escurecimento de tecidos excisados de plantas. As solues antioxidantes so preparadas usando uma mistura de 100 mg de cido ascrbico e 150 mg de cido ctrico, dissolvido em 1 litro de gua. Esta soluo no deve ser autoclavada e sua esterilizao feita em filtro bacteriolgico de 0,22 ou 0,45 micras. A incluso de 2000 mg/L de cido ascrbico estimula o crescimento de calo.! - Compostos fenlicos:
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Muitos derivados fenlicos (mono-OH) promovem o desenvolvimento da parte area enquanto que os derivados fenlicos (bi-OH) esto envolvidos com a iniciao de razes. Estas substncias atuam na degradao oxidativa do AIA. Por outro lado, compostos fenlicos (bi-OH) inibem a degradao oxidativa do AIA, tendo efeito benfico no enraizamento.
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- Extratos naturais: So preparaes obtidas de produtos naturais, de composio indefinida, que servem para enriquecer o meio de cultivo. So fontes de fatores, at ento desconhecidos, que estimulam o crescimento in vitro. A incluso destes extratos em meio de cultura s feita, em ltimo caso, quando as tentativas de adequao no forem suficientes para promover determinado processo morfogentico. Em trabalhos de rotina, estas preparaes podem ser usadas caso estimulem respostas desejadas.
Leite de coco: o endosperma de Cocus nucifera na fase gelatinosa. um
suplemento bastante usado. Recomenda-se que seja esterilizado a frio. ' Suco de laranja, tomate e outros: O suco de laranja contm cido ctrico e outras substncias de crescimento no identificadas. Pode-se usar suco de i laranja fresco ou congelado. Polpa de Banana: Tem sido usada na suplementao do meio de cultura de orqudeas. O seu efeito depende da cultivar e da quantidade, bem como, se originar de frutos verdes ou maduros. Extrato de leveduras: extrado com lcool, contendo em sua composio produtos solveis neste solvente. fonte de aminocidos e vitaminas. Protenas hidrolisadas: Tambm so fontes de aminocidos. Dentre estas, incluem: casena hidrolisada; lacto-albumina hidrolisada, triptona, peptona, etc. Protena de digesto enzimtica tais como a K-Z-amina Tipo A recomendada, em virtude dos aminocidos se manterem intactos. A hidrlise cida destri os aminocidos.
3.2.4. Materiais de suporte a) gar gar um polissacardeo obtido pela purificao de algas marinhas. O gar deve ser de boa qualidade, por exemplo, TC agar, ou Taiyo agar. A concentrao usada varia de 0,6% a 1% (de 6 a 10 g/L). O gar impuro constitudo de polissacardeos, aminocidos, sais, acar, etc, devendo ser lavado em gua destilada antes de ser usado. O gar alcalino, lquido temperatura de 80C e se solidifica 40C. Outros produtos gelificantes so Gelrite (Calbiochem) e Phytagel (Sigma). So mais puros que o gar e provenientes de fermentaes bacterianas. Usados na concentrao de 0,2% (2 g/L). Citam-se que estes produtos podem causar vitrificao em algumas espcies. Alguns laboratrios sugerem o uso de polvilho de mandioca ou de milho (maizena) como gelificantes.
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b) Carvo ativado um p bastante fino e de cor escura. utilizado para eliminar substncias txicas produzidas pelo explante in vitro. A concentrao em torno de 0,3%. usado quando ocorre o escurecimento do tecido in vitro, descolorao de meio de cultura, formao de calo na fase de enraizamento de propgulos, ou quando o crescimento do tecido inibido. O carvo adsorve produtos provenientes do metabolismo, bem como substncias hormonais e vitaminas. Sugere-se, em alguns a casos, aumento da concentrao de auxina, quando na presena de carvo ativado. , A pureza deste produto varivel. c) Outros produtos: Poliacrilamida, slica gel e papel de filtro. 3.2.5. Qualidades fsicas do meio de cultura As qualidades fsicas do meio de cultura, semelhana da composio qumica, podem desempenhar um papel importante no sucesso ou falha do estabelecimento da cultura in vitro. H espcies cujos explantes se desenvolvem melhor em meio lquido (gemas de bromeliceas, pices caulinares de batata e batata-doce); outras em meio slido (pices caulinares de alho, embries de tomate, diferenciao de brotaes em cotildones de alface e tomate) e, um terceiro grupo que responde melhor em meio lquido com suporte de papel de filtro (ovrios de tomate, morango e fumo). Na utilizao de meio slido, deve-se considerar a concentrao e pureza do agente gelificante. ^ 3.2.6. pH CN A to'uwc. ou a * H ^ > p ^ ^
A
^J^H^^^
c * ti ta* o
O crescimento do tecido in vitro melhor em torno de pH 5,0. Recomenda-se este valor para formulaes lquidas. Em meios gelificados com gar, o pH deve ser ajustado em 5,7, pois em pH 5,0, ocorre a hidrlise de polissacardeos, enquanto que em pH 6,0-6,2 verifica-se a precipitao de sais. No ajustamento de pH, lava-se primeiramente o eletrdo e, em seguida, faz-se a leitura em tampo 4,0. Posteriormente lava-se o eletrdo e desta maneira o potencimetro estar calibrado para uso. O pH varia durante o perodo de incubao. 3.2.7. Quantidade de meio Como regra geral, quanto menor o explante, menor a quantidade de meio a ser utilizado. Para pices caulinares de batata e batata-doce, 4 mL de meio lquido so suficientes para a diferenciao e crescimento inicial, entretanto, em culturas estabelecidas, a taxa de crescimento diretamente proporcional quantidade de meio.
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3.2.8. Condies de incubao Devem ser considerados principalmente as exigncias de luminosidade, temperatura, trocas gasosas e acmulo de produtos txicos no meio. 3.2.8.1. Luminosidade No acorre diferenciao de parte area em culturas mantidas no escuro. As caractersticas intensidade luminosa, perodo de exposio e qualidade da luz, so fundamentais. a) Intensidade Luminosa A fase inicial Ide desenvolvimento do explante in vitro (estgio I) requer baixa intensidade luminosa (at 1000 lux). Na fase de multiplicao de parte area (estgio II) as exigncias so de 1000 a 3000 lux, e no estgio III (pr-transplante, aclimatizao), recomenda-se de 3000 a 10.000 lux, Nesta fase o propgulo se prepara para a fotossntese. b) Qualidade da luz A qualidade do espectro da lmpada utilizada de suma importncia na iniciao de parte area e raiz em cultura in vitro. As lmpadas recomendadas so fluorescentes brancas fria, Gro-lux ou outros tipos de lmpadas com emisso nas regies do vermelho (430 nm) e azul (660 nm). Estas regies do espectro influenciam os processos morfogenticos. As lmpadas incandescentes no so recomendadas, pois emitem faixas do vermelho e vermelho distante e, este ltimo no adequado. A regio do azul critica para induo de parte area e a iniciao de razes adventcias estimulada por luz vermelha. Em Heliantus tuberosus, a iniciao de razes adventcias em sees de tubrculos, efetiva quando as culturas foram expostas a luz emitida prximo a 600 nm. A luz vermelha tambm pode inibir a iniciao de razes laterais, enquanto que a infra-vermelha pode reverter este efeito. A diferenciao de razes laterais e adventcias parecem ter exigncias diferentes. Assim, em cultura de tecidos, quando se objetiva a multiplicao de plantas, as lmpadas devem conter emisses adequadas nas regies do luz azul e vermelho, pois ambas esto envolvidas na iniciao de parte area e raiz. Muitas das lmpadas disponveis foram desenhadas para serem utilizadas em casa de vegetao, onde a fotossntese importante, mas em cultura de tecidos a fotossntese no to limitante. As lmpadas fluorescentes devem ser trocadas a cada seis meses.
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c) Perodo de exposio diria luz - Fotoperodo As exigncias em fotoperodo devem ser satisfeitas. O incio de determinado processo morfogentico s se manifesta quando as culturas esto expostas adequado comprimento do dia. Em geral, 16 horas de iluminao e 1000 lux de intensidade luminosa, tm se mostrado satisfatrio para determinadas espcies, utilizando lmpadas fluorescentes branco fria ou Gro-lux. A manuteno das culturas sob iluminao constante no recomendada. d) Quantidade total de energia Deve considerar a intensidade luminosa e o nmero de horas de exposio por dia. Podemos citar que, em fumo no h exigncias de fotoperodo, mas, mxima formao de parte area ocorre com 16 horas de fotoperodo e, 1000 lux de intensidade luminosa (50-60 umol.m" .s" ).
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3.2.8.2. Temperatura Devem ser considerados os aspectos de flutuao diurna. As plantas em seu habitat natural no desenvolvem sob temperatura constante. Em cultura de tecidos o uso de temperatura constante deve-se a manuteno se diferentes espcies cultivadas numa mesma cmara de crescimento. Entretanto, alguns processos morfolgicos exigem flutuaes diurnas de temperaturas. o caso de cultura de ovrio de tomate, onde o nmero mximo de sementes formadas in vitro, ocorre em culturas submetidas a um regime diurno/noturno de 22/17C. Menor nmero de sementes foi observado em cultura mantida sob temperatura constante de 27C. As exigncias de temperatura para o desenvolvimento da planta em condies naturais devem ser consideradas como ponto de partida para estabelecer cultivo in vitro da espcie em questo. Espcies oriundas de habitat tropical, temperado e desrtico tm diferentes temperaturas timas para o crescimento e desenvolvimento. Outro aspecto importante que, algumas vezes, obtm-se um bom desenvolvimento de plantas in vitro, mas quando transplantadas para o solo morrem porque esto dormentes, ou seja, ser necessrio uma boa aclimatizao para que sejam quebradas as dormncias antes de serem transplantas ao solo. 3.2.8.3. Umidade relativa Em condies de clima seco pode ser pode usar tampas algodo, pois estas permitem boa troca gasosa, entretanto, o meio pode secar mais rpido em condies de baixa umidade relativa. Quando em clima mido cuidados devem ser tomados com relao as contaminaes. As tampas de algodo podem ser usadas com cautela, e o uso de um desumidificador na cmara de crescimento recomendado.
34 3.2.8.4. Trocas gasosas
As plantas produzem oxignio, gs carbnico, etileno, aldedo e outros volteis. Na natureza estes compostos so dissipados na atmosfera. O etileno acelera a senescncia, absciso foliar e amadurecimento. lcool em alta concentrao induz a formao de calos. A cultura de tecidos um sistema fechado. A acumulao de C 0 em altas concentraes conduz anaerobiose, fermentao e produo de lcoois. Em alguns casos, altas concentraes de gs carbnico induzem distrbios no crescimento e desenvolvimento da planta in vitro. Deve-se observar a sensibilidade da planta a volteis. A maneira de fechar o frasco bastante importante.
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Em cultura de tecidos de Solanum tuberosum, nunca se deve vedar os frascos com parafilm, devido ao acmulo de altas concentraes de C 0 e etileno, fazendo com que os propgulos apresentem anomalias caracterizadas pelo entumescimento do caule, folhas ausentes ou pequenas, iniciao de razes adventcias em vrios pontos do caule, e o efeito indireto da necrose do pice caulinar (deficincia nas trocas gasosas reduz a transpirao e a translocao do clcio dificultada). Em laboratrios comerciais de produo de batata-semente livre de viroses no recomendado o vedamento das culturas.
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Em locais onde h muita poluio ambiental recomenda-se o uso de filtro de carvo ativado. 3.2.9. Esterilizao do meio de cultura O tempo mnimo recomendado para esterilizao de meio para cultura de tecidos de plantas apresentado na Tabela 2. Tabela 2: Perodo mnimo recomendado para esterilizao de meio para cultura de tecidos de plantas. (Extrado do Catlogo da Sigma, 1990). Volume do meio por recipiente (mL) 25 50 100 250 500 1000 2000 4000 121C e 1,05kg/cm/cm = 105kPa.
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Tempo mnimo de autoclavagem (minuto) 20 25 28 31 35 40 48 63
Os desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas esto apresentados na Tabela 3.
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Tabela 3: Desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas. (Extrado do Catlogo da Sigma, 1990). Desinfestante Hipoclorito de Clcio Hipoclorito de Sdio gua Oxigenada lcool etlico Nitrato de prata Cloreto de mercrio o5 Concentrao (%) 9-10 0,5-5,0 3-12 70-95 1 0,1 - 1,0 ieto:S OC Tempo de exposio (minuto) 5-30 5-30 5-15 5-15 5-30 2-10 co-ô?..*
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TCNICAS DE ESTABELECIMENTO
IN VITRO
Jos Raniere Ferreira de Santana Renato Paiva Edson Jos Artiaga de Santiago Patrcia Duarte de Oliveira Paiva Luciano Vilela Paiva
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4.1. INTRODUO Vrias tcnicas tem sido utilizadas no estabelecimento in vitro de tecidos vegetais. Dentre estas destacam-se a calognese, suspenso celular, cultura de anteras, meristemas e de embries. A escolha do tipo de tcnica a ser empregada varia com a espcie estudada e com o tecido utilizado como explante.
Calos so tecidos que se desenvolvem em resposta a injrias fsicas ou qumicas. As clulas tem certo grau de diferenciao e so desorganizadas podendo apresentar algumas reas com tecido organizado. Apresentam tecido indiferenciado mas as clulas esto diferenciadas. A cultura de calos pode ser iniciada in vitro colocando uma pequena parte de uma planta (explante) no meio de cultura, em condies asspticas. Sob o estmulo de substncias de crescimento endgenas ou de reguladores de crescimento adicionado no meio, o metabolismo celular, que se encontra no estdio quiescente, Professor Assistente, MS, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras (UFLA) Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA Professor Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA Professor Adjunto, Dr, Departamento de Qumica, UFLA.
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Tcnicas de Estabelecimento In Vitro
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modificado iniciando-se uma diviso ativa. Durante o processo, a diferenciao e a especializao celular so revertidas e o explante origina um novo tecido que composto de clulas meristemticas e no especializadas (Figura 13).
Suspenso celular
A suspenso decantada ou filtrada
Figura 13: Etapas da iniciao de culturas de calo e suspenso celular (Modificado de George, 1993).
Durante-a diferenciao, novos meristemas so formados no tecido e esses originam clulas parenquimosas no diferenciadas, sem nenhuma estrutura organizada, caracterstica do rgo ou tecido do qual elas foram derivadas. Embora o calo permanece no organizado, o crescimento continua e, algumas tipos de clulas especializadas podem ser formadas. Tal diferenciao pode ocorrer em locais aleatrios ou associados a centros de morfogenese que originam rgos como razes, brotaes e embries. A produo de novas plantas de culturas no organizadas frequentemente referida como regenerao.
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4.2.1. Aplicao da cultura de calos A cultura de calos tem vrias aplicaes como permitir o estudo do desenvolvimento celular, explorao de produtos secundrios (metablitos de plantas medicinais), obteno de suspenses celulares (evitando o extrativismo da planta), propagao de espcies onde a via direta difcil sendo neste caso, recomendada a sua utilizao mesmo existindo risco de variao somaclonal. A cultura de calos permite tambm estudar a citodiferenciao e a morfogenese, alm da induo de mutao atravs de tcnicas qumicas ou radiao. 4.2.2. Tcnicas para estabelecimento de calos a) Induo Nesta fase, a seleo do explante bem como meio adequado e condies ambientais favorveis (baixa luminosidade, temperatura normal) so decisivas para a induo. Tem-se nesta etapa um metabolismo ativo com clulas de tamanho constante e ocorrendo sntese de protenas e DNA e a preparao da clula para diviso. b) Diviso Celular As clulas revertem para um estdio meristemtico (desdiferenciao). uma fase de sntese onde ocorre decrscimo do tamanho da clula. c) Diferenciao Nesta fase h a expresso de certas rotas metablicas. O explante utilizado pode no requer regulador de crescimento, pode requer somente auxina ou citocinina ou ambos. 4.2.3. Tipos de calos Os tipos de calos usados variam de acordo com o objetivo do trabalho. Calos 'firmes' por serem altamente lignificados e de textura dura, so indicados para organognese. Por outro lado, calos 'friveis' (mole), que so frgeis e separam-se facilmente, constituem o tipo mais utilizado em suspenso celular. A colorao dos calos tambm varivel podendo ser amarelo, verde, branco, etc. 4.2.4. Tamanho, tempo de repicagem e manuteno de calos na subcultura O tamanho dos calos deve ser suficiente para assegurar o crescimento. O inCUO deve possuir de 5 a 10 mm de dimetro ou 20 a 100 mg. O tamanho fundamental para que acontea o efeito comunidade, onde uma clula dependente da outra para se multiplicar.
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Aps um certo tempo de cultivo, os calos envelhecem e devem portanto serem repicados, ou seja, divididos (quando o tamanho permitir) e transferidos para outro meio. O tempo de repicagem varivel e dependente da taxa de crescimento. Em muitas espcies pode ser realizada em intervalos de 28 dias de cultivo. Na manuteno do calos, o mais comum usar o mesmo meio de cultura bsico da induo. Algumas caractersticas bsicas do calo com sinal de 'velhice': desacelerao do crescimento (pode ser avaliado pesando-se os calos de 3 em 3 dias, construindo-se uma curva de crescimento); necrose do tecido; escurecimento do tecido; secamento, que pode ser devido a exausto de nutrientes, inibio do crescimento, etc.
4.3. SUSPENSO CELULAR Consiste de clulas ou agregados de clulas dispersas crescendo em meio lquido em movimentao (agitao). O incio da suspenso celular a utilizao de calos friveis em agitao. O incuo na faixa de 2 g / 25 ml constitui uma quantidade suficiente para um bom efeito de comunidade. As suspenses celulares so obtidas transferindo-se calos friveis para meio lquido sob agitao. Em geral, a composio do meio de cultura para a obteno de suspenses celulares igual do meio utilizado para o cultivo de calo. O conhecimento das fases de crescimento de uma suspenso celular dentro de cada subcultivo bastante importante, uma vez que o potencial embriognico das clulas em suspenso pode ser mantido atravs da utilizao de subcultivos nas fases de crescimento logartmica das clulas. 4.3.1. Aplicaes da suspenso celular: usada para obteno de sementes sintticas (embriognese somtica), isolamento de protoplastos, isolamento de mutantes, obteno de resistentes a certos elementos (Alumnio, toxinas, herbicidas, sal), produo de metablitos secundrios e nos processos de transformao de plantas. 4.3.2. Mtodos mais utilizados para medir o crescimento celular: Para quantificar o crescimento de clulas em suspenso, so utilizados principalmente os mtodos baseados no nmero de clulas, peso de matria seca, peso de matria fresca, volume de clulas e protena total da clula. Um calos tpico iniciado de um explante passa por trs estgios desenvolvimento, que compreende a induo da diviso celular, um perodo diviso celular ativa durante o qual as clulas diferenciadas perdem caractersticas especializadas para tornarem-se desdiferenciada e um perodo de de as no
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qual a diviso celular reduzida ou mesmo cessa, iniciando ento a especializao celular. Esses estdios podem ser acompanhadas numa curva de crescimento caracterizadas por seis fases (Figura 14). Fase lag: caracterizada por no ter ganho em nmero de clulas, pelo inicio da mobilizao de metablitos sem ocorrer qualquer diviso celular, pela sntese de protenas e sntese de metablitos especficos. A ateno deve ser dada densidade do incuo que afeta o comprimento da fase lag. Quanto menor o peso do calos utilizado, maior a fase lag. Fase exponencial: caracterizada por diviso celular intensa, aumento no nmero de clulas, porm clulas de tamanho pequeno com formao de agregados de clulas. Fase linear, a fase exponecial seguida pela fase linear. O crescimento celular ativo e as clulas adquirem competncia para proceder a repicagem. Fase de desacelerao: ocorre uma reduo na diviso celular. no final dessa fase que se deve iniciar o processo de repicagem. Fase estacionria: a repicagem deve ser terminada ainda no incio dessa fase quando no h diviso celular. As culturas no podem ser mantidas nessa fase por um perodo longo. Fase de declnio: as clulas comeam a morrer, culminando com a lise celular.
clulas
F a s e de desacelerao do crescimento Fase de crescimento exponencial Fase lag Fase de crescimento linear
Fase estacionria
Fase de declnio
Incuo inicial
Tempo -+ Figura 14: Curva de crescimento de uma suspenso celular.
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4.3.3. Importncia da curva de crescimento A curva de crescimento de calos calculada com o objetivo de se obter a poca de repicagem (subcultura), para determinar onde h a maior produo de metablitos (quando o estudo objetiva o metabolismo secundrio). Esta fase de desacelerao, pois os metablitos secundrios no constituem prioridade no metabolismo celular. 4.4. CULTURA DE ANTERAS A cultura de anteras uma tcnica para a obteno de plantas haploides a partir de plantas normalmente diplides. A descoberta que o gro de plen poderia desenvolver embries foi feita por acaso na dcada de 60. Atualmente, muitas plantas so produzidas a partir do gro de plen imaturo ou calo que desenvolve a partir do micrsporo (Figura 15).
Figura 15: Cultura de anteras de Nicotiana tabacum. A flor excisada quando as ptalas esto emergindo do boto [superiora esquerda). A antera imatura removida assepticamente e inoculada em um meio padro sem reguladores. Embries somticos desenvolvem do calo derivado do micsporo haplide. Os embries haploides (1n) para formar plntula (extrado de Hartmann et a/., 1997).
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A cultura de anteras tem grande potencial para o melhoramento de plantas e usada para a obteno de plantas haploides. A palavra haplide refere-se a plantas que possuem o nmero gametoftico de cromossomos em seus esporfitos, ou seja, so originrias de um esporfito e contm metade do nmero de cromossomos da espcie. Plantas haploides podem ser obtidas in vivo atravs de polinizao com plen irradiado, polinizao com plen abortivo (estril), tratamento do plen com choques trmicos, hibridao distante. In vitro pode ser obtido pelo desenvolvimento da oosfera no fertilizada, pela cultura de anteras e ou gros de plen (diretamente por embriognese e indiretamente via formao de calos). As fontes de explantes usadas so anteras imaturas, que fornecem plen uninucleado (por ocasio da primeira mitose) se constituindo no material mais promissor para induo de andrognese e botes florais fechados. 4.4.1. Protocolo para a obteno de haploides O protocolo para cultura de anteras pode ser descrito resumidamente como segue: a) os botes florais fechados so desinfestados; b) faz-se uma inciso de um dos lados do boto floral e estames so delicadamente removidos. O filamento do estame removido (com bastante cuidado para no danificar as anteras) e c) as anteras so inoculadas em meio de cultura. 4.4.2. Fatores que influenciam a andrognese 1) Gentipo da planta doadora: tem sido observado que gneros, espcies e cultivares apresentam diferentes respostas na cultura de anteras. 2) Condies fisiolgicas e idade da planta: flores das plantas relativamente novas, no incio da florao so mais adequadas do que botes florais de plantas velhas e em final de seu perodo de crescimento. 3) Estdio de desenvolvimento do plen: o micrsporo no estgio uninucleado o mais adequado (antes ou logo aps a primeira antese). Existe correlao entre o tamanho do boto floral e o estdio do desenvolvimento do plen (importante ao se considerar a plidia do embrio produzido). O estgio do desenvolvimento do plen na antera pode ser determinado pelo corante acetocarmicma ou reagente de Schiff. 4) Pre-tratamento dos botes ou anteras: a) Tratamento trmico: deve ser feito em baixa temperatura (3 a 5 C). Assim se retm a viabilidade do plen por mais tempo, retardando a senecncia, sincronizando as clulas e previnindo o aborto do plen.
o
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b) Tratamento qumico: aplicaes de qumicos como o etrel (paclobutrazol), hidrazida maleica, carvo ativado, podem induzir as anteras a formar em embries. c) Tratamento fsico: radiaes ionizantes, presses atmosfricas reduzidas (uso de dissecador); centrifugao. 5) Composio do meio de cultura: os meios mais utilizados so o MS, White, Nitsch. A sacarose a fonte de carbono mais efetiva de carboidratos e sua concentrao varia com as espcies. A necessidade de reguladores de crescimento, tambm varivel. Suplementos orgnicos como casena hidrolizada, gua de coco, extrato de leveduras, aminocidos, cido ascrbico tem sido utilizados com sucesso. 4.4.3. Identificao de haploides A identificao de haplides pode ser feita com genes marcadores, que produzem cor, cuja manifestao possa ser mostrada na semente ou plntulas. Marcadores morfolgicos e por contagem de cromossomos, atravs de tcnicas citolgicas. 4.4.4. Problemas Alguns problemas relacionados cultura de anteras podem ocorrer quando so usadas tcnicas inadequadas para se produzir plantas dipides a partir de haploides regenerados de cultura de anteras; uso de tcnicas inadequadas de regenerao; ocorrncia de elevada taxa de mutao (anormalidades); desdiferenciao de calo a partir de clulas dos tecidos somticos da antera e; alta incidncia de plantas albinas (principalmente em gramneas). 4.4.5. Utilizao de plantas haplides A tcnica da andrognese permite: a) Obteno de homozigose. Em programas de melhoramento, onde necessrio a obteno de linhagens, a homozigose destas pelos processos tradicionais s ocorre aps 6 a 8 geraes de autofecundao ou retrocruzamento. Atravs da cultura de anteras, plantas haploides so obtidas imediatamente, pois uma vez duplicado seu nmero de cromossomo, originam plantas diplides que apresentam homozigose em 100% dos loci, reduzindo o tempo. b) Produo de supermachos. Tomando-se com exemplo o aspargo, que diica, as plantas masculinas so mais produtivas. H interesse na determinao de um mtodo que produza por sementes todas as plantas hbridas F^ heterticas masculinas. A partir de plantas femininas ( XX - homogamticas) e plantas masculinas (XY heterogamticas), por cultura de anteras, pode-se obter plantas haploides tanto X
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como Y, pela duplicao: XX (plantas femininas) e YY (supermachos). Usando estes supermachos na produo de hbridos, toda a prognie de plantas ser masculina (XY) e portanto, mais produtiva e menos fibrosa. A obteno de haploides in vitro pela cultura de anteras j uma realidade em solanaceaes, gramneas e crucferas. 4.5. CULTURA DE ESTRUTURAS ORGANIZADAS O termo cultura de rgos usado para todas os tipos de cultura nos quais uma forma organizada de crescimento pode ser continuamente mantida. Inclui o isolamento assptico de estruturas definidas como primrdio foliar, flores imaturas e frutos, e seu crescimento in vitro. Para a propagao vegetal, os mais importantes tipos de culturas de rgos so:
a) Cultura de meristema
Consiste no estabelecimento do domo meristemtico apical sem os primrdios foliares. A brotao apical tipicamente cresce, originando um nico broto.
b) Cultura de pices caulinares
o estabelecimento in vitro a partir de brotaes apicais maiores do que aquelas utilizadas para iniciar a cultura de meristema, tendo alguns primrdios foliares. Essas brotaes apicais podem produzir mltiplas brotaes.
c) Cultura de segmentos nodais
Os segmentos nodais so constitudos de gemas laterais isoladas, segmentos de caule com uma ou mltiplas gemas. Cada gema desenvolve para formar uma nica brotao.
d) Cultura de embries
iniciada a partir de embries zigticos extrados de sementes. Os embries germinam originando brotos. A cultura de* meristema e a cultura de embries so descritos com mais detalhes a seguir. 4.5.1. Cultura de Meristemas U'lffTRt, cultura de meristema refere-se ao crescimento da brotao, excluindo as folhas primordiais.. do domo apical
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O meristema no apresenta fololos (Figura 16) sendo constitudo por duas regies diferentes, tnica e corpus. A tnica constituda de uma a trs camadas de clulas, a mais interna forma a epiderme e as outras duas restantes do origem a folha ou somente a epiderme foliar. O corpus a camada mais interna, responsvel pela formao do restante da planta. O plano de diviso da tnica anticlinal e do corpus periclinal. 4.5.1.1. Aplicaes da cultura de meristema A cultura de meristemas utilizada para estudos do efeito de fitorreguladores na iniciao foliar e no estudo do florescimento, na propagao vegetativa para obteno de plantas livres de patognos e, na multiplicao clonal rpida. Os meristemas so amplamente ultilizados na limpeza pois estes materiais so livres de vrus. Isto explicado pelos seguintes fatos: a) Crescimento contnuo do tecido. A diviso celular intensa, o que aumenta a competio por metablitos e desta forma o vrus no tem energia suficiente para sua multiplicao. b) Ausncia do tecido vascular (floema e xilema) no meristema. muito difcil a passagem do vrus clula a clula (o DNA do vrus maior que o plasmadesmata). Vrios fatores so determinantes para se obter sucesso na limpeza. Dentre estes, pode-se detacar: Tamanho ideal do meristema: de 0,1 a 1 mm. Menor tamanho implica num maior sucesso na limpeza, mais a sobrevivncia menor; Localizao do explante. explantes retirados da ponta do broto esto em um estdio mais jovem de desenvolvimento do que explantes da base; poca de colheita: os explantes devem ser de fase de crescimento ativo.
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Figura 16: Localizao de explantes no pice caulinar (modificado de George, 1993). 4.5.2. Cultura de Embries A cultura de embries pode ser definida como o isolamento estril e crescimento de um embrio imaturo ou maturo in vitro, com o objetivo de se obter uma planta vivel. Embries zigticos ou de sementes so frequentemente usados vantajosamente como explantes em cultura de tecidos, por exemplo, para iniciar a cultura de calo. Em cultura de embries, entretanto, os embries so retirados das sementes e so individualmente isolados e "germinados" in vitro desenvolvendo uma planta por explante. A cultura de embries isolados pode ajudar na produo rpida de plntulas de sementes que apresentam dormncia embrionria ou embrio imaturo. 4.5.2.1. Tipos de cultura de embries:
a) Cultura de.embrio imaturo
Originado de sementes imaturas, usado para evitar o abortamento natural. E mais difcil, devido a exciso e meio de cultura mais complexo.
b) Cultura de embries maturos
Originado de sementes maturas, usado para evitar a inibio de germinao de semente.
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4.5.2.2. Estdios de desenvolvimento do embrio Quanto mais imaturo for o embrio maior ser o requerimento nutricional. No estdio globular h requerimento de meios mais complexo (fitormnios, altas concentraes de acares, gua de coco, etc). Antes do formato de corao, os embries so bastante heterogneos, no sintetizando fitormnio ou mobilizando compostos de carbono. No estdios heterotrficos, os embries requerem sais, acares, vitaminas, nitrognio, citocininas, auxinas, gua de coco (algumas substncias podem ser opcionais). Quando aumentam de tamanho, tornam-se autotrficos e neste estdio requerem um meio mais simples. Os embries geralmente requerem alta taxa de acar (fonte de carbono e agente osmtico), pois tm um potencial hdrico muito negativo (contedo alto de slidos). Uma alternativa para resolver a dificuldade imposta pelo potencial hdrico do embrio fixar a sacarose e elevar o teor de de manitol (agente osmtico). 4.5.2.3. Fatores que afetam o sucesso da cultura de embrio 1) Gentipo: em algumas espcies o embrio cresce facilmente enquanto que em outras muito difcil (h tambm diferenas entre cultivares de uma espcie). 2) Estdio de desenvolvimento do embrio no isolamento: muito difcil desenvolver embrio muito pequeno in vitro. 3) Condio de crescimento da planta-me. crescer a planta-me em condies controladas resulta em um melhor desenvolvimento do endosperma, portanto melhora o crescimento do embrio isolado. 4) Composio do meio: embries imaturos requerem uma composio mais crtica do que embries maturos. Em ambos (maturo e imaturo) os macro e microelementos so importantes. Os meios usados so slidos: MS, White e B , em uma faixa de pH entre 5 a 6. Carboidratos (sacarose, usada na concentrao de 2-3% e 8-12% para embries maturos e imaturos, respectivamente) so fontes de energia e tambm agem abaixando o potencial osmtico, especialmente em embrio jovens.
5
O gar usado em concentraes entre 0,6 a 0,8% (valores abaixo resultam em inibio de crescimento). Os reguladores de crescimento auxinas e citocininas geralmente no so usados. As vezes se utiliza giberelina. Substncias de contribuio complexa como a gua de coco so bastante utilizadas, especialmente para embries imaturos. 5) Luz: fator pouco estudado. Algumas vezes mantm-se o embrio isolado no escuro por 7 a 14 dias.
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6) Temperatura: a temperatura tima dependente da espcie, variando, geralmente entre 22 e 28C). 4.5.2.4. Aplicaes prticas da cultura de embries
a) Eliminao da inibio (dormncia) da germinao de
semente
Em algumas espcies absolutamente impossvel obter a germinao in vivo devido a caractersticas genticas ou fisiolgicas.
b) Recuperao de hbridos de cruzamentos incompatveis
No melhoramento, cruzamentos interespecficos e intergenricos para transferir genes de interesse da espcie selvagem para a cultivada (aumenta a variabilidade gentica) podem produzir embries abortivos devido a incompatibilidade. Isto ocorre tambm em cruzamentos onde existam barreiras pr ou pszigticas (sementes murchas e embries abortivos). Os embries hbridos so salvos e removidos antes que ocorra o aborto e, posteriormente cultivados in vitro.
c) Superao da dormncia das sementes
Em algumas sementes ocorrem inibidores qumicos endgenos ou h requerimentos especficos de luz e temperatura ou ainda a resistncia fsica presente nas estruturas que recobrem o embrio. A cultura de embries uma alternativa para superar estes problemas.
d) Superao da esterilidade das sementes.
As causas de ocorrncia de sementes estreis em algumas espcies podem ser o desenvolvimento incompleto do embrio, mutaes das estruturas que cobrem o embrio ou algum tipo de dormncia recalcitrante para a qual nenhum mtodo tem sido desenvolvido.
e) Germinao de sementes de parasitas obrigatrios.
N'
Sem o hospedeiro, impossvel a ocorrncia in vivo. Assim tambm a retirada dos embries e cultivo in vitro pode suprir esta necessidade, permitindo o desenvolvimento de plantas. f) PVIO 00 mbrO abortivo que ocorre com o amadurecimento
de frutos carnosos
precoce
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Em cruzamento dos frutos (pssego, ameixa, cereja) o transporte de gua e nutrientes para o embrio imaturo algumas vezes cortado muito cedo, ocorrendo o aborto.
g) Propagao vegetativa
Devido a sua natureza juvenil com alto potencial regenerativo, embries so excelentes explantes para propagao clonal in vitro. Especialmente para conferas e gramneas.
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MULTIPLICAO
Edson Jos Artiaga de Santiago Renato Paiva Patrcia Duarte de Oliveira Paiva Cntia Guimares dos Santos Guilherme Augusto Canela Gomes
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5.1. INTRODUO Nos ltimos anos, a cultura de tecido tornou-se importante tcnica na tentativa de estabelecimento de metodologias de propagao de vrias espcies. Por ser uma tcnica que possibilita resultados bastante prticos, a cultura de tecido ainda necessita de informaes bsicas para seu perfeito entendimento. Os mtodos mais econmicos e disponveis para propagao de plantas de uma determinada espcie podem mudar com o tempo. Maiores avanos podem vir de um melhor conhecimento dos fatores que controlam a morfogenese e a estabilidade gentica in vitro. Os laboratrios de micropropagao comercial utilizam quatro mtodos bsicos para multiplicar plantas in vitro: aumento de brotaes axilares; segmentos nodais; brotaes adventcias e embriognese somtica. A reduo nos custos de produo e a identificao de produtos, os quais so diferenciados pelo seu valor econmico, so estgios crticos para que a micropropagao possa ser expandida comercialmente. A totipotncia celular (capacidade da clula em formar um indivduo idntico ao indivduo de onde esta foi extrada), associada aos efeitos do balano hormonal, tem tornado possvel o estudo da morfogenese in vitro e sua aplicao mais prtica, a Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA - PfdfSf Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras (UFLA) Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA Mestre em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, UFLA Doutorando em Fitotecnia, Departamento de Agricultura, UFLA
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Multiplicao
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micropropagao, tcnica amplamente utilizada para a propagao de frutferas de clima temperado. A micropropagao o desenvolvimento de novas plantas em um meio artificial sob condies asspticas, a partir de pequenos propgulos (explantes). Para as espcies lenhosas, as partes mais empregadas so pices caulinares, microestacas, embries, calos celulares, entre outras. A cultura de tecidos difere dos mtodos tradicionais, principalmente nas condies sob as quais a propagao efetuada, mas no difere destes quanto a seus princpios. As diferenas bvias referem-se ao fato de a micropropagao empregar propgulos pequenos, controle assptico, controle do meio ambiente e rpida multiplicao, quando comparada com os mtodos tradicionais.
5.2. FASES DA MICROPROPAGAO 5.2.1. Fase preparativa (Estdio 0) Esta fase compreende o cultivo das matrizes em condies especial de higiene. Isto redundar posteriormente em obteno de propgulos com menor incidncia de fungos e bactrias. As plantas matrizes devem estar crescendo em vasos ou outros recipientes, em casa de vegetao com cobertura de vidro ou plstico. Ser til qualquer dispositivo que fornecer gua para as plantas diretamente no vaso ou por capilaridade, como, por exemplo, irrigao por gotejamento. A durao mnima do regime de gua deve ser testada para cada espcie. O impacto deste estdio inicial aparentemente no limita somente a condio sanitria da planta, mas tambm a percentagem de sobrevivncia na fase seguinte. Assim, empregando-se esta fase, pode-se desinfestar o material sem a retirada das folhas que contero um menor nmero de inculos, o que, consequentemente, redundar em uma maior sobrevivncia. Alguns parmetros afetam sensivelmente a planta matriz de onde ser coletado o propgulo. Entre eles, podem ser citados:
a) Luz
Os segmentos foliares provenientes de plantas estoques (matrizes) tratadas com luz vermelha produzem mais brotaes por explante do que plantas notratadas. b) Temperatura plantas" lgflhOa podem Ser induzidas a surtos de novos crescimenus quando colocadas em temperaturas de 4 a 5C por um perodo de tempo equivalente quele necessrio para a quebra natural de dormncia.
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A reatividade do explante logo aps o estgio 0, ou seja, no estgio 1, pode ser controlada por um tratamento apropriado com reguladores de crescimento da planta estoque, das fontes de explantes ou do prprio explante. Manipulaes podem mudar a fisiologia das estacas de rvores velhas, de tal forma que elas se tomam propcias para uma propagao clonal comercial. 5.2.2. Incio do cultivo (Estgio 1) Nesta fase, deve-se prestar a ateno no seguintes fatores:
a) Tipo de explante
A escolha do explante recai, geralmente, nas gemas apicais ou axilares. O estgio de desenvolvimento do explante de suma importncia. A idade da planta matriz, a idade fisiolgica do explante e seu estgio de desenvolvimento, assim como seu tamanho pode determinar o sucesso deste procedimento.
b) Reaes de hipersensibilidade
Quando os tecidos so expostos a condies de estresse, tais como dano mecnico, que ocorre ao se isolar o explante da planta estoque, o metabolismo de compostos fenlicos estimulado. Isto leva a reaes de hipersensibilidade, tais como a liberao do contedo nas clulas danificadas, as reaes nas clulas vizinhas, mas, sem mostrar sintomas de danos, e/ou a morte prematura de clulas especficas no lugar do ferimento ou o lugar de infeco. De um modo geral, existem trs tipos possveis de resposta ao estresse ou dano mecnico: 1) oxidao de compostos fenlicos pr-formados, ocorrendo a formao de quinonas e material polimerizado; 2) sntese de monofenis e; 3) sntese de derivados de polifenis. A sntese de monofenis pode levar ao acmulo de maiores quantidades de produtos pr-formados nos tecidos no danificados ou ao aparecimento de novos produtos que desempenham um papel no mecanismo de proteo do tecido contra a contaminao (fitoalexinas). O papel destes produtos j mencionados pode ser o de formar uma barreira fsica contra a invaso (lignina), ou um inibidor de crescimento microbiano (quinonas, fitoalexinas). Um grupo especial de compostos fenlicos so as auxinas protetoras (antioxidantes que inibem a oxidao do AIA catalizado pelas peroxidases). Numa planta intacta, h um gradiente na inibio da degradao enzimtica do AIA que inversamente proporcional idade do tecido. Isto mostra que a inibio diminui em direo base do caule, ou a concentrao de auxinas protetoras maior nas folhas mais novas e nos intendios. De um modo geral, os fenlicos so produtos
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Multiplicao
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facilmente oxidados. Tais produtos podem ser fitotxicos, ou mesmo aumentar os processes de oxidao, pois aps a ocorrncia da oxidao, estes se tornam oxidantes muito fortes. Alguns passos bsicos para evitar o escurecimento do tecido e do meio na fase de incio de cultivo incluem a: > remoo dos compostos fenlicos produzidos (lixiviao, adsoro com carvo ativado ou polivinilpirrolidona); > modificao do potencial redutor (agentes redutores ou menos oxignio disponvel); > inativao das enzimas fenolases (agentes quelantes); > reduo da atividade da fenolase (baixo pH, escurido, entre outros). Nem todo antioxidante eficaz nesta fase. Alguns so at mesmo recomendado por um curto espao de tempo, porque rapidamente eles se tornam fortes oxidantes, como, por exemplo, o cido ascrbico. Alguns micronutrientes, tais como o mangans (co-fator de peroxidases) e o cobre (parte da complexa enzima fenolase), podem estimular a oxidao de fenis. Desta forma, conveniente usar estas formulaes de sais em baixas concentraes. 5.2.3. Multiplicao (Estgio 2) Nesta fase, cultivam-se brotaes com a finalidade de aumentar o nmero de estacas. Nesta fase, inmeros subcultivos podem ocorrer at atingir um nmero de brotaes que sero enraizadas. Objetiva-se, nesta fase, a obteno de brotaes alongadas e aptas para a fase de enraizamento. O mtodo mais usado o da formao adventcia de caules, pois facilita e acelera o aumento dos propgulos. Para cada espcie, no entanto, tem-se que determinar se este sistema produz plantas com as mesmas caractersticas genticas da planta-me. A calognese axilar tambm empregada na micropropagao e garante a obteno de indivduos com idntica composio gentica da planta matriz (Figura 17).
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REMOO DAS GEMAS APICAIS E LATERAIS
INICIAO DO CULTIVO
ENRAIZAMENTO _JN VITRO (OPCIONAL PARA ALGUMAS CULTURAS)
Figura 17: Diagrama da produo de mudas advindas da micropropagao de gemas terminais e axilares (adaptado de FACHINELLO et al., 1995). Na fase de multiplicao, uma dosagem excessiva ou escolha inadequada de citocinina pode ser responsvel pelo aparecimento de plantas epigenticas (plantas que apresentam modificaes fenotpicas, mas sem alterao na carga gentica) que s podero ser avaliadas no final do processo. Elevado nmero de subcultivos in vitro de morangueiro resulta em srios distrbios, tais como ausncia ou fraco enraizamento, formao excessiva de flores, frutos pequenos e deformados e plantas heterogneas. 5.2.4. Alongamento de brotaes e induo de raiz (Estgio 3) Nem sempre o alongamento das brotaes necessrio. s vezes, a simples transferncia das brotaes para um meio com ausncia de citocininas o suficiente para causar o alongamento. A auxina o regulador de crescimento utilizado na fase de induo de razes. Aps a induo radicular, no h necessidade da brotao permanecer na presena de auxina para a iniciao radicular. 0 emprego de auxina nesta fase geralmente leva formao excessiva de calos na base das brotaes. Razes adventcias podem ser formadas, porm nem sempre estas apresentam conexo vascular.
Multiplicao
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5.2.5. Transferncia para as condies de casa de vegetao (Estgio 4): Esta , sem dvida (juntamente com a etapa anterior) uma das mais crticas em todo o processo da micropropagao. As plntulas que durante todo o tempo cresceram em condies totalmente artificiais (temperatura variando de 25 2C; irradincia em tomo de 2000 lux e fotoperodo de 16 horas), passam para condies naturais. As folhas das plantas micropropaga.das apresentam uma menor quantidade de ceras epicuticulares que, associada a pouca funcionabilidade dos estmatos, as torna suscetveis a grandes perdas de gua por transpirao. Assim, todo o material deve permanecer por 1 a 2 semanas em um ambiente com luz solar indireta (sombrite) e alta umidade relativa, que poder ser suprida com o emprego de nebulizao em casa de vegetao ou telado.
5.3. PRODUO DE MUDAS LIVRES DE ENFERMIDADES A propagao vegetativa permite a produo de plantas idnticas planta-me. Porm, esse processo de clonagem propicia nestas plantas o acmulo de vrus, o que leva a uma queda continua na produtividade. A limpeza clonal ocorre com o emprego de tcnicas tais como: 5.3.1. Termoterapia As plantas matrizes ou estoques so colocadas em ambiente com temperatura elevada, geralmente acima de 30C; nesta temperatura, que varivel de acordo com a espcie e variedade, as plantas devem permanecer por um perodo de tempo mnimo de 20 dias, mas, preferivelmente, acima de 40 dias. Este tempo necessrio para inativar o vrus ou micoplasma presente na planta. Concomitantemente, ocorre crescimento das brotaes da planta estoque, que provavelmente no acusaro a presena do vrus. Estas brotaes so ento retiradas e podero, aps o enraizamento, servir de fonte de material vegetativo livre de vrus. 5.3.2. Cultura de meristema Faz-se a retirada do meristema, tecido contido nas gemas vegetativas, terminais ou> axilares. Este tecido transferido para um meio de cultura contendo reguladores de crescimento, onde, atravs do processo de diferenciao, ocorrer a formao de brotaes que seguiro as etapas j mencionadas anteriormente (Figura 18).
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SEGMENTOS NODAIS
EXTRAGAQ DO PICE MERISTEMTICO
CULTURA DE MERISTEMA MULTIPLICAO IN VITRO DAS PLANTAS INDEXADAS INDEXAO
REGENERAO DA PLANTA A PARTIR DO MERISTEMA APICAL
SINTOMA
MULTIPLICAO DA PLANTAS INDEXADAS EM TE LADO
PLANTA VfDtCADORA MICROSCOPIA ELETRtHCA
T E S T E S SEROLGICO
Figura 18: Diagrama da cultura de meristema (adaptado de FACHINELLO et al., 1995). 5.3.3. Termoterapia seguida de cultura de meristema Este processo um dos mais seguros para se obter a limpeza clonal. As plantas passam por um perodo de termoterapia que se sucede retirada do meristema, o qual inoculado em meio de cultura semelhante ao anterior. 5.3.4. Microenxertia Este processo empregado para aquelas espcies que no podem ser submetidas a temperaturas elevadas e, principalmente, para as espcies que, ao
Multiplicao
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serem multiplicadas in vitro, apresentam uma reverso ao estgio de juvenilidade. Neste caso, o meristema coletado enxertado em porta-enxerto crescido in vitro (Figura 19). Este processo apresenta um baixo rendimento. comumente empregado para os citros, podendo tambm ser usado para a cultura da ameixeira e pessegueiro.
C O L E T A DO B R O T O
C O R T E E DESINFESTAO
SEPARAO DO PICE C A U L I N A R COM 2 O U 3 PRIMRDIOS F O L I A R E S
Figura 19: Diagrama da tcnica de microenxertia para obteno de plantas isentas de vrus e micoplasmas (adaptado de FACHINELLO et al., 1995).
ENRAIZAMENTO
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Gustavo de Arajo Soares Renato Paiva

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Edson Jos Artiaga de Santiago Jos Raniere Ferreira de Santana Patrcia Duarte de Oliveira Paiva
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6.1. INTRODUO O enraizamento a etapa onde ocorre a formao de razes adventcias nas partes areas. Pode ser dividido em induo, iniciao e alongamento das razes. Essa fase a ltima do processo de propagao in vitro, realizada antes da CflW.t\lO S muS f) ambiente externo. 0 enraizamento pode tambm ser realizado fora do tubo de ensaio, em condies de menor assepcia, j fazendo parte do processo de aclimatizao. A opo por um dos sistemas depende da qualidade da estaca, da espcie de trabalho, das condies do laboratrio e dos recursos disponveis. Pode-se tambm criar um terceiro sistema, onde as estacas so mantidas in vitro at a induo da rizognese e, posteriormente, so transplantadas em um substrato ex Wfro para desenvolvimento das razes (Figura 20). Geralmente, necessrio que j se tenham formados estacas da espcie de trabalho, com folhas e outros tecidos diferenciados, para que se induza a formao das razes. A capacidade de enraizamento dos explantes varia muito entre espcies
Mestrando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras (UFLA)
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Pf8MG[ Mjuntu, PtlD, Departamento s Biologia, UFLA

Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA Professor Assistente, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA Professor Adjunto, Dr, Departamento de Qumica, UFLA.
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Enraizamento
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e de acordo com o tratamento hormonal aplicado. Normalmente, o uso de auxinas favorece a induo e a iniciao radicular e inibe o alongamento, porm concentraes elevadas podem levar formao de calos. Espcies herbceas e regies jovens das plantas geralmente enrazam mais facilmente que espcies lenhosas e regies mais maduras.
IN VITRO EX VITRO
Brotaes enraizadas espontaneamente em culturas
Transferncia para o solo
Brotaes em meio de , enraizamento
Estacas enraizadas movidas para o solo A induo do enraizamento usualmente envolve tratamento das estacas com auxina
Brotaes sem razes
*\
Estacas transferidas diretamente para o solo
Estacas enraizadas
Ambiente mido fechado (sombreamento parcial + nebulizao o ideal)
Figura
20:
Etapas para enraizamento de (modificado de George, 1993).
brotaes
micropropagadas
6.2. ENRAIZAMENTO IN VITRO A vantagem deste tipo de enraizamento o melhor controle das condies em que se trabalha e, com isso, a obteno de um alto percentual de enraizamento. Este mtodo o mais empregado nos laboratrios de cultura de tecidos vegetais. Por outro lado, a desvantagem do mtodo que as razes formadas in vitro nem sempre so eficientes na absoro de gua e de nutrientes, no momento da Pg/D UluS p O substrato. Razes produzidas in \,itro podem poaou.v poucos pelos radiculares e conexes vasculares, e s comearem a desenvolver o cmbio secundrio quando so removidas do frasco de cultura. Algumas vezes, elas no se desenvolvem o suficiente para suportar o crescimento da muda, levando a
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morte ou reduo do crescimento da planta. Pode acontecer tambm a formao de um nmero pequeno de razes longas e pouco ramificadas ao invs de um nmero grande de razes mais curtas e ramificadas. Em alguns casos, foi observado que razes de plantas formadas em tubo de ensaio, morrem depois de um certo tempo de transplantio para o solo e novas razes ento, so formadas. Esta situao no entanto no regra pois, cada espcie reage de uma maneira ao processo de enraizamento. O enraizamento in vitro pode ocorrer de duas formas: quando as razes so formadas a partir de brotaes sendo chamado de processo direto, e quando so formadas a partir de calo, denomina-se de processo indireto. Em ambos os casos, se no houver uma ligao vascular eficiente entre a parte area e a parte subterrnea, a aclimatizao da muda dificultada, podendo comprometer sua sobrevivncia. A rizognese est associada ao de reguladores de crescimento (internos e externos), principalmente nas fases iniciais da induo da formao das razes. Algumas espcies, contudo, j possuem um nvel endgeno de fitormnios suficiente e s enrazam na ausncia de qualquer tipo de regulador, podendo ou no necessitarem apenas de uma pequena leso na base da estaca. Auxinas como o AIB (cido indolbutrico), AIA (cido indolactico) e ANA (cido naftalenoactico) so os principais reguladores envolvidos no processo de enraizamento in vitro. Normalmente, o nmero de razes formadas aumenta com a concentrao de auxina utilizada, at o momento em que sua concentrao fica excessivamente elevada, ocorrendo ento inibio da formao das razes, favorecendo o surgimento de calos. Em alguns casos, a concentrao de auxina que promove bom enraizamento no a mesma que promove uma alta sobrevivncia ex vitro. As concentraes mais utilizadas para induzir rizognese normalmente esto entre 1,0 - 10,0 mg.L" para AIA, 0,05 - 1,0 mg.L" para ANA e 0,5 - 3,0 mg.L" para AIB. Estas substncias podem ser misturadas de vrias maneiras para se encontrar a frmula ideal para o enraizamento de cada espcie. A avaliao dos resultados encontrados utilizando-se diferentes concentraes e misturas de auxinas no deve considerar apenas a porcentagem de estacas enraizadas, mas tambm a qualidade, o tamanho e o nmero de razes formadas. A auxina deve ser aplicada no meio de cultura ou anteriormente inoculao do explante (no caso de enraizamento ex vitro), levandose em conta que a sua concentrao inversamente proporcional ao tempo de permanncia com o regulador.
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Associadas s auxinas, outras substncias tambm interferem de forma direta * )M'. enraizamento dos explantes. Poliaminas, cido sulfrico, cloreto de magnsio e compostos fenlicos, como o floroglucin, atuam, por exemplo, estimulando a sntese de AIA ou liberando a auxina existente no explante. J as citocininas, geralmente utilizada para estimular a formao de brotaes, costumam inibir 0 enraizamento. Existem poucos casos em que uma citocinina no interfere ou
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Enraizamento
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estimula a formao das razes. As giberelinas funcionam como as citocininas, inibindo, na maioria das vezes, a rizognese. Alguns fatores ambientais, tais como tamanho dos recipientes de inoculao, meio de cultura, gases, substratos, luz, temperatura e o prprio explante, tambm afetam a formao de razes. O tamanho dos frascos onde os explantes so colocados ajuda ou dificulta a formao e o crescimento das razes, no momento em que se tornam uma barreira fsica. Logicamente, em frascos maiores se torna mais fcil conseguir o enraizamento. A concentrao de sais no meio de cultura pode ser regulada de acordo com cada espcie, de forma que a reduo da concentrao inica dos meios (50% ou 75% da fora total do meio) pode favorecer esta etapa do processo de micropropagao. A falta de oxignio e o excesso de dixido de carbono no recipiente de cultura dificultam a induo e o crescimento das razes. Para melhorar a aerao e o desenvolvimento de razes, recomenda-se o uso de substratos mais porosos alternativos ao gar. Os substratos desse tipo mais utilizados atualmente so o papel de filtro esterilizado em forma de ponte, para evitar que o explante se afogue no meio lquido, a areia grossa autoclavada, a vermiculita tambm autoclavada, a perlita e as bandejas de espuma. Quanto luminosidade, o escuro, que normalmente estiola as brotaes favorece o enraizamento das mesmas. Posteriormente, um perodo de luz estimula o alongamento das razes formadas no escuro. A provvel explicao a esse fato que no escuro as auxinas so degradadas mais lentamente. Assim, auxinas exgenas devem ser fornecidas para os explantes antes ou depois deste perodo, pois nestes dois momentos a metabolizao das auxinas ser mais rpida. Formas alternativas d fUltt frf(dd d luz na regio formadora da raiz so o carvo ativaao misturado no meio de cultura ou um simples sombreamento com material escuro na parte externa do frasco. A temperatura ideal para enraizamento varia muito de espcie para espcie, mas, geralmente, obtm-se razes em temperaturas mais altas que as das outras fases da micropropagao. Finalmente, a qualidade do explante muito importante para o sucesso do enraizamento. Explantes grandes ou pequenos demais dificultam o processo, o ideal que eles possuam cerca de 2 centmetros. Explantes velhos e lignificados tambm apresentam eficincia menor de rizognese, por serem tecidos j muito especializados. Em contra partida, um corte em sua base pode auxiliar na absoro do regulador e na remoo de barreiras morfolgicas que impeam a diferenciao do tecido. Deve-se ressaltar que em cultura de tecidos vegetais, cada espcie ou at mesmo cada parte da planta utilizada como explante responde de uma forma. Todos esses fatores, internos ou externos, analisados podem ou no afetar a formao e o desenvolvimento das razes e de maneiras completamente diferentes.
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6.3. ENRAIZAMENTO EX VITRO A principal vantagem do enraizamento ex vitro o menor custo financeiro que esta tcnica proporciona. As estacas brotadas, ao invs de serem inoculadas em meios de cultura com reguladores propcios ao enraizamento, so enraizadas fora das condies asspticas dos frascos de cultura, j fazendo parte da etapa seguinte, a aclimatizao. Calcula-se que os recursos economizados por esta tcnica, cheguem a 75% dos gastos totais, o que corresponde justamente aos gastos com mo-de-obra e materiais apenas para esta etapa da micropropagao. Como um dos grandes problemas da cultura de tecidos de plantas so os gastos com a produo, esta alternativa muito importante para obter uma produo com baixos custos. Alm disso, o enraizamento ex vitro reduz o tempo de cultivo e de comercializao da muda, pois elimina uma etapa do processo de micropropagao, misturando as etapas de enraizamento e aclimatizao. Por estrem substrato mais poroso e melhor arejado, as razes formadas so mais funcionais e eficientes na absoro de gua e nutrientes. Isso aumenta o nmero de sobreviventes na aclimatizao e tambm diminui o tempo de formao da muda. No entanto, o enraizamento ex vitro no possui apenas vantagens. Em algumas espcies, a taxa de enraizamento ex vitro to baixa, que a utilizao deste processo invivel. Em outras, a estaca, antes do enraizamento, necessita de passar por uma etapa chamada de "endurecimento", para conseguir sobreviver ao ambiente adverso da fase de aclimatizao. A alta sensibilidade das estacas requer cuidados especiais para enraizar. 9 "gndurSmgn9" D mais do que alterar algumas caractersticas da estaca para que ela consiga sobreviver fase de aclimatizao, ou seja, transformar uma estaca fraca e frgil em uma forte e resistente aos estresses ambientais do meio externo. Para isso, existem algumas tcnicas que proporcionam o "endurecimento" da estaca para que ela possa enraizar sem problemas. A resistncia perda de gua, que ocorre em plantas em ambiente externo, pode ser conseguida atravs da reduo do potencial hdrico e do aumento da deposio de ceras epicuticulares e da formao de estmatos funcionais. Isso obtido aumentando-se, gradativamente, a concentrao de sais, sacarose ou gar no meio de cultura ou reduzindo-se, tambm gradativamente, a umidade nos frascos de cultura. O aumento da intensidade luminosa no laboratrio e do suplemento de dixido de carbono nos tubos e a diminuio da concentrao de sacarose no meio de cultura pode intensificar o desenvolvimento e aprimorar o aparelho fotossinttico das plantas, deixando-as KIJfiSf fX$$ p enfrentar gs condies de autotrofismo ria fasp rip aclimatizao. A tcnica de enraizamento ex vitro consiste em destacar brotaes e plant-las no substrato desejado. As estacas no podem ser nem muito grandes, nem muito
Enraizamento
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pequenas, pois esses extremos so de difcil manuseio, dificultam o enraizamento e demandam mais tempo para formar mudas. Estacas de tamanho entre 2 e 5 centmetros so as ideais. Se possvel, o plantio deve ser em grupos, ao invs de isoladas, o que favorece o enraizamento, que, geralmente, ocorre em 2 a 5 semanas. Existem vrios substratos nos quais se pode realizar o plantio. Turfa, areia, vermiculita, perlita, bandejas de espuma, substratos comerciais como o Plantmax* e o Agromix e solo esterilizado so os mais utilizados. O importante que todos sejam submetidos a um processo de esterilizao por calor ou irradiao, para garantir a assepsia do solo e evitar o aparecimento de pragas, fungos e bactrias. Se necessrio, pode-se enriquecer o substrato com sais, do meio de cultura nutritiva ou reguladores de crescimento como auxinas, que aumentam a intensidade e a velocidade do enraizamento. Estes reguladores podem ser aplicados diretamente no substrato ou na passagem das estacas do tubo de cultura para o substrato.
ACLIMATIZAO
Edson Jos Artiaga de Santiago Renato Paiva Breno Rgis Santos Patrcia Duarte de Oliveira Paiva Guilherme Augusto Canela Gomes
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7.1. INTRODUO O termo aclimatizao definido como a adaptao climtica de um organismo, especialmente uma planta, que transferida para um novo ambiente, sendo todo esse processo realizado artificialmente. O termo aclimatao tem um significado similar, mas um processo no qual as plantas ou outros organismos se tornam ajustados a um novo clima ou situao, como resultado de um processo essencialmente natural. Muitas pesquisas tm sido realizadas para resolver o problema referente aclimatizao. Um grande nmero de planta micropropagada no sobrevive quando so transferidas das condies in vitro para o ambiente externo. Esta passagem crtica se deve basicamente aos seguintes fatores:
7.2. ESTRESSE HDRICO O estresse hdrico causado pela transpirao excessiva de partes da planta, principalmente nas folhas, ou absoro inadequada de gua pelas razes e, em geral, o maior problema no processo de transplantio e aclimatizao. Nas condies in vitro, as plntulas se desenvolvem com baixa luminosidade e elevada Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA Professor djuht, PhD, Departamento de Sofogia, Universidade Federaf ae Lavras
(UFLA) Doutorando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, UFLA Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA Doutorando em Fitotecnia, Departamento de Agricultura, UFLA.
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Aclimatizao
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umidade relativa com consequente reduo do fluxo respiratrio. Ao serem expostas a um ambiente com alta luminosidade e baixa umidade relativa, a taxa de transpirao aumenta, surgindo um dficit hdrico na planta. A cutcula e o estmato so as causas primrias de perda de gua pelas folhas. A cutcula uma membrana composta por uma cutina matriz, juntamente com ceras internas e superficiais que protegem os tecidos das plantas. A funo principal da cutcula limitar a perda de gua por transpirao. As plantas obtidas atravs da micropropagao possuem uma camada mnima ou inexistente de cera protetora sobre as folhas. Outra causa da perda de gua pela superfcie das folhas o controle ineficiente dos estmatos que no so funcionais e respondem lentamente ao estresse hdrico. A estrutura dos estmatos de plantas micropropagadas pode variar entre as espcies, porm todas apresentam estmatos muito mais abertos nas condies in vitro do que em estufa ou campo. A morfologia e a densidade dos estmatos podem ser alteradas mudando-se as condies ambientes. Em plntulas de rosa, por exemplo, um aumento na luminosidade e uma diminuio na umidade relativa de 100 para 75%, resultou em estmatos semelhantes s plantas cultivadas em estufa.
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7.3. FOTOSSNTESE A estrutura e a morfologia interna das plantas micropropagadas so, inicialmente, muito diferentes daquelas cultivadas em condies de campo. Esta variao na anatomia ou ultra-estrutura pode afetar o processo de fotossntese. No proeSSO convencional de micropropagao, os explantes ou plntulas, nos estgios de diferenciao, multiplicao e enraizamento, desenvolvem-se heterotroficamente. No estgio de aclimatizao as plntulas sofrem uma mudana drstica quando so removidas dos frascos onde a luz e as trocas gasosas so limitadas e existe grande disponibilidade de acar. Essa passagem faz com que mudem de heterotrficas para autotrficas, com grande gasto de energia. 7.4. ABSORO DE NUTRIENTES As plntulas in vitro ao serem aclimatizadas, passam de um meio onde tm disposio alta concentrao de nutrientes para um substrato no qual so foradas a iniciar 0 processo de absoro de sais para seu desenvolvimento. A emisso de novas razes muito importante, pois as formadas in vitro tm pouca capacidade de absoro e no respondem imediatamente ao momento do transplante, alm de serem pouco funcionais, delicadas e propensas ao ataque de microorganismos.
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7.5. FITOSSANIDADE A fragilidade da plntula in vitro aliada alta umidade relativa, na qual aclimatizada, favorece o crescimento de fungos e bactrias. essencial, portanto, que se faa uma preveno de doenas para o sucesso do transplante, durante e aps a aclimatizao.
7.6. CONDIES PARA A ACLIMATIZAO 1) As plntulas devem apresentar aspecto sadio com sistema radicular e parte area proporcionais, a fim de garantirem maior taxa de sobrevivncia; 2) A manuteno da alta umidade relativa, por alguns dias aps o transplante, considerada ponto crtico para a sobrevivncia das plntulas. Um nmero significante de laboratrios comerciais tem evitado o uso de um sistema automtico de irrigao para este propsito, por tornar o meio excessivamente mido, favorecendo o crescimento de fungos e algas. O sistema preferencial o "fogging" ou nebulizao, que pode evitar muitos dos problemas encontrados com sistemas de irrigao. Outros mtodos incluem o uso de umidificadores ou o uso de reas fechadas que retm o vapor d'gua; O uso de antitranspirantes, para reduzir a perda de gua durante a aclimatizao, tem conseguido resultados controversos e deve ter seu uso limitado para algumas espcies; 3) As plntulas in vitro requerem baixa luminosidade relativa e quando submetidas ao aumento de luz sofrem um processo de destruio das molculas de clorofila, tomando-se clorticas e queimadas. Para evitar esses problemas, as plntulas podem ser removidas.gradualmente, para uma intensidade de luz sob a qual manter seu crescimento; O controle de fotoperodo tambm importante para prevenir dormncia ou controlar o ciclo de reproduo vegetativa em algumas espcies e o seu ajuste deve ser feito considerando-se a espcie, a estao do ano e os custos econmicos. 4) A temperatura do ar no qual as plntulas devem ser mantidas, durante a fase de aclimatizao, deve estar na faixa entre 13 e 30C e determinada, primeiramente, pela espcie da planta em questo; 5) O solo deve ter pH apropriado para cada espcie, ser tampo, frtil e lOlflTlflt PQTQSQ Dat promover drenagem adequada e aerao. Algune produtores aquecem o solo atravs de serpentinas de gua quente, para maior atividade da raiz, promovendo o crescimento mais rpido da planta;
Aclimatizao
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6) As plntulas desenvolvem-se melhor e crescem mais rapidamente em recipientes mais espaosos. Existem vrios tipos de recipientes como bandejas plsticas ou de isopor com clulas de diversos tamanhos, caixas de polietileno, sacos, copos plsticos, etc; 7) Para a fertilizao muitos laboratrios adicionam, periodicamente, macro e/ou micronutrientes no substrato em que as plntulas so transplantadas; 8) Para o controle fitossanitrio, necessrio que se tome alguns cuidados essenciais. Normalmente, antes do transplantio, as plntulas so lavadas, de preferncia, com gua morna para retirada total do meio de cultura e plantadas em substrato esterilizado. Alguns autores recomendam a lavagem das plntulas com soluo fungida, enquanto outros, no aconselham seu uso durante as primeiras duas semanas depois do transplante, pois podem ser fitotxicos nesta fase. Outros mtodos usados para garantir sanidade incluem o uso de desinfetantes no meio de cultura, nos recipientes e bancadas ou mesmo coberturas novas de polietileno ou tratadas para controle de patgenos. Mos limpas e instrumentos limpos e desinfectados tambm so imprescindveis.
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FOTOMORFOGNESE IN VITRO
Jos Raniere Ferreira de Santana Renato Paiva Breno Rgis Santos Gustavo de Arajo Soares Patrcia Duarte de Oliveira Paiva
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8.1. INTRODUO O estudos dos efeitos da luz na morfologia e desenvolvimento em plantas regeneradas a partir de cultura de tecidos so bastante escassos na literatura. Sabese que a luz pode induzir mltiplas respostas sendo isto importante sobretudo no processo de micropropagao onde as plantas so crescidas em condio de luz artificial. Quando a luz do dia completamente substituda, o'espectro da fonte de luz artificial torna-se particularmente importante e ainda, na maioria dos casos, isso largamente ignorado em instalaes de micropropagao comercial.
8.2. LUZ E LMPADAS Todas as fontes de luz artificial que esto atualmente disponveis diferem do espectro da luz do dia, o que traz implicaes para a micropropagao. A energia da luz absorvida pelas plantas encontra-se numa faixa de frequncia com comprimento de onda entre 400 e 700 nm, aproximadamente.
Professor Assistente, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras (UFLA) Doutorando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, UFLA Mestrando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, UFLA Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA
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Fotomorfognese In Vitro
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Para produzir uma resposta, a luz deve primeiramente ser absorvida por um pigmento fotorreceptor. Nos vegetais, os dois pigmentos mais importantes so o fitocromo e o criptocromo. O criptocromo absorve luz na faixa do azul (400-500 nm) e prximo da regio do ultravioleta (320-400 nm) do espectro. O fitocromo, em contraste, absorve principalmente nas regies do vermelho (600-700 nm) e vermelho-distante (700-760 nm). A maioria das instalaes de micropropagao utilizam lmpadas fluorescentes tubulares (brancas) como nica fonte de luz. Entretanto, existem diferentes tipos destas lmpadas no mercado, o que pode influenciar profundamente o processo de fotomorfognese. A baixa quantidade de comprimento de onda na faixa do azul que certas lmpadas fluorescentes fornecem pode afetar algumas respostas morfognicas Toda lmpada fluorescente emite alguma radiao na faixa do ultravioleta sem efeito, no entanto morfogentico.
8.3. RESPOSTAS DA PLANTA LUZ Os vegetais so inteiramente dependentes da fotossntese e consequentemente da luz para sobreviverem. A fotossntese requer a absoro de considerveis quantidades de energia luminosa para atingir um crescimento satisfatrio. Em contraste, o sistema fotomorfogentico requer pequena quantidade de luz. A transferncia de plantas obtidas pelo cultivo in vitro para o solo um estgio em que muitas perdas ocorrem durante a micropropagao. Razo para isso o pequeno desenvolvimento das plantas in vitro e a baixa atividade fotossinttica. 8.4. FOTOMORFOGNESE E CULTURA DE TECIDOS As trs qualidades da luz que mais claramente influenciam o crescimento e morfogenese in vitro so: o comprimento, a intensidade e a durao da exposio luz ou o fotoperodo. Cada um desses atributos tem efeito sobre a fotomorfognese e a fotossntese. A influncia pode ser direta, atravs de uma ao sobre o tecido j estabelecido in vitro, ou indireto, consequente da influncia da luz nas plantas matrizes. No ltimo caso, o crescimento ou morfogenese observado in vitro modificado pelos tratamentos de luz aplicados na planta matriz antes dos explantes serem removidos. Os efeitos da luz sobre a fotossntese no so de grande importncia em cultura de tecidos, a menos que o crescimento autotrfico seja requerido.
9 Sf9Ff)nt9 /1 Vitm 03 tecidos Vegetais organizados gereimentc
pela luz, que frequentemente requerida para se obter timos resultados. Por outro lado, a diviso celular inicial dos explantes e o crescimento de tecido de calos so, s vezes, impedidos pela luz.
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8.4.1. Comprimento de onda 8.4.1.1. Crescimento, regenerao e morfogenese de calos. Calos de algumas espcies podem ser induzidos e crescidos no escuro, enquanto que tecidos de outras plantas podem crescer melhor em luz contnua ou em um fotoperodo irregular. Calos induzidos no escuro so frequentemente transferidos para a luz quando a morfogenese indireta desejada. A regenerao a partir de calos influenciada pela luz, mas a condio tima varia com a espcie. 8.4.1.2. Induo de razes adventcias A induo de razes adventcias tambm um estgio crtico na microprogao influenciado pela luz. Dependendo da espcie, o enraizamento pode ser induzido na ausncia de luz, ou mesmo sob baixo nvel de irradincia, principalmente luz vermelha. 8.4.1.3. Inibio do crescimento de calos A inibio do crescimento de calos pode ocorrer quando estes so expostos luz na faixa do azul. Possveis causas desta inibio so devido ao aumento na produo de compostos fenlicos, que interferem na atividade de regulao do crescimento; destruio da enzima citocromo oxidase envolvida em processos respiratrios, inibio da sntese de citocinina natural, ou produo de acido abscsico cujo efeito mostra-se antagonstico para citocinina. 8.4.1.4. Formao de brotaes Em algumas espcies, reduzida exposio luz na faixa do vermelho (655 nm) pode induzir a formao de brotaes a partir de gemas laterais. 8.4.1.5. Desenvolvimento dos cloroplastos Os cloroplastos originados em cultura de tecidos tendem a serem mais variveis em estrutura do que aqueles presentes em tecidos foliares da planta matriz. Podem apresentar desenvolvimento inadequado e tilacides com formas anormais. 8.4.2. Intensidade de luz (irradincia) Alm de apresentarem espectro diferente, as culturas in vitro so tipicamente desenvolvidas em intensidade luminosa 10 vezes menor que a luz do dia. Existem vrias razes para explicar porque baixa intensidade luminosa usada: a) a proviso de altos nveis de iluminao artificial onerosa e gera calor no desejado; b) os frascos de culturas so selados, o que contribui para aumentar o calor no inferior do rasco em aita'intensidadeluminosa devido ao "efeito estufa";
Fotomorfognese In Vitro
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c) a tecnologia da cultura de tecidos de plantas envolve o uso de tecidos no autotrficos suplementado com um carboidrato. 8.4.2.1.Crescimento e proliferao de brotos O nvel ideal de iluminao para os estgios I e II da cultura de tecidos deve ser entre 7-120 umol m' s' . Entretanto, o cultivo inicial sob baixa irradincia pode ajudar a prevenir o escurecimento nas culturas de espcies sensveis a este processo.
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Muitos gneros (ex. Aster, Chrysanthemum e Caryphyllaceae, dentre outros) requerem irradincia relativamente alta para a multiplicao das brotaes, e cultivo em baixas irradincias pode causar brotaes vitrificadas. Uma intensidade luminosa de 40-150 Ltmol m" .s" sugerida no estgio III para atingir taxas mximas de sobrevivncia quando se for transferir as plntulas para um ambiente externo.
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8.4.3. Comprimento do dia (fotoperodo) Os efeitos fotoperidicos nas plantas so energizados por luz de relativa baixa irradincia e so geralmente associados com o fitocromo. O comprimento do dia pode influenciar o crescimento natural dos nveis de substncias dentro do tecido da planta. Dias longos tm o mesmo efeito de exposies luz vermelha; longas noites (dias curtos) promovem respostas do fitocromo ao vermelho-extremo. Geralmente plantas que crescem em fotoperodos longos mostram maior contedo endgeno de auxina do que em dias curtos.
PROBLEMAS NO CULTIVO IN VITRO
Breno Rgis Santos Renato Paiva Patrcia Duarte de Oliveira Paiva Jos Raniere Ferreira de Santana
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9.1. INTRODUO No processo de cultivo in vitro alguns problemas podem ocorrer tornando limitante a propagao. Dentre estes problemas pode-se citar a oxidao, o declnio no vigor e a vitrificao.
9.2. OXIDAO Os explantes ao serem inoculados no meio de cultura podem apresentar escurecimento e liberar exudatos que tornam o meio de cultivo escuro. Este tipo de escurecimento consequncia dos ferimentos ocasionados no processo de extrao dos explantes. Nem todas as substncias liberadas no meio causam inibio no desenvolvimento do explante, mas frequentemente esta inibio de crescimento ocorre, podendo levar morte dos tecidos. O processo de oxidao como sendo a mudana de colorao no explante e no meio de cultura causado por compostos fenlicos liberados pelo prprio explante. As substncias encontradas em meio de cultura no cultivo de algumas espcies lenhosas foram identificadas como sendo taninos, flavonides e fenis. Ferimentos normalmente provocam oxidao, sendo que discos foliares apresentam maior oxidao do que segmentos nodais por sofrerem ferimentos em maior rea. O efeito
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Doutorando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras (UFLA) Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, UFLA Professora Adjunto, Dra, Departamento de Agricultura, UFLA Professor Assistente, Departamento de Cincia Biolgicas, Universidade Estadual de Feira
de Santana (UEF5).
Problemas no Cultivo In Vitro
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inibitrio no desenvolvimento dos explantes atribudo presena de taninos e fenis, sendo a autotoxidade dos exudatos varivel com as cultivares, espcies e gneros. A ocorrncia de oxidao pode ser geneticamente correlacionada, ou seja, em gneros cujas plantas apresentam maiores teores de tanino ou hidroxifenis a oxidao ocorre de forma mais intensa como o exemplo de Quercus, Rhododendron, Sorghum e das conferas. Numa mesma espcie, diferentes cultivares podem apresentar variaes de tolerncia oxidao. Produo de pigmentos de diferentes coloraes podem ser vermelho, marron claro e avermelhado, azul e lils. Variaes de intensidade na ocorrncia dos pigmentos e na formao de necrose do explante tambm so observadas. Pesquisas indicam que compostos como a cistena, o carvo ativado, PVP, cido ascrbico e cido ctrico tm sido adicionados ao meio de cultura com o objetivo de controlar o processo de oxidao. A maioria destes compostos age adsorvendo os exudatos liberados pelos explantes os quais causam a oxidao. Uma tcnica eficiente a lavagem do explante com antioxidantes como cido ctrico e cido ascrbico antes da inoculao e a adio de carvo ativado ao meio. O carvo ativado tem sido adicionado ao meio de cultura em concentraes que variam de 0,3 a 2,0%, e a sua ao consiste em adsorver os fenis presentes no meio de cultura, alm de atuar induzindo os processos de morfogenese e rizognese. Em alguns casos, a adio de carvo ativado no eficiente para controlar a oxidao, mas estabiliza o processo, evitando-se o acmulo de fenis. A poliamina PVP possui tambm a capacidade de adsorver os compostos fenlicos evitando que estes oxidem e polimerizem. Alm de estimular a embriognese, o PVP pode tambm reagir com fenis oxidados e prevenir a ocorrncia de oxidao por enzimas fenolases. Esta substncia geralmente adicionada ao meio de cultura em concentraes que variam de 0,01- 4,0 %. A eficincia no uso de PVP e/ou carvo ativado, no entanto, varia de acordo com a espcie. Modificaes na composio dos meios de cultura tais como variaes na concentrao do meio MS, sacarose, excluso ou diminuio em concentrao de ferro e cobre, uso de reguladores de crescimento (variaes em tipo e concentraes) alm da adio de antioxidantes tambm podem ser eficientes para controle da oxidao. O cido ctrico atua como agente quelante de metais mas no muito eficiente em retirar ferro da soluo. J o cido ascrbico normalmente acrescido ao meio de cultura, possuindo a propriedade de estimular a atividade metablica dos tecidos. ao m&ic &m , ^?yyidade destes cidos s tem sido observada, quando adicionado*, concentraes entre 10 e 140 mgL" , podendo reduzir a oxidao em 50%.
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Em alguns casos, os explantes podem apresentar oxidao apenas no incio da cultura, a qual diminuda medida que ocorre desenvolvimento. A idade dos explantes tambm influencia na ocorrncia de oxidao; de modo geral, explantes mais jovens so menos propcios oxidao do que explantes mais maduros. A preveno da ocorrncia de oxidao pode ser feita minimizando os danos causados ao explante, removendo os compostos fenlicos produzidos ou atravs da alterao da composio do meio de cultura e a concentrao ou tipo de reguladores de crescimento empregados. A remoo dos compostos pode ser feita ainda pela utilizao de meios lquidos (facilitam a difuso dos compostos), de diferentes agentes de solidificao, alm da adio ao meio de substncias de adsoro. Para a solidificao do meio de cultura de modo geral utiliza-se o gar, mas existem indicaes de que este tambm possa causar oxidao. O gar o agente solidificante mais utilizado em cultura de tecidos. constitudo de acares, galactose e uma frao neutra, a agarose, que possui forte capacidade de geleificar. O gar possui graus variveis de pureza, o que influencia na sua capacidade de solidificar e provocar reaes com outros agentes no meio de cultura. Contm grande quantidade de sulfatos, os quais so bastante reativos e tambm j se identificou a presena de cobre, elemento capaz de acelerar o processo de oxidao. Alguns tipos de gar - dependendo do fabricante, alm do enxofre, podem ainda conter substncias fenlicas. A utilizao de outros produtos mais puros como agarose e phytagel tem sido bastante eficiente para permitir a ocorrncia de oxidao.
9.3. DECLNIO NO VIGOR m algumas situaes as brotaes, depois de um certo tempo de cultivo, diminuem ou cessam o crescimento, sendo este processo denominado de declnio no vigor. O declino est associado com a produo de substncias fenlicas ou a outros fatores como vitrescncia, habituao ou maturidade dos explante. A perda de vigor pode ser tambm afetado por erros no balano nutricional do meio de cultura, utilizao de fitorreguladores inadequados ou falta de repicagem do material vegetal. A ocorrncia de clorose, absciso foliar e reduo do processo de crescimento so sintomas tambm relacionados perda de vigor. 9.3.1. Declnio na taxa de proliferao A taxa de proliferao de brotos axilares bastante varivel com as espcies ff,', 5, 5 S StmpTS 99mtni, Mgumas vezes a iaxa cte mu>HpSio a* aumenta at um mximo e depois decresce nas sucessivas subculturas.
m m n a
O declnio na taxa de formao de brotos tambm ocorre frequentemente em

culturas que no so repicadas.
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9.3.2. Habituao No cultivo in vitro de algumas plantas tem sido observado a habituao pela citocinina, que consiste em uma excessiva multiplicao de brotos em meio livre de citocinina, mas os brotos produzidos so pequenos, e do origem a poucas radculas adventcias dificultando o estabelecimento ex vitro.
9.4. NECROSES Necrose pode ser descrita como sendo a morte de uma parte de um organismo vivo. Isto ocorre com explantes colocados in vitro, podendo ter uma perda parcial ou a de toda a cultura. 9.4.1. Necrose apical em brotaes 9.4.1.1. Causas 9.4.1.1.1. Deficincia de clcio Necrose apical ocorre em culturas de brotos, principalmente os de plantas lenhosas. Embora exista outras causas, a mais comum a necrose ocasionada pela deficincia de clcio no pice dos brotos cultivados, fator este atribudo a absoro inadequada de nutrientes do meio, ou falta de translocao. Em cultivo in vitro, a alta umidade limita a transpirao e consequentemente a translocao no xilema de ons e compostos, assim como o clcio pode no alcanar os tecidos da regio apical. 9.4.1.1.2. Substncias de crescimento Alguns fitorreguladores podem induzir a necrose apical, principalmente em subculturas. 9.4.1.1.3. Intervalo de subculturas O amarelecimento e necrose foliar pode ser observado quando no so feitas subculturas com a frequncia necessria. Quando estes sintomas so observados, o intervalo entre as subculturas deve ser reduzido; como prtica pode manter um alta taxa de proliferao das brotaes. O tempo entre uma subcultura e a outra deve ser ajustado de acordo com a espcie que est sendo cultivada. 9.4.1.1.4. Gases poluentes O gs ou lcool queimado opera com um limitado suplemento de ar, emitindo grandes quantidades de gases como o metano, butano, entano, propano, etileno, metanol e etanol. Quando se utiliza chama para flambar instrumentos e as bordas dos vasilhames utilizados para o cultivo, o acmulo de gases pode ser alto. Esses
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gases provocam a absciso foliar, podendo causar a paralisao da cultura, ou ainda ocasionar a morte das brotaes. 9.4.2. Como evitar a necrose Permitir que o clcio fique mais disponvel uma prtica que pode evitar o aparecimento de necroses. Pode ser feito ainda incremento na concentrao de clcio no meio de cultivo; ou alterao no ambiente fsico no qual a cultura est crescendo, permitindo assim um aumento na transpirao. O incremento de clcio no meio pode ser feito adicionando-se nitrato de clcio. Outra prtica que pode auxiliar a reduo dos gases txicos. Neste caso deve-se evitar as chamas amarelas quando for flambar os instrumentos e os frascos na Gamara de fluxo laminar, o idear regular a chama para que fique com a colorao azul. A utilizao de algodo para o tamponamento dos tubos de ensaio onde se est cultivando os brotos permite uma troca gasosa mais efetiva com o meio externo, reduzindo a concentrao dos gases txicos no recipiente de cultivo. Tambm pode ser utilizado outras formas tamponamento que permitam esta troca de gases. 9.5. VITRIFICAO (HIPERHIDRICIDADE) A vitrificao ou hiperhidricidade definida como o processo no qual os explantes apresentam anatomia, morfologia e fisiologia atpicas em comparao com outras plantas cultivadas in vitro. As alteraes na estrutura das plantas cultivadas in vitro so sintomas bastante prematuros de uma complexa sndrome de caractersticas anormais. Em algumas condies de cultivo, pode-se detectar tecidos e rgos altamente anormais aps um certo perodo, os quais apresentam propagao reduzida quando transferidos para outro meio de cultivo, ou quando transferidos para o meio externo. Isto pode levar a perda de 60% da cultura de brotos ou plntulas em trabalhos de micropropagao comercial. A "sndrome do broto de vidro" como tambm chamado pode ocorrer em vrios nveis de severidade. Inicialmente, apenas uma parte do broto, ou uma ou duas folhas podemser afetadas. As brotaes de culturas que demonstram sintomas leves frequentemente crescem mais rapidamente do que o normal e pode mostrar altas taxas de brotaes axilares. Esta vantagem perdida em condies mais severas de vitrificao. 1191 !J} &tW, Bf9t9 Vitrificados tem interndios curtes o o ;^ aparece fasciculado. Os brotos afetados frequentemente apresentam-se inchados e com uma colorao verde claro e suas folhas so translcidas, aquosa e com aparncia de vidro; as folhas se apresentam tambm alongadas, trgidas e frgeis,
m
F
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com uma colorao verde azulada. Algumas vezes a folhas de brotos afetados apresentam-se grossas e enroladas, e podendo aparecer regies de colorao verde escuro, devido a superposio de clulas. Brotos altamente anormais produzem razes adventcias ou alguma fraca radcula. 9.5.1. Ocorrncia A vitrificao pode ocorrer em culturas de brotos e ns, em regenerao de brotos a partir de calos, em todos as espcies. mais frequente em massa de calos de plantas lenhoas, mas tambm ocorre em plantas herbceas. Por exemplo, plantas da famlia Caryophyllaceae, so particularmente vulnerveis. O grau de susceptibilidade e o aparecimento dos sintomas no est apenas vinculado espcie das plantas, mas tambm depende da natureza da cultura. Pode-se encontrar vrios graus de vitrificao em um mesmo meio de cultivo ou em meios diferentes para uma mesma espcie. A vitrificao pode ser consequncia da difuso passiva da gua dentro dos tecidos ou um fenmeno ativo relacionado a um distrbio no processo metablico da planta. 9.5.2. Fatores que influenciam a vitrificao Os sintomas da vitrificao ocorrem com menas frequncia em culturas que se desenvolvem mais rapidamente. Quando se busca melhores condies de cultivo para cada espcie, diminui-se expressivamente o risco de ocorrer a vitrificao; ao se utilizar condies de cultivo que limitam o crescimento, a hiperhidricidade ocorre com mais facilidade. Os brotos apresentam sintomas de vitrificao mais frequentes quando se utiliza concentraes de BAP acima de 2,0 mg.L" , suplementado com sacarose e baixas concentraes de sorbitol.
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A vitrificao tende a ser promovida por altas temperaturas, baixa irradincia luminosa ou em culturas mantidas no escuro. Brotos que se desenvolvem em condies contnuas de alta umidade relativa apresentam maior susceptibilidade vitrificao, pois este provavelmente o ambiente mais favorvel para ocasion-la. Culturas mantidas em meio lquido, incluindo aquelas realizadas com suportes (ponte de papel) geralmente desenvolvem a vitrificao mais facilmente do que aquelas que so cultivadas em meio slido. Em algumas plantas, brotaes normais cultivadas em meio slido ficam totalmente vitrificadas quando so transferidas para um meio de cultivo lquido. A condio de vitrificao geralmente ocorre quando se utiliza meio MS com a concentrao mxima de seus sais; entretanto se reduzir as concentraes dos macronutrientes no se observa a ocorrncia da vitrificao. Outros fatores do meio como concentrao de sacarose, pH e potencial hdrico tambm influenciam a
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ocorrncia de vitrificao. Condies de cultivo como por exemplo luminosidade e trocas gasosas constituem outros fatores de influncia. Em vrias culturas a induo da vitrificao pode ser tambm influenciada pelo tipo e concentrao dos reguladores de crescimento utilizados. As citocininas so particularmente responsveis pela induo da vitrificao em brotos quando estes esto sendo cultivados em meios que possuam deficincia em sua composio. A citocinina BAP tem sido observada como indutor da vitrificao quando utilizada em altas concentraes. Isto pode ser evitado transferindo a cultura para um meio que no possua BAP. As auxinas podem s vezes induzir a vitrificao entretanto, a adio de auxinas no meio contendo citocininas, frequentemente aumenta a proporo de vitrificao. O cido giberlico pode ser utilizado no controle deste problema, 9.5.3. Preveno da vitrificao Existem vrios fatores que podem auxiliar na preveno da vitrificao, dentre estes pode-se destacar: 1) Reduo da umidade relativa no ambiente in vitro. 2) Aumento da concentrao de agar no meio semi-solido. 3) Controle da concentrao de sacarose. 4) Utilizao da tcnica de duas fases (meio lquido e slido) no meio de cultura. 5) Em meio lquido, utilizar suportes porosos para sustentao dos explantes (ponte de papel). 6) Em meio lquido pode adotar a tcnica de submerso temporria, onde o material vegetal periodicamente mergulhado no meio de cultura. 7) Reduo da concentrao de ons de amnio no meio de cultivo. 8) Ajuste correto do pH do meio de cultivo. 9) Adio ao meio de cultivo um ou mais cidos orgnicos como o citrato, succinato ou malato para auxiliar a assimilao do N H .
4+
10) Reduo da concentrao de micronutriente no meio de cultivo. 11) Substituio da sacarose por frutose ou galactose. 12) Transferncia da cultura para um meio de cultivo ausente de fitorreguladores. Isto possibilita a formao de novos brotos sem os sintomas da vitrificao.
13} DlFRRUIG OUW citocininas ou restrio do uso do B A P cm copooir^,
substituindo-o por outros compostos com atividade similar. Pode-se tambm

aumentar o nmero de subcultivos.
Problemas no Cultivo In Vrtro
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14) Utilizao de um balano mais adequado entre auxina / citocinina para a espcie estudada. 15) Utilizao de alta de luminosidade.
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PRINCIPAIS APLICAES DA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
Jos Raniere Ferreira de Santana Renato Paiva Patrcia Duartt Luciano Vilela Paiva*
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10.1. INTRODUO As tcnicas de cultura de tecidos tm sido empregadas de diferentes formas no desenvolvimento de novas cultivares de plantas. A cultura de tecidos pode oferecer novas alternativas aos programas de melhoramento em suas diferentes fases e, muitas vezes, oferecem solues nicas.
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10.2. APLICAES DA CULTURA DE TECIDOS NA PROPAGAO ASSEXUADA a) Limpeza de material: As espcies que so propagadas assexuadamente ficam expostas a problemas fitossanitrios, especialmente viroses, as quais, por serem de natureza sistmica, podem permanecer por tempo indeterminado nas plantas. A cultura de meristema tem-se mostrado bastante eficiente na obteno de plantas livres de vrus, considerando-se que a distribuio das partculas virticas na planta segue um gradiente decrescente em direo ao pice. Outra vantagem do uso de meristema a conexo vascular incipiente desta regio com o restante dos tecidos. A associao da cultura de meristema com a termoterapia proporciona uma melhor eficincia no controle de certas viroses. Posteriormente, a limpeza das
ProfessorÂssistente^pepartamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) Professor Adjunto, PhD., Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
(UFLA)
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Professor Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA Professor Adjunto, Dr., Departamento de Qumica, UFLA.
Principais Aplicaes da Cultura de Tecidos Vegetais
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plantas obtidas dever ser comprovada por indexao, seja ela por plantas indicadoras, tcnicas imunolgicas ou marcadores moleculares. b) Recuperao do vigor e da produtividade: Fatores biolgicos (doenas e pragas) podem diminuir a qualidade do material vegetal e, consequentemente, sua produtividade. Um declnio gradual no vigor e na produtividade contribui para o desenvolvimento de doenas, que podem expressar sintomas ou permanecer latentes. c) Multiplicao de cultivares: Uma das principais vantagens do uso da propagao in vitro a alta taxa de multiplicao que pode ser obtida. Neste caso, um conjunto de indivduos geneticamente idnticos so produzidos partir de um nico explante. Este processo de propagao de um indivduo selecionado conhecido como clonagem. Alm do mais, pode ainda constituir uma fonte de material juvenil para o caso de variedades ou linhas promissoras que se encontram atacadas por doenas sistmicas. d) Germinao de sementes in vitro: Em espcies com germinao lenta ou desuniforme, a germinao in vitro de sementes uma importante alternativa para superar a fase inicial do desenvolvimento vegetal.
10.3. APLICAES EM FITOPATOLOGIA As tcnicas de cultura de tecidos tm oferecido contribuies importantes na rea da fitopatologia. Sistemas de co-cultura de patgenos com os tecidos de plantas hospedeiras permitem o estudo das relaes entre os dois organismos em condies controladas, levando descoberta de mecanismos de patogenicidade e de resistncia a nvel celular. Como mencionado anteriormente, a recuperao de plantas livres de vrus e de outros agentes causadores de doenas uma outra grande contribuio da cultura de tecidos fitopatologia. As tcnicas de cultura de tecidos tambm tm sido utilizadas com sucesso na manuteno de nematides e de outros parasitas obrigatrios, seleo de plantas resistentes a toxinas e no estudo do efeito mutagnico de toxinas.
10.4. APLICAES NO MELHORAMENTO GENTICO Coles de plantas que asseguram variabilidade gentica so parte essencial de qualquer programa de melhoramento gentico. A necessidade de preservao dos recursos genticos existentes assume uma importncia enorme face a eroso gentica que se verifica em muitas espcies. s pcaos da cur de tecidos em programas de melhoramento gentico podem ser:
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aj Aumento da variabilidade gentica para fins de seleo: Pesquisadores podem explorar a variabilidade gentica mediante o uso de variantes somaclonais, que so plantas com caractersticas morfolgicas distintas da planta matriz obtida atravs do cultivo in vitro. b) Introgresso de genes de interesse para espcies-alvos: A quebra de barreiras de incompatibilidade gentica pode ser obtida mediante a polinizao in vitro, cultura de embries e fuso de protoplastos. A cultura de embries tem sido utilizada visando estender as possibilidades de hibridao interespecficas e evitar o abortamento dos embries. Pode ser utilizada tambm em programas de melhoramento onde o nmero de sementes resultantes dos cruzamentos baixo, onde no ocorre formao de endosperma e ou desenvolvimento dos cotildones ou quando as sementes perdem rapidamente a viabilidade durante o armazenamento. A cultura de embries tambm proporciona a obteno de plntulas sadias in vitro, que podem ser propagadas rapidamente e avaliadas antes dos ensaios de campo. A cultura de protoplastos (clulas sem a parede celular) constitui um sistema apropriado para a realizao de estudos fisiolgicos e bioqumicos e para diferentes manipulaes genticas. A fuso de protoplastos (hibridao somtica) envolve a fuso de duas clulas somticas fundindo o citoplasma de ambos os pais, diferindo, portanto, dos cruzamentos sexuais, onde apenas a planta-me contribui com o citoplasma. c) Acelerao de programas de melhoramento: Atravs da germinao de sementes in vitro das plantas melhoradas, clonagem de gentipos para testes de capacidade de combinao, cultura de anteras e micrsporos para a obteno de haploides e limpeza clonal. d) Banco de germoplasma in vitro: As colees de germoplasma so, normalmente, mantidas em campo, o que ocasiona altos custos de manuteno, alm do material ficar exposto a pragas e doenas. A conservao de material vegetal in vitro, seja por criopreservao (manuteno em baixas temperaturas) ou sob condies de crescimento lento oferecem como vantagens o pouco espao ocupado, a possibilidade de contaminao por doenas e pragas praticamente nula e a taxa de propagao elevada. Com isto, reduz-se os custos de manuteno de colees de germoplasma e -evita-se a transmisso de patgenos sistmicos de uma gerao outra. Alm disto, a alta organizao do explante permite que as plantas assegurem um grau considervel de estabilidade gentica, mantendo suas caractersticas varietais. e) Obteno de plantas transgnicas: Os mtodos de transformao utilizados para gerar plantas geneticamente modificadas exigem que estas plantas passem pelo cultivo in vitro. No processo de transformao via bactria
Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhyzogenesis, tecidos alvos de
transformao so mantidos na presena de bactrias contendo genes de interesse.
Principais Aplicaes da Cultura de Tecidos Vegetais
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durante o cultivo in vitro, conhecido como co-cultivo, que a bactria transfere o gene de interesse para o tecido alvo. Posteriormente, atravs do uso de meios de cultura seletivos faz-se a identificao das clulas eficientemente transformadas. O cultivo seletivo tambm utilizado para identificar as clulas que forma transformadas mediante o processo transformao por biobalstica, que se baseia no bombardeamento do tecido alvo por partculas de ouro ou tungstnio contendo aderidos a essas, plasmdeos com os genes de interesse.
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ALGUNS CONCEITOS EM CULTURA DE TECIDOS
Breno Rgis Santos Patrcia Duarte de Oliveira Paiva Renato Paiva Luciano Vilela Paiva
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ABA: (cido abscsico): Hormnio vegetal pertencente classe de sesquiterpenos, ou seja, constitudo de trs unidades de isopreno. Est envolvido no fechamento de estmatos, tolerncia dessecao e manuteno da dormncia de sementes. cido Abscsico: fitohormnio inibidor de germinao. Tambm atua no mecanismo de fechamento do estmatos. Aclimatao: Ajuste de uma planta a um novo clima ou situao como , !SJ9 de um processo essencialmente natural.
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Aclimatizao: Adaptao climtica de um organismo, especialmente uma planta, o qual transferido para um novo ambiente, sendo todo esse processo realizado artificialmente. Adventcio: rgo vegetal formado em posio diferente daquela onde se origina no curso normal de desenvolvimento. Por exemplo, raiz desenvolvida em um segmento de caule ou diferenciao de uma gema a partir da raiz. gar: Polissacardeo extrado de algas marinhas. utilizado como agente gelificante, principalmente, em culturas bacterianas, cultura de tecidos de plantas e gis de eletroforese. Agente desinfestante: Substncia capaz de eliminar ou inibir o crescimento de um microrganismo na superfcie de explante.
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Doutorando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras (UFLA) Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA Professor Adjunto, PhD., Departamento de Biologia, UFLA Professor Adjunto, Dr., Departamento de Qumica, UFLA.
Alguns Conceitos em Cultura de Tecidos
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gua deionizada: gua purificada de baixa condutividade, cujos ctions e nions foram removidos, atravs da sua passagem por uma coluna de resina de troca inica. gua destilada: gua purificada pelo processo de destilao. A gua aquecida e seu vapor condensado em uma coluna de destilao. AIA: (cido indol-3-actico): Hormnio vegetal de ocorrncia natural pertencentes a classe das auxinas. Induz o alongamento celular. Primeira auxina indentificada. AIB: (cido indol-3-butrico): Hormnio vegetal de ocorrncia natural pertencentes a classe das auxinas. Induz o alongamento celular. Possui atividade enraizante. Ambiente: Conjunto de condies externas que podem afetar o crescimento, o desenvolvimento e a reproduo de um organismo. Fatores fsicos e biolgicos externos que influenciam a expresso dos genes de um indivduo. ANA: (cido naftalenoactico): Hormnio pertencentes a classe das auxinas que induz o alongamento celular. mais efetivo que o AIB e AIA. Antibitico: Composto orgnico, geralmente produzido por microrganismos, que mata ou inibe seletivamente o crescimento de outros microrganismos. Dentre os antibiticos, tm-se as penicilinas, as cefalosporinas, os aminoglicosdeos e as tetraciclinas. pice caulinar: Segmento do pice do caule, composto pelo meristema apical (0,05 - 0,1 mm) juntamente com os primrdios foliares e folhas em desenvolvimento. A cultura de pices caulinares usada para eliminao de patgenos. Nesse caso, os pices no devem exceder ao tamanho de 0,3 mm. Explantes de maior tamanho so apropriados para propagao rpida. Assepsia: Tcnica utilizadas para prevenir a introduo de fungos, bactrias, vrus, micoplasma, ou outros microrganismos em cultura de clulas, tecidos ou rgos. Esse procedimento pode no excluir a introduo de molculas infecciosas. Autoclave: Equipamento utilizado, em geral, para esterilizao de vidrarias e meios de cultura, empregando vapor de gua, alta presso (1,05 X 105 Kpa) e alta temperatura (121C), por um determinado perodo de tempo. Auxina: fitohormnio causador de expanso celular. BAP: (6-benzilaminopurina): Hormnio pertencente a classe das citocininas que promovem a diviso e a diferenciao celular. Biorreator: Recipiente onde ocorre uma reao biolgica, em geral, fermentao ou biotransformao. Biotecnologia: Conjunto de tcnicas que utiliza seres vivos, ou parte desses, para produzir ou modificar produtos, aumentar a produtividade de plantas e animais de maneira eficiente ou, ainda, produzir microrganismos para uso especficos. A
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biotecnologia inclui as tecnologias de engenharia gentica, DNA recombinante, manipulao de clulas e embries. Dentre os produtos biotecnolgicos destacam-se a produo de insulina e de interferon a partir de genes humanos clonados e expressos em bactrias ou outros organismos heterlogos e plantas transgnicas resistentes a doenas. Calos: Grupo ou massa de clulas com crescimento desordenado, as quais podem apresentar certo grau de diferenciao. Callus: forma em latim da palavra calos. Cinetina: regulador de crescimento com propriedades citocininas. Citocinina: fitohormnio associado a induo de diviso celular. Clone: Populao de clulas ou organismos geneticamente idnticos, produzidos assexualmente. Descendncia que, por propagao assexuai, se originou de uma nica planta. Populao de clulas que possui um vetor de clonagem com o mesmo inserto. Fragmento de DNA isolado do gene de um organismo ou de um cDNA de um vetor de clonagem. Crescimento: Aumento de massa seca ou protoplasma de um organismo, associado ao desenvolvimento. Em muitas situaes, envolve diviso celular, expanso, diferenciao e morfogenese. Criopreservao: Conservao de materiais em baixas temperaturas, prximas temperatura do nitrognio lquido (-196C). Cultura de clulas: Cultivo em meio nutritivo de clulas isoladas ou de pequenos grupos de clulas similares, em condies asspticas e controladas de luminosidade e temperatura. Cultura de embries: Refere-se aos processos de crescimento e desenvolvimento do embrio zigtico in vitro, independentemente da idade, tamanho e estdio de desenvolvimento em que o embrio excisado colocado em meio de cultura. Cultura de tecidos: Tcnicas de cultura de tecidos vegetais em meio nutritivo, em condies controladas de luminosidade e temperatura. Cultura Primria: Cultura estabelecida com um explante originado de uma planta matriz que se encontra ex vitro. Desdiferenciao: Processo no qual uma clula diferenciada perde suas caractersticas especficas, reassumindo atividades meristemticas. Por exemplo, no proCQSSO de organognese indireta a passagem para a fase de calos um processo de desdiferenciao, no qual as clulas perdem sua identidade original e assumem caractersticas mais simples. Desenvolvimento: Crescimento integrado de um organismo pluricelular ou parte dele, associado a mudanas na forma e na complexidade, por padres sucessivos de diferenciao e morfogenese.
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Desinfestao: Eliminao de microrganismos superficiais presentes em um explante com o uso de substncias como o hipoclorito de sdio ou clcio, lcool, cloreto de mercrio, etc. Diferenciao: Mudanas fisiolgicas, morfolgicas, bioqumicas e anatmicas que ocorrem em um clula, tecido, rgo ou planta, durante o desenvolvimento do estado meristemtico ou juvenil para o adulto. As clulas do embrio e do meristema apical servem de exemplo do estado indiferenciado. 2ip (isopenteniladenina): Hormnio vegetal pertencente a classe das citocininas, de ocorrncia natural. Foi descoberta na bactria Corynebacterium fascians. A alta atividade fisiolgica est relacionada diviso e diferenciao celular. 2,4-D (cido 2,4 diclofenoxiactico): Auxina sinttica altamente ativa que promove a organognese, sendo mais frequentemente empregada para iniciar a cultura de calos. Apresenta propriedade herbicida. Dormncia: Condio em que o crescimento suspenso ou reduzido por controle endgeno, mesmo quando as condies ambientais so favorveis. Ocorre em rgos de reserva (bulbos e tubrculos), em gemas e em sementes, entre outros rgos vegetais. Uma semente vivel considerada dormente quando no germina ao ser submetida a condies favorveis de germinao (temperatura, gua, oxignio e especficos que quebrem a dormncia. Embrio: Planta rudimentar formada dentro do gametfito feminino, que possui um eixo polar com um pice caulinar e um radicular em extremidades opostas. Origina-se da unio do vulo com o ncleo espermtico. Embrio somtico: Embrio formado a partir de clulas somticas seauindo padres de desenvolvimento do embrio zigtico. > Embriognese somtica: Processo de formao do embrio a partir de clulas somticas, sem que ocorra fuso de gmetas, podendo ser direta e indireta. Embriognese somtica direta: Processo de embriognese somtica que ocorressem a passagem pelo estdio de calo. Embriognese somtica indireta: Processo de embriognese somtica que ocorre com a passagem pelo estdio de calo. Embriide: Sinnimo de embrio somtico. Explante: Segmento de tecido ou rgo vegetal retirado do seu stio natural e utilizado para iniciar uma cultura in vitro. Exsitu: Fora do lugar original Ex vitro: Literalmente 'fora do vidro'. Termo normalmente contrastar com processos efetuados in vitro. utitizad yj ,a
a
Etileno: Fitohormnio associado com o amadurescimento de frutos. Fitohormnio: Substncia orgnica produzida pela planta, de baixa massa
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molecular que, em pequenas concentraes, promove, inibe ou modifica processos fisiolgicos, geralmente em locais diferentes daquele onde foi produzida. Flambagem: Ato de esterilizar intrumentos, expondo-os chama. Fluxo laminar: Fluxo de uma massa contnua de ar ultrafiltrado (atravs de um filtro HEPA), livre e constante, no sentido unidirecional e aerodinmico, ao longo de linhas paralelas, sem criar turbulncia. Esse fluxo de ar toma a forma dos objetos ou pessoas que encontra no trajeto, envolvendo-as em uma atmosfera estril, carregando, ao mesmo tempo, as contaminaes geradas dentro da rea de trabalho. O fluxo pode ser horizontal ou vertical. Friabilidade: Capacidade das clulas vegetais se separarem uma das outras, quando cultivadas in vitro. Por exemplo, calos mantidos em meios com altas concentraes de auxinas, em geral, se tornam friveis. Fuso de protoplastos: Unio de clulas desprovidas de parede celular resultando em uma clula hbrida com material nuclear das diferentes clulas de origem. GA3 (cido giberlico): Hormnio pertencente a classe das giberelinas que induz a germinao. Germinao: Engloba todos os eventos que iniciam pela absoro de gua de uma semente e, na maioria das vezes, termina com a emisso da radcula. Germoplasma: Material hereditrio que determina a caracterstica de um organismo ou de um grupo de organismos. Giberelina: fitohormnio estimulador de germinao. Habituao: Habilidade adquirida por uma populao de clulas de crescer e de se dividir independentemente do suprimento exgeno de substncias reguladoras de crescimento. Hiperhidricidade: Veja vitrificao. Hormnio: Mensageiro qumico que coordena diferentes atividades em organismos multicelulares. Indiferenciado: Em clulas vegetais, estado caracterizado por clulas de forma isodiamtrica, com pouco ou nenhum vacolo e ncle grande. Como exemplo tem-se as clulas meristemticas. Induo: Desencadeamento de um processo morfogentico pela exposio do explante a estmulos fsicos, qumicos ou biolgicos. Induo envolve o controle da expresso gnica, sem alterao no patrimnio gentico de organismo, ou seja, esse termo se refere somente expresso de genes preexistentes. inoculao: introduo de bactria, fungo, parte da planta ou clulas animais em meio nutritivo, para o estabelecimento da cultura. Introduo de microrganismos em animais ou vegetais. In situ: No lugar original.
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In vitro: Literalmente 'no vidro'. Termo aplicado para designar crescimento de clulas, tecidos ou rgos vegetais em meio de cultura, em condies asspticas. In vivo: Literalmente 'ao vivo'. Refere-se ao desenvolvimento de organismos vivos, em condies naturais. Juvenilidade: Estado fisiolgico do desenvolvimento caracterizado pela incapacidade de florescimento mesmo quando a planta exposta a condies indutoras. s vezes, acompanhado por diferenas morfolgicas (tamanho, forma ou disposio de folhas; presena de espinhos etc.) e fisiolgicas (maior capacidade de enraizamento de estacas). a fase do crescimento, aps a germinao da semente. Meio nutritivo: Combinao de sais minerais (macro e micronutrientes), carboidrato, vitaminas e reguladores de crescimento, quimicamente definido e utilizado para o crescimento de clulas, tecidos ou rgos in vitro. Pode ser slido (adicionando-se gar ou outro agente para a gelificao) ou lquido. , Meristema: Tecido composto de clulas no diferenciadas, envolvido na sntese protoplsmica e formao de novas clulas por diviso mittica. Quando no h especificao, o termo se refere ao meristema apical do caule com tamanho menor que 0,1 mm. Microenxertia: Forma de propagao assexuada in vitro que consiste em excisar parte de uma planta (pice caulinar ou gema lateral) e introduzi-la em outra planta (porta-enxerto) tambm estabelecida in vitro. Micropropagao: Refere-se s tcnicas para propagao de plantas in vitro, incluindo-se, cultura de pices caulinares e segmentos nodais, embriognese somtica e formao de gemas adventcias em explantes. Mutagnese in vitro: Qualquer processo de mutao induzida realizado in
vitro.
Necrose: Morte de clulas ou tecidos, em totalidade ou em parte, resultante da ao de agentes biticos ou abiticos. Organognese: Processo de neoformao de parte area ou raiz a partir de calo ou de outros explantes; contrasta com embriognese. Organognese direta: Organognese em que no ocorre passagem pela fase de calo. Organognese indireta: Organognese que passa pela fase de calo. Oxidao: Escurecimento do meio de cultura e ou explante ocasionado por compostos (a maioria fenlicos) liberados pelo explante. -4 Quiescncia: Inibio da germinao devido a algum fator ambiental desfavorvel. Propagao in vitro: Propagao de plantas em ambiente controlado, usando frasco de cultura, tcnicas asspticas e um meio nutritivo adequado para o crescimento e o desenvolvimento do explante inoculado.
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Regenerao: Em cultura de tecidos de plantas, significa uma resposta morfogentica de um explante a um estmulo, que resulta na formao de parte area, embrio, propgulo ou planta. Nesse processo, clulas diferenciadas sofrem desdiferenciao, assumindo caractersticas meristemticas e, em seguida, so reprogramadas, diferenciando-se em rgos especializados (rediferenciao). A regenerao pode ocorrer via organognese ou embriognese. Regenerao adventcia: Regenerao de um rgo vegetal em uma regio diferente daquela onde originalmente formado. Regulador de crescimento: Substncias sintticas, no produzidas naturalmente que, quando aplicadas planta em quantidades diminutas, estimulam, inibem ou modificam o crescimento ou o desenvolvimento (efeitos semelhantes aos dos fitohormnios). Muitas dessas substncias so quimicamente anlogas aos fitohormnios. Repicagem: Transferncia de calos ou material vegetal em cultivo, sem subdividi-lo, para um novo meio nutritivo. Resgate de embries: Processo de recuperao in vitro de embries resultantes de cruzamentos incompatveis. Em geral, realizado mediante cultura de embries. Subcultura: Cultura de tecido constitudo na subdiviso de material j estabelecido in vitro, suas transferncia para novo meio, e a incubao subsequente em condies controladas. Suspenso celular: cultura de clulas ou agregados celulares em meio lquido, frequentemente sob agitao. TX d multiplicao: Nmero de propgulos obtidos a partir de um explana inicial, em um determinado perodo de tempo. TDZ (thidiazuron): Hormnio pertencente a classe das fenilurias, ativamente ligadas na promoo de crescimento de calos e morfogenese. Totipotncia: Propriedade inerente s clulas vegetais de manifestar, em momentos diferentes e sob estmulos apropriados, a potencialidade em iniciar um novo indivduo multicelular. Ultravioleta: Radiao eletromagntica com comprimento de onda entre 290 e 359 nm. Geralmente, empregada na induo de mutaes em microrganismos ou na desinfestao de materiais utilizados em cultura de tecidos vegetais. Em biologia molecular, utilizada para a visualizao de cidos nuclicos corados com brometo de etdeo. ^Variao somaclonal: Variao expontnea ocorrida em plantas regeneradas de cultivo in vitro de clulas ou tecidos. 4e Vitrificao: Refere-se a um processo no qual um propgulo se torna quebradio, com aspecto de vidro, provavelmente ocasionado pela absoro
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excessiva de gua, processo esse atribudo a diversos fatores (gentipo, composio do meio, etc). Anteriormente este processo era denominado de hiperhidricidade. ZEA (zeatina): Hormnio vegetal pertencente a classe das citocininas, de ocorrncia natural, especialmente, em gros imaturos de milho. [ Z J U X **SO*J/> ) 5
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Renato Paiva Patrcia Duarte de Oliveira Paiva

Renato Paiva Patrcia Duarte de Oliveira Paiva

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Figura 2: Autoclave horizontal.

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Figura 3: Estufa de secagem de materiais.

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Figura 4: Balana analtica.

Figura 5: Medidor de pH.

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n) Agitador magntico: auxilia no processo de dissoluo de reagentes (Figura 6).

Figura 7: Capela de fluxo laminar.

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Figura 12: Aspecto visual de frascos de vidro para armazenamento de solues.

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Edson Jos Artiaga de Santiago Renato Paiva

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(6-benzilamino)-9-(2-tetrahidrooiranil) purina N -3-dimetil-2-butilaminopurina ou Isopentenilladenina

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34 3.2.8.4. Trocas gasosas

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Tempo mnimo de autoclavagem (minuto) 20 25 28 31 35 40 48 63

, > < a > c * 2 o s > e ,w,oo5e

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A suspenso decantada ou filtrada

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Tempo -+ Figura 14: Curva de crescimento de uma suspenso celular.

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Originado de sementes maturas, usado para evitar a inibio de germinao de semente.

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a) Eliminao da inibio (dormncia) da germinao de

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REMOO DAS GEMAS APICAIS E LATERAIS

ENRAIZAMENTO _JN VITRO (OPCIONAL PARA ALGUMAS CULTURAS)

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EXTRAGAQ DO PICE MERISTEMTICO

CULTURA DE MERISTEMA MULTIPLICAO IN VITRO DAS PLANTAS INDEXADAS INDEXAO

REGENERAO DA PLANTA A PARTIR DO MERISTEMA APICAL

MULTIPLICAO DA PLANTAS INDEXADAS EM TE LADO

PLANTA VfDtCADORA MICROSCOPIA ELETRtHCA