ESPECTROFOTMETRO Un espectrofotmetro es un instrumento usado en el anlisis qumico que sirve para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre

valores de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentracin o reacciones qumicas que se miden en una muestra. Tambin es utilizado en los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotmetros, puede ser de absorcin atmica o espectrofotmetro de masa y visuales. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones: 1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra 2. Indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la muestra Componentes de un espectrofotmetro Fuente de luz La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las siguientes condiciones: estabilidad, direccionabilidad, distribucin de energa espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son: lmpara de wolframio (tambin llamado tungsteno), lmpara de arco de xenn y lmpara de deuterio que es utilizada en los laboratorios atmicos. Monocromador El monocromador asla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz monocromtica. Est constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersin. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida. Es un lente que lleva el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida.

Compartimiento de Muestra Es donde tiene lugar la interaccin, R.E.M con la materia (debe producirse donde no haya absorcin ni dispersin de las longitudes de onda). Es importante destacar, que durante este proceso, se aplica la ley de Lambert-Beer en su mxima expresin, con base en sus leyes de absorcin, en lo que concierne al paso de la molcula de fundamental-excitado. Detector El detector, es quien detecta una radiacin y a su vez lo deja en evidencia, para posterior estudio. Hay de dos tipos: a) los que responden a fotones; b) los que responden al calor Registrador Convierte el fenmeno fsico, en nmeros proporcionales al analito en cuestin. Fotodetectores En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 fotodetectores para percibir la seal en forma simultnea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes mviles del equipo. Instrumentos de Espectroscopia para regiones UV-VIS El espectrmetro es un instrumento espectroscpico que utiliza un monocromador o policromador en combinacin con un transductor para convertir las intensidades de radiacin en seales elctricas. Los espectrofotmetros son espectrmetros que permiten medir la relacin entre la energa radiante de dos rayos, lo cual es necesario para medir la Absorbancia. Los fotmetros utilizan un filtro para seleccionar las longitudes de onda en combinacin con un transductor de radiacin adecuado. La mayora de los equipos de espectroscopia que se utilizan en las regiones UVVisible tienen los siguientes componentes: 1. Una fuente estable de energa radiante. 2. Un selector de longitudes de onda que asla una regin limitada del espectro para su medida. 3. Uno o varios recipientes de muestras.

4. Un detector de radiacin que convierte la energa radiante en una seal elctrica medible 5. Una unidad de procesamiento y lectura de seales que habitualmente consiste en un equipo electrnico y un computador.

Los espectrofotmetros de reflectancia miden la cantidad proporcional de luz reflejada por una superficie como una funcin de las longitudes de onda para producir un espectro de reflectancia. El espectro de reflectancia de una muestra se puede usar, junto con la funcin del observador estndar CIE y la distribucin relativa de energa espectral de un iluminante para calcular los valores triestmulos CIE XYZ para esa muestra bajo ese iluminante.

El funcionamiento de un espectrofotmetro consiste bsicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo ms usual es que los datos se recojan en 31 intrvalos de longitudes de onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm 700 nm). Esto se consigue haciendo pasar la luz a travs de un dispositivo monocromtico que fracciona la luz en distintos intrvalos de longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparacin con una superficie de reflexin difusa perfecta.

La reflectancia de una muestra se expresa como una fraccin entre 0 y 1, o como un porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de que los valores de reflectancia obtenidos son valores relativos y, para muestras no fluorescentes, son independientes de la calidad y cantidad de la luz usada para iluminar la muestra. As, aunque los factores de reflectancia se midan usando una fuente de luz concreta, es perfectamente correcto calcular los valores colorimtricos para cualquier iluminante conocido.

Espectrometra ultravioleta-visible

La espectrometra ultravioleta-visible o espectrofotometra UV-Vis implica la espectroscopia de fotones en la regin de radiacin ultravioleta-visible. Utiliza la luz en los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo (IR) cercano. En esta regin del espectro electromagntico, las molculas se someten a transiciones electrnicas.

Esta tcnica es complementaria de la espectrometra de fluorescencia, que trata con transiciones desde el estado excitado al estado basal, mientras que la espectrometra de absorcin mide transiciones desde el estado basal al estado excitado. APLICACIONES La espectrometra UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinacin cuantitativa de soluciones de iones metlicos de transicin y compuestos orgnicos muy conjugados. Soluciones de iones metlicos de transicin Las soluciones de iones metlicos de transicin pueden ser coloreadas (es decir, absorben la luz visible) debido a que los electrones en los tomos de metal se pueden excitar desde un estado electrnico a otro. El color de las soluciones de iones metlicos se ve muy afectado por la presencia de otras especies, como algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color de una solucin diluida de sulfato de cobre es muy azul; agregando amonaco se intensifica el color y cambia la longitud de onda de absorcin mxima. Compuestos orgnicos Los compuestos orgnicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugacin, tambin absorben luz en las regiones del espectro electromagntico visible o ultravioleta. Los disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles en agua, o el etanol para compuestos orgnicos solubles. Los disolventes orgnicos pueden tener una significativa absorcin de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso en espectrometra UV. El etanol absorbe muy dbilmente en la mayora de longitudes de onda. La polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la absorcin del espectro de un compuesto orgnico. La tirosina, por ejemplo, aumenta su mximo de absorcin y su coeficiente de extincin molar cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando disminuye la polaridad de los disolventes. Aunque los complejos de transferencia de carga tambin dan lugar a colores, stos son a menudo demasiado intensos para ser usados en mediciones cuantitativas.

La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solucin es directamente proporcional a la concentracin de la solucin. Por tanto, la espectrometra UV/VIS puede usarse para determinar la concentracin de una solucin. Es necesario saber con qu rapidez cambia la absorbancia con la concentracin. Esto puede ser obtenido a partir de referencias (las tablas de coeficientes de extincin molar) o, con ms exactitud, determinndolo a partir de una curva de calibracin. El espectrofotmetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR). La presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional a la concentracin. Para resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito debe compararse con la respuesta a un estndar, lo que es muy similar al uso de curvas de calibracin. La respuesta (por ejemplo, el pico de altura) para un concentracin particular se conoce como factor de respuesta. LEY DE BEER-LAMBERT La espectrometra UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para determinar las concentraciones de especies absorbentes en solucin, usando la Ley de Beer-Lambert: donde A es la absorbancia medida, I0 es la intensidad de la luz incidente a una determinada longitud de onda, I es la intensidad de transmisin, L la longitud de ruta a travs de la muestra, y c la concentracin de las especies absorbentes. Para cada especie y longitud de onda, es una constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extincin. Esta constante es una propiedad fundamental molecular en un solvente dado, a una temperatura y presin particular, y tiene como unidades 1/M * cm o, a menudo, U/M * cm. La absorbancia y extincin a veces son definidas en trminos de logaritmo natural en lugar de logaritmo de base 10. La ley de Beer-Lambert es til para la caracterizacin de muchos compuestos, pero no sirve como relacin universal para la concentracin y absorcin de todas las sustancias. En molculas complejas de gran tamao, como los tintes orgnicos

(Xylenol Naranja o Rojo Neutro, por ejemplo), a veces se encuentra una relacin polinmica de segundo orden entre la absorcin y la concentracin. ESPECTROFOTMETRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE El instrumento utilizado en la espectrometra ultravioleta-visible se llama espectrofotmetro UV-Vis. Mide la intensidad de luz que pasa a travs de una muestra (I), y la compara con la intensidad de luz antes de pasar a travs de la muestra (Io). La relacin I / Io se llama transmitancia, y se expresa habitualmente como un porcentaje (%T). La absorbancia (A) se basa en la transmisin: A = - log (%T) Las partes bsicas de un espectrofotmetro son una fuente de luz (a menudo una bombilla incandescente para las longitudes de onda visibles, o una lmpara de arco de deuterio en el ultravioleta), un soporte para la muestra, una rejilla de difraccin o monocromador para separar las diferentes longitudes de onda de la luz, y un detector. El detector suele ser un fotodiodo o un CCD. Los fotodiodos se usan con monochomadores, que filtran la luz de modo que una sola longitud de onda alcanza el detector. Las rejillas de difraccin se utilizan con CCDs, que recogen la luz de diferentes longitudes de onda en pxeles. Un espectrofotmetro puede ser nico o de doble haz. En un instrumento de un solo haz (como el Spectronic 20), toda la luz pasa a travs de la clula muestra. La Io debe medirse retirando la muestra. Este fue el primer diseo, y todava est en uso en la enseanza y laboratorios industriales. En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Un haz se utiliza como referencia, y el otro haz de luz pasa a travs de la muestra. Algunos instrumentos de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz de referencia y el de la muestra se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos haces pasan a travs de un bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de muestra y la del haz de referencia. Las muestras para espectrofotometra UV-Vis suelen ser lquidas, aunque la absorbancia de los gases e incluso de los slidos tambin puede medirse. Las muestras suelen ser colocadas en una clula transparente, conocida como cubeta. Las cubetas suelen ser rectangulares, con una anchura interior de 1 cm. Esta anchura se convierte en la longitud de ruta, L, en la Ley de Beer-Lambert. Tambin se pueden usar tubos de ensayo como cubetas en algunos instrumentos.

Las mejores cubetas estn hechas con cuarzo de alta calidad, aunque son comunes las de vidrio o plstico. El cristal y la mayora de los plsticos absorben en el UV, lo que limita su utilidad para longitudes de onda visibles. ESPECTRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE Un espectro ultravioleta-visible es esencialmente un grfico de absorbancia de luz frente a una longitud de onda en el rango del ultravioleta o la luz visible. Este espectro puede ser producido directamente con los espectrofotmetros ms sofisticados, o bien pueden registrarse los datos de una sola longitud de onda con los instrumentos ms simples. La longitud de onda se representa con el smbolo . Del mismo modo, para una determinada sustancia, puede hacerse un grfico estndar del coeficiente de extincin () frente a la longitud de onda (). Es te grfico estndar sera efectivamente "la concentracin corregida" y, por tanto, independiente de la concentracin. Para una sustancia determinada, la longitud de onda en la cual se produce el mximo de absorbancia en el espectro se llama max, y se pronuncia "lambda-max". Las reglas de Woodward-Fieser son un conjunto de observaciones empricas que pueden utilizarse para predecir max, la longitud de onda de la absorcin UV -Vis, para compuestos orgnicos conjugados como dienos y cetonas. Las longitudes de onda de los picos de absorcin pueden correlacionarse con los tipos de enlace en una determinada molcula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales dentro de la molcula. La absorcin UV-Vis no es, sin embargo, una prueba especfica para ningn compuesto determinado. La naturaleza del disolvente, el pH de la solucin, la temperatura, la concentracin de electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden influir en los espectros de absorcin de los compuestos, as como las variaciones en la anchura de la hendidura (ancho de banda efectivo) en el espectrofotmetro.