Professional Documents
Culture Documents
Ana Paula Ferro Bruna Polacchine da Silva Cidnei Marschalk Fabiane Cristina dos Santos Thatiane Rodrigues Mota Vernica Sayuri Nishida Prof Dra. Rosane Marina Peralta
1 Introduo
1.1-Amilase
A -amilase (1,4--D-glicano glicanoidrolase) possui atividade endohidroltica e atua aleatoriamente sobre ligaes glicosdicas -1,4, produzindo uma mistura de glicose, maltose, maltotriose e dextrinas, podendo ser encontrada em animais, plantas, fungos e bactrias. Amilases so membros da famlia das amilases ou famlia 13 das glicosdeo hidrolases (GH13), classificao esta, baseada na similaridade das sequncias de aminocidos (HENRISSAT e BAIROCH, 1996) e cuja relao estrutural e evolucionria com outros membros da famlia das glicosdeo hidrolases vem sendo amplamente investigada (JANEEK, 1997; PUJADAS e PALAU, 2001). As -amilases compartilham a estrutura barril (/)8, similar a encontrada para a triose fosfato isomerase (TIM) e ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), apresentando no entanto, caractersticas distintas em sua estrutura primria que as diferem da TIM e CGTase. O tipo de arranjo estrutural encontrado nas -amilases pode ser evidenciado tambm nas famlias GH-70 e GH-77 das glicosdeo hidrolases, desta forma, as famlias GH-13, GH-70 e GH-77 foram organizadas em um novo grupo, GH-H, que reflete aspectos evolutivos mais prximos entre seus membros, como por exemplo, os resduos catalticos e a disposio espacial dos mesmos (VIEIRA-JUNIOR, 2001).
1.2Mtodo de Bradford
O mtodo de Bradford uma tcnica para a determinao de protenas totais que utiliza o corante de Coomassie brilliant blue BG-250. Este mtodo baseado na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas que contm aminocidos de cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH de reao, a interao entre a protena de alto peso molecular e o corante BG250 provoca o deslocamento do equilbrio do corante para a forma aninica, que absorve fortemente em 595nm, tem sido utilizado para a determinao de protenas totais em diversos meios: plasma ou soro sanguneo, lquor, saliva humana, produtos alimentcios, leite humano, tecidos de plantas, suspenses de clulas, avidina e estreptoavidina, urina e detergentes. As metodologias utilizando equipamentos automatizados esto tornando este mtodo mais rpido. Apesar do mtodo de Bradford ser mais rpido, sensvel e estar sujeito a um nmero bem menor de interferentes que o mtodo de Lowry, o mesmo apresenta algumas desvantagens, tais como a variao da absortividade especfica para diferentes protenas, devido baixa solubilidade ou baixo peso molecular das mesmas e fornecimento de resultados nem sempre reprodutveis devido ao grau de pureza do corante BG-250 que varia conforme a procedncia, sendo recomendvel a padronizao das condies de reao para cada lote de corante adquirido. No caso de amostras com protenas de baixo peso molecular, no recomendado a utilizao deste mtodo.
Existem substncias que so interferentes no mtodo de Bradford, e estes interferentes normalmente reagem com as protenas impedindo a reao com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando aumento na absorbncia (Tabela 1).
Tabela1: Algumas substncias que interferem na determinao de protenas totais.
Figura 1: Reao de oxidao da carbonila pelo reagente DNS. Fonte: MILLER, 1959.
As tcnicas de separao de protenas podem ser classificadas em trs categorias: alta produtividade e baixa resoluo; alta resoluo e baixa produtividade; alta resoluo e alta produtividade. As tcnicas de baixa resoluo e alta produtividade so usadas na concentrao das protenas. Em seguida, para o fracionamento das protenas so utilizadas as tcnicas de alta resoluo e baixa produtividade ou alta resoluo e alta produtividade (GHOSH, 2003). Os processos de bioseparao comumente usados na concentrao, purificao e fracionamento de protenas esto apresentados na Tabela 2. A ultrafiltrao listada em duas categorias, sendo que a resoluo do processo depende do produto que ser obtido e da forma que o processo ser operado.
Tabela 2. Tcnicas de bioseparao de protenas.
Categorias
Processos Precipitao Centrifugao Extrao lquido-lquido Microfiltrao Ultrafiltrao Extrao supercrtica Cromatografia em leito empacotado Ultracentrifugao Separao por afinidade Eletroforese Cromatografia com fluido supercrtico Cromatografia em leito fluidizado Cromatografia em membrana Ultrafiltrao Cromatografia de coluna com monlitos
interesse das que tm caractersticas (de tamanho) radicalmente diferentes. Tambm pode ser empregada para mudar o ambiente do tampo ou para retirar o sal de uma amostra de biopolmeros, como por exemplo, a remoo de sal em amostras contendo protenas precipitadas por salting out, sendo um processo menos moroso do que a dilise. Finalmente, a cromatografia pode ser implementada como um meio para determinar parmetros moleculares como o raio hidrodinmico e a comum massa molecular, o que conseguido usando, por exemplo, protenas de peso molecular bem conhecido e traando uma reta de calibrao, como ser descrito a seguir (HUBER, 2000). De acordo com DEUTSCHER et al. (1990) na cromatografia de excluso molecular, um volume de eluio do pico do soluto (Vr) de substncias de peso molecular elevado (MW), tendo um coeficiente de distribuio, aproximadamente, de 1.0 coincide com o volume de espaos vazios, intra partculas da coluna (Vm). Para molculas com um coeficiente de distribuio menor que 1.0, existe uma relao linear entre o log (MW) e o volume ou tempo de eluio do soluto. Assim, em condies ideais, a ordem de eluio pode ser prevista, geralmente, pelo tamanho de molculas uma vez que existe uma relao linear entre o seu volume de eluio e o valor logartmico do seu peso molecular (MIKES, 1988). exibido, esquematicamente, o grfico de calibrao na Figura 2. Em determinadas gamas do peso molecular (MW) de um soluto ou nanopartculas existe uma dependncia linear de log (MW) com o volume de eluio ou o tempo de reteno, intervalo 2. Molculas maiores so excludas e no separadas numa situao como a do intervalo 1. Molculas menores penetram completamente na fase estacionria e no esto separadas na situao do intervalo 3.
Figura 2. Representao esquemtica da dependncia do peso molecular dos solutos (MW) com o tempo de reteno, onde V0 o volume de espaos vazios e Vt o volume total da coluna.
A CEM apresenta a vantagem de requerer pequenas quantidades de material a ser analisado e propicia ainda medies diretas, as quais resultam em avaliaes de propriedades das substncias. Para se conseguir uma boa resoluo fundamental a escolha do gel (matriz), o tamanho da amostra e a qualidade do enchimento da coluna. De um modo geral, deve-se escolher um gel em que as molculas de maior dimenso saiam com o volume de espaos vazios. Na cromatografia em coluna, o slido utilizado na fase fixa deve ser um material insolvel na fase mvel associada (eluente); sendo que os mais empregados so a slica gel
5
(SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de p finamente dividido. A mistura a ser separada colocada na coluna com um eluente pouco polar, aumentando-se gradativamente a polaridade do eluente e, consequentemente, o seu poder de arraste de substncias mais polares. O fluxo de eluente deve ser contnuo para no haver o ressecamento do material que preenche a coluna (recheio). Os diferentes componentes da mistura movem-se com velocidades distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor com o adsorvente) e tambm pelo eluente. Assim, a capacidade de um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase diretamente da polaridade do solvente em relao ao composto. medida que os compostos da mistura so separados, bandas ou zonas mveis comeam a ser formadas; cada banda contendo somente um composto. De um modo geral, os compostos apolares atravessam a coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros tm menor afinidade com a fase estacionria. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela no se mover. Por outro lado, se for escolhido um solvente muito polar, todos os solutos podem ser eludos sem serem separados. Com uma escolha cuidadosa das condies (adsorvente, eluente, tamanho da coluna, velocidade de eluio), praticamente qualquer mistura pode ser separada (Figura 3).
Tempo 0 Tempo 1 Tempo 2 Tempo n
Figura 3. Ilustrao de uma cromatografia de excluso molecular, em que a amostra passada atravs da coluna e separada conforme seus pesos moleculares. As fraes so coletadas e analisadas.
Trs parmetros permitem avaliar a eficincia do processo de purificao de uma protena: - Atividade especfica (AE): a razo entre a quantidade da protena de interesse, medida atravs de sua atividade biolgica, e a quantidade total de protenas presentes em cada etapa de purificao. Esse ndice aumenta ao longo da purificao; - ndice de purificao: indica quantas vezes em relao ao material de partida a protena de interesse foi concentrada. Calcula-se como a razo entre as atividades especficas inicial (material de partida) e final (protena pura); - Rendimento: indica quanto (em %) da protena de interesse ativa presente no material de partida foi recuperado ao final da purificao. Um certo grau de perda inerente do
6
processo de purificao (em cada etapa s devem ser processadas as fraes mais ricas em atividade biolgica, desprezando-se aquelas que apresentam pouca atividade). Tambm podem ocorrer perdas por desnaturao das protenas devido s diferentes condies (pH, sais, etc) a que so submetidas nas diferentes etapas de purificao. Espera-se recuperar o mximo possvel da protena de interesse.
relao emprica. A tcnica de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (muitas vezes referida como SDS-PAGE do ingls sodium dodecyl sulfate-poliacrylamide gel electrophoresis), rpida, sensvel e capaz de alto grau de resoluo. Basta uma quantidade de 0,1g ( 2pmoles) de uma protena para dar uma faixa distinta com azul de Coomassie, e at menos ( 0,02g) pode ser detectado na colorao com prata. Protenas que difiram em massa por cerca de 2% (por exemplo, 50 e 51KDa, provenientes de uma diferena em torno de 10 aminocidos) podem geralmente ser distinguidas. Podemos examinar a eficcia de nosso esquema de purificao, analisando uma parte de cada frao por eletroforese. A frao inicial apresentar de dzias a centenas de protenas. Na medida em que progride a purificao, o nmero de faixas diminui e a salincia de uma das faixas aumenta. Esta faixa corresponde s protenas de interesse (BERG et al., 2008). Para a anlise do gel deve-se medir, com o auxlio de uma rgua, a distncia percorrida pelo corante azul de bromofenol, a dos marcadores de peso molecular e da amostra estudada. Posteriormente deve-se calcular o Rf (mobilidade relativa), dividindo a distncia percorrida por cada marcador pela distncia percorrida pela corante. Assim, constri-se um grfico plotando na abcissa os valores de Rf e na ordenada os logaritmos dos pesos moleculares dos padres. Para a anlise da amostra deve-se interpolar na reta o Rf da amostra, e assim, determinar seu peso molecular (BRACHT et al., 2003).
2 Objetivos
2.1 Objetivo geral
Purificar e caracterizar a amilase pancretica suna comercial.
3 Materiais e Mtodos
3.1 Dosagem de Protenas
As protenas foram dosadas pelo mtodo de Bradford (1976), utilizando-se soro albumina bovina como padro. Amostra: diluio 1:1 (10mg de -amilase em 10mL de tampo fosfato-sdio 20mM com NaCl 100mM, pH 6,9). 3 tubos de ensaio: 1) Branco: 0,25mL de gua destilada + 2,5mL de reagente de Bradford; 2/3) Amostra (duplicata): 0,25mL amostra (1:1) + 2,5mL de reagente de Bradford.
8
Esperou-se 5 min a temperatura ambiente e em seguida, a leitura foi realizada em espectrofotmetro (Shimadzu UV 1800) em 595nm. Clculo: fator de Bradford (0,168) x Abs= mg/mL Obs: na preparao da amostra enzimtica, esta foi bem homogeneizada para a total dissoluo. Como isso no ocorreu, a amostra foi submetida a centrifugao a 5000rpm/5min (Jouan BR 4i refrigerada). Aps a preparao da amostra, esta foi mantida sempre em banho de gelo.
tubos e estes foram levados ao espectrofotmetro para medir a absorbncia a 610nm. Foram lidas somente as amostras que apresentaram indcios de corante (amostras 8 a 12) e a partir das absorbncias o volume morto foi determinado.
q.s.p. 50 mL de gua destilada. Esta soluo foi fornecida pronta. 4 - Azul de bromofenol a 0,02% em gua 2 g de azul de bromofenol gua suficiente para completar 100 mL. Esta soluo foi fornecida pronta. 5 - Preparo da amostra 50,0 l da amostra 50,0 l de sacarose a 40% preparada em tampo de corrida 5,0 l de azul de bromofenol a 0,02% 6- soluo de fixao do gel 100 mL de cido actico 400 mL de etanol Completar o volume para 1,0 L com gua destilada. 7- soluo de colorao Coomassie Blue G-250 0,5 g de CoomassieBlue G-250
gua bi destilada em q.s.p. 10 ml Agitar por alguns minutos. O corante no se dissolvera completamente. Para a realizao da eletroforese desnaturante da protena obtida aps coluna de Sephadex G-50 foi primeiramente montado o sistema de placas de vidro para a aplicao do gel e amostras. As placas foram limpas com lcool e mantidas juntas pelo sistema de suporte e presilhas. Aps o encaixe das placas de vidro no sistema, foi adicionado gua destilada entre as placas para verificao de possveis vazamentos. Com o sistema de placas de vidro montado, foi preparado o gel de poliacrilamida a 40% seguindo protocolo. Foram tomados os cuidados no manuseio da acrilamida, por esta ser neurotxica. O persulfato de amnia foi preparado no momento da aplicao e adicionado por ltimo, pois se decompe em sulfato de amnia, o qual no possui atividade cataltica. Aps o preparo do gel de poliacrilamida, este foi colocado entre as placas de vidro e o pente foi colocado na margem superior, entre as placas, para que fossem formados os poos onde posteriormente se adicionaria as amostras. Aguardou-se a polimerizao do mesmo, sendo este colocado em estufa para acelerar a polimerizao. Com o gel polimerizado, o sistema foi colocado na cuba eletrofortica, com a parte chanfrada para o interior, e adicionado o tampo de corrida.
11
Foi adicionado em cada amostra uma soluo contendo sacarose (40%), para conferir densidade, e azul de bromofenol a 0,02%, para marcar as protenas e determinar o fim da corrida. No foi necessrio adicionar ao padro de peso molecular sacarose e azul de bromofenol, pois este foi adquirido comercialmente com o marcador e densidade correta. Com o gel polimerizado, foram adicionados aos poos 50L de amostra (duplicata) e 25L de padro. A cuba eletrofortica, contendo o tampo de corrida, as amostras e o padro, foi conectada a uma fonte de 150V e 50mA. A corrida eletrofortica durou 2 horas e 30 minutos e o azul de bromofenol atingiu a base do sistema, sendo interrompido o fornecimento de energia cuba. Aps o trmino da corrida, o sistema de placas foi desmontado da cuba eletrofortica. O gel foi retirado cuidadosamente e colocado na soluo de fixao (cido actico, etanol e gua) por 30 minutos. Aps a fixao do gel, este permaneceu overnight em soluo de colorao com Coomassie blue G-250 coloidal. Em seguida, o corante foi retirado com lavagens repetidas utilizando gua bi destilada e foi conservado em cido actico para posterior visualizao de suas bandas. A anlise da corrida foi feita medindo-se a distncia entre o ponto de aplicao da amostra e o fronte da corrida e da distncia do ponto de aplicao da amostra e o meio da banda da mesma. Com estes dados, realizou-se o clculo do Rf (distncia da amostra/distncia total da corrida). Fez-se este mesmo clculo para o marcador de peso molecular e assim foi possvel encontrar o peso molecular das amostras aps clculo da reta com os padres e interpolao do Rf da amostra.
4 Resultados e Discusso
4.1 Dosagem de protena
Abs 1: 0,212 Abs 2: 0,213 Mdia das Abs: 0,2125 Clculo: fator de Bradford (0,168) x Abs= mg/mL 0,168 x 0,2125= 0,0357mg/mL Ou: 35,7g/mL quantidade de protena por mL de soluo.
12
O mtodo utiliza a quantificao de acares redutores liberados na reao para obter (quantitativamente) atividade amiloltica. Portanto 132,52 U de enzima (-amilase) produziram 1mol de acar redutor por minuto nas condies do ensaio.
13
Absortividade molar
Comprimento de onda
O grfico 2 mostra o perfil protico das 15 fraes eludas da coluna (linha azul) e tambm mostra a atividade amiloltica testada em cada uma delas (linha vermelha). Foram lidas somente 15 amostras, pois as 30 fraes iniciais eludas foram reunidas aos pares. O mesmo grfico nos mostra uma regio, na qual o pico de absoro de protena e o pico de atividade
14
amiloltica se sobrepem. Com este resultado, podemos inferir que as fraes eludas correspondentes a esta regio, referem-se a protena de nosso interesse, a amilase. Somente com a leitura a 280nm no possvel tirar nenhuma concluso concreta, j que trs picos sobressaem no grfico. Como o extrato utilizado foi de uma protena comercial, esta somente previamente purificada, apresentando outras protenas no material. Por isso, o resultado no mostrou um nico pico, pois h outras protenas no extrato. O teste da atividade amiloltica importante para determinar quais picos referentes ao perfil proteico correspondem amilase. Dessa forma, foram testadas cada frao com o substrato especfico da amilase, o amido, confirmando a regio em que a amilase se encontra, ou seja, as amostras que a contm. Pela anlise, foram escolhidas quatro fraes, correspondentes aos tubos 5 a 8 e s amostras (9 a 16), pois apresentaram os maiores valores de atividade especfica. No grfico, so os quatro maiores pontos de atividade. Optamos por descartar os demais pontos, e, por conseguinte, as amostras para posterior liofilizao e uso da enzima, para deixa-l o mais pura possvel, eliminando assim, alguns contaminantes que so considerados os outros pontos. Perde-se um pouco de material, mas isso torna-se insignificante, quando pensamos em processos posteriores, nos quais os contaminantes iro interferir.
Fra es 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Abs 0,079 0,074 0,076 0,087 0,256 0,437 0,363 0,259 0,164 0,163 0,126 0,128 0,112 0,101 0,094
Ativida de amilolt ica 0,70 0,66 0,68 0,78 2,30 3,92 3,26 2,32 1,47 1,47 1,13 1,15 1,00 0,90 0,84
15
4.6 Recuperao
Durante os procedimentos de fracionamento protico, o mais importante fator a ser seguido a recuperao da protena em estudo, seja pela atividade enzimtica (enzima), pela bioatividade (protena no-enzimtica) ou por algum mtodo capaz de quantificar o componente desejado, como por exemplo, a anlise eletrofortica. O segundo ponto mais importante o conhecimento da quantidade total de protenas presentes na frao da qual se coletou a protena em estudo. A partir desses dois dados, o percentual de recuperao pode ser calculado. Os resultados obtidos para a amilase esto dispostos nas tabelas 3 e 4, seguem abaixo.
Tabela 3. Resultados detalhados da atividade amiloltica e % de recuperao da protena.
Etapa s Volume
(mL)
Atividade amilase
amostra adicionado na coluna 132,52 em 1 mL, 26,50 mas queremos 4 saber em 0,2 mL 132,52 -1mL x -0,2mL x= 26,504
enzima, cada um continha 2mL (4X2=8) Pegamos os valores referentes aos 4 tubos (5 a 8) e 23,6 multiplicamos por 2, pois so 2 mL em cada tubo 2,3 x 2= 3,92 x 2= 4,6
Recupera o (%)
100%
89%
7,8 4 3,26 x 2= 6,5 2 2,32 x 2= 4,6 4 Agora somamos: 23,6 U/mL 26,504 -100% 23,6 -- x x= 89%
Etapas
% Recuperao
100% 89%
O percentual de recuperao para a amilase foi de 89%, valor considerado relativamente alto. Isso nos leva a concluir que o mtodo de purificao utilizado para essa protena foi eficaz e com taxa alta de recuperao.
17
Figura 5 Gel de SDS-PAGE, (1) Enzima no desnaturada (sem ferver), (2) padro de peso molecular, (3) enzima desnatura (fervida).
Pelo resultado da primeira banda, pode se inferir que no apresenta pureza, tendo em vista que a banda obtida foi consideravelmente espessa. Esta impureza foi constatada na terceira amostra, com 3 bandas, provavelmente devido aos contaminante que no processo de fervura se soltaram. A primeira hiptese foi que a enzima em questo dimrica, mas essa hiptese foi descartada, pois como conhecemos que a estrutura da -amilase de sunos monomrica. A segunda hiptese foi que a amostra no estava totalmente pura, e esta hiptese a verdadeira, pois, tendo em vista que uma enzima comercial, ela possui contaminantes proticos e, por isso, apresentou duas bandas, sendo separadas pelo processo de fervura. Esperava-se oito bandas no padro comercial, entretanto apareceram apenas 2 bandas, fato este no elucidado, pois o mesmo encontrava-se dentro do prazo de validade e armazenado adequado. Aps a corrida eletrofortica, mediu-se, com o auxlio de uma rgua, a corrida total (a partir do ponto de aplicao da amostra at o fronte da corrida), sendo esta igual a 9,1 cm de comprimento, da enzima desnaturada (do ponto de aplicao at o meio da banda obtida) e 3,5 cm da enzima no desnaturada 2,8 cm.
Tabela 6 Valores de pesos moleculares do padro, log do peso molecular, distncia dos padres e Rf.
Massa molecular
Log do peso
Distncia percorrida
Rf
18
(KDa) Albumina Ovalbumina G3PD Anidrase carbnica tripsinognio Inibidor da tripsina de soja - lactoalbumina aprotinina 66.000 45.000 36.000 29.000 24.000 20.000 14.200 6.500
molecular 4,82 4,65 4,56 4,46 4,38 4,30 4,15 3,81 2,7 3,9 4,7 5,1 5,6 6,0 7,1 8,4 0,30 0,44 0,53 0,57 0,63 0,68 0,80 0,94
Aps a anlise do gel o grfico foi plotado (grfico 3) e o peso molecular das protenas em questo obtido pelo clculo do Rf de cada amostra e interpolao na equao da reta. O Rf da amostra 1 foi de 0,3076 e o da amostra 3 foi de 0,3846.
6 LogPes o Molecula r (k D a ) 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0 0,2 0,4 R f 0,6 0,8 1 Srie1 Linear (Srie1) y =-1,5441x +5,3351 R =0,981
2
Para a amostra 1 temos: Rf da amostra1: 2,8/9,1 = 0,3076 Amostra1: -1,5441 x + 5,3351 Amostra1: - 1,5441 . 0,3076 + 5,3351 Amostra1: 4,860 Amostra1: antilog = 104,860 = 72.443 KDa Para a amostra 3 temos: Rf da amostra2: 3,5/9,1 =0,3846 Amostra2: -1,5441 x + 5,3351
19
Amostra2: - 1,5441 . 0,3846+ 5,3351 Amostra2: 4,741 Amostra1: antilog = 104,741 = 55.080 KDa O resultado do gel de forma geral foi bom porque este apresentou um fundo lmpido e bandas ntidas. As amostras apresentaram os pesos moleculares de 72.443 KDa para a amostra 1 e 55080 KDa para a amostra 3. Esta diferena de valores pode ser atribuda a impurezas presentes na amostra visto que a amostra 1 no foi fervida, permanecendo os contaminantes, j em 3, temos apenas a enzima de interesse.
5 Referncias
BERG J. M.; TYMOCZKO, J. L.; STRYER, L. Bioqumica, 6 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008, Captulo 3: Explorando protena e proteomas, p. 73-75. BRACHT, A.; ISHII-IWAMOTO, E. L., PERALTA, R. M. Mtodos de laboratrio em bioqumica, Captulo 8: Procedimentos de isolamento e fracionamento de protenas, Editora Manole, 2003. CHIN, YU-PING & GSCHWEND, P.M. The abundance, distribution, and configuration of porewater organic colloids in recent sediments. Geochem. Chosmochem. Acta, 55:1309-1317, 1991. DEUTSCHER, M. P., 1990, Guide to Protein Purification; Academic Press, USA. GHOSH, R. Protein bioseparation using ultrafiltration: theory; applications and new developments. Imperial College Press, pp. 3 60, 2003. HENRISSAT, B., BAIROCH, A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. v.316, n.2, p.695-696, 1996. HUBER, C. G., 2000, Encyclopedia of Analytical Chemistry Biopolymer chromatography, R. A. Meyers, Wiley & Sons, Chichester, pp. 11250-11278. JANEEK, . -Amylase family: molecular biology and evolution. Prog. Biophys. Molec. Biol. v.67, n.1, p.67-97, 1997. MEYER, V.R. Practical High-performance liquid chromatography. West Sussex, John Wiley & Sons, 1993. 376P. MIKES, O., 1988, High-performance Liquid Chromatography of Biopolymers and Biooligomers - Part B: Separation of Individual Compound Classes, Elsevier, The Netherlands. MILLER, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem., n. 31, p.426, 1959. NOVOTNY, E.H.; BLUM, W.E.H. & GERZABEK, M.H. Soil management system effects on size fractionated humic substances. Geoderma, 92:87-109, 1999.
20
PUJADAS, G., PALAU, J. Evolution of -amylases: Architectural features and key residues in the stabilization of the (/)(8) scaffold. Mol. Biol. Evol. v.18, n.1, p.38-54, 2001. SHAW, P.J.; JONES, R.I. & HAAN, H. Separation of molecular size classes of aquatic humic substances using ultrafiltration and dialysis. Environ. Technol. 15:765-774,1994. VIEIRA-JUNIOR, A. Seqncia e caracterizao molecular do cDNA de uma amilase expressa durante o amadurecimento da banana (Musa spp.). So Paulo, 2001. 87p. (Dissertao de Mestrado - Faculdade de Cincias Farmacuticas - USP). ZAIA, D.A.M.; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG J. Determinao de protenas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes, Qumica Nova, v. 21, n. 6, p. 787-793, 1998.
21