PRACTICAS Curso 2002/2003 RECURSOS VIVOS EXPLOTABLES MARICULTURA VEGETAL

Lunes y viernes de 15,00 a 19,00 Lugar: Centro de Algologa Aplicada Muelle de Taliarte s/n, Telde Tlfno.: 928 133290 Martes, mircoles y jueves de 13,00 a 17,00 Lugar: Laboratorio B-1 Edif. Ciencias Bsicas / FCM Relacin de grupos y fechas Grupo 1.- Lunes 31/3 Viernes 4/4 Grupo 3.- Lunes 7/4 Viernes 11/4 Grupo 2.- Lunes 21/4 Viernes 25/4 Grupo 5.- Lunes 5/5 - Viernes 9/5 Grupo 4.- Lunes 12/5 Viernes 16/5 Grupo 6.- Lunes 19/5 Viernes 23/5

Relacin de prcticas: N1.- Cultivo, cosechado y procesado de microalgas y cianobacterias de interes industrial N2.- Cultivo intensivo de macroalgas de inters industrial / Policultivo N3.- Ficocoloides N4.- Aplicacin de algas en cosmtica N5.- Aplicacin de algas en alimentacin humana

Nombre del alumno: Grupo:

PRACTICA N 1.- CULTIVO, COSECHADO Y PROCESADO DE MICROALGAS Y CIANOBACTERIAS DE INTERS INDUSTRIAL

Objetivos Demostrar y ensear como se realiza: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Preparacin de medios de cultivo Mantenimiento de cepas en las Colecciones de Cultivo Escalado de cultivos desde la cepa en placas al sistema de cultivo intensivo Clculo de la tasa de crecimiento y del tiempo de duplicacin de la biomasa Control las variables que afectan al cultivo Reconocer diferentes sistemas de cultivo intensivo de microalgas Reconocer los diferentes procedimientos para el cosechado y secado de la biomasa 8. Identificar las microalgas de inters industrial Material y Metodologa Material biolgico Las algas utilizadas para la realizacin de los ensayos sern cedidas por el Banco Nacional de Germoplasma de Algas (BANGAL): Chlorella sp. Microalga verde aislada (BANGAL 001, 1995) del agua de tratamiento secundario de la Estacin Depuradora de Aguas Residuales Urbanas (EDAR) del Sudeste (Arinaga, Gran Canaria) Spirulina platensis (Geitler) variedad Lonar (BANGAL 17), aislada del lago Lonar (Pargaonkar) en la India (el lago Lonar puede alcanzar 40g L-1 de sales en poca de sequa). Spirulina es una cianobacteria (microalga verde-azul) filamentosa caracterstica de aguas salobres y fuertemente alcalina. La gran demanda de Spirulina se debe fundamentalmente a: su alto contenido en protenas (60-70% peso seco), cido gamma-linolnico y ficocianinas (ambas con propiedades teraputicas), y su capacidad de absorber minerales esenciales del medio. Dunaliella salina (Teodoresco) BANGAL 421 asilada en 1992 de pozas de cristalizacin de las salinas de Pozo Izquierdo, en el sur de Gran Canaria. Es uno de los microorganismos ms halotolerante conocidos, cuyo rasgo ms caracterstico en el de acumular grandes cantidades de caroteno en condiciones de cultivo causantes de estrs: Escasa disponibilidad de nutrientes, baja temperatura, alta salinidad y elevada irradiacin.

Etapas de trabajo (esquema I) 1. Preparacin de medios de cultivo (Anexo I) El procedimiento para la preparacin de los medios de cultivo en laboratorio y en sistema intensivo, especficos para cada cepa, se detallan en el anexo 1 y son los siguientes: Chlorella Medio Mnimo (Sueoka, 1960) para cultivo en laboratorio de Chlorella (Tabla1) Medio Tamiya (Tamiya, 1968) modificado para cultivo intensivo de Chlorella (Tabla 2) Spirulina Medio Zarrouk (Zarrouk, 1966) para cultivo en cmara de Spirulina (Tabla 3) Medio Zarrouk-modificado para cultivo intensivo de Spirulina (Tabla 4) Dunaliella Medio de cultivo Semenenko & Adullaev (Semenenko & Adullaev, 1980) para Dunaliella en cmara de cultivo (Tabla 5) Medio Semenenko & Adullaev (Semenenko & Adullaev, 1980) modificado para cultivo intensivo de Dunaliella en una sola fase (Tabla 6) 2. Escalado del cultivo (ver esquema I) 2.1. Cultivo en laboratorio La activacin de cultivos se realiza mediante la transferencia de las cepas desde medios slidos a matraces de 50 ml, 1L y 2L que contiene medio lquido. Esta fase del escalado transcurre en el laboratorio en cmaras de cultivo termostatizadas, con control automtico de irradiacin, fotoperiodo e inyeccin de la mezcla de gases. Condiciones establecidas en la cmara de cultivo: Temperatura: Fotoperiodo: Irradiacin: Gases: 2.2. Cultivo en fotobioreactores Los cultivos se transfieren desde los matraces a los fotobioreactores cilndricos de 60 litros donde finalmente alcanzan la densidad de cultivo necesaria para inocular los sistemas intensivos. Esta fase del escalado se lleva a cabo en el exterior. 3. Sistema de cultivo intensivo El sistema que emplearemos son tanques tipo raceway (sistema de cultivo ms utilizado por su bajo coste de operacin y alta eficacia de produccin) de 8 m2 de superficie de cultivo til, agitacin por paletas (30 cm/s) e incorporacin de CO 2: aire por difusin. Los raceways se llenan con agua (10cm de profundidad) en la que diluyen los nutrientes, seguidamente se conecta el sistema de difusin de aire y se inoculan las algas procedentes de los fotobioreactores. 4. Control de los parmetros de cultivo 4.1. Parmetros abiticos (Anexo II) Diariamente se tomaran datos de: - pH y temperatura (C) empleando un pH-metro porttil equipado con una sonda de temperatura CRISON 507. - Irradiacin tomada en continuo por un sensor de irradiacin PAR y UV. Programa ELDONET
4.2. Parmetros biticos: Medidas de crecimiento (Anexo I; Anexo II)

Densidad ptica. Medida al espectrofotmetro de la absorbancia del cultivo a 750nm Clorofila. Mtodo colorimtrico de extraccin de las clorofilas empleando como solvente metanol 100% segn Wellburn (1989) para microalgas verde y segn Mckinney (1941) para cianobaterias. El contenido en clorofilas totales se expresa en g clorofila ml1 de cultivo. Tasa de crecimiento y tiempo de duplicacin de la biomasa, a partir de los datos de densidad ptica.

5. Cosechado de la biomasa El cosechado consiste en la separacin de las algas del medio de cultivo. Se realizar mediante bombeo desde los sistemas de cultivo A la separadora Westfalia 1000L en el caso de los cultivos de Chlorella y Dunaliella Y al sistema de filtracin con mallas para el cultivo de Spirulina. 6. Procesado de la biomasa El procesado consiste en la deshidratacin de la biomasa: Para ello emplearemos un atomizador Mobile Minor de la casa NIRO cuya capacidad de trabajo de 6 litros a la hora. Pesar la biomasa obtenida y determinar la produccin del cultivo (Anexo I). 7. Aplicaciones de la biomasa Muestra de las diferentes estrategias de presentacin del producto para consumo humano. Bibliografa citada Mckinney G (1941) Absorption of light by chlorophyll solutions. J. Biol. Chem. 150:315-322 Semenenko VE & Abdullaev AA (1980) Parametric control of -carotene biosynthesis in Dunaliella salina cells under conditions of intensive cultivation, Sov. Plant. Physiol. 27: 22-30. Sueoka N (1960) Mitotic replication of deoxyribonucleic acids in Chlamydomonas reinhardtii. Proc. Ntla. Acad. Sci. USA 46:83-91. Zarrouk C (1966) Contribution a lestude duna cyanophyce. Influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la croissance et la photosynthse de Spirulina maxima. Ph D Thesis, Paris. Wellburn AR (1994) The spectral determination of chlorophylls a and b, as well as total carotenoids, using various solvents with spectrophotometers of different resolution. J. Plant Physiol. 144: 307-313. Bibliografa recomendada Becker, EW (1994). Microalgae biotechnology and microbiology. Cambridge University Press, Cambridge. 293pp. Borowitzka, M A & Borowitzka, L J (Eds) (1988). Micro-algal biotechnology. I ed. Cambridge University Press, Perth, Australia. 477 pp. Isaac S & Jennings D (1995) Microbial culture. Bios Scientific Publishers. Liverpool. 133 pp Richmond, A (Ed) (1986). Handbook of Microalgal Mass Culture. I ed. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA. 528 pp. Canter-Lund H, Lund JWG (1995) Freshwater algae. Their microscopic world explored Microalgae. Bipress Ltd. I ed. Bristol 360 pp. Vonshak A (1997) Spirulina platensis (Arthorspira): Physiology, cell-biology and biotechnology. Tylor & Francis. London. 233 pp.

ANEXO I PROCEDIMIENTOS DE TRABAJO 1. Preparacin de medios de cultivo

Tabla 1. Medio Mnimo (Sueoka, 1960) para el cultivo en cmara de Chlorella. Sal Solucin 1 NH4Cl CaCl2 2H2O MgSO4 Solucin 2 K2HPO4 KH2PO4 Solucin Trazas EDTA ZnSO4 7H2O H3BO3 MnCl2 4H2O FeSO4 7H2O CoCl2 6H2O CuSO4 5H2O (NH4)6Mo7O24 Sol. Madre (g/L) 16.00 2.04 4.00 37.42 14.52 50.00 22.00 11.40 5.06 4.99 1.61 1.57 1.10 Dilucin ml/L 25 Tabla 3. Medio de cultivo Zarrouk (1966) para el cultivo en cmara de Spirulina Sal NaHCO3 Na2CO3 K2HPO4 25 1 NaNO3 KSO4 NaCl MgSO4 7H2O CaCl2 2H2O FeSO4 7H2O Sol A5 +CO * Sol B6 * Concentracin g/L 13.61 1.03 0.50 2.50 1.00 0.20 0.04 0.01 0.05 1.00 ml 1.00 ml

Tabla 2. Medio Tamiya (Tamiya, 1968) modificado para el cultivo intensivo de Chlorella. Sal KNO3 MgSO4 KH2PO4 Solucin A FeSO4 EDTA Solucin B H3BO3 EDTA Solucin C MnSO4 CuSO4 ZnSO4 CoSO4 (NH4)6Mo7O24 EDTA g/L sol madre 273 10 154 6 0.5 111.5 124.5 143.5 140.5 85.0 25.0 Concentracin (g/L medio) 2.50 1.25 0.63 ml sol. Madre/L medio 0.1 0.1

Solucin A5 + Co * (g/ L agua destilada) H3BO3 2.86 MnCl2 4H2O 1.81 ZnSO4 7H2O 0.22 NaMoO4 2H2O 0.39 CuSO4 5H2O 0.079 Co(NO3) 2 6H2O 0.049 Solution B6 * (mg/ L agua destilada) VOSO4 5H2O 49.6 K2Cr2(SO4)4 2H2O 96.0 NiSO4 7H2O 47.8 Na2WO4 2H2O 17.9 TiOSO4 33.3 Co(NO3)2 6H2O 44.0

Tabla 4. Medio de cultivo Zarrouk para cultivo intensivo de Spirulina

Sal NaHCO3 KNO3 NaCl K2SO4 K2HPO4 KH2PO4 K(OH) MgSO4 EDTA FeSO4

Concentracin g/L 1600 2380 1000 1000 1000 390 160 200 60 8

Sal KNO3 KH2PO4 MgSO4 7H2O FeSO4 7H2O NaCl EDTA Solucin Fe-EDTA

Concentracin g/L** 5.00 1.25 50.00 0.009 116.0 0.037 2.00 ml

** Diluir 100 veces para cultivos en una sola fase

Tabla 5. Medio para cultivo de Dunaliella en cmara de cultivo (Semeneko & Adullaev 1980) Sal MgCl MgSO4 7H2O NaNO3 Ca(NO3)2 4H2O KH2PO4 Tris NaCl 116 1 ml 37.0 3.0 Concentracin g/L 0.376 0.492 0.850 0.365 0.68 6.5

Solucin Fe-EDTA EDTA FeSO4

Tabla 6. Medio para cultivo intensivo de Dunaliella (Semeneko & Adullaev 1980)

2. Determinacin de la densidad ptica

Tomar una muestra del cultivo y medir directamente al espectrofotmetro la densidad ptica a 750 nm. Hacer el blanco en el espectrofotmetro con agua destilada.

3. Determinacin de la concentracin de clorofila

1. 2. 3. 4. 5. Tomar 1ml cultivo y ponerlo en un tubo eppendorf (triplicado) Centrifugar 14000 r.p.m., 5 min. a 4C Retirar el sobrenadante y aadir 1 ml de metanol. Centrifugar a 140000 r.p.m., 5 min. 4C Recoger el sobrenadante y medir en el espectrofotmetro a las longitudes de onda indicadas en las frmulas correspondientes. Las concentraciones vienen dadas en g/ml

Ecuaciones para Chlorella y Dunaliella (Wellburn, 1994) Cl a = 15.65 A666 - 7.34 A653 Cl b = 27.05 A653 - 11.21 A666 Ecuaciones de para Spirulina (McKinney, 1941) Cl a = 13.9 A665

4. Determinacin de la tasa de crecimiento

La tasa de crecimiento representa el crecimiento por unidad de biomasa (expresada en funcin de la densidad ptica en este experimento). Para determinarla, normalizar los valores de absorbancia y representarlos en escala logartmica frente al tiempo en horas. La tasa de crecimiento viene dada por pendiente de la fase logartmica de crecimiento. El tiempo de duplicacin g de la biomasa se calcula segn la ecuacin: g = ln2/ = 0.693/

Latencia Exponencial Transicin Estacionaria TIEMPO

Senescencia

5. Determinacin de la produccin
Expresa los gramos de peso seco obtenidos despus de deshidratar la biomasa por la superficie de cultivo expresada en m2 y los das que se ha mantenido el cultivo desde su inoculo hasta el cosechado:

P= g PS/ m2 d

PRACTICA N 2.INTRODUCCION

CULTIVO INTENSIVO DE MACROALGAS DE INTERES INDUSTRIAL / POLICULTIVO

El desarrollo de sistemas de cultivo intensivo en tierra "indoor" surge a mediados de la dcada de los 70 (Neish et al. 1977; Ryhter et al. 1978) como resultado de la necesidad de desarrollar sistemas de produccin intensiva de macroalgas marinas de inters comercial como fuente alternativa de biomasa, debido a la sobreexplotacin de las poblaciones naturales. Los sistemas de cultivo intensivo indoor a diferencia de los realizados en mar abierto ("outdoor)", se caracterizan por una mayor produccin por unidad de superficie y un mayor control sobre el proceso de cultivo y sobre la calidad de la biomasa producida. El cultivo "indoor" puede ser realizado en diferentes sistemas de cultivo como tanques, estanques, tanques tipo raceways o en sistema de flujo por aspersin, con aporte discontinuo o continuo de agua (sistemas abiertos, cerrados, semicerrados). Una alternativa a la fertilizacin artificial la constituye el desarrollo de sistemas de biofiltracin de efluentes de piscifactorias en el que los nutrientes disueltos en el agua son asimilados por las algas (Neori et al. 1991; Jimnez del Ro et al. 1994). Existen una gran variedad de factores que regulan la eficacia (rentabilidad) de los sistemas de cultivo intensivo. Estos factores pueden ser de tipo abitico (irradiacin, carbono inorgnico disuelto, pH, oxgeno disuelto, nutrientes, temperatura, salinidad), biticos (densidad, morfologa de la planta, epifitismo) y/o tcnicos (aireacin, paletas, diseo del tanque). MATERIAL Y METODOS - Preparacin de tanques de cultivo: limpieza y tasas de renovacin. - Inoculacin de la biomasa de Gracilaria cornea (densidad 12 g l-1), Grateulopia doryphora (densidad 12 g l-1), Ulva sp. (densidad 2 g l-1), Enteromorpha compressa (densidad 2 g l-1). - Control de parmetros fsicos: - pH - temperatura - oxgeno disuelto - Cosechado y clculo de tasas de crecimiento y produccin a los t das. Las prcticas de cultivo se realizarn en un invernadero con tanques semicirculares y circulares de 750 y 1500 L de capacidad, donde se tendr en cuenta lo siguiente: - Cultivo en aguas residuales procedentes de tanque de cultivo de dorada (Sparus aurata). - Circuito abierto. - Desarrollo de flora epfta en los tanques/algas de cultivo. Calculo de la tasa especfica de crecimiento. Se calcula a partir de la estima de los incrementos de peso fresco escurrido con respecto al tiempo. Al referirnos a peso fresco escurrido hablamos de algas en el interior de redes suspendidas, de modo que, no presenten restos visibles de agua sobre la superficie del talo en el momento de la pesada. Segn DeElia y DeBoer (1978)

100 Ln( W t ) W0 = t
donde: = Promedio de crecimiento diario en porcentaje Wt= Biomasa alcanzada en t das W0= Biomasa inicial

Clculo de la produccin Segn DeBoer y Ryther:

N t - N 0 PS * t PH = gPSm-2 -1 P= d A
donde: P = Tasa de produccin (en PS) Nt-N0= Excedente en gramos de PH, a los t das. PS/PH= Relacin peso seco* / peso escurrido. A =Area de cultivo en metros cuadrados (1,7 y 1,2 m2)

El peso seco se determina con muestras secadas en estufa a 90 C durante 24 h. RESULTADOS Medicin de parmetros fsicos en el Muelle de Taliarte: - pH = - Temperatura (C) = - Salinidad (%o) = - Concentracin de O2 (mg l-1) = pH entrad a T (C) entrada pH tanque T (C) tanque O2 (mg/l) entrada O2 (mg/l) tanque

Tanque N/nombre macroalga

Fecha de inoculacin: Fecha de cosechado: n de das en cultivo: Relacin PS/PH (Gracilaria)= 0,1 Tanque N/nombre macroalga Di (g l-1) Df (g l-1) Peso (g) (%) Producc. (g PS m-2 d-1)

BIBLIOGRAFIA D'Elia C. F. & J. A. DeBoer. - 1978. J. Phycol. 14: 266-272. DeBoer J. & J. Ryther. - 1977. In: R. W. Krauss (ed.), pp 231-248. Oregon State University Press. Jimnez del Ro, M., Z. Ramazanov & G. Garca-Reina, 1994. Scientia Marina. 59 (4): 1-7. Neish, A. C.; P. F. Shacklock, C. H. Fox & F. J. Simpson 1977. Can. J. Bot., 55: 2263-2271 Neori, A., I. Cohen & H. Gordin, 1991. Bot. mar. 34: 483-489.

PRACTICA N 3.- FICOCOLOIDES OBJETIVOS Demostrar y ensear: 1. Los principios, las necesidades y la realizacin de una extraccin de agar, carragenatos y alginatos a escala de laboratorio 2. Cuales son los parmetros de caracterizacin y calidad de los diferentes ficocoloides y como se determinan 3. Cuales son las aplicaciones de cada tipo de ficocoloide dependiendo de sus caractersticas fsicoqumicas INTRODUCCION Los ficocoloides son polisacridos estructurales que se encuentran en la pared celular y en la matriz intercelular de algunas especies de Feofitas y Rodofitas. En algunos casos pueden llegar a constituir hasta el 60% del peso seco del alga, aunque en las extracciones comerciales las concentraciones oscilan entre un 20 y un 30%. Sus funciones biolgicas principales son las de mantener la integridad celular y generar fuerza mecnica. Los ficocoloides se clasifican en los siguientes tipos: - ALGINATOS: - AGAR: - CARRAGENATOS: extrados de Feofitas (Laminaria, Ascophyllum, Macrocytis) extrados de Rodofitas (Gelidium, Gracilaria) extrados de Rodofitas (Chondrus, Eucheuma)

Las aplicaciones especficas, mercado y precio de estos polisacridos dependen de su comportamiento en soluciones acuosas. Todos tienen gran poder viscosante y gelificante Los geles de agar y carragenato son termoreversibles y presentan grandes histresis de gelificacin Todos los geles aumentan su dureza al disminuir la temperatura y al aumentar la concentracin.

1.- AGAR Extraccin de agar de Gelidium y Gracilaria La principal diferencia entre la extraccin de agar de Gelidium y Gracilaria radica en la necesidad de efectuar una "hidrlisis alcalina" previa (con cualquier especie de Gracilaria) cuya funcin es la de aumentar la dureza del gel del agar mediante la: - hidrlisis de grupos sulfato y - transformacin de L-Galactosa 6 sulfato en 3,6 anhidro-galactosa 1.1.- Extraccin de agar de Gelidium Pretratamiento: Pesar 50 g de alga seca. Introducirlas en un vaso de precipitado con una solucin de 0.5 g de CO3Na2 en 800 ml de agua destilada. Calentar a 80 C durante 20 min agitando con una varilla de cristal. Despus de los 20 min, repetir tres veces el lavado del alga con agua del grifo. Extraccin: Filtracin: Introducir las algas en 1.5 L de agua destilada. Ajustar el pH entre 6.5 y 7.5 con cido fosfrico al 10%. Meter el matraz en el autoclave (1 kg cm-2) durante tres horas. Aadir 50 g de ayuda de filtracin (tierra de diatomeas) y filtrar con aire comprimido. El filtrado se vierte en una bandeja y se mete en el congelador a -20 C.

Al dia siguiente se descongelar a temperatura ambiente y luego se secar en la estufa y se moler.

1.2.- Extraccin de agar de Gracilaria Pretratamiento: Pesar 65 g de alga seca. Introducirlas en 1 L de una solucin de NaOH al 5%. Mantener a 70C durante 2 horas y media. Entonces lavar 3 veces durante 15 min con agua fria y una vez con 1.5 L de agua con 0.32 ml de SO4H2 durante 20 min. Extraccin: Meter las algas en 1.5 L de agua destilada, calentar y antes de hervir enfriar a 80C y ajustar el pH entre 6.4-6.6 con cido fosfrico al 10%. Picar las algas con la picadora. Hervir durante 30 min agitando con una varilla continuadamente. Aadir 50 g de ayuda de filtracin y filtrar con aire a presin. Verter el filtrado en una bandeja y congelar a -20C. Al dia siguiente se descongelar a temperatura ambiente y luego se secar en la estufa y se moler.

Filtracin:

1.3.- Determinacin del punto de fusin y punto de gelificacin 1.3.1.- Punto de fusin Preparar una solucin al 1.5% de agar en agua destilada. Disolver en una placa calefactora a reflujo durante 30 min cuando comienze a hervir. Poner 20 ml de la solucin en un tubo de vidrio (dimetro 18 mm y 15 cm largo) y dejarlo enfriar toda la noche en posicin vertical. Poner el tubo con el gel en un vaso de precipitado lleno con agua y calentar en una placa calefactora con agitacin. Situar una bola de acero de 16 mm de dimetro en la superficie del gel y poner un termmetro entre 50100 C en el agua. Cuando el agar comienze a fundirse, la bola caer al fondo del tubo. Mirar la temperatura del agua. Sacar el tubo del agua y medir la temperatura en su interior. Esa ser la temperatura de fusin.

1.3.2.- Punto de gelificacin Sacar la bola de metal del tubo e introducir una perla de vidrio. Situar el tubo en un vaso de precipitado lleno con agua que ha sido calentada a 50C previamente. Introducir un termmetro en el tubo. Poner el tubo en un ngulo de 45 y rotarlo en el sentido de las agujas del reloj. La perla de vidrio debera moverse libremente en el fondo del tubo. A medida que la solucin se enfra, continuar girando el tubo hasta que la perla de vidrio se para. La temperatura que marca el termmetro en ese momento es la temperatura de gelificacin del agar.

1.4.- Determinacin de la fuerza de gel (Mtodo Kobe con el sistema Nikan) Por este mtodo se mide la fuerza capaz de romper un gel de una concentracin de 1.5% en 20 s. ?Preparacin del gel: Preparar una solucin del 1.5% de agar como se explic previamente (T de fusin). La cantidad a preparar es la necesaria para formar un gel de 3 cm de espesor en una caja metlica de 6 x 30 x 4.5 cm. Una vez formado el gel (enfriado a temperatura ambiente) se proceder a aadir pesos sobre un pistn de 1 cm2 hasta que el gel se rompa justo despus de 20 s. Si el pistn rompe el gel antes de los 20 s, repetir la operacin en otro espacio libre utilizando menos peso. El peso empleado + el peso de la pieza que contiene el pistn representan la fuerza de gel de la solucin. Calcula los rendimientos en la extraccin de agar: Cuales fueron los rendimientos en % del agar de Gelidium y Gracilaria? % RGra = %

RGel = ?-

Cuales fueron los puntos de fusin y gelificacin del agar comercial y de los extrados durante la prctica (si es posible). TFusA = C TFusG = C TFusGr = C

TGelA = ?-

TGelG =

TGelGr =

Cual fue la fuerza de gel (en Nikan = g en peso) del agar comercial y de los extrados durante la prctica (si es posible). Nikan FgG = Nikan FgGr = Nikan

FgA =

2.- CARRAGENATOS 2.1.- Extraccin de carragenatos de Eucheuma Pesar 10 g de alga e introducirlos en una solucin de CaCl2 al 2% (200 ml). Mantenerlo en esta solucin durante 1 h. De esta manera se consigue que el carragenato insoluble se separe al lavar con una mnima cantidad de agua destilada despus de haber filtrado con vaco. Suspender el alga hidratada en 300 ml de una solucin 0.1M de NaOH. Mantener en un bao mara a 90-95C durante 4 h. Agitar el matraz regularmente y asegurarse que el pH de la solucin es alcalino con papel indicador de pH. Aadir unas gotas de NaOH 1M si la solucin se vuelve cida. Despus de las 4 h, aadir 20 g de tierra de diatomeas y mezclar bien. Volver a incubar en el bao mara durante 5 min. Filtrar con aire a presin.

2.2.- Identificacin del carragenato ?Verter 50 ml de la solucin en un cristalizador y enfriar la solucin con la ayuda de una bandeja con hielo en escamas. Cuales fueron los rendimientos en la extraccin de carragenatos? RA = ?% RB = %

De que tipo de carragenatos se trataba?

3.- ALGINATOS 3.1.- Extraccin de alginato de Laminaria Materiales: 0.2N HCl, 2M NaOH, NaCl, Etanol (96 y 60%), dietileter, papel de filtro, agitadores magnticos, barras de vidrio Pesar 5 g de algas secas y molidas. Suspenderlas en 250 ml de HCl (0.2N) y mantenerlas en un agitador toda la noche. Al dia siguiente filtrar el contenido del matraz y lavar el residuo 3 veces con agua destilada. Suspender las algas en 250 ml de agua destilada y neutralizar (pH 7.0) con adicin de NaOH (2M) al mismo tiempo que se agita. El proceso de neutralizacin es lento y hay que controlarlo bien. Despus de asegurarse que el pH es 7.0 filtrar la solucin viscosa de alginato de sodio con aire a presin, aadir NaCl para alcanzar 0.5% (w/v) y agitar para solubilizarlo. Aadir un volumen igual de etanol 96% mientras se agita lentamente y recuperar la fibra de alginato con una barra de vidrio. Si no se forman fibras de alginato, ste puede ser recuperado por centrifugacin o filtracin. Lavar el precipitado 2 veces con 60% etanol, 2 veces con 96% etanol y finalmente con dietileter. Dejar el alginato de sodio en una cabina de extraccin para evaporar el eter. Pesar y estimar el rendimiento en % por peso seco de alga. Cuales fueron los rendimientos obtenidos en la extraccin ? Propiedades de gelificacin de los alginatos: influencia de la concentracin de alginato y los iones en solucin.

?.3.2.-

 ?????-

Preparar 100 ml de soluciones al 4% de alginato de Macrocystis y Laminaria hyperborea con agitacin, dejarlas bastante tiempo para disolver bien el alginato. Preparar soluciones adicionales disolviendo con agua destilada en proporcin 1:20. Introducir las membranas de dilisis en agua destilada durante al menos 10 min. Cortarlas al tamao de los cilindros de plstico. Cerrar uno de los extremos y llenar los cilindros con las diferentes soluciones. Cerrar el otro extremo con las anillas de goma evitando que queden burbujas de aire. Dejar los cilindros durante toda la noche en diferentes soluciones de: 0.1M CaCl2, 0.1M NaCl, 0.1M HCl y 0.1M MgCl2. Observa y describe lo que ocurre despus de abrir y separar los cilindros. Cual es la diferencia entre las soluciones 4% y 0.2% ? Describe los resultados de la dilisis con HCl, CaCl2 y MgCl2 Las diferencias entre los diferentes alginatos son: Hervir algunos geles de alginato en agua durante 5 min. Cual es la diferencia entre el alginato y los geles de agar/carragenato?

3.3.- Inmobilizacin con alginatos ?Preparar una solucin de alginato de Laminaria (300 mg en 10 ml de agua destilada). Asegurarse que el polisacrido est bien disuelto. Mezclar a partes iguales con medio conteniendo clulas algales (Spirulina, Chlorella o Dunaliella) Aadir un volumen en la cmara del "bead-maker", ajustar la presin de nitrgeno para obtener perlas con talla uniforme (1-2 mm). Observar las perlas que se van formando al caer las gotas de alginato en una solucin 0.1M de CaCl2, mientras se agita lentamente. Que aplicaciones se te ocurren para este tipo de immobilizacin.

PRACTICA N 4.- PREPARACION DE COMPUESTOS CON APLICACIONES COSMETICAS A BASE DE ALGAS 1.- OBJETIVOS 1. 2. 3. 4. Conocer una de las mltiples aplicaciones de las algas en la industria Conocer procesos de preparacin de extractos algales para su posterior aplicacin. Valorar el aporte de algas a los preparados cosmticos. Conocer algunos principios bsicos de cosmetologa.

2.- INTRODUCCION El uso de los productos para el cuidado corporal se remonta a la poca de los Egipcios. Francia es el primer pais en definir en su legislacin el producto cosmtico como "... sustancia o preparacin destinada a las partes superficiales y mucosas del cuerpo humano para limpiar, proteger, mantener en buen estado, modificar el aspecto o perfumar" (ao 1975). Se diferencian los cosmticos de los medicamentos, en que su accin es slo superficial. En Espaa se crea en 1977 el Comit Cientfico de Cosmetologa. Las microalgas se introducen como ingredientes naturales (preferidos por el mercado frente a los artificiales) en el estudio de nuevas frmulas cosmticas como principio activo que: proporciona vitaminas, acidos grasos y aminocidos a la piel protege naturalmente de los rayos solares debido a sus pigmentos El producto cosmtico ms importante son las cremas hidratantes porque: palan las insuficiencias de la barrera epidrmica, restaurando la pelcula lipdica que se opone a la evaporacin de la capa crnea fijan agua mediante sustancias higroscpicas y humectantes cuyo fin es capturar el agua del ambiente para que hidrate la piel. Las cremas son generalmente emulsiones constituidas por una fase acuosa, una fase lipoflica y emulsionantes. Los emulsionantes son productos qumicos que disminuyen la tensin superficial de la interfase entre los dos medios para mantener la estabilidad de la solucin. Estas emulsiones pueden ser de dos tipos: emulsiones aceite en agua: constituidas por una mayor cantidad de fase hidroflica. Dejan sobre la piel una sensacin de frescor, relacionada con la evaporacin de la fase acuosa. emulsiones agua en aceite: mantienen sobre la piel una pelcula lipdica semipermeable de mayor duracin, por su gran contenido en fase lipoflica. Se usan para pieles secas. El alga seleccionada para la elaboracin del fotoprotector es Spirulina ya que su composicin qumica se caracteriza por: Destaca un cido graso esencial, el gamma-linolnico, que est reconocido como agente anticancergeno y combate adems varias enfermedades de la piel. Contiene una enzima, la superxido dismutasa, que actua contra los radicales libres, agentes destructores de las proteinas, ADN y membranas. Sus principales pigmentos son: ficocianina, zeaxantina y clorofila. Actuan de filtro de los rayos del sol en la longitud de onda en la que absorben. La vitamina E que contienen protege de los efectos de los rayos UV y la vitamina A evita la prdida de agua de la piel. Los aminocidos funcionan como tampones de los agentes alcalinos que daan la piel. La introduccin de algas en la crema tambin presenta ciertos inconvenientes: el precio se eleva debido al proceso de preparacin de las microalgas el color que adquiere no es muy apreciado en el mercado, por eso el porcentaje de algas incluido no puede ser muy alto el olor suele ser fuerte. Es conveniente aadir perfume

el tiempo de conservacin de la crema disminuye al introducir materia orgnica viva. Esto implica que el uso de bactericidas y fungicidas debe ser grande. Entra en conflicto con la naturalidad del producto la emulsin puede desestabilizarse, por eso se realizan los test de estabilidad.

3.- MATERIAL Y METODOS 3.1.- Preparacin del extracto de Spirulina Se cosecharn los cultivos de Spirulina en 12 botellas de 500 ml y se centrifugarn a 8.000 rpm durante 10 min. La pasta concentrada se somete a ultrasonidos para romper la pared celular con una sonda durante 5 minutos al 80% de potencia, en vasos de precipitado de 25 ml y manteniendo la temperatura tan baja como sea posible con hielo picado.

Utilizaremos diferentes porcentajes de microalgas en la crema, del 1 al 4%. Se realizarn 4 preparaciones diferentes. Este conjunto de preparaciones se denomina gama de preparacin. Cada grupo usar un porcentaje diferente para completar la gama entre todos. 3.2.- Preparacin del fotoprotector 1.- Fase lipoflica Base OW L-200 Aceite de almendras Manteca de Karit Isopropilo miristato Filtro solar D-L.-Tocoferol 2.- Fase hidroflica Dixido de Titanio Extracto de algas Glicerina Agua destilada 3.- Conservante Kathon GC (%) 16 3 2 3 1 0.3 1 10 4 c.s.p 0.1

1. Pesar todos los compuestos de la fase grasa y calentar al bao mara a 70C. 2. Pesar todos los compuestos de la fase acuosa, calentar ligeramente 3. Una vez homogeneizadas se incorpora la fase lipoflica en la fase hidroflica bajo agitacinn constante hasta que aparezcan homogeneas. 4. Incoprorar al conjunto el consrvantea unos 30-35 C. Una vez realizada la emulsin se deja enfriar y se aade la pasta de microalgas en frio. La adicin de la pasta en frio evita la desnaturalizacin de los componentes activos de las algas. 3.3.- Test de Estabilidad 1. Test cutneo. La crema debe ser suave, esparcirse fcilmente y tener una buena penetracin cutnea. 2. pH. Tras calibrar el pH-metro, medimos el pH de la solucin, que debe estar en torno a 6,8. 3. Estabilidad en caliente. Se colocan 20 g de crema en un bote a 40C durante 4 h. La emulsin debe permanecer inalterable. 4. Estabilidad en frio. Se mantiene la crema en una nevera a 4 C durante varios dias. No debe alterarse. 5. Centrifugacin. Se centrifuga la preparacin a alta velocidad durante 15 min. La homogeneidad no debe cambiar. Otros posibles anlisis de estabilidad son: 6. Test de viscosidad. La media de las mediciones debe rondar 105 cp.

7. Test de envejecimiento. Se trata de acelerar el proceso de envejecimiento de la crema mediante un aparato hermtico que, variando la temperatura y humedad durante 16 dias, simula 1 ao de envejecimiento del producto. 8. Test microbiolgico. Anlisis microbiolgico en 1 gramo de preparacin, siguiendo los lmites establecidos por el Comit Asesor de Cosmetologa en Espaa.

4.- TERMINOLOGIA Base O/W L-200: mezcla de alcohol estearlico-stareh 7, ster isooctadeclico, triglicrido de cidos grasos y petrolatum.Base emulgente no inica, dermatologicamente incua Manteca de karit: extracto natural de nues de Karit.. Presenta propiedades emolientes, estimulantes del metabolismo y vasodilatadoras que la hacen apropiada en preparados destinados a combatir la sequedad cutnea, la inflamacin y el eritema solar. Aceite de almendras: Se emplea por sus propiedades emolientes en emulsiones cosmticas. Filtro solar: filtro qumico de banda ancha UV A+B Dixido de titanio: filtro fsico Isopropilo miristato: mezcla de steres isoproplicos de los cidos mistricos, lurico y palmtico. Tiene propiedades emoliente, espesante y reengrasante. Confiere tacto graso, facilita su extensin y ayuda a la penetracin. Glicerina: propanotriol.. Su empleo, de forma diluida, proporciona suavidad y proteccin a la piel. Kathon GC: contiene 5-cloro-2-metil-4-isotiazolina-3-ona, 2-mentil-4-isotiazolina-3-ona, nitrato y cloruro de magnesio. Agente microbiano de amplio espectro.

5.- BIBLIOGRAFA Simon, V. (1991) Formulation d'une crme cosmtique au Phytoplankton, BTS biochimie, 40 pp. D Roeck-Holtzhauer, Y et al. (1993) Vitamin, free amino acids and fatty acids composition of some marine planktonic microalgae used in aquaculture. Bot. Mar. 36, 321-325. Berasategui del Alamo, E. (1989) Aplicacin de Las Algas a La Cosmtica, Diputacin Foral de Vizcaya, 251 pp. Comit Asesor de Cosmetologia (1994) Manual para el control microbiolgico de Productos cosmticos, Ministerio de Sanidad y Consumo, 63 pp. ISBN. 84-7670-383-X.

PRACTICA N 5.- CARACTERIZACION DE MACROALGAS MARINAS PARA ALIMENTACION HUMANA 1.- OBJETIVOS 1. Familiarizar al alumno, potencial consumidor, con el consumo de algas 2. Determinar el efecto de diferentes procesos de preservacin de algas sobre las propiedades organolpticas de las especies seleccionadas. 3. Determinar el nivel de aceptacin de consumo de algas sobre un determinado sector poblacional. 4. Elaborar un perfil organolptico de las algas seleccionadas 2.- INTRODUCCION El reciente crecimiento del mercado de los procesados de productos marinos ha conducido al desarrollo de gustos especficos. Un gusto es una combinacin de compuestos solubles responsables del sabor y compuestos voltiles que dan olor y aroma. En la industria de los productos marinos, los gustos estn constituidos por extractos naturales (que dan cuerpo al sabor), sabores artificiales, productos que aumentan el sabor y agentes que enmascaran otros gustos (produciendo sensacin de frescura). El anlisis bsico de las propiedades organolpticas da dos tipos fundamentales de informacin: 1. la descripcin de los caracteres organolpticos: sabor, olor, textura, que permiten elaborar perfiles sensoriales 2. el nivel de aceptacin de los consumidores, en este caso el personal que juzga el producto El objetivo fundamental de esta prctica es conocer cuales son los parmetros bsicos a la hora de caracterizar y decidir si un alga (u otro producto procedente del mar) cumple los requisitos para ser comercializada como alimento humano. Algunos de los parmetros a estudiar son utilizados usualmente en alimentos ya establecidos y comercializados a escala industrial: sopas, pats, cremas etc. 3.- MATERIAL Y METODOS 3.1.- Determinacin de la humedad y del peso seco Calentar dos cristalizadores a 100C en una estufa Aadir 500 ml de agua destilada en un vaso de precipitado Pesar 25 g de algas secas y aadirlos al vaso de precipitado (proporcin alga:agua=1:20). Controlar el tiempo Despues de calentar los cristalizadores y con la ayuda de un guante seco, situarlos en un desecador y dejarlos enfriar. Pesar los cristalizadores con la mayor precisin. Evitar tocarlos con los dedos ya que la humedad puede alterar el peso del cristalizador Pesar entre 5 y 10 g de alga seca en un cristalizador y dejarlos en la estufa a 100C durante 24 h. 2 horas despus del comienzo de la extraccin filtrar el lquido con un embudo Bchner usando una malla de nylon como filtro. Presionar el residuo para extraer todo el lquido retenido. Guardar 5 muestras del filtrado (lquido) en botellas de plstico, marcarlas y guardarlas en la nevera Aadir el residuo algal en el segundo cristalizador pre-pesado. Secar este residuo en la estufa a 100 C 24 h Despus de las 24 h sacar los cristalizadores de la estufa y enfriarlos en el desecador (sin tocarlos con los dedos) Pesarlos en la balanza Determinacin de la humedad:

% H 2 O = 100 * (1 donde: IW= peso inicial de las algas (entre 5 y 10 g) PW= peso del cristalizador

(FW - PW) ) IW

FW= peso final despus de enfriar (cristalizador + alga seca) Determinacin del peso en materia seca (DM) en 25 g de algas troceadas

DM = 25 * (1 -

% H2O ) 100

Determinacin de la tasa de solubilidad (SR) durante el proceso de extraccin

SR = 100 * (1 -

(FW + PW) ) DM

donde: FW= peso final despus de enfriar (cristalizador + residuo algal) PW= peso del cristalizador ?.- Discutir y comparar los valores de las tasas de solubilidad. Los rendimientos de extraccin de compuestos aromticos y otras molculas (p.e. polisacridos o proteinas) normalmente aumentan con la tasa de solubilidad. 2.2.- Caracterizacin aromtica del material; anlisis sensorial (Dia 1) Oler las algas secas y anotar 3 o 4 descriptores a los que te recuerden el olor (puedes usar cualquier descriptor: palabra o adjetivo siendo tan preciso como sea posible: por ejemplo; en vez de escribir vegetal escribe tomate, pescado salado en lugar de pescado. (Dia 2) Utilizando los extractos preparados el dia anterior. Oler las muestras y anotar los tres o cuatro olores principales que te recuerdan. En la lista de descriptores aromticos que se adjunta, especfica para algas, anota los tres descriptores que encuentras ms precisos para describir los olores.

A RELLENAR POR EL ALUMNO Que especies has utilizado para realizar esta prctica? Describe las diferencias entre los diferentes extractos y sus correspondientes olores Compara tambin los descriptores de aromas de los extractos con los del material de partida.

2.3.- Determinacin de la actividad de agua aw Principio: En el sector alimentario, se entiende como actividad del agua (valor aw), la humedad en equilibrio de un producto, determinada por la presin parcial del vapor de agua en su superficie. El valor aw depende de la composicin, la temperatura y el contenido en agua del producto y tiene incidencia sobre las caractersticas de calidad como: propiedades biolgicas, contenido en protenas y vitaminas, caractersticas sensoriales (olor, color y sabor), estabilidad de la composicin, solubilidad o consistencia y el tiempo de conservacin. Utilizando el medidor de actividad de agua, calcular las diferentes actividades de las muestras de algas en funcin de: o su temperatura de secado o tiempo de secado, y o tiempo de almacenamiento

?.- Anota los resultados obtenidos .- A la vista de los resultados que conclusiones sacas?; cual sera el mejor tratamiento para mantener la muestra conservada durante ms tiempo?

4.- TEST ORGANOLPTICO

Las algas han sido consumidas tradicionalmente en Asia y de forma marginal en el resto de Europa. En los pases occidentales, las algas son empleadas principalmente en la industria de coloides como fuente de gelificantes, espesantes y aditivos estabilizantes. En 1990 el Gobierno Francs autoriz 10 especies de macroalgas para consumo como vegetales o condimentos. Esto ha permitido la venta de diferentes tipos de algas en tiendas de alimentacin, as como su uso en la industria alimentaria bajo diferentes formulaciones como sopas, galletas, ensaladas, etc. Muchos productos desarrollados en la agroindustria deben pasar test organolpticos por los consumidores antes de puesta en el mercado. Este anlisis puede ser logrado a travs de un anlisis sensorial con la ayuda de personal asesor. El anlisis sensorial nos da dos tipos de informacin bsicamente: 1. Descripcin de las caractersticas organolpticas del producto: sabor, olor, textura, etc. 2. Determinar el nivel de aceptacin por los consumidores Material y mtodos Las especies seleccionadas para realizar este test son las siguientes: Gracilaria cornea Hypnea spinella Ulva rigida Las muestras a valorar se presentan bajo dos formas en fresco y secas. Los procesos que se han realizado para la preservacin de las muestras secas son: - Secado con aire caliente - Liofilizacin Rellenar el test que se presenta. Oler y probar las diferentes muestras de algas y anotar 3 o 4 descriptores a los que te recuerden (puedes usar cualquier descriptor, palabra o adjetivo siendo tan preciso como sea posible, por ejemplo en vez de escribir vegetal escribe tomate, pescado salado en lugar de pescado. TEST ORGANOLPTICO PARA MACROALGAS (Descriptores aromticos)
1.- Edad 2.- Sexo < 20 H 20-25 25-30 M Positiva Si Si Restaurante Si Indiferente No No Casa No Otros Negativa 30-35 35-40 >45

3.- Qu opinin tienes del consumo de algas? 4.- Has comido alguna vez algn tipo de algas? 5.- Te gustaron? 6.- Dnde las probaste? 7.-Te gustan las verduras?

Por favor rellena en la siguiente tabla tu apreciacin organolptica de las muestras de algas que se ofrecen (por favor no expreses tu opinin en voz alta). Aporta tu propia descripcin del gusto y olores que percibas.

Muestra 1 DESCRIPTOR Marino / Mar Pescado Pescado fresco Pescado hervido (sopa) Pescado seco / salado Pescado asado Pescado aumado Pescado podrido Crustceos (langostinos..) Crudo / fresco Hervido / cocinado Moluscos (mejillones..) Crudo / fresco Hervido / cocinado Algas (verdes, rojas) Costa (agua costera) Lodos (estancadas) Otros marino (definir) Plantas / Vegetales Hierba fresca Verduras crudas (lechuga.) Perejil T Vegetales hervidos (sopa..) Vegetales asados (cebolla..) Flores Fruta Hierba hmeda Championes, liquenes Hongos / moho Animal Carne cruda Carne hervida Carne asada / frita Carne aumada Carne podrida Piel Miscelnea Chocolate Caf Dulce, azcar, miel, vainilla Azucar tostada, caramelo Pan tostado Especias (clavo, organo) Goma quemada Orina Fuerte, desgradable Acido Salado Amoniaco Otros (definir) Otros (definir) .. ............. .. .. .. .. .. ............. .. .. .. .. .. ............. .. .. .. .. .. ............. .. .. .. ..

Muestra 2

Muestra 3

Muestra 4

Muestra 5

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