MAPAS GENETICOS

GENETICA I
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INTRODUCCIN El ratn, despus del hombre, es el mamfero que tiene el mapa gentico ms completo y fue el segundo genoma mamfero completamente secuenciado (ver ms adelante). Por otro lado, las tcnicas de mapeo, los programas de computacin y las bases de datos estn enormemente desarrolladas en esta especie. Las cualidades que hacen del ratn la especie modelo para el desarrollo de mapas genticos son: (I) Tienen un tiempo generacional muy corto y son muy prolficos, lo que permite criar miles de ratones hbridos F1, F2 o N2. (II) Es una especie en la cual se pueden llevar a cabo cruzas interespecficas. (III) Existe una cantidad enorme de lneas genticamente definidas, como las consanguneas y congnicas, adems de miles de mutaciones y un gran nmero de rearreglos cromosmicos disponibles. Por todo lo mencionado, tomaremos al mapa gentico del ratn y sus mtodos de desarrollo como gua (con reservas) para todos los animales de laboratorio. Como ya se vio, el ratn de laboratorio estndar tiene un cariotipo de 40 cromosomas (19 autosmicos ms el par sexual). Los cromosomas murinos son difciles de diferenciar en los preparados citogenticos porque, contrariamente a los humanos, son todos acrocntricos y muestran una graduacin continua en el tamao. Los cromosomas autosmicos se numeran del 1 al 19, en orden decreciente de longitud. Desde un punto de vista fsico (y muy reduccionista!) los genesno son ms que segmentos de ADN alineados a lo largo de los cromosomas como cuentas de un rosario. Una manera de establecer un mapa final sera clonando el genoma en pequeos segmentos superpues-tos y secuenciando estos fragmentos uno tras otro. Esto llevara, finalmente, a la secuencia completa del genoma. Este planteo fue considerado poco realistaen el pasado (teniendo en cuenta las tcnicas disponibles) pero, debido a la gran disminucin en los costos y al aumento en la eficiencia de la secuenciacin automtica, es hoy una realidad. Se sabe que los genes en los mamferos no son tan compactos como la mayora de los genes procariotas y estn salpicados con secuencias repetitivas de distinto tipo, como copias de pro-virus, minisatlites, microsatlites y pseudogenes, cuya funcin, si existe, es an desconocida. Es por todo esto que se critic, al principio, la idea de secuenciar completa-mente un genoma haciendo experimentos muy tediosos con gastos enormes e injustificados debido a las secuencias de ADN irrelevante (lo que se conoci en una poca como ADN de descarte, del ingls junk DNA). Sin embargo, como veremos en detalle ms adelante, la disponibilidad de las secuencias de los genomas humanos y del ratn est trayendo valiosa informacin sobre la estructura del genoma de los mamferos

TIPOS DE MAPA DEL GENOMA Hay varias clases de mapas que interesan a los genetistas, aunque los tres ms importantes son los mapas de ligamiento, los mapas cromosmicos y los mapas fsicos. MAPAS DE LIGAMIENTO El establecimiento de mapas de ligamiento (linkage maps), tambin llamados mapas meiticos, se basa en el hecho de que, durante la meiosis, los loci que se encuentran en diferentes cromosomas se separan al azar en las gametas, mientras que los que se encuentran en un mismo cromosoma tienden a co segregar, al menos que un evento de recombinacin rompa esa asociacin de tipo parental (Figura 6.1). La presencia de este fenmeno de entrecruzamiento (del ingls crossing-over) se visualiza en los cromosomas como una estructura llamada quiasma. Por lo tanto, para desarrollar este tipo de mapas de ligamiento hace falta realizar cruzas de animales.

Bsicamente, la probabilidad de que dos genes sean separados por un evento de recombinacin depender de la distancia que haya entre ellos. En el caso de dos loci no ligados, la frecuencia de gametas esperada ser 50% tipo parental y 50% tipo no parental (recombinante), mientras que en aquellos loci que estn ligados la frecuencia de gametas tipo parentales ser siempre mayor al 50% (Figura 6.2). Esto se ve reflejado en la eleccin de la unidad de mapeo, el centiMorgan (cM), que corresponde al 1% de probabilidad de producir una gameta recombinante luego de una meiosis.

En otras palabras, un mapa de ligamiento es un diagrama de los rearreglos lineales de los genes localizados en un cromosoma dado. Estos mapas fueron diseados a principios del siglo XX por el cientfico americano (premio Nobel de Medicina y Fisiologa en 1933) Thomas H. Morgan y sus discpulos (en particular Alfred H. Sturtevant), usando cruzas de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster)y fueron aplicados posteriormente a los mamferos. Como se ver ms adelante, para desarrollar este tipo de mapas es esencial cruzar animales (generacin parental) que tengan alelos diferentes en dos o ms loci, para poder estudiar el patrn de segregacin en la descendencia. Es por esta razn que los mapas de ligamiento dependen enormemente de la disponibilidad de polimorfismos(la existencia de 2 ms alelos en un locus dado). La Figura 6.3 muestra, a modo de ejemplo, un mapa (parcial) del cromosoma 13 del ratn donde se localiz la mutacin inmunodeficiente nackt (Ctslnkt).

Existen un par de puntos a tener en cuenta con respecto a estos mapas: Para establecer el orden de los loci se requiere, por definicin, que al menos un evento de recombinacin rompa el orden lineal de origen parental. Esto es poco frecuente si los dos marcadores estn fuertemente ligados. La densidad de un mapa gentico estar correlacionada con el nmero de polimorfismos que segregan en una cruza particular, mientras que su resolucin depende del nmero de gametas (= nmero total de meiosis) analizadas en la progenie. La longitud total del mapa de ligamiento del ratn ha sido estimada por diversos investigado-res, usando diferentes enfoques, en el orden de los 1500 a 1600cM. Esto quiere decir que, en promedio, 1 cM en el genoma del ratn corresponde a 1700 kb,mientras que en el humano esta cifra es equivalente a 1000 kb. Estos datos deben considerarse estrictamente como promedios porque no hay una correlacin absoluta entre escalas en cM y kb, debido a la distribucin despareja de los eventos de recombinacin a lo largo de las cromtides (en el ratn se calcula un promedio de 28 quiasmas por genoma). Por ello, dos genes pueden apa-recer completamente ligados en un mapa de alta resolucin y resultar estar muy distantes en trminos moleculares mientras que, contrariamente, dos genes pueden parecer relativamente alejados uno del otro si existe un hot spot de recombinacin en la regin intergnica. Tambin hay que considerar que existe un fenmeno conocido como interferencia de entrecruzamientos (del ingls crossover interference) que impide la formacin de quiasmas cercanos en un mismo cromosoma (la localizacin de los quiasmas en las cromtides no es al azar). En

particular, el genoma del ratn muestra un fenmeno de interferencia mucho ms fuerte que el descripto en el genoma humano. Varios programas de computacin han sido desarrollados para ayudar a los genetistas a pro-cesar los datos obtenidos de las cruzas experimentales y la evaluacin de los marcadores en un anlisis de ligamiento. Entre ellos: MAPMAKER/EXP 3.0 (1992)de Eric Lander (Whitehead Institute, Estados Unidos), MapManager QT (1999) y MapManager QTX (2001), de Kenneth Manly y colaboradores (Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos) y Gene-Link de Xavier Montagutelli (Institut Pasteur, Francia). MAPAS CROMOSMICOS Mientras que los mapas de ligamiento requieren de la realizacin de protocolos con cruzas de animales, los mapas cromosmicos se logran usando tcnicas que no incluyen la reproduccin sexual y, por lo tanto, asignan una localizacin segn las regiones citogenticas (adems, estos mapas presentan la ventaja de no requerir del uso de marcadores polimrficos). Esas tcnicas son: (I) hibridacin in situ, (II) hbridos de clulas somticas y (III) hbridos de radiacin. HIBRIDACIN IN SITU. Cuando una secuencia de ADN, en este caso referida como una sonda de ADN (en ingls, probe), es marcada con istopos radioactivos o fluorescencia, podemos hibridarla con su secuencia complementaria en el ADN genmico de un cromosoma especfico y observar la marca directamente sobre el extendido cromosmico con un microscopio ptico. La hibridacin in situ fluorescente (FISH) es una tcnica muy sensible siempre que se cuente con son-das lo suficientemente grandes (y homlogas) y que se suprima la fluorescencia de fondo. La sensibilidad de esta variante de la tcnica de hibridacin in situ permite localizar una secuencia con una precisin de hasta 30 Mb y de detectar anormalidades cariotpicas en cromosomas metafsicos tanto como interfsicos. Los fluorocromos ms empleados son la fluorescena (FITC), la rodamina (XRITC) y el Texas Red. Aunque se trata de una tcnica muy confiable, el FISH es poco utilizado en la construccin de mapas en el ratn por varias razones: (I) en muchos casos es ms fcil y prctico realizar es-quemas reproductivos, (II) la hibridacin in situ nos provee de una posicin regional, no una localizacin precisa y (III) los cromosomas murinos, como ya se dijo, son muy difciles de distinguir entre s, en un preparado citogentico. De todas maneras, la hibridacin in situ es la tcnica de eleccin para la localizacin rpida de los transgenes (ver Captulo VIII). Es tambin muy til para evaluar si los

grandes insertos en los cromosomas artificiales de levadura (YA-Cs) derivan todos del mismo cromosoma o, por el contrario, son quimricos. Por ltimo, el pintado de cromosomas (del ingls chromosome painting) es una variante del FISH que emplea una mezcla de sondas de ADN derivada de un cromosoma entero o de una regin cromosmica de inters. Se utiliza para obtener patrones de regiones homlogas entre diferentes especies y es una forma muy directa de evaluar la cantidad de rearreglos que se produje-ron entre dos especies en el curso de la evolucin. HBRIDOS DE CLULAS SOMTICAS Para esta tcnica se utilizan clulas hbridas (viables) derivadas de la fusin in vitro de clulas somticas de especies diferentes de mamferos. Aunque se desconoce la razn, se observa que los cromosomas que se van perdiendo en las clulas hbridas pertenecen exclusivamente a uno de los conjuntos parentales. Por ejemplo, los hbridos humano/roedor tienden a perder (a travs de los sucesivos cultivos y en forma preferencial) los cromosomas humanos y que-darse con una mayora de cromosomas de roedor. Debido a esto, es posible derivar un panel de clulas hbridas que representen cada cromosoma humano en forma nica, sobre un conjunto de cromosomas de roedor. Por lo tanto, todos los genes de origen roedor son retenidos (y se expresan normalmente), mientras que slo los genes presentes en el nico cromo-soma humano que qued retenido en ese hbrido podrn ser localizados por medio del uso de sondas moleculares o el anlisis de expresin. De esta manera, detectando patrones de presencia o ausencia de marcadores (o expresin de genes) y correlacionando con los cromosomas presentes en el hbrido, se puede asignar un gen humano a un cromosoma en particular. Los hbridos de clulas somticas humano/ ratn, con un complemento limitado de cromosomas humanos (intactos), han sido muy usados para localizar genes humanos en los ltimos 20 aos, a pesar de ser muy inestables. Tambin existen hbridos similares segregando cromosomas de ratn, pero no han sido muy utilizados porque es en general ms fcil y rpido usar el ADN derivado de cruzas de animales. Adems, contrariamente a los cromosomas humanos, son raros los hbridos de clulas somticas del ratn con deleciones o translocaciones, lo que complica la asignacin sub-cromosmica de genes por este mtodo. HBRIDOS DE RADIACIN (HR) Otra tcnica desarrollada para obtener mapas de alta resolucin en humanos son los paneles de hbridos de radiacin (Radiation Hybrid RH), enfoque descripto por Goss y Harris en 1975. Las dos grandes ventajas de este sistema son que pueden

mapearse marcadores o genes no polimrficos (ya que se evala slo la presencia o ausencia de un marcador) y que se logra una resolucin mayor que con los mapas de ligamiento, constituyendo un puente entre stos y los mapas fsicos. Estos paneles de clulas hbridas se construyen a partir de clulas donantes (de la especie a ser mapeada) que han sido irradiadas letalmente (ya sea con rayos g o X) para causar la fragmentacin de sus cromosomas (por roturas de doble cadena). Las clulas as irradiadas son fusionadas con lneas celulares receptoras deficientes para un marcador de seleccin, como ser la timidina quinasa(TK) o la hipoxantina fosforibosil transfera-sa (HPRT). Usando condiciones de seleccin con medios apropiados, sobrevivirn slo aquellas clulas que contengan, por lo menos, algn fragmento cromosmico proveniente de las clulas dadoras. Por ejemplo, para el mapeo de genes humanos se utiliz siempre un fon-do de clulas receptoras de roedor, en particular de ratn o hmster chino (Cricetulus griseus) (Figura 6.4). Muchas de las lneas de clulas hbridas obtenidas por este mtodo retienen cantidades detectables del ADN donante (normalmente entre 20 y 30%del genoma). Por lo tanto, estas clulas hbridas, obtenidas por las tcnicas clsicas de fusin celular, contienen slo un pequeo segmento del genoma donante (irradiado) incorporado en los cromosomas de la especie receptora (no irradiada). El concepto terico es que aquellos loci que se encuentran muy prximos unos de otros sern retenidos en el mismo fragmento cromosmico despus de la irradiacin. Esta caracterstica es similar al principio de ligamiento gentico que hemos visto en los mapas meiticos. Como en los paneles de ADN obtenidos con cruzas de animales, la informacin de los paneles HR es acumulativa y puede proveer datos para el ordenamiento (de alta resolucin) de regiones no polimrficas o no separables por los mapas de ligamiento. MAPAS FSICOS Un mapa fsico (physical map) es la representacin real del alineamiento de los genes en un cromosoma, en la misma forma que un mapa de ruta indica la localizacin de las ciudades a lo largo de una autopista. El orden de los genes es el mismo que el dado por los mapas de liga-miento, pero las distancias son medidas en kb o Mb. Estos mapas constituyen un paso crucial en la caracterizacin estructural y funcional del genoma. Pueden lograrse por diversos mtodos pero el ms conveniente es el ordenamiento de grupos de clones superpuestos (contigs), ya sean estos clonados en fagos (P1 en general), csmidos, cromosomas artificiales de bacterias (BACs) o cromosomas artificiales de levaduras (YACs) (ver Captulo I). Aunque en teora es posible desarrollar un mapa fsico de novo, por ejemplo

uniendo extremos de insertos de ADN clonados en YACs (y detectando otros clones usando esos extremos como sondas hasta tener grandes segmentos ordenados), el establecimiento de dicho mapa se vera muy facilitado si existiese previamente un mapa de ligamiento de alta densidad (200-400 marcadores por cromosoma). Siguiendo esta estrategia, la realizacin de un mapa fsico es un segundo paso una vez establecido el mapa de ligamiento .Como en los mapas de ligamiento, existen varios puntos a tener en cuenta: (II) Antes de establecer contigs de YACs, BACs o P1 es importante confirmar que cada molcula de ADN clonada representa realmente una secuencia inalterada y derivada slo de un cromosoma. Dado que todas las bibliotecas genmicas(o genotecas) son construidas con la misma estrategia (fragmentacin del ADN de alto peso molecular con enzimas de restriccin y el posterior ligado de los productos a un vector), es muy comn que, por azar, dos segmentos completamente independientes sean empaquetados juntos en el mismo vector. El vector resultante ser un mosaico y su uso puede llevar a resultados incongruentes. Una situacin similar, pero an ms grave, puede ocurrir si un segmento de ADN queda delecionado en el proceso de clonacin. (II) Para establecer contigs superpuestos de clones de YACs, BACs, csmidos o P1 es necesario construir varias genotecas independientes con diversas enzimas de restriccin, con digestin completa o incompleta. APLICACIONES DE LOS MAPAS GENTICOS IDENTIFICACIN DE GENOTIPOS ESPECFICOS Criar ratones mutantes para investigacin es muchas veces complicado por el hecho de que los genotipos homocigotas, los cuales son buscados para muchas experiencias, generalmente mueren in tero, en el perodo perinatal o el defecto les impide reproducirse .Esto ltimo es lo que le ocurre, entre otras, a las mutaciones obese (ob) y dwarf (dw). Es aqu donde la informacin de un mapa gentico puede ser de gran utilidad. Por ejemplo, en la mutacin autosmica recesiva progressive motor neuronopathy (ahora Tbce pmn) los ratones homocigotas pueden ser identificados entre los das 14 y 20 de nacidos (cuando comienzan a desarrollar una par-lisis de los miembros anteriores), pero estos animales mueren rpidamente, entre los das 50 y 55 de vida. Por trabajos de mapeo, se localiz esta mutacin muy cerca (< 0,2 cM) del lo-cus Xt (Extra toes, ahora Gli3Xt) En el cromosoma 13. Esta localizacin ha permitido aumentar la eficiencia de los programas de cra de mutantes pmn/pmn utilizando al dedo extra de la mutacin Xt como marcador fenotpico de fcil identificacin. Esto se logr estableciendo un grupo de ratones con la mutacin Xten repulsin, es decir sobre

el cromosoma que no por-ta el alelo mutante pmn. Haciendo uso de esta ayuda, se intercruzan animales con genotipos Xt +/+ pmn (dedo suplementario): los animales Xt +/Xt +, que no portan ms el alelo pmn, mueren in tero, mientras que los homocigotas + pmn/+ pmn (dedos normales) pueden ser reconocidos desde recin nacidos, antes de que enfermen (ver AnexoI). ESTABLECIMIENTO DE HOMOLOGAS CROMOSMICAS ENTRE ESPECIES De los 18.000 genes mapeados actualmente en el ratn, se conocen alrededor de 3.500 homlogos con genes humanos (incluyendo cerca de 400 loci homlogos con enfermedades genticas humanas), de los cuales alrededor de 2.500 estn mapeados en ambas especies en distintos segmentos homlogos. (Adems, la informacin vertida recientemente por las comparaciones de los genomas completos del ratn y el hombre -con un ancestro comn que se remonta a 75 millones de aos estara indicando que aproximadamente el 99% de los genes del ratn tiene un homlogo en el genoma humano). Cada grupo de genes homlogos cons-tituye un segmento cromosmico conservado, o sea que se trata de grupos de genes que muestran el mismo orden lineal en ambas especies, lo que se denomina conservacin de la sintena (del griego sobre el mismo hilo), lo que hace referencia a los genes que se encuentran en el mismo cromosoma. Algunos autores diferencian entre segmentos conservados (Tambin ligadura conservada o, en ingls, syntenic segment), aquellas regiones donde el or -den de varios genes es el mismo en ambas especies, y sintena conservada, donde se con-serva la localizacin cromosmica de los genes, pero no necesariamente el mismo orden (tambin llamados -en ingls syntenic blocks). Hasta la fecha de este escrito (incluyendo la informacin proveniente del primer borrador del genoma del ratn), se identificaron 342 segmentos conservados entre el genoma del ratn y el humano, con tamaos que van desde 300 kb hasta 65 Mb (un promedio de 7 Mb). Alrededor del 90% del genoma humano y 93% del genoma del ratn reside en estos segmentos conservados. Otros hallazgos recientes son que el cromosoma X est representado por un nico bloque sinttico en ambas especies y que el cromosoma 20 humanos corresponde enteramente a una porcin del cromosoma 2 del ratn, con una conservacin del orden de genes casi perfecto. ESTUDIOS DE EVOLUCIN DEL GENOMA Existen mltiples ejemplos para ilustrar la importancia de los mapas genticos en los estudios de evolucin del genoma, entre ellos citaremos slo dos. Dentro del

genoma del ratn existen muchas secuencias que se encuentran repetidas un nmero determinado de veces. Algunas de ellas son genes funcionales y sus diferentes copias pueden estar en el mismo cromosoma o en cromosomas distintos. Algunas, inclusive, presentan una expresin diferencial segn los tejidos. Este es el caso de la duplicacin de un gen ancestral que codifica para la amilasa en el cromosoma 3 del ratn. Como resultado de esa duplicacin existen dos copias ligadas del gen, Amy1y Amy2, siendo el primer gen activo en las glndulas salivales y el segundo en el pncreas. Esta distribucin responde a cambios producidos durante la evolucin del genoma en diferentes momentos de la historia de la especie. Estos mecanismos an no son bien conocidos pero, con el desarrollo de buenos mapas genticos, se podr comprender mejor lo ocurrido durante la evolucin de estas secuencias. El otro ejemplo lo constituyen los estudios realizados sobre el origen del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (ver captulo V). Los enigmas sobre su origen parecen haber sido resueltos recientemente con el descubrimiento de regiones que evolucionaron paralelamente por duplicacin de un gen ancestral comn. Es decir que estas regiones emergieron como resultado de una duplicacin cromosmica producida, aparentemente, en un ancestro comn a todos los vertebrados con mandbula, antes de su divergencia de los peces sin mandbulas (Vertebrados primitivos como la lamprea). Estas observaciones sealan la importancia evoluti-192 MANUAL DE GENTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO va que tienen los fenmenos de duplicacin cromosmica en la creacin de sistemas cada vez ms complejos en los organismos vivos.