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7. ELETROFORESE DE CIDOS NUCLICOS

Joo Jos de Simoni Gouveia
Luciana Correia de Almeida Regitano
A eletroforese uma tcnica utilizada para separar, identificar e purificar
molculas carregadas (como DNA e protenas) (Maniatis, 1987). Este mtodo foi
introduzido por Tiselius, no ano de 1937 (Brammer e Iorczeski, 2002) e simples,
rpido e capaz de separar fragmentos que no so adequadamente separados por
outras tcnicas (Sambrook e Russel, 2002).
A tcnica apresenta basicamente um sistema de suporte (gel de agarose, por
exemplo), um tampo no qual est imerso o gel e os eletrodos nas extremidades da
cuba onde esto contidos o tampo e o gel.
Sob a influncia de um campo eltrico, molculas carregadas e partculas
migram em direo ao plo oposto. A carga e a massa das molculas fazem com
que elas migrem em velocidades diferentes e, portanto, propiciam a separao
destas (Westermeier, 2005). Como os cidos nuclicos (DNA e RNA) possuem
carga eltrica negativa (devido ao grupamento fosfato) eles sempre migraro em
direo ao plo positivo. Ento, o fator determinante da taxa de migrao ser a
massa da molcula (quando se fala em cidos nuclicos, a massa diretamente
proporcional ao tamanho da molcula).
Existem vrios meios de suporte que podem ser utilizados (papel filtro,
membrana de celulose, gel de agarose, gel de poliacrilamida). No caso dos gis, a
porosidade (que tem uma relao direta com a concentrao de agarose) determina
o poder de separao (Brammer, 2002).
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Na escolha do tampo, o principal fator a ser considerado sua capacidade
tamponante. Os dois tampes mais utilizados na eletroforese de cidos nuclicos
so o TAE (Tris, Acetato e EDTA) e o TBE (Tris, Borato e EDTA). O TAE mais
utilizado que o TBE, porm mais facilmente exaurido durante corridas longas ou
com alta voltagem. O TBE, apesar da melhor capacidade tamponante, deve ser
evitado quando se deseja purificar os cidos nuclicos do gel (Ausubel, 1994).
Alguns fatores alteram a migrao das molculas atravs do gel, dentre eles
podemos citar: concentrao de agarose, conformao do DNA e intensidade da
corrente.
A concentrao de agarose atua de forma importante na eletroforese, pois ela
determina a faixa de tamanho das molculas de DNA que podem ser separadas. As
relaes entre concentrao de agarose e resoluo de molculas lineares de DNA
so apresentadas na tabela abaixo (Maniatis et al., 1982).
Tabela 1. Limites de eficincia da separao de DNA em diferentes concentraes
de agarose (Maniatis, 1987)
Concentrao de agarose no
gel (%)
Separao de molculas de DNA
(Kb).
Limites de eficincia
0,3 60 5,0
0,6 20 1,0
0,7 10 0,8
0,9 7 0,5
1,2 6 0,4
1,5 4 0,2
2,0 3 0,1
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Para observar cidos nuclicos em gel de agarose, deve-se cor-los e
submet-los a uma luz ultravioleta. O corante mais comum o brometo de etdeo,
que se intercala entre as bases do DNA (Ausubel, 1994).
7.1. Protocolo para anlise de produtos de amplificao e fragmentos de
digesto em gel de agarose
gel 1% 0,3 g de agarose para 30 mL de gel, que deve ser preparado com
tampo Tris-Borato-EDTA 1X. Para isso, aplicar 5 l de produto de amplificao
+ 1 l de loading buffer.
gel 4% 1,2 g de agarose de baixo ponto de fuso para 30 mL de gel, que deve
ser preparado com tampo Tris-Borato-EDTA 1X. Utilizado para analisar o
resultado das digestes com enzimas de restrio. Aplicar todo o produto da
digesto (13 l) + 2,6 l de loading buffer.
1. Pesar a agarose
2. Coloc-la em um erlenmeyer contendo o volume necessrio de tampo TBE 1X
3. Aquecer no forno de microondas at iniciar a ebulio (aproximadamente 30
segundos em potncia mdia para um gel de 30 mL). Agitar o frasco e retornar
ao forno de microondas por mais alguns segundos
4. Aguardar a reduo da temperatura para aproximadamente 60
o
C e adicionar
Brometo de Etdio, na quantidade indicada para cada gel
5. Verter no molde previamente nivelado e colocar os pentes
6. Aps a solidificao, colocar o gel na cuba de eletroforese e cobrir com tampo
TBE 1X
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7. Aplicar as amostras acrescidas de loading buffer e aplicar a corrente de acordo
com o tamanho do gel
A eletroforese deve ser realizada em TBE 1X, a uma voltagem constante na faixa
de 2 a 5 V/cm (considerando a distncia entre os eletrodos). Aps a corrida,
submergir o gel por 20 minutos em soluo de brometo de etdio a 0,5 g/mL e
visualiz-lo sob luz ultra-violeta. Caso o fundo do gel esteja muito corado, pode-
se lavar o excesso de brometo por submerso em TBE 1X por 5 a 10 minutos
O Brometo de etdio um potente agente mutagnico. Utilizar luvas e mscara
para preparar a soluo estoque e manipular os gis
A luz ultra-violeta produz queimaduras severas. Utilize mscara/culos de
proteo adequados
7.2. GEL DESNATURANTE PARA RNA
Adriana Mrcia Guaratini Ibelli
Para analisar molculas de RNA podem ser utilizados gis de agarose e
poliacrilamida, desnaturantes ou no. As propriedades desta eletroforese so
basicamente semelhantes s de eletroforese de DNA (Patel, 1994).
A qualidade das molculas de RNA pode ser analisada em gel de agarose
normal, feito com tampo (TBE, TAE) com gua DEPC ou em gel desnaturante.
Devido a interaes intramoleculares, as molculas de RNA podem dobrar-se,
alterando a estrutura secundria e afetando a migrao das molculas no gel. O gel
desnaturante soluciona este problema, pois sob condies desnaturantes as pontes
de hidrognio so rompidas e o RNA migra como molcula de fita simples. Isto
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permite avaliar com acurcia a qualidade e o peso molecular do RNA (Sambrook,
2002; Maseka, 2005).
Dentre os desnaturantes existentes, o mais poderoso, alm de caro e
altamente txico o hidrxido de metil mercrio. Porm, o mais freqentemente
utilizado o formaldedo, mas pode haver variantes de gis utilizando tiocianato de
guanidina, formamida e DMSO. A utilizao de cada um deles apresenta vantagens
e desvantagens de acordo com a escolha do tipo de gel, poliacrilamida ou agarose,
diferentes nveis de toxicidade e potencial de desnaturao (Patel, 1994).
Os gis polimerizados com formaldedo no coram satisfatoriamente as
amostras, de forma que o brometo de etido deve ser colocado em cada amostra
individualmente, e no no gel, como comumente utilizado (Regitano, 2001).
Outro diferencial no gel desnaturante de agarose a utilizao de MOPS (3-
N-morfolino cido propanosulfnico). O MOPS um excelente tampo para
manuteno de sistemas biolgicos em pH neutro. muito utilizado em biologia
molecular e bioqumica.
Figura 2. Exemplo de separao eletrofortica. Nos nmeros 1 a 3 so mostradas
as bandas 28S, 18S e 5S do RNA, indicando integridade das amostras. O nmero 4
exemplifica uma amostra de RNA degradada.
28S
18S
5S
1 2 3 4
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7.2. PROTOCOLO DE GEL DESNATURANTE DE AGAROSE 1% COM
FORMALDEDO (adaptado de Lcia Elvira Alvares (2001):
Reagente Quantidade
Agarose (1%) 0,3 g
Buffer 5X (1 x) 6,0 mL
Formaldedo (2,2M)* 5,4 mL
gua DEPC 18,6 mL
Total 30 mL
* verificar se o pH do formaldedo superior a 4
A vidraria utilizada para a preparao do gel, assim como a cuba de
eletroforese devem estar previamente tratadas contra ao de RNAses. Todas as
solues empregadas devem ser feitas com gua DEPC.
Tampo de corrida 5X
Reagente Quantidade
MOPS (100 mM) 20,6 g
Acetato de sdio 0,05 M (40 mM) 800 mL
EDTA 0,5 M pH 8,0 (5 mM) 10 mL
1. Pesar o MOPS
2. Dissolv-lo em acetato de sdio 0,05 M. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 2N
e completar o volume para um litro de gua DEPC
3. Adicionar o EDTA 0,5 M pH 8,0. Guardar protegido da luz
4. Diluir este tampo para concentrao final de 1X com gua DEPC
Tampo da Amostra
Reagente Quantidade
Tampo de Corrida 5X 300 L
Formamida (50 %) 750 L
Formaldedo (10 %) 150 L
Azul de bromofenol (0,4 %) 0,004 g
gua DEPC 300 L
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1. Acrescentar 3 L do tampo da amostra para cada 1 L de RNA
2. Acrescentar 1 L de brometo de etdio (0,05 g/L)
3. Incubar as amostras por 15 minutos 65 C
4. Transferir para um recipiente contendo gelo
5. Centrifugar rapidamente para recolher o contedo no fundo do tubo
6. Manter em gelo at aplicar as amostras no gel
7.3. ELETROFORESE EM SISTEMA CAPILAR
Gustavo Gasparin
Durante dcadas, a eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose foi
intensamente utilizada como uma das ferramentas mais importantes dos laboratrios
de biotecnologia e bioqumica para a anlise de macromolculas. Nos ltimos anos,
porm, a eletroforese capilar tem apresentado vantagens em relao tcnica de
eletroforese em placas. Para a anlise simultnea de amostras, instrumentos de
eletroforese capilar com arranjo de capilares so os mais utilizados. Existem
aparelhos que possuem desde um nico capilar, at 384 capilares, possibilitando a
maximizao do tempo necessrio para as mais diferentes anlises, desde deteco
de resduos de explosivos e drogas, at testes de paternidade.
A separao das macromolculas conduzida em tubos de dimenses de 15
a 100 m de dimetro interno, e 36 a 100 cm de comprimento, preenchidos com um
eletrlito. O uso do capilar fornece vantagens sobre as placas de gel devido s
razes geomtricas, em que h uma elevada relao entre a rea superficial e o
volume interno, permitindo a dissipao eficiente do calor gerado pela corrente
eltrica, e possibilitando a aplicao de campos eltricos elevados (100 a 500 V/cm),
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o que resulta em separaes de alta eficincia, alto poder de resoluo, e reduzido
tempo de anlise.
Em geral, um aparelho de eletroforese capilar bsico consiste de uma fonte
de alta tenso, capilares (geralmente de slica fundida), eletrodos (de platina,
normalmente), e um detector apropriado. A fonte de alta tenso aplicada nos
eletrodos de platina situados nos reservatrios contendo uma soluo eletroltica
apropriada. As extremidades do capilar so imersas nos reservatrios da soluo,
para completar o contato eltrico. As amostras normalmente so introduzidas no
capilar por mtodos eletrocinticos, nos quais uma diferena de potencial
estabelecida entre o capilar e o recipiente que contm a amostra, durante um tempo
pr-determinado.
O detector localiza-se em algum ponto do capilar, prximo ao reservatrio de
sada.
A eletroforese capilar em gel (CGE) utilizada exclusivamente para
separao de macromolculas, tais como oligonucleotdeos, fragmentos de DNA, e
protenas. Teve incio com a aplicao nas separaes de DNA por tamanho
molecular, utilizando colunas preenchidas com gel, denominados gis qumicos: um
capilar tratado com um reagente que estabiliza o gel junto parede do capilar,
atravs de ligaes covalentes. Esse mtodo foi descartado dado o grande nmero
de problemas que surgiram, tais como aparecimento de bolhas (perda de
condutividade), introduo limitada de amostra, reteno de fragmentos com alto
peso molecular, e degradao do gel por hidrlise. Tais problemas levaram
formulao de novos sistemas, que foram denominados gis fsicos.
Gis fsicos so matrizes polimricas hidroflicas, dissolvidas em tampo
apropriado, que no so ligados parede do capilar, podendo assim ser substitudos
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a cada separao, o que permite o aproveitamento do mesmo capilar por centenas
de vezes, sem perda de eficincia. A uma dada concentrao de polmero, as fitas
polimricas individuais comeam a interagir umas com as outras, formando uma
estrutura em rede dentro do capilar, possibilitando a separao dos fragmentos de
DNA. A concentrao polimrica tima depende do tamanho do DNA a ser
separado.
7.4. PROTOCOLO PARA ANLISE DE PRODUTOS DE AMPLIFICAO EM
SISTEMA CAPILAR
Antes da injeo no capilar, as amostras so desnaturadas em presena de
formamida, para evitar que a formao de estruturas secundrias afete a velocidade
de migrao. Um padro de tamanhos conhecidos aplicado junto com as amostras
para permitir a estimativa do tamanho dos fragmentos analisados.
Procedimento:
1. Preparar o MIX de formamida + padro interno de tamanho de fragmentos:
para cada amostra, colocar 8,85 L de formamida Hi-Di e 0,15 L de padro
(GS 500 ROX).
2. Aplicar esses 9 L de MIX em um pocinho da placa de corrida
3. Aplicar 1 L de produto de PCR da sua amostra por pocinho
4. Desnaturar as amostras (j na placa de corrida) durante 5 minutos 95C
5. Colocar as amostras imediatamente no gelo aps a desnaturao,
permanecendo por 5 minutos.
6. Preparar a injeo das amostras no computador, atravs do software Data
Collection