Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE INMUNOLOGA Q.F.

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO

REA ESPECFICA DE:

MICROBIOLOGA

NOMBRE DE LA ASIGNATURA: CDIGO: FECHA DE ELABORACIN: NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: TIPO DE ASIGNATURA:

LABORATORIO DE INMUNOLOGA LQF 306L MARZO 2002 FORMATIVO DISCIPLINARIA

PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIN: M.C. Nidia Gary Pasos Salazar M.S.P. Oscar Prez Torz M.C. Alejandro Ruiz Tagle M.C. Patricia Guadalupe Surez Albores M.C. Carlos Tllez Osorio M.S.P. Claudy Lorena Villagran Padilla HORAS DE TEORA: 4 HORAS PRCTICA: 2 CRDITOS: 10

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NDICE
NMERO DE LA PRCTICA PRACTICA N 1 PRACTICA N 2 PRACTICA N 3 PRACTICA N 4 PRACTICA N5 PRACTICA N 6 PRACTICA N7 PRACTICA N8 PRACTICA N9 PRACTICA N10 PRACTICA N11 PRACTICA N 12 PRACTICA N 13 PRACTICA N 14 PRACTICA N 15 PRACTICA N 16 TITULO DE LA PRCTICA SEGURIDAD EN EL LABORATORIO TOMA DE MUESTRAS DILUCIONES OBSERVACION DE LEUCOCITOS DETERMINACIN DEL GRUPO SANGUNEO SEMINARIO: HERENCIA DE LOS GRUPOS SANGUNEOS DETERMINACIN DEL TITULO DE ANTICUERPOS ABO DEL SUERO PRUEBAS CRUZADAS REACCIONES FEBRILES SEMINARIO: DIAGNSTICO SEROLGICO DE INFECCIONES MICROBIANAS FACTOR REUMATOIDE Y PROTEINA C REACTIVA DETERMINACIN DE ANTIESTREPTOLISINAS O (ASO) SEMINARIO: INMUNIZACIN DETERMINACIN DE LA GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA SEMINARIO: DETECCIN DE ANTICUERPOS CONTRA EL VIH (ELISA/WESTERN BLOT) SEMINARIO: INMUNOELECTROFORESIS 23 19 21 13 15 17 PGINA 5 7 8 10 11

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INTRODUCCIN

Desde el descubrimiento de la alta especificidad de las reacciones antgeno-anticuerpo (Ag-Ac), muchos investigadores han buscado su aplicacin con propsitos de diagnstico (inmunodiagnstico). Inicialmente los investigadores se dedicaron a la deteccin de anticuerpos en el suero del paciente como un signo de infeccin y as a la identificacin serolgica del microorganismo. Sin embargo, hoy en da la sensibilidad y especificidad de los inmunoensayos permiten no solo la deteccin de anticuerpos contra una amplia variedad de organismos infecciosos incluyendo bacterias, parsitos, hongos y virus sino a la identificacin del propio microorganismo. An ms, proporcionan un medio para la deteccin y cuantificacin de antgenos no infecciosos y anticuerpos de importancia clnica tales como la determinacin del grupo sanguneo, el VDRL, la determinacin de la protena C-reactiva, una prueba que seala un proceso inflamatorio agudo, la deteccin de antgenos asociados a tumores y la demostracin de la hormona gonadotropina corinica, una prueba diagnstica del embarazo. Independientemente de la variedad de reacciones Ag-Ac usadas in vitro con propsito diagnstico, hay dos principios que deben ser establecidos: un anticuerpo con especificidad conocida sirve como reactivo para la identificacin del antgeno correspondiente y de igual manera un antgeno conocido sirve como reactivo para la identificacin del anticuerpo correspondiente. Se ha desarrollado una gran variedad de mtodos para demostrar y medir las reacciones antgeno-anticuerpo in vitro. Sin embargo de manera general las tcnicas de inmunoensayo pueden dividirse en dos grupos: las que se ven afectadas por la concentracin de Ag y Ac en la reaccin y las que no se afectan por la concentracin. Dentro del primer grupo se encuentran las reacciones de aglutinacin y de precipitacin. En el segundo se incluyen los ensayos que emplean al complemento, las pruebas de neutralizacin en las cuales se inhibe alguna propiedad del antgeno o del anticuerpo y especialmente los ensayos que dependen de antgenos o anticuerpos marcados con radioistopos, con colorantes fluorescentes o con enzimas. Aunque existen tcnicas modernas ms sensibles las pruebas de aglutinacin son muy usadas en muchas disciplinas del laboratorio clnico. La aglutinacin es una manifestacin secundaria de la reaccin antgeno-anticuerpo. En la aglutinacin el antgeno y el anticuerpo se unen para formar un agregado macroscpico fcilmente visible. La principal diferencia entre una prueba de precipitacin y una de aglutinacin es que en precipitacin el antgeno es soluble (molecular) mientras que la aglutinacin es agregacin de partculas o una clulas. Por esta razn se necesita mucho menos antgeno para obtener una reaccin de aglutinacin visible que en la precipitacin. La aglutinacin se puede observar 3

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sobre un portaobjetos a simple vista o con el microscopio, otro mtodo es en un tubo de ensaye se puede detectar por la formacin de grumos en la suspensin o viendo el patrn de sedimentacin en el fondo del tubo. La reaccin de aglutinacin ocurre en dos etapas, combinacin y agregacin. La combinacin o unin es extremadamente rpida, mientras que la agregacin es mucho ms lenta, sin embargo la velocidad puede incrementarse por incubacin en bao serolgico. Tambin es la razn por la cual muchos ensayos incluyen instrucciones de agitar, centrifugar o mezclar frecuentemente. Como se coment al inicio, el exceso de antgeno o anticuerpo pueden afectar las reacciones de aglutinacin al inhibir la formacin del agregado, esto se conoce como fenmeno de zona. La formacin del agregado es mxima a una concentracin ptima de antgenos y anticuerpos, mientras que un exceso de anticuerpos (prozona) o un exceso de antgenos (postzona) pueden causar la inhibicin del agregado y por los tanto dar un resultado falsamente negativo a la prueba.

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PRACTICA N 1 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

El conocimiento de las propiedades fisicoqumicas y de la infecto-contagiosidad de los viriones, permite definir las normas que en materia de seguridad, son necesarias para no correr ningn riesgo de adquirir an en forma accidental, una infeccin por este tipo de partculas. Con base en lo anterior, se enlistan a continuacin los reglamentos y normas que habrn de seguirse en el Laboratorio de Virologa, con la finalidad de asegurar la integridad fsica de los alumnos, as como para mantener una organizacin adecuada para el desarrollo de las prcticas correspondientes. La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no se permitir el acceso al laboratorio. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. Colocar todo los artculos personales en la zona lateral o en los cajones de las mesa de trabajo. Al iniciar y finalizar las prcticas, lavarse las manos con agua y jabn desinfectante. Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, as como introducir algn objeto en la boca. La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada. Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de utilizarla. Permanecer en la zona de trabajo asignada para cada equipo. Comunicarse con sus compaeros solo en la medida indispensable. Antes de iniciar la prctica, leer y recordar la metodologa a seguir de acuerdo con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es el momento para aclararlas. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material, derramamiento de suspensiones virales, etc.). Todo el material que se va a incubar o desechar, deber colocarse en el sitio indicado por el profesor. Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material de desecho no contaminado deber depositarse en los contenedores correspondientes. En forma previa a su lavado, siempre se deber desinfectar el material que se le proporcione en el laboratorio. Rotule todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos: grupo, seccin, equipo, nombre del alumno, as como fecha de entrada y salida.

En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, en la cual se establecen los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los Residuos Peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en establecimientos e instituciones relacionadas con el sector salud. En la NOM referida, se establecen adems definiciones de inters para los laboratorios y reas de microbiologa, tales como:

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Desinfeccin: Destruccin de microorganismos patgenos en todos los ambientes, materias o partes que pueden ser nocivos, por los distintos medios mecnicos, fsicos o qumicos contrarios a su vida o desarrollo, con el fin de reducir el riesgo de transmisin de enfermedades. Residuo peligroso biolgico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros microorganismos con capacidad de causar infeccin o que contiene o puede contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a seres vivos y al ambiente, que se generan en hospitales y establecimientos de atencin mdica. En adicin, se consideran residuos peligrosos biolgico-infecciosos los siguientes: La sangre Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos Los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin, as como los generados en la produccin de biolgicos Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico Los residuos anatmicos derivados de la atencin a pacientes de los laboratorios Los equipos y dispositivos desechables utilizados para la exploracin y toma de muestras Los objetos punzo cortantes usados o sin usar Los que han estado en contacto con pacientes o sus muestras clnicas durante el diagnstico y tratamiento, incluyendo navajas, lancetas, jeringas, pipetas Pasteur, agujas hipodrmicas, de acupuntura y para tatuaje, bistures, cajas de Petri, cristalera entera o rota, porta y cubreobjetos, tubos de ensayo y similares.

Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, debern ser tratados por mtodos fsicos o qumicos, los cuales: Debern garantizar la eliminacin de microorganismos patgenos Debern volver irreconocibles a los residuos peligrosos biolgico-infecciosos Debern ser cremados, si se trata de residuos patolgicos. El cumplimiento de las consideraciones sealadas con anterioridad, garantiza la seguridad que deber observarse tanto para alcanzar los objetivos de las prcticas, como para su desarrollo en condiciones aspticas. Finalmente y dada la especificidad de especie que presentan los virus, en esta primera sesin de laboratorio se har nfasis en que a travs de las diferentes prcticas, se utilizarn nicamente suspensiones virales de tipo vacunal destinadas para uso veterinario, con la finalidad de evitar el ms mnimo riesgo de infeccin hacia los estudiantes. CUESTIONARIO 1. Con ayuda de un esquema especifique, cul sera el manejo que se la dara a materiales como jeringas, portaobjetos, pipetas, tubos y material con residuos de tejidos, desde que han sido utilizados para el anlisis de la sangre hasta su destino final.

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PRACTICA N 2 TOMA DE MUESTRA

Obtencin de Muestra de Sangre. Para efectuar anlisis serolgicos, las muestras de sangre pueden ser de sangre capilar o perifrica y de sangre venosa. Sangre capilar o perifrica. La sangre capilar o perifrica es la que fluye despus de aplicar una puncin superficial cutnea. Se puede obtener de la yema del dedo. Algunas pruebas pueden realizarse con sangre capilar o perifrica y se aconseja cuando no es posible obtener una muestra de sangre venosa o no se desea puncionar la vena. Sangre venosa. Esta muestra se obtiene por puncin de una de las tres venas del pliegue del codo: la baslica, la ceflica o la mediana cubital. Se emplean jeringas desechables con agujas de tipo 21x32, 20x32 o el sistema para la extraccin de sangre intravenosa al vaco Vacuntainer . Previamente se realiza la limpieza del rea elegida con torunda y alcohol. Antes de puncionar se coloca el torniquete aproximadamente a 8 cm de distancia arriba del pliegue del codo. No debe olvidar soltarlo tan pronto empiece a obtenerse la muestra. La cantidad mxima de sangre a extraer ser estrictamente la necesaria para las pruebas. Anticoagulantes. Los anticoagulantes ms usados son el citrato de sodio, oxalato de sodio y EDTA. El citrato de sodio se emplea al 3.8% y el oxalato de sodio al 1.4%. Se usan en relacin de una parte de anticoagulante por cada nueve partes de sangre, habitualmente se usan 0.25ml de la solucin para completar a 2.5ml de volumen total con la muestra de sangre. El EDTA (cido etilen-diamino-tetra-actico) se utiliza al 10% y es uno de los anticoagulantes de eleccin para el trabajo de rutina. Manejo y conservacin de la muestra. La muestra debe rotularse correctamente y separase segn el caso en plasma o suero, y dependiendo del tipo de anlisis debe analizarse inmediatamente o puede conservarse adecuadamente refrigerada entre 4 y 8C para el anlisis posterior.

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PRACTICA N 3 DILUCIONES
Se les llama diluciones a las soluciones con concentracin menor obtenidas al agregar volmenes conocidos de diluyente a una solucin de concentracin conocida. Las diluciones se expresan en forma de una proporcin, por ejemplo 1/10 (1:10) donde la primera cifra o numerador (1) corresponde al volumen de lo que se est diluyendo y la segunda cifra o denominador (10) al volumen total en que se encuentra. As, una dilucin 1/10 indica que se tiene un volumen de la solucin original contenido o diluido en 10 volmenes totales, de los cuales 9 corresponden al diluyente. Dado que en una dilucin lo que se indica es la relacin entre el volumen de la solucin original y el volumen total en que se encuentra, una dilucin 1/10 puede prepararse de diferentes maneras: Por ejemplo: 1 ml de muestra en 9 ml de diluyente 0.1 ml de muestra en 0.9 ml de diluyente 0.5 ml de muestra en 4.5 ml de diluyente En la prctica el clculo de las diluciones se puede efectuar de dos maneras diferentes que cumplen ciertas expectativas, la dilucin directa y la dilucin en serie. Dilucin directa. Para realizar una dilucin directa se puede hacer uso de la siguiente expresin: 1/d=Vm/Vt donde 1/d= dilucin Vm= volumen de muestra Vt= volumen total (volumen de diluyente + volumen de muestra)

Ejemplo N1 Lleve 5 ml de muestra a una dilucin 1/10. Sustituyendo los valores conocidos tenemos: 1/d=1/10 Vm=5 ml Vt= ? As: 1/10=5 ml/Vt despejando Vt tenemos que Vt=10 x 5/1=50 ml volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra volumen de muestra = 50-5 = 45 ml Ejemplo N2 Prepare exactamente 200 ml de una dilucin 1/50.

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Sustituyendo los valores conocidos tenemos: 1/d=1/50 Vm=? Vt= 200 ml As: 1/50=Vm/200 despejando Vm tenemos que Vm=200 x 1/50=4 ml volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra volumen de diluyente = 200-4=196 ml Sin embargo, las diluciones directas tienen el inconveniente de que cuando es necesario hacer una dilucin alta por ejemplo 1/ 10 000, se desperdicia mucho reactivo o se incurre en un error de medicin. As, una dilucin 1/ 10 000 se preparara con 1 ml de muestra y 9 999 ml de diluyente o bien 9.999 ml de diluyente y 0.001 ml de muestra. Dilucin seriada Este tipo de dilucin soluciona los inconvenientes que presenta el calculo directo de las diluciones altas. Adems, en microbiologa permite el calculo de la poblacin microbiana en la muestra de estudio, de la cual se toma una alcuota que se diluye en varios tubos y se siembra por vertido en placa. La diferencia entre la dilucin de dos tubos consecutivo se conoce como factor de dilucin, siendo 2, 4 y 10 los ms usados. En el ejemplo de la dilucin 1/ 10 000, la muestra se puede diluir 1/ 100 ( Vm= 0.1 ml + Vt= 10 ml) en un primer tubo y colocar 0.1 ml de esta dilucin en un segundo tubo con 9.9 de diluyente. El segundo tubo tendr una dilucin 1/ 100, sin embargo como la muestra ya se encuentra diluda previamente 1/ 100, multiplicando sus denominadores tenemos: 1/ 100 x 1/ 100= 1/ 10 000 En este caso el factor de dilucin es de 100. Debe insistirse en que solo el primer tubo lleva la alcuota de la muestra sin diluir, los dems tubos toman la alcuota ya diluida del tubo previo. El nmero de tubos y las diluciones intermedias se plantean considerando el volumen de los tubos as como el volumen mnimo que se puede medir fcil y exactamente con las pipetas disponibles. Cmo lograr exactamente 30 ml de una dilucin 1:2000?

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PRACTICA N 4 OBSERVACION DE LEUCOCITOS (CUENTA DIFERENCIAL)

Los cinco principales tipos de leucocitos son los neutrfilos (50-70%), los eosinfilos (1-5%), basfilos (0.5-1.0%), linfocitos (20-30%), y monocitos (2 6%). Por cuenta diferencial se entiende la determinacin del porcentaje relativo de cada tipo de leucocito en una muestra de sangre. Se realiza en extendidos (frotis) preparados cuidadosamente y teidos con colorantes tales como Wright, el cual tie el ncleo de los leucocitos de un color prpura que facilita la diferenciacin. MATERIAL Y EQUIPO Portaobjetos Lancetas desechables Algodn Colorante de Wright Solucin reguladora pH 6.4 Microscopio PROCEDIMIENTO 1. A partir de la muestra de sangre preparar 2 extendidos (frotis) siguiendo las indicaciones del instructor. 2. Dejar secar completamente los frotis, colocar en un puente de tincin y cubrirlos (contar el nmero de gotas) con colorante de Wright. Dejar el colorante 1 minuto y aadir el mismo nmero de gotas de solucin reguladora pH 6.4 durante 8 minutos. 3. Lavar suavemente la preparacin por 30 segundos y secar el exceso de agua. 4. Cuando la preparacin est completamente seca, colocar una gota de aceite de inmersin y observar al microscopio. 5. Para facilitar la identificacin consultar las lminas a color que ilustran los diferentes leucocitos.

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PRACTICA N5 DETERMINACIN DEL GRUPO SANGUNEO

Alrededor de 1900 Karl Landsteiner descubri que en el humano existen cuatro tipos de sangres con respecto a la presencia o ausencia de dos antgenos especficos denominados A y B. Estos cuatro grupos se conocen actualmente como tipos A, B, AB y O. Este ltimo se caracteriza por la ausencia de los antgenos A y B. En 1940 Landsteiner y Wiener reportaron que el suero de conejo producido contra eritrocitos de mono Rhesus poda aglutinar los eritrocitos del 85% de una poblacin caucsica. Este antgeno se design inicialmente como factor Rh, posteriormente se encontr que existe como seis antgenos a los cuales Fisher y Race designaron con letras C, D, E, c, d, e. Uno de estos antgenos, el D es responsable de la condicin Rh positivo. La tipificacin de eritrocitos en el laboratorio se realiza con antisueros especficos contra los antgenos A, B y D, y puede realizarse por mtodos en tubo o en portaobjetos. OBJETIVO Demostrar por medio de una reaccin de aglutinacin la presencia de los Ag eritrocitarios A, B y D. MATERIALES Y EQUIPO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Muestras de sangre con anticoagulante Pipetas graduadas de 1 y 5 ml Tubos de ensayo de 10 X 75 mm Solucin salina isotnica Lancetas desechable Aplicadores de madera o palillos Sueros tipificadores anti-A anti-B anti-D (Rh) 8. Placa oscilatoria PROCEDIMIENTO Mtodo en tubo 1. Se obtiene aproximadamente 5 ml de sangre venosa y se colocan en un tubo con EDTA (0.1 ml de EDTA al 1% por cada ml de sangre). Se centrfuga por 2 min. a 2000 r.p.m. para separar el plasma del paquete celular. 2. Se toman 0.1 ml del paquete celular y se resuspenden en 1.9 ml de solucin salina para una suspensin aproximada del 5%. 3. Se marcan tres tubos de la siguiente manera: anti-A, anti-B y anti-D, y se agrega una gota del suero tipificador segn corresponda. 4. Se agregan 4 gotas de la suspensin de eritrocitos a cada tubo y se agitan suavemente. 5. Los tubos se centrifugan 1 min a 2000 r.p.m. 11

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6. Se busca la presencia de aglutinacin agitando suavemente los tubos. La aglutinacin se reconoce por la formacin de grumos. 7. Si la prueba en el tubo anti-D es negativa se realiza el siguiente procedimiento. 8. Se incuba a 37C por 30 minutos, se centrfuga y se busca la aglutinacin. 9. Si persiste la negatividad se lavan los eritrocitos 3 veces con 0.5 ml de solucin salina y se elimina perfectamente el sobrenadante. 10. Se agrega una gota del suero de Coombs y se agita suavemente, se centrfuga y se busca la aglutinacin Interpretacin: Si aglutina en el paso 6 es Rh positivo Si aglutina en el paso 10 es Du Si persiste la negatividad es Rh negativo. Mtodo en portaobjetos 1. Depositar 2 gotas de sangre en tres diferentes divisiones de un portaobjetos. 2. Agregar de izquierda a derecha una gota del antisuero anti-A, una gota de anti-B y una gota de anti-D respectivamente. 3. Mezclar los reactivos con un aplicador de madera diferente para cada gota. 4. Agitar suavemente en la placa oscilatoria. 5. Buscar la presencia de aglutinacin. CUESTIONARIO 1. Cul es la estructura qumica de los Ag A y B? 2. Elabore una tabla que muestre los Ag, Ac, fenotipo y genotipo de los grupos sanguneos del sistema ABO y Rh. 3. Puede una persona de grupo A y una B tener como descendencia a un hijo de grupo O? Explique

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PRACTICA N 7 DETERMINACIN DEL TITULO DE ANTICUERPOS ABO DEL SUERO.

El sistema de grupo sanguneo ABO posee una caracterstica nica; la presencia de anticuerpos fuertemente reactivos en el suero de los que carecen de los antgenos correspondientes. Estos anticuerpos pertenecen a la clase IgM y son producidos en respuesta a una inmunizacin. Se dice que estos anticuerpos se producen de manera natural en base a que los inmungenos son probablemente de origen bacteriano, dado que algunas bacterias presentan sustancias similares a los antgenos A o B. El ttulo es una medida relativa de anticuerpos o antgenos en una reaccin serolgica. Se determina realizando a partir del suero problema diluciones seriadas. El ttulo del anticuerpos A o B del suero se reporta como el recproco de la mxima dilucin en la cual es posible observar eritrocitos aglutinados. OBJETIVO Establecer a travs de diluciones seriadas el concepto de ttulo aplicado en las reacciones serolgicas MATERIAL Suspensin de eritrocitos de grupo A o B al 5 % en SSI Suero (plasma) de grupo O Pipetas graduadas de 1 y 5 ml Tubos de ensayo de 10 X 75 mm Solucin salina isotnica Lancetas desechable Aplicadores de madera o palillos Sueros tipificadores anti-A anti-B PROCEDIMIENTO 1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos rotulados del 1 al 6 y se agregar 0.1 ml de solucin salina cada uno de ellos. 2. Agregar 0.1 ml del suero problema al tubo n 1, mezclar bien y transferir 0.1 ml al tubo n 2 y as sucesivamente hasta el tubo n 6 del cual se desechan 0.1 ml. 3. Agregar 4 gotas de la suspensin de eritrocitos a cada tubo y mezclar. 4. Incubar a 37C por 15 minutos, mezclan suavemente y centrifugar a 1000 r.p.m. durante 1 minuto. 5. Desprender el botn suavemente y buscar la presencia de aglutinacin.

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INTERPRETACIN 1. El ttulo de anticuerpos en el suero problema se determina como el recproco de la dilucin mxima en la que se observa aglutinacin. 2. Adems de la aglutinacin se puede observar hemlisis, por lo que se debe comprobar la presencia de hemoglobina libre CUESTIONARIO 1. Cul es la dilucin en cada uno de los tubos? 2. Explique porqu puede variar el ttulo de Ac. en la muestra para cada equipo 3. Existen los Ac anti-O naturales

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PRACTICA N8 PRUEBAS CRUZADAS

El objetivo de una transfusin es el proporcionar al paciente (receptor) el tipo preciso de sangre. Por supuesto este objetivo es difcil de lograr, pero es posible aproximarse mucho si se realizan las pruebas correctas de hemaglutinacin. En primer lugar, deben determinarse con exactitud los anfgenos de los grupos sanguneos principales: el grupo ABO y el Rh del paciente, sobre la base de estos grupos se selecciona la unidad de sangre de grupo ABO y Rh compatible y se procede a efectuar las denominadas pruebas cruzadas mayor y menor. La prueba cruzada mayor, denominada prueba de compatibilidad, se realiza mezclando el suero del receptor con los eritrocitos del donador. Si se produce hemaglutinacin, esta sangre no puede darse al receptor porque tiene anticuerpos capaces de reaccionar y destruir la sangre administrada. En la prueba cruzada menor, los eritrocitos del receptor son incubados con suero del donador y se observa si hay aglutinacin. Si se produce hemaglutinacin, la sangre del donador no debe administrase. En ambas pruebas una suspensin de los eritrocitos respectivos se mezclan con el suero y la mezcla se incuba a 37C durante unos 30-60 minutos. Despus del periodo de incubacin los eritrocitos se lavan para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos, y se aade el reactivo de Coombs (anti-globulina).

MATERIAL Y EQUIPO Muestras de sangre con y sin anticoagulante Pipetas graduadas de 1 ml y 5 ml 8 tubos de ensaye de 10 X 75 mm solucin salina isotnica. Bao serolgico Centrfuga Solucin de albmina bovina al 10% PROCEDIMIENTO 1. Se obtiene una muestra de sangre del donador y receptor y se procede igual a lo descrito en los incisos 1 y 2 de la prctica anterior. 2. Se disponen 4 tubos etiquetados como sigue: PM/S =Prueba Mayor en solucin salina pm/s =Prueba Menor en solucin salina PM/A =Prueba Mayor en albmina pm/a =Prueba Menor en albmina 3. Se agregan a cada tubo los siguientes reactivos en el orden indicado: PM/S. pm/s. 2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del donador 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del receptor 15

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PM/A.

2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de albmina + 1 gota de eritrocitos (al 5%) del donador pm/a. 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de albmina + 1 gota de eritrocitos (al 5%) del receptor 4. Se mezclan bien y se incuban a 37C por 30 minutos. 5. Se centrifugan 1 minuto a 2000 r.p.m. y se busca la presencia de aglutinacin. 6. En caso de que no se presente la aglutinacin, los tubos se centrifugan nuevamente y se descarta el sobrenadante. Se lava el paquete celular de cada tubo con 1 ml de solucin salina y se centrifuga nuevamente descartando el sobrenadante. Repetir el lavado 2 veces. 7. Al paquete celular se le agrega un agota del suero de Coombs y se busca la presencia de hemaglutinacin. Interpretacin: Si hay aglutinacin en cualquiera de los tubos, ser indicativo de que hay incompatibilidad entre el posible donador y el receptor (paciente). Si no la hay, las sangres son compatibles. CUESTIONARIO. 1.-Qu significa una prueba cruzada positiva y una negativa? 2.-Qu nos indica la prueba mayor y menor? 3.-Qu factores pueden interferir en los resultados de una prueba cruzada? 4.-Qu caractersticas debe tener un donador sanguneo ideal?

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PRACTICA N9 REACCIONES FEBRILES (DIAGNSTICO SEROLGICO DE INFECCINES BACTERIANAS)

La aglutinacin de clulas bacterianas con antisueros es una de las pruebas serolgicas mas antiguas de la inmunologa prctica. Se inici como un mtodo para el diagnstico de la infecciones bacterianas y fue propuesta por Widal en 1896. La pruebas de aglutinacin bacteriana tienen dos aplicaciones principales en el diagnstico ; las clulas bacterianas desconocidas pueden identificarse por medio de anticuerpos conocidos, o bien utilizando bacterias conocidas pueden identificarse los anticuerpos en el suero del paciente. La identificacin bacteriolgica completa del agente patgeno es un proceso que lleva tiempo (3 o ms das), mientras se intenta el reconocimiento del agente es posible la identificacin serolgica. En la aglutinacin de los antgenos bacterianos con sus anticuerpos portaobjetos produce un agregado macroscpico . MATERIAL Y EQUIPO 1. 2. 3. 4. 5. 6. Muestras de sueros Placa de vidrio marcada en 6 cuadros Pipetas graduadas de 1 y 0.2 ml Pipeta Pasteur Placa oscilatoria Equipo con antgenos: O de Salmonella typhi H de Salmonella typhi H de Salmonella enteritidis paratyphi A H de Salmonella enteritidis paratyphi B Brucella abortus Proteus OX-19

PROCEDIMIENTO 1. En una placa de vidrio perfectamente limpia se depositan 0.08 ml del suero problema en cada una de las seis divisiones. 2. Se agrega una gota de cada antgeno comenzando por la izquierda arriba, respetando el orden establecido. 3. Se mezclan las gotas con palillos diferentes y se agita suavemente en la placa de rotacin durante dos minutos. 4. La lectura se hace observando la aglutinacin macroscpica. 5. Si aparece aglutinacin con alguno de los antgenos, continuar con el siguiente paso. 6. Se toma otra placa y se depositan 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, y 0.005 ml del suero problema. 7. Se agrega una gota del antgeno seleccionado, se mezclan con un palillo y se revisa la presencia de aglutinacin.

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INTERPRETACIN: 1. Los volmenes de suero empleados corresponden respectivamente a diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320. 2. El titulo de anticuerpos del suero problema se reporta como el recproco de la mxima dilucin que muestra aglutinacin. 3. La mayora de los ttulos mayores de 160 son presuntivos de infeccin. 4. La mejor indicacin de una infeccin activa es un aumento en el ttulo de dos determinaciones sucesivas con una diferencia de 5-7 das concomitantes a la infeccin. CUESTIONARIO 1. Qu enfermedades producen los agentes microbianos revisados? 2. Qu significado tiene el demostrar la presencia de Ac en el suero del paciente 3. Cul es la razn de utilizar una suspensin de Proteus OX-19 para el diagnstico de tifo?

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PRACTICA N11 FACTOR REUMATOIDE Y PROTEINA C REACTIVA

Los factores reumatoides son anticuerpos dirigidos contra los determinantes antignicos de la regin Fc de las IgG. En personas sanas, estos anticuerpos pueden hallarse en baja concentracin, sin embargo se encuentra aumentado en la mayora de los pacientes con artritis reumatoide. La determinacin del factor reumatoide se lleva a cabo con partculas de latex cubiertas de IgG. La Protena C Reactiva forma parte de las protenas de fase aguda, un conjunto de protenas del suero cuya concentracin aumenta de manera drstica durante el dao tisular, la infeccin o el estrs. No es especfica de una enfermedad sino que es un indicador del proceso inflamatorio. MATERIAL Y EQUIPO 1. Muestras de sueros 2. Placa de vidrio oscuro marcada 3. Pipetas graduadas de 1 y 0.2 ml 4. Aplicadores de madera o palillos 5. Pipeta Pasteur 6. Reactivo de latex-FR 7. Reactivo de latex- Protena C Reactiva 8. Solucin amortiguadora de glicina-cloruro de sodio pH 8.2 9. Solucin salina isotnica 10. Placa rotatoria PROCEDIMIENTO Factor Reumatoiden (FR). Por el mtodo de aglutinacin en latex en placa, utiliza una suspensin estabilizada de partculas de latex sensibilizadas con IgG humana. 1. El suero se inactiva previamente calentando en bao serolgico a 56C por 15 min o 60C por 1 min. Ya inactivado se diluye 1:20 con amortiguador de glicina-cloruro de sodio colocando 0.1 ml de suero y 1.9 ml del amortiguador. 2. Se coloca una gota de la dilucin en la placa de vidrio oscura y se aade una gota del reactivo latex-FR. 3. Se mezcla y se agita suavemente en la placa rotatoria durante dos minutos. 4. Se busca la aglutinacin macroscpica. 5. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640, las cuales se preparan con 0.5 ml de la dilucin 1/20 en 0.5 ml del amortiguador para una dilucin 1/40 y as consecutivamente. Protena C Reactiva (PCR). Por el mtodo de aglutinacin en latex en placa. Utiliza una suspensin acuosa de partculas de latex recubiertas de anticuerpos especficos antiProtena C Reactiva.

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1. El suero problema se diluye 1/5, 1/40 con solucin salina isotnica y se coloca una gota de la dilucin en una placa de vidrio oscuro. 2. Se aade una gota del reactivo latex-PCR se mezcla bien y se agita suavemente en la placa rotatoria por 3 min. 3. Se busca la aglutinacin macroscpica. 4. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero a partir de 1/80. CUESTIONARIO 1. Por qu se inactiva el suero? 2. Explique el fundamento de cada una de las pruebas 3. Explique el significado clnico de una prueba FR positiva y el de una PCR positiva

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PRACTICA N12 DETERMINACIN DE ANTIESTREPTOLISINAS O (ASO)

Las estreptolisinas son enzimas hemolticas producidas por la mayora de los estreptococos del grupo A, destruyen la membrana de los eritrocitos ocasionando la hemlisis. Este producto bacteriano es una de las muchas toxinas extracelulares y enzimas producidas por los estreptococos. En particular, la estreptolisina O recibe este nombre debido a que sensible al oxgeno, solo posee actividad en estado reducido, razn por la cual se le incorpora un reductor (el hidrosulfito de sodio) inmediatamente antes de usarla. En el laboratorio las ASO pueden determinarse por una reaccin serolgica de neutralizacin, en la cual si el suero del paciente contiene anticuerpos contra la enzima (antiestreptolisinas) neutralizarn su capacidad hemoltica y ocurrir inhibicin de la hemlisis. MATERIAL Y EQUIPO Muestras de suero Suspensin de eritrocitos al 5% Amortiguador para ASO (fosfatos pH 6.5) Estreptolisina O Bao serolgico Centrfuga Pipetas graduadas de 1 ml y 5 ml 15 tubos de ensaye de 10 X 75 mm PROCEDIMIENTO 1. Preparar a partir del suero problema las siguientes diluciones iniciales: a) 1:10 con 0.2 ml del suero problema + 1.8 ml de solucin amortiguadora b) 1:100 con 0.3 ml de la dilucin 1:10 + 2.7 ml de solucin amortiguadora c) 1:500 con 0.6 ml de la dilucin 1:100 + 2.4 ml de solucin amortiguadora 2. Rotular los tubos de ensaye con nmeros del 1 al 12 y dos ms como control (+) y control (-).

3. Preparar diluciones secundarias aadiendo primero el volumen de solucin amortiguadora y posteriormente el volumen del suero diluido segn se indica a continuacin:
Tubos N ml amortiguador Dilucin ml suero diluido Unidades Todd 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.1 0.4 --- 0.1 0.2 0.3 0.35 --- 0.1 1:10 1:100 0.4 0.1 0.5 0.4 0.3 0.2 0.15 0.5 0.4 12 50 100 125 166 250 333 500 625 10 11 12 (+) (-) 0.2 0.3 0.4 0.5 0.75 1:500 0.3 0.2 0.1 --- --833 1250 2500

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4. Mezclar suavemente y aadir a cada tubo 0.25 ml de estreptolisina, EXCEPTO al tubo control (-). 5. Mezclar por agitacin e incubar a 37C por 15 min. 6. Aadir a cada tubo 0.25 ml de una suspensin de eritrocitos al 5%., mezclar e incubar a 37C por 30 min. 7. Centrifugar los tubos a 2500 rpm por 2 min. 8. Comprobar la presencia de hemlisis completa en el tubo control (+) y la ausencia de hemlisis en el tubo control (-) 9. Determinar el ttulo de antiestreptolisinas (unidades Todd) como el de la mxima dilucin que no presenta hemlisis.

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PRACTICA N 14 DETERMINACIN DE LA GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA

Las pruebas de laboratorio para el diagnstico del embarazo se basan en la determinacin de la gonadotropina corinica humana (hGC), hormona producida por la placenta y que puede detectarse tanto en el suero como en la orina. La excrecin de hGC alcanza su mximo durante la duodcima a decimocuarta semana de gestacin y a partir de entonces desciende de nivel. Hasta los aos 60, las pruebas de embarazo eran bioensayos en los cuales la presencia de la hGC en el suero o en la orina se demostraba por su efecto en animales. Las primeras pruebas utilizaban ratones y conejos, las pruebas ulteriores ratas hembra o ranas. Actualmente estas pruebas han sido sustituidas por pruebas inmunolgicas. Las pruebas inmunolgicas dependen del anticuerpo anti-hGC. La presencia de hGC en el suero u orina se demuestra por un sistema indicador. Los ensayo de aglutinacin denominadas de inhibicin de la aglutinacin consisten de eritrocitos de conejo o partculas de ltex recubiertas con hGC. Cuando se realiza la prueba, el suero u orina de la paciente se incuban con el anticuerpo. Si existe hGC en la muestra, el anticuerpo es inactivado y los eritrocitos o partculas de ltex no aglutinan. Si la muestra no contiene hGC, el anticuerpo permanece activo y se produce la aglutinacin. Adems de la aglutinacin, existen otras tcnicas inmunolgicas para la determinacin de la hGC, tales como los inmunoensayos enzimticos (ELISA) y el radioinmunoanlisis (RIA), el cual requiere de equipo especial para su realizacin. Esta tcnicas varan en su sensibilidad, esto es las pruebas inmunolgicas son, ms sensibles al detectar concentraciones menores de hGC, por ejemplo las pruebas con eritrocitos tienden a ser ms sensibles que la que emplean partculas de ltex. MATERIAL Orina del Paciente (10 ml) Solucin salina isotnica (SSI) Equipo de diagnostico de hGC Pipetas serolgicas de 1 ml PROCEDIMIENTO 1. Se filtran unos 5 ml de orina o se centrifuga a 3000 r.p.m. 5 minutos para precipitar el material insoluble. Se usa el filtrado o el liquido sobrenadante 2. Se diluye un volumen de orina en dos volmenes de solucin salina, por ejemplo 0.5 ml de orina y 1.0 ml de solucin salina. 3. Se colocan en el tubo apropiado 0.25 ml de antisuero anti-hGC, se agregan 0.25 ml de la orina diluida y se agita suavemente. 4. Se agrega una gota de la suspensin de eritrocitos sensibilizados y se agita suavemente hasta lograr una suspensin homognea. 23

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5. Se coloca en una superficie libre de vibraciones o del calor. De preferencia en una gradilla con el espejo adecuado. 6. Efectuar la lectura 2 horas despus. RECOMENDACIONES 1. Los residuos de orinas anteriores falsearan la prueba. 2. Tubos diferentes a los apropiados distorsionan la lectura 3. No deben mezclarse los goteros o tocar con ellos los tubos de ensayo. 4. Los reactivos deben agregarse en el orden establecido. INTERPRETACION Para la lectura se interpretan los esquemas celulares en el fondo del tubo de ensayo Prueba positiva = un botn claramente definido Prueba negativa = un tapiz difuso de clulas

PRUEBA NEGATIVA

PRUEBA POSITIVA

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BIBLIOGRAFA
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