Dispositivos Mdicos rotulados Endotoxinas Bacterianas

de

apirognicos:

Pesquisa

de

Existem dispositivos mdicos no mercado rotulados como estreis e apirognicos, como o caso dos sistemas para administrao de sangue, sistemas para administrao de solues, sistemas de hemodilise. Enquanto que os requisitos para os dispositivos mdicos submetidos a uma esterilizao final serem rotulados de estril encontram-se estabelecidos na norma NP EN 556:2000, a qual menciona que os mesmos devem estar isentos de microorganismos viveis, a apirogenia dever ser verificada atravs da realizao do ensaio das endotoxinas bacterianas, que se encontra estabelecido no captulo 2.6.14 da Farmacopeia Portuguesa VII. Entenda-se que as endotoxinas bacterianas no so os nicos compostos designados de pirognios, mas so consideradas as de maior significado nos produtos estreis. O que so endotoxinas bacterianas? As endotoxinas bacterianas so lipopolissacardeos da superfcie da membrana de bactrias Gram-negativas (ex. Escherichia coli, Pseudomonas spp). As endotoxinas podero provir de bactrias vivas ou de fragmentos de bactrias mortas. Quais as principais fontes de contaminao? A gua uma das fontes de contaminao por endotoxinas bacterianas. O vapor de gua, presente durante o processo de esterilizao, tambm uma das fontes de contaminao por endotoxinas bacterianas dos dispositivos mdicos. So igualmente eventuais fontes de contaminao os equipamentos e as mos dos operadores. Quais os efeitos clnicos da presena de endotoxinas bacterianas? Febre Alteraes hematolgicas, nas quais se inclui leucocitose Hiperglicmia Diminuio da resistncia s infeces Perturbaes circulatrias

As endotoxinas bacterianas quando introduzidas na circulao sangunea ligam-se a lipoprotenas plasmticas reduzindo a sua actividade biolgica, induzem a coagulao e afectam a funo heptica e os sistemas endcrino e nervoso.

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As altas concentraes de endotoxinas ou um aumento da sensibilidade s mesmas, acarretam alteraes na resposta imunitria que acaba por ser prejudicial para o doente/paciente. Considerando que a febre uma das respostas mais frequentes e estudadas, as endotoxinas bacterianas so vulgarmente designadas por pirognios. Como se procede sua destruio? As endotoxinas presentes nas bactrias e nos seus fragmentos so substncias muito estveis, sendo os processos usuais de esterilizao ineficazes para a sua destruio. Para degrad-las quimicamente devem ser usados cidos ou bases fortes, ou um processo de pirlise ( 180 C por 3 horas , ou 250 C por 30 minutos ). Por tal motivo, no fabrico de dispositivos mdicos apirognicos devero ser tomadas medidas preventivas para evitar a contaminao por endotoxinas bacterianas. Como se pesquisam as endotoxinas bacterianas? O ensaio de endotoxinas bacterianas destina-se deteco ou quantificao das endotoxinas produzidas por bactrias Gram-negativas por meio de um lisado de amebcitos de lmulo (LAL- LIMULUS AMOEBOCYTE LYSATE ). O ensaio pode ser realizado por trs tcnicas: 1) Gelificao induo da formao de um gel (tcnica no quantitativa); 2) Turbidimetria- desenvolvimento de uma turvao por libertao de um substracto endgeno (tcnica quantitativa); 3) Colorimetria- desenvolvimento de uma colorao por libertao de um complexo peptdeo cromognico sinttico (tcnica quantitativa). As referidas tcnicas vm descritas no captulo 2.6.14. da Farmacopeia Portuguesa VII. Em que se baseia o princpio do LAL? O princpio biolgico do teste do LAL foi observado no Limulus polyphemus, vulgo caranguejo ferradura. Quando o sangue entre em contacto com as bactrias Gram-negativas ocorre a coagulao dos amebcitos (clulas sanguneas). Em 1885 Howell descreveu esta coagulao do sangue, mas foi Bang, no Marine Biological Laboratory em Massachusets, que na dcada de 50, correlacionou esta coagulao com a presena de bactrias gram-negativas. Bang e Levin, posteriormente, descobriram que a reaco enzimtica, e que os enzimas esto localizados nos grnulos dos amebcitos do caranguejo. Sabe-se hoje, que a reaco que produz a formao de um gel (gelificao) uma reaco em cascata de activao enzimtica. A protena de coagulao (coagulognio) clivada por um enzima coagulante activado. Os

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produtos insolveis da clivagem ligam-se por interaco inica para formar o gel, caracterstico da positividade do teste do LAL. Como se efectua a tcnica de gelificao? A tcnica de gelificao a tcnica mais usual e mais simples no ensaio de endotoxinas bacterianas. Uma das etapas do mtodo de gelificao a confirmao da sensibilidade declarada da soluo () do lisado, expressa em U.I/ml, ou seja a concentrao de endotoxinas necessria para produzir a coagulao do lisado. Esta confirmao, feita em quadruplicado, deve ser efectuada por cada lote de lisado ou quando so realizadas alteraes ao mtodo que possam interferir com os resultados do ensaio. Para se proceder confirmao necessrio preparar solues, em quadruplicado, com pelo menos quatro concentraes distintas preparadas a partir da soluo me padro de endotoxina. Estas solues so preparadas com a adio de gua LAL soluo me padro de endotoxina, obtendo-se concentraes de 2 (duas vezes superior declarada no lisado), (igual declarada no lisado), 0,5 (metade da declarada no lisado) e 0,25 (um quarto da declarada no lisado). O mtodo encontra-se descrito no ponto 1)Controlos Preliminares captulo 2.6.14 Endotoxinas Bacterianas da Farmacopeia Portuguesa VII. Se o valor determinado quanto sensibilidade do lisado estiver compreendido entre 0,5 e 2 o lote de reagente de LAL pode ser utilizado. Deve proceder-se ao ensaio da pesquisa de endotoxinas bacterianas no dispositivo conforme especificado no captulo 2.6.14. da Farmacopeia Portuguesa VII.

Material necessrio: Reagente de LAL Lisado de amebcitos liofilizado com sensibilidade declarada () gua LAL gua para preparaes injectveis ou gua produzida por outro processo que no apresente reaco com o reagente LAL at ao limite de deteco do mesmo Preparao de endotoxinas preparao aferida com o padro internacional de endotoxina, ou com um preparao biolgica de referncia (PBR), e que a actividade expressa em unidades internacionais de endotoxina (U.I) ou em unidades de endotoxina (U.E.). Nota: U.E.=U.I. Material de plstico ou vidro apirognico

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Qual a frequncia da dispositivos mdicos?

pesquisa

os

limites

admitidos

nos

A pesquisa de endotoxinas bacterianas deve ser efectuada lote a lote, sempre que o produto rotulado de apirognico. O limite mximo admissvel de endotoxinas bacterianas nos dispositivos de 0,5 EU/ml, excepto nos dispositivos que contactam com o lquido cerebrospinal que tem de ser inferior a 0,06EU/ml (recomendaes da FDA).

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