Seqenciamento de DNA

Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Qumica- USP

Bibliografia: Recombinant DNA James Watson & Michael Gilman Guia de Rotas na Tecnologia do Gene Matthew Walker & Ralph Rapley Biologia Molecular Bsica-Arnaldo Zaha

Seqenciamento de DNA
Clivagem qumica ou Mtodo de MaxamGilbert (utilizado apenas em situaes especiais) Mtodo de Sanger: Terminao controlada da replicao Manual Automatizado

Mtodo de Sanger

Reao da DNA Polimerase I

2, 3didesoxirribonucleotdeo trifosfato (ddNTP)

2, 3didesoxirribonucleotdeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reao de polimerizao da cadeia de DNA

Sequenciamento mtodo de Sanger Obteno do molde: DNA dupla fita desnaturado Anelamento do primer (iniciador) ao molde
Primer pode estar radioativamente marcado com
32P

Extenso do primer: dCTP, dGTP, dTTP e dATP + DNA polimerase Terminao da sntese: adio dos ddNTPs
No sequenciamento automatizado cada um dos ddNTPs est acoplado a um cromforo fluorescente distinto

Separao dos fragmentos de DNA com 1base de diferena em eletroforese

Gel de poliacrilamida ou Capilar

Deteco dos fragmentos aps eletroforese

Autorradiografia (sequenciamento manual Laser (sequenciamento automatizado)

Sequenciamento mtodo de Sanger

Anelamento do primer Extenso do primer Terminao da sntese: adio dos ddNTPs Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante

Autorradiografia

Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferena

Autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA

Sequenciamento automatizado

Imagem de um gel de sequenciamento com deteco por fluorescncia

Cromatograma: Sequenciamento automatizado com dye terminators (mtodo da interrupo controlada da replicao com ddNTPs)

Programa para montagem (PhredPhrapConsed)

Estratgia de sequenciamento do genoma humano

Nature 15 Feb 2001 409(6822)

Whole genome shotgun

Anlise de Sequncias de genes e de genomas

Comparao da sequncia obtida com sequncias depositadas em Bancos de Dados de Sequncias de DNA e Protenas (www.ncbi.nlm.nih.gov) Programa BLAST Identificao de fases abertas de leitura (ORFs) na seqncia de bases no caso de seqncias codificadoras Anlise de domnios proteicos na seqncia de aminocidos deduzida a partir da seqncia de bases Identificao de regies regulatrias (promotores, enhancers, etc) Estabelecimento de relaes filogenticas entre a sequncia de interesse e sequencias similares de outros organismos Etc, Etc, Etc......

Bioinformtica

Busca por comparao no GenBank com programa BLAST

>geneX GGCACGAGGGAGAAGTTTGTGGTAGTAATAATAATAGTAATGAACAACCAATAAACGAAAATTTAAATAT ATAAAATATATTTAAAATAAAAATAAAAAATAAAACAAAACAAAACAAAACAAAAACAAAAAAAAATAAA AAGAGAAAGAAAATAAATAAAAATAAAATAATATAAATAAAAAAGAATGGAAATTGATTTAGATTCAATC ATTACAAGATTATTGGAACCAAGAACTACAAAACCAGGTAAATTAGTTGATTTAGCAGAGGAGGAAATTA GATATTTAACAGTTCAAGCCACTGAAATCTTTATAAATCAACCAATTTTATTGGAATTAGAAGCACCAAT CAAGATCTGTGGTGATATTCATGGACAATACTACGATTTACTTCGTCTCTTTGAGTACGGAGGATTCCCA CCACAAAGTAATTATCTTTTTTTAGGTGATTATGTCGATCGTGGTAAGCAATCCTTAGAGACCATTTGTT TATTGTTGGCCTATAAAATCAAATATCCAGAGAACTTTTTCATTCTTCGTGGAAATCACGAATGTGCATC CATCAATCGTATCTATGGTTTTTACGATGAATGCAAGAGAAGATACAACAGCAAATTATGGAAAGCATTT ACAGATTGCTTCAACTGTCTCCCAGTTGCAGCCATCATTGACGAGAAAATCTTTTGTATGCATGGTGGTC TCTCACCAGATCTCAAGAATATGGATCAAATTCGTAGAATCACTAGACCAACCGTTGTTCCAGATTTTGG TCTTTTATGTGATCTCTTGTGGGCTGATCCTGATAAAAACATTCAAGGTTGGGAAGATAATGACCGTGGT GTCTCCTATACTTTTGGTGCCGACGTTGTCGAATCATTCTTAAAGAAACACGATCTCGATTTAGTTTGTA GAGCTCATCAAGTTGTAGAAGATGGTTATGAATTCTTTGCTAAACGTCAATTGGTAACCCTCTTTTCCGC TCCAAATTACTTTGGTGAATTTGATAACGCTGGTGCTATGATGGGTGTCGATGAAACTTTAATGTGTTCA TTCCAAATTTTAAAACCTGCCGATAAAAAAAAACTTACAAACGATAGTAATGGTAGACCATTAACTCCTC CAAGAAATAAACAACAAAAACCAAAAAAATAAATTAAAATAACTACTTTTTTAAAAAAAAAG

BLASTx no GenBank Traduo em todas as 6 fases de leitura e busca contra banco de sequncia de protenas