Tesis - Leticia Durán PDF

UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA FACULTAD DE INGENIERA, CIENCIAS Y ADMINISTRACIN DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA
EFECTO DE LA DENSIDAD Y TEMPERATURA DE CO2 SOBRE LA EXTRACCIN SUPERCRTICA DE ACEITE DE MICROALGA (Botryococcus braunii)
LETICIA ALEJANDRA DURN MANOSALVA 2012
UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA FACULTAD DE INGENIERA, CIENCIAS Y ADMINISTRACIN DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA
TRABAJO PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO EN ALIMENTOS
Profesor Gua: Dr.Edgar Uquiche Carrasco
COMISIN EXAMINADORA
EDGAR UQUICHE CARRASCO Profesor gua
CAROLINA SHENE DE VIDTS Profesor examinador
XIMENA INOSTROZA HOFFMANN Profesor examinador
Nota trabajo escrito : Nota examen Nota final : :
RESUMEN
Las microalgas son una fuente importante de componentes naturales de alto valor biolgico como protenas, pigmentos carotenoides, cidos grasos, aminocidos, etc. Estos componentes pueden ser aislados y empleados como ingredientes funcionales en la industria farmacutica, cosmtica y alimentaria. Actualmente, la tecnologa de extraccin con CO2 supercrtico (SC-CO2) se perfila como una tcnica innovadora para extraer y aislar estas sustancias, por ser ms seguro que el hexano (sin dejar restos de solvente), ser una tecnologa amigable con el medio ambiente y limpia, ofreciendo una alta calidad del producto final en comparacin a los extractos obtenidos a travs de tcnicas convencionales. Dentro de los factores que se deben considerar para este tipo de extraccin se encuentran la densidad del fluido, temperatura, presin, entre otros. El objetivo principal de este trabajo fue estudiar el efecto de la temperatura y la densidad del SCCO2 sobre la velocidad y el rendimiento de extraccin de aceite de microalga Botryococcus braunii junto con evaluar el rendimiento y concentracin de carotenoides, esteroles y tocoferoles presentes en el extracto. Para ello, se realizaron extracciones basadas en un diseo central compuesto rotatorio con 5 niveles de cada variable independiente (temperatura de extraccin y densidad SC-CO2), con 2 factoriales, 2 axiales y 1 punto central. De acuerdo a los resultados obtenidos, el mayor rendimiento de extraccin de aceite fue 87,0 g aceite/kg SS, obtenido a 69 C y 957 kg CO2/m3. En carotenoides el mayor rendimiento fue 1550,0 mg car/kg SS obtenido a 69 C y 957 kg CO2/m3. En tocoferoles se observ la mayor concentracin a 41 C y 957 kg CO2/m3 siendo sta 18,0 g tocoferoles/ kg aceite. La mayor concentracin de carotenoides se obtuvo a 69 C y una densidad de 957 kg CO2/m3 y fue 17,0 g car/kg aceite. En cuanto a la concentracin de esteroles, la mayor concentracin fue 23,0 g esteroles/ kg aceite obtenida a 41C y 957 kg CO2/m3 Las variables densidad SC-CO2 y temperatura de extraccin afectaron significativamente (p0,05) el rendimiento de extraccin de aceite explicando su comportamiento en un 89% siendo la temperatura el factor que ms afect el rendimiento con un 46,36% de contribucin a la respuesta. Se agradece al Proyecto Corfo Desert Bioenergy 09CTEI-6860 por el financiamiento para la realizacin de este trabajo.
INDICE DE CONTENIDOS Pgina
CAPTULO 1. INTRODUCCIN ............................................................................................... 1

1.1. Objetivos .............................................................................................................................................3
1.1.1. Objetivo general ............................................................................................................. 3 1.1.2. Objetivos especficos...................................................................................................... 3 CAPTULO 2. ANTECEDENTES GENERALES ..................................................................... 4
2.1 Microalga (Botryococcus braunii). ......................................................................................................4 2.2 Lpidos .................................................................................................................................................5 2.3 Antioxidantes naturales........................................................................................................................5 2.4 Importancia de los carotenoides, esteroles y tocoferoles en la nutricin. ............................................6
2.4.1 Carotenoides .................................................................................................................... 6 2.4.2 Esteroles .......................................................................................................................... 7 2.4.3 Tocoferoles ...................................................................................................................... 8

2.5 Fluidos Supercrticos y sus propiedades ..............................................................................................9 2.6 Extraccin con FSC ...........................................................................................................................10 2.7 Antecedentes de extraccin con SC-CO2 en microalgas. ...................................................................11 2.8 Aplicacin industrial de FSC. ............................................................................................................11
2.8.1 Extraccin de aceites esenciales .................................................................................... 12 2.8.2 Fraccionamiento de la grasa lctea................................................................................ 13 2.8.3 Desalcoholizacin de bebidas alcohlicas .................................................................... 13 2.8.4 Obtencin de sustancias antioxidantes a partir de microalgas. ..................................... 14 CAPTULO 3: MATERIALES Y MTODOS ....................................................................... 15
3.1. Materiales.........................................................................................................................................15
3.1.1 Materia prima ................................................................................................................ 15 3.1.2. Equipos e instrumentos ................................................................................................ 15
3.1.3. Material de vidrio y otros ............................................................................................. 15 3.1.4. Reactivos ...................................................................................................................... 16

3.2 Mtodos de anlisis ............................................................................................................................16
3.2.1. Determinacin de humedad .......................................................................................... 16 3.2.2. Extraccin de aceites utilizando SC-CO2 ..................................................................... 17
3.3. Anlisis del aceite .............................................................................................................................17
3.3.1 Contenido de carotenoides totales ................................................................................. 17 3.3.2 Contenido de esteroles .................................................................................................. 18 3.3.3 Contenido de tocoferoles ............................................................................................... 19
3.4 Diseo de experimentos .....................................................................................................................20
3.4.1 Anlisis estadstico ........................................................................................................ 20 CAPTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIN ....................................................................... 22

4.1 Contenido de humedad de la muestra inicial .....................................................................................22 4.2 Efecto de las variables independientes temperatura y densidad del CO2 sobre el comportamiento de las respuestas............................................................................................................................................22 4.3 Anlisis estadstico ............................................................................................................................24
4.3.1. Anlisis del rendimiento de extraccin de aceite ......................................................... 26 4.3.2 Anlisis de concentracin de carotenoides.................................................................... 28 4.3.3 Anlisis de concentracin de esteroles .......................................................................... 29 4.3.4 Anlisis de concentracin de tocoferoles ...................................................................... 31 4.3.5 Anlisis de rendimiento de extraccin de carotenoides ................................................ 32 4.3.6 Rendimiento de extraccin de esteroles ........................................................................ 34 4.3.7 Rendimiento de extraccin de tocoferoles .................................................................... 35
4.4 Discusin General ..............................................................................................................................37
CAPTULO 5. CONCLUSIONES ............................................................................................. 39 BIBLIOGRAFA ......................................................................................................................... 42
ANEXOS ...................................................................................................................................... 51
Anexo A. Determinacin de la humedad del sustrato ..........................Error! Marcador no definido.51 Anexo B. Determinacin del rendimiento de extraccin de aceite de microalga B. braunii. ......... Error! Marcador no definido.52 Anexo C. Determinacin de la cintica de extraccin de aceite de microalga (Botryococcus braunii). .58 Anexo. D Anlisis del extracto de aceite de microalga (Botryococcus braunii). ....................................64 Anexo E Anlisis Estadstico.......67
INDIDE DE TABLAS
Pgina Tabla 2.1.Condiciones de extraccin con CO2 supercrtico utilizadas en algunas especies de algas y microalgas....................................................................................................... 12 Tabla 3.1. Diseo experimental Central Compuesto Rotatorio. .................................................. 22 Tabla 4.1 Rendimiento de extraccin y concentracin de carotenoides, esteroles y tocoferoles con CO2 supercrtico. .................................................................................................. 23 Tabla 4.2. Tabla de anlisis de varianza para el modelo cuadrtico ............................................ 24 Tabla 4.3. Indicadores estadsticos para el modelo de superficie de respuesta ............................ 26 Tabla A-1. Determinacin de la humedad del sustrato......51 Tabla B-1.Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 45 C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseo 1.52 Tabla B-2. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 65 C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseo 2)....52 Tabla B-3. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 45 C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseo 3)....53 Tabla B-4. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 65 C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseo 4)....53 Tabla B-5. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 41 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo 5)....54 Tabla B-6. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 69 C y 900 kg CO2/m3 (punto de diseo 6)....54 Tabla B-7. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 55 C y 843 kg CO2/m3 (Punto de diseo 7)....55 Tabla B-8. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 55 C y 957 kg CO2/m3 (Punto de diseo 8)....55 Tabla B-9. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 55 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo 9)....56
Tabla B-10. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 55 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo (10).....56 Tabla B-11 Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 55 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo 11)......57 Tabla B-12 Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 55 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo 12)......57 Tabla D-1 Datos curva de calibracin para la concentracin de carotenoides en el aceite de microalga B. braunii......64 Tabla D-2 Datos curva de calibracin para la concentracin de esteroles en el aceite de microalga B. braunii. ...65 Tabla D-3 Datos curva de calibracin para la concentracin de tocoferoles en aceite de microalga (Botryococcus braunii)........66 Tabla E-1. Anlisis de varianza para el rendimiento de extraccin de aceite...70 Tabla E-2. Anlisis de varianza para la concentracin de carotenoides en el aceite. ...71 Tabla E-3. Anlisis de varianza para la concentracin de esteroles en el aceite...71 Tabla E-4. Anlisis de varianza para la concentracin de tocoferoles en el aceite...72 Tabla E-5. Anlisis del rendimiento de carotenoides72 Tabla E-6. Anlisis del rendimiento de esteroles..73 Tabla E-7. Anlisis del rendimiento de tocoferoles..73
INDICE DE FIGURAS
Pgina Figura 2.1. Forma estructural B. braunii.....4 Figura 2.2. Diagrama de fases que muestra la regin de un fluido supercrtico.9 Figura 4.1 Superficie de respuesta del rendimiento de extraccin de aceite (Y1) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3). ............................................................. 27 Figura 4.2. Superficie de respuesta de la concentracin de carotenoides (Y2) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3). ................................................................. 29 Figura 4.3. Superficie de respuesta de la concentracin de esteroles (Y3) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3). ................................................................. 30 Figura 4.4. Superficie de respuesta de la concentracin de tocoferoles (Y4) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3). ................................................................. 32 Figura 4.5. Superficie de respuesta del rendimiento de extraccin de carotenoides (Y5) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3) ............................................ 33 Figura 4.6. Superficie de respuesta de la rendimiento de extraccin esteroles (Y6) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3). ........................................................ 35 Figura 4.7. Superficie de respuesta del rendimiento de tocoferoles (Y7) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3). ................................................................. 36 Figura C-1. Curva cintica de extraccin a 45 C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseo 1)....58 Figura C-2. Curva cintica de extraccin a 65 C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseo 2)....58 Figura C-3. Curva cintica de extraccin a 45 C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseo 3)....59 Figura C-4. Curva cintica de extraccin a 65 C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseo 4)....59 Figura C-5. Curva cintica de extraccin a 41 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo 5)....60 Figura C-6. Curva cintica de extraccin a 69 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo)...60 Figura C-7. Curva cintica de extraccin a 55 C y 843 kg CO2/m3 (Punto de diseo)...61
Figura C-8. Curva cintica de extraccin a 55 C y 957 kg CO2/m3 (Punto de diseo 8)61 Figura C-9. Curva cintica de extraccin a 55 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo 9)....62 Figura C-10. Curva cintica de extraccin a 55 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo 10)62 Figura C-11. Curva cintica de extraccin a 55 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo 11)....63 Figura C-12. Curva cintica de extraccin a 55 C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseo 12)....63 Figura D-1. Curva calibracin carotenoides totales..64 Figura D-2. Curva de calibracin esteroles totales65 Figura D-3. Curva de calibracin para tocoferoles totales66 Figura E-1. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de extraccin de aceite (Y1).67 Figura E-2. Valores actuales y predichos para la respuesta concentracin de carotenoides (Y2). ................................................................................................... Error! Marcador no definido.67 Figura E-3. Valores actuales y predichos para la respuesta concentracin de esteroles (Y3). ................................................................................................... Error! Marcador no definido.68 Figura E-4. Valores actuales y predichos para la respuesta concentracin de tocoferoles (Y4). ................................................................................................... Error! Marcador no definido.68 Figura E-5. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de carotenoides (Y5). .. 69 Figura E-6. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de esteroles (Y6) ......... 69 Figura E-7. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de tocoferoles (Y7). ................................................................................................... Error! Marcador no definido.70
CAPTULO 1 INTRODUCCIN
Captulo 1. Introduccin
CAPTULO 1. INTRODUCCIN
Actualmente existe una tendencia del consumidor por cambiar continuamente de gustos y escoger productos innovadores, saludables y atractivos a la vista, lo cual es una seal de alerta en la industria alimentaria que da a da busca la forma de satisfacer las demandas del mercado. Es por ello, que resulta necesario buscar nuevas metodologas para desarrollar y extraer compuestos altamente beneficiosos, por ejemplo: esteroles, carotenoides, tocoferoles, entre otros a partir de sustancias naturales. Estos compuestos actan en una o varias funciones del organismo, de modo especfico y positivo, contribuyendo a mantener y/o mejorar el estado de salud y reducir el riesgo de sufrir determinadas enfermedades o alteraciones (Palou et al., 2005). Estos ingredientes son preferidos por los consumidores debido a su origen natural, tales como plantas, subproductos de alimentos o incluso algas y microalgas, las cuales estn recibiendo mucha atencin, debido a su capacidad de realizar fotosntesis y a su adaptacin a la vida en medios marinos o en aguas continentales (Mendiola, 2008). Las algas en general han desarrollado compuestos de gran inters para la industria alimentaria, pueden ser empleadas como fuente de ingredientes funcionales, ya que son reconocidas como una importante fuente renovable de lpidos bioactivos con una alta proporcin de cidos grasos poliinsaturados (PUFA, -caroteno y otros pigmentos (antioxidantes), polisacridos
sulfatados (antivirales) y esteroles) (Herrero et al., 2006). Para la extraccin de aceite a partir de microalgas, la tecnologa con CO2 supercrtico (SC-CO2) se mira con inters, por ser ms seguro que el hexano, ser una tecnologa amigable con el medio ambiente y limpia, ofreciendo un tiempo de extraccin corto y alta calidad del producto final (Andrich et al., 2005). La extraccin con fluido supercrtico (EFS) es una operacin unitaria que aprovecha el poder solvente de los fluidos supercrticos en condiciones por encima de su temperatura y presin crtica (31,1 C y 7,9 MPa). Tiene las caractersticas tanto de un gas como de un lquido, su poder solvente depende slo de su densidad, la cual puede ajustarse fcilmente combinando las variables presin y temperatura. Estos cambios en la densidad son la base de las propiedades solventes de un fluido supercrtico; ya que, estn ligados a la solubilidad y de este modo, la selectividad del fluido puede ser modificada de acuerdo a los componentes que se requieran
Efecto de la densidad y temperatura deCO2 sobre la extraccin supercrtica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 1
extraer y para ello es necesario realizar pequeos cambios en las variables de presin y temperatura del flujo solvente. Adems, la temperatura tiene un efecto positivo sobre la volatilidad del soluto. Se espera que a mayor temperatura, se aumente la presin de vapor del soluto y de esta forma se mejore la transferencia del soluto a la fase supercrtica. Por otra parte, se ha sealado que la solubilidad de los carotenoides, esteroles y tocoferoles en el SC-CO2 aumenta con la densidad a temperatura constante y viceversa (Saldaa et al., 2010). El presente trabajo de ttulo tiene como objetivo estudiar el efecto de la temperatura de extraccin y densidad del CO2 supercrtico, sobre el rendimiento de extraccin de aceite y velocidad de extraccin de microalga (Botryococcus braunii) incluyendo las caractersticas qumicas del extracto obtenido mediante la determinacin del contenido de carotenoides, esteroles y tocoferoles. Se emplear un diseo central compuesto rotatorio para la realizacin de los ensayos de extraccin y obtencin de resultados experimentales, los que sern analizados con la Metodologa Superficie de Respuesta.
Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extraccin supercrtica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 2
1.1. Objetivos 1.1.1. Objetivo general Estudiar el efecto de la temperatura y densidad del CO2 sobre el comportamiento de la velocidad y rendimiento de extraccin de aceite de microalga (Botryococcus braunii) usando CO2 supercrtico.
1.1.2. Objetivos especficos Estudiar el efecto de la temperatura de extraccin y densidad de CO2 sobre la velocidad y el rendimiento de extraccin de aceite de microalga (Botryococcus braunii). Estudiar el efecto de la temperatura y densidad de CO2 sobre la velocidad y el rendimiento de extraccin de carotenoides, esteroles y tocoferoles. Estudiar el efecto de la temperatura y densidad de CO2 sobre la concentracin de carotenoides, esteroles y tocoferoles. Caracterizar el aceite de microalga obtenido bajo condiciones de extraccin seleccionadas.
Efecto de la densidad y temperatura de CO2sobre la extraccin supercrtica de aceite de microalga (Botryococcus braunii).
CAPTULO 2 ANTECEDENTES GENERALES
Captulo 2. Antecedentes generales
CAPTULO 2. ANTECEDENTES GENERALES
2.1 Microalga (Botryococcus braunii). Existen al menos 30.000 especies conocidas de microalgas, tanto de agua dulce como salada, pero slo unas cuantas son de importancia comercial donde se incluyen: Chlorella, Spirulina, Dunaliella, Haematococcus, Botryococcus, entre otras, a partir de las cuales se extraen componentes de alto valor biolgico como protenas, pigmentos, vitaminas, minerales, enzimas y cidos grasos. El nmero de especies de color azul-verde es muy grande y se caracteriza por tener un alto contenido de lpidos (Loera-Quezada y Olgun, 2010), adems, algunas especies marinas como Isochrysis, Nannochloropsis, Skeletonema, Chaetoceros etc., tambin se utilizan para la alimentacin de moluscos u otros propsitos de acuicultura (Bruton et al., 2009). La microalga verde Botryococcus braunii es una especie de agua dulce perteneciente a la familia Chlorophyceae, se distribuye en oligotrficos y eutrficos y segn Fang et al. (2004), posee niveles inusualmente altos de cidos grasos libres. El verde alga colonial de esta microalga (Figura 2.1) es bien conocido por su alto contenido de hidrocarburos, y se ha propuesto como una fuente renovable para las necesidades futuras de energa en beneficio de la proteccin del medio ambiente, ya que dentro de sus ventajas se encuentra su cultivo, que puede ser en agua de mar, en agua salobre o en aguas residuales, creciendo en una amplia variedad de climas no compitiendo por el agua dulce ni suelos requeridos para la produccin de alimentos (Loera-Quezada y Olgun, 2010).
Figura 2.1. Forma estructural B.braunii (Barker et al., 2012).
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extraccin supercrtica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 4
2.2 Lpidos El contenido de lpidos en las microalgas oleaginosas se encuentra dentro de un 20 a 50%, llegando a alcanzar un 70% de la biomasa seca cuando las clulas estn sometidas a condiciones de estrs fisiolgico o un medio ambiente desfavorable en cuanto a la limitacin de nutrientes (Li et al., 2008; Dorval et al., 2009). El contenido de lpidos, su composicin y las proporcin de los diversos cidos grasos en una microalga puede variar, ya que stos pueden ser afectados por una serie de variables ambientales como: intensidad de luz y fotoperiodo, temperatura, salinidad, concentracin de dixido de carbono, concentracin de nitrgeno, fsforo y la intensidad de la radiacin UV-B (Mansour et al., 2003). Ahlgren et al. (1992) analizaron los cidos grasos en 24 muestras de microalgas de un grupo verde-azul (por ejemplo, Oscillatoria y Microcystis) procedentes de diferentes lotes de cultivos continuos y en diversas fases de crecimiento. Encontraron altas cantidades de cidos grasos de 18 carbonos de la familia -3 y -6, as como tambin, en el grupo de flagelados (grupo taxonmicamente diverso) encontraron altas cantidades de cidos grasos poliinsaturado de cadena larga (20-22 carbonos), especialmente del tipo -3. Se determin una relacin 3/6 ms alta en las algas en la fase de crecimiento exponencial. Las familias -6 y -3 destacan por sus importantes funciones fisiolgicas, como por ejemplo, son necesarios para el crecimiento y desarrollo del sistema nervioso central y la retina, y el correcto funcionamiento del sistema cardiovascular (Sahena et al., 2009). Se han determinado los principales cidos grasos que constituyen los lpidos de la microalga verde B. braunii estos son: 2,3% cido lurico (C12:0), 2,87% cido mirstico (C14:0), 4,32% cido esterico (C18:0), 13,2% cido linolnico (C18:3), 14,5% cido linoleico (C18:2), 22,3% cido oleico (C18:1) y finalmente 40,6% de cido palmtico (C16:0) (Dayananda et al., 2007). La investigacin realizada por Dayananda et al. (2007) fue similar a las observaciones realizadas por Fang et al. (2004) ya que ambas informan que el cido palmtico y cido oleico son los principales cidos grasos presentes en la microalga Botryococcus braunii. 2.3 Antioxidantes naturales Los antioxidantes naturales estn ampliamente distribuidos en la naturaleza formando parte de semillas, frutos, hojas, races, etc. de una amplia variedad de plantas (Valenzuela et al., 2000) presentndose como compuestos fenlicos, compuestos nitrogenados, flavonoides, tocoferoles,
aminas, o carotenoides. Una fuente inagotable de exploracin es el mar y su biodiversidad, siendo las algas marinas uno de los recursos potenciales de dichos compuestos, ya que se ha informado que la actividad antioxidante de los extractos de algas depende de los componentes qumicos de los extractos que principalmente consisten en carotenoides, polifenoles, tocoferoles y vitamina C (Daz, 2012).
2.4 Importancia de los carotenoides, esteroles y tocoferoles en la nutricin. 2.4.1 Carotenoides
Los colores rojo, amarillo y naranjo en muchos vegetales son originados por la presencia de carotenoides, pigmentos de origen vegetal que se clasifican dentro de los pigmentos liposolubles. Los carotenoides o tetraterpenoides son una clase de pigmentos terpenoides con 40 tomos de carbono, en su mayora son solubles en solventes apolares, se clasifican en dos grupos: carotenos y xantofilas. Los carotenos solo contienen carbono e hidrgeno (por ejemplo el -caroteno, el licopeno, etc.), mientras que las xantofilas contienen adems oxgeno (por ejemplo la lutena). (Yeverino, 1997). Los carotenoides debido a la alta conjugacin de enlaces dobles presentes en sus molculas se descomponen por efecto de la luz, la temperatura y el aire. La luz favorece reacciones fotoqumicas que cambian la estructura original del carotenoide (por ejemplo isomerismo cis y trans), el calor tambin favorece reacciones trmicas de degradacin y finalmente el aire debido al oxgeno favorece la oxigenacin de los enlaces dobles a funciones epxido, hidroxilos y perxidos, entre otros (Martnez, 2003). Es debido a estas razones que la extraccin de carotenoides se debe realizar preferentemente en condiciones de ausencia de luz, a temperatura ambiente o menor, y en ausencia de oxgeno, realizndose a partir de tejidos frescos, para evitar la degradacin por la accin conjunta de estos factores adversos. Los carotenoides son muy utilizados como pigmentos y antioxidantes en diversos sectores industriales, principalmente en la industria farmacutica, nutracutica y alimentaria. En los ltimos aos se ha conducido a estimular la produccin de carotenoides procedentes de microalgas para su uso como colorantes y aditivos naturales (Mendiola 2008). Entre las
microalgas con mayor potencial para la produccin de carotenoides se encuentran, Dunaliella salina, Dunaliella viridis, Haematococcus y Chlorococcum (Garca, 1998). Los carotenoides que se encuentran frecuentemente en las microalgas incluyen: astaxantina, caroteno, cantaxantina, equinenona, lutena, neoxantina, violaxantina y zeaxantina.
(Abrahamsson et al., 2012). Entre las principales fuentes naturales de astaxantina est la microalga Haematococcus pluvialis que tiene la capacidad de acumularla en altas concentraciones (2 a 5% en base seca) (Borowitzka et al., 1991). Otro estudio realizado en Spirulina platensis informa que contiene 5,53 mg/g de carotenoides totales dentro de los cuales se identificaron cantaxantina, equinenona, mixoxantina y zeaxantina (Marquez et al., 1995). 2.4.2 Esteroles Los esteroles se encuentran ampliamente distribuidos en los reinos animal y vegetal; y se les encuentra en forma libre, como steres o como glicsidos, se caracterizan por ser sustancias esteroideas en cuya estructura qumica aparece una agrupacin de cuatro anillos, especfica del sistema fenantreno, portador del grupo OH en posicin C-3 que le permite estar enlazado a molculas de cidos grasos (Bello, 2000). La mayora de esteroles naturales poseen una cadena lateral de 8 a 10 tomos de carbono y un enlace doble en el C-5. El gran inters despertado por los alimentos enriquecidos con esteroles vegetales se debe, principalmente, a que disminuyen las concentraciones sanguneas de colesterol, sin efectos adversos colaterales. Por lo tanto, el aumento de la cantidad de esteroles vegetales en una variedad de alimentos puede ser una ayuda importante en la proteccin de las personas con hipercolesterolemia frente a la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares relacionadas, causa principal de la mortalidad en las sociedades ms desarrolladas (Palou et al., 2005). En cuanto a las microalgas existen estudios que sealan que a partir de las especies Scenedesmus obliquus y Navicula pelliculosa se obtienen esteroles precursores de la hormona cortisona, hormona que reduce la inflamacin, evitando que los glbulos blancos (leucocitos polimorfonucleares) viajen a la zona de inflamacin del cuerpo (Molina y Morales, 2008). Volkman et al., (1994.) estudiaron el contenido de esteroles en cinco especies de algas y microalgas (viz. Tetraselmis chui, cordata Pyramimonas, pusilla Micromonas, Micromonas aff pusilla. y provasolii Pycnococcus) las cuales se analizaron por cromatografa de gases y
espectrometra de masa. Los principales esteroles encontrados fueron: 24-methylcholesta-5, 24 (28)-dien-3-ol, 24-methylcholest-5-en-3-ol y 24-ethylcholesta-5 y 24 Methylcholest-5-en-3-ol entre otros. 2.4.3 Tocoferoles Solamente los organismos fotosintticos sintetizan tocoferoles, encontrndose presentes en semillas oleaginosas, hojas y otras partes de plantas verdes de plantas superiores. Los tocoferoles y tocotrienoles engloban un grupo de 8 compuestos liposolubles que reciben el nombre genrico de vitamina E, con carcter esencial reconocido hace ms de 40 aos. Los tocoferoles tienen una estructura qumica que consiste en dos anillos, uno fenlico y otro heterocclico y una cadena lateral de 16 tomos de carbono saturada. Dependiendo del nmero y la posicin de los grupos metilo en el anillo fenlico, estos compuestos se denominan como -, - y - tocoferoles (Calvo et al., 2011). El -tocoferol es el ms abundante en la dieta y el que presenta mayor actividad antioxidante in vivo. La vitamina E es un trmino genrico que describe un grupo de antioxidantes que incluye los tocoferoles y tocotrienoles. La vitamina E o -tocoferol, presenta un gran inters debido a que es una vitamina liposoluble que acta como antioxidante, es decir, defiende las clulas reduciendo el estrs oxidativo, estimula el sistema inmunolgico y se ha comprobado que detiene el desarrollo del Alzheimer. Adems, ayuda a reducir los niveles de colesterol en la prevencin de trombos en las arterias es an discutible (Belitz y Grosch, 1997). El contenido de -tocoferol en microalgas se ve afectado tanto por la fuente de nitrgeno de la cual se alimenta y el tiempo de cosecha. Durmaz, (2007) evalu el contenido de -tocoferol en la microalga Nannochloropsis oculata registrando una concentracin de 2326 39 mg g-1 (peso seco), donde, adems pudo predecir un aumento de la produccin de -tocoferol durante el ciclo de vida debido a la necesidad de la microalga por obtener antioxidantes durante el proceso de envejecimiento. Otra investigacin realizada por Mendiola et al. (2008) determinaron el contenido de -tocoferol en Spirulina platensis, con valores que van desde 0,011 hasta 0,014 mg de tocoferol/g Spirulina seca.
2.5 Fluidos Supercrticos (FSC) y sus propiedades Un FSC es un material que se encuentra en condiciones de presin y temperatura por encima de sus valores correspondientes de presin crtica (pc) y temperatura crtica (Tc). La pc es la presin por encima de la cual el gas no condensa al disminuir la temperatura isobricamente y la Tc es la temperatura por encima de la cual el gas no condensa al aumentar la presin isotrmicamente (del Valle y Aguilera, 1999). Los FSC poseen diferentes propiedades fsico-qumicas, entre las que destaca: densidad, viscosidad y difusividad, las que se encuentran en rangos de valores intermedios entre lquidos y gases (Figura 2.2); es debido a su baja viscosidad, difusividad relativamente alta y poder solvente que los lquidos supercrticos tienen mejores propiedades de transporte y penetrabilidad que los lquidos y, por lo tanto, pueden obtener mejores rendimientos de extraccin, por lo tanto, una de las principales caractersticas de un FSC es la posibilidad de modificar la densidad del fluido, cambiando la presin y/o temperatura, ya que la densidad est directamente relacionada con la solubilidad (del Valle y Aguilera, 1999), mediante la alteracin de la presin de extraccin, la fuerza disolvente del fluido puede ser modificada.
Figura 2.2. Diagrama de fases que muestra la regin de un FSC.
Otras ventajas, en comparacin a otras tcnicas de extraccin, son el uso de disolventes generalmente reconocido como seguro (GRAS), y alta eficiencia del proceso de extraccin (en trminos de aumento de los rendimientos y la posibilidad de acoplamiento directo con tcnicas de anlisis cromatogrficas tales como cromatografa de gases (GC) o cromatografa de FSC) (Herrero et al., 2006). En general, la EFS en lugar de extracciones tipo Sohxlet es justificada por la reduccin de los tiempos de extraccin, por la selectividad que se puede llegar a obtener de acuerdo a las condiciones de extraccin y adems, la eliminacin de posibles compuestos que puedan intervenir en el anlisis (Mendiola, 2008).
2.6 Extraccin con FSC El CO2 es el FSC ms utilizado en EFS debido a que es no txico, no inflamable, no corrosivo, incoloro, no es costoso, se elimina fcilmente, no deja residuos, sus condiciones crticas son relativamente fciles de alcanzar y se consigue con diferentes grados de pureza, se puede trabajar a baja temperatura; por tanto, se pueden separar compuestos termo-sensibles (del Valle y Aguilera, 1999). En la EFS, adems de seleccionar el solvente (fluido supercrtico), se deben considerar diversas variables que influyen significativamente en la operacin de extraccin. Las principales variables a tener en cuenta son: presin y temperatura que determinan la densidad del fluido, velocidad del fluido, tamao de partcula, humedad de la muestra, entre otros. La densidad del fluido por sobre sus condiciones supercrticas (31,1 C y 7,9 MPa), est estrechamente relacionada con los cambios de presin y temperatura, debido a que un cambio en estas variables modifica su magnitud. Estos cambios en la densidad son la base de las propiedades solventes del FSC ya que, la densidad est ligada a la solubilidad y de este modo, la selectividad del fluido puede ser modificada de acuerdo a los componentes que se requieran extraer. Esta propiedad hace que los FSC sean solventes muy verstiles y que se pueden aplicar en la extraccin de diversos componentes naturales de materiales biolgicos (Luque de Castro et al., 1993). El efecto significativo de la presin sobre el rendimiento de extraccin (g soluto/g sustrato seco) se debe al aumento de la solubilidad de aceites y pigmentos carotenoides como tambin al incremento del poder solvente del SC-CO2 (Li et al., 2010).
Al aumentar la temperatura permite aumentar el rendimiento de extraccin debido al incremento en la presin de vapor del soluto, aumenta la solubilidad permitiendo una mejor transferencia desde el sustrato hacia la fase supercrtica, aumentando la velocidad de extraccin (del Valle et al., 2001). Otras variables que influyen son la humedad y el tamao de partcula del sustrato, la velocidad de flujo de solvente, el consumo especfico de solvente. Se ha recomendado que los sustratos posean una baja humedad, puesto que el agua reduce el poder solvente del CO2 a condiciones supercrticas inhibiendo el contacto entre el SC-CO2 y el sustrato (Li et al., 2010). Para conseguir una mejor velocidad de extraccin y ms completa posible del sustrato slido, se tiene que ofrecer al disolvente superficies de intercambio grandes y recorridos de difusin cortos. Esto se puede lograr a travs de la molienda de la matriz. Las muestras slidas de diferente granulometra deben ser molturadas para homogeneizar el tamao de partcula, y, por ende, evitar la variabilidad originada por la frecuente diferencia en composicin de las porciones que tienen distinto tamao (Luque de Castro et al., 1993). 2.7 Antecedentes de extraccin con SC-CO2 en microalgas. En la Tabla 2.1 se observan algunas condiciones de las variables presin, temperatura y densidad de CO2 que se han utilizado para extraer y analizar el aceite de diferentes microalgas. Se observa que las temperaturas utilizadas estn dentro de un rango de 40-85 C siendo las temperaturas cercanas a 40 C las ms utilizadas, ya que, en la gran mayora se necesitan extraer componentes termolbiles y a esta temperatura no van a ser perjudicados. Las investigaciones expuestas utilizan diferentes rangos de presin, lo cual se debe a los componentes que se desean extraer; por ejemplo, en el caso de Mendes et al. (2003) utilizan presiones entre 125 y 300 bar para la extraccin de hidrocarburos los cuales son altamente voltiles y por lo tanto de menor peso molecular, en cambio, Andrich et al. (2005) utiliza un rango de presin 550-700 bar para la extraccin de lpidos, los cuales tienen un alto peso molecular. 2.8 Aplicacin industrial de FSC. Los FSC se estn utilizando a escala industrial principalmente en los sectores agroalimentario, qumico, farmacutico, y cosmtico. Entre otras aplicaciones se dirigen a la obtencin de
extractos herbales a partir de plantas aromticas, de extractos de especias para colorantes alimentarios, aceites esenciales, etc. (Tornero, 2011). 2.8.1 Extraccin de aceites esenciales La extraccin de aceites esenciales y especias con SC-CO2 es la aplicacin industrial ms extendida, producindose ms de 60.000 ton/ao por esta tecnologa, existiendo plantas industriales en Europa, EEUU, Canad, el Sudeste Asitico y Nueva Zelanda (Cocero, 2006). En Espaa, la empresa Solutex construy, en el ao 2004, una instalacin para la produccin de alimentos funcionales mediante SC-CO2 en Malln (Zaragoza). Esta planta dispone de instalaciones de extraccin y cromatografa en SC-CO2 produciendo 50 toneladas anuales de EPA y DHA mediante cromatografa supercrtica a partir de aceite de pescado. Flavex, otra destacada compaa ubicada en Rehlingen (Alemania) produce ingredientes botnicos activos desde 1986 y en la actualidad produce ms de 50 extractos obtenidos con SCCO2 operando con una presin mxima de diseo de 500 bar y logrando una produccin anual de 1000 toneladas. Entre los extractos obtenidos destacan: extracto de jengibre (40% aceites
Tabla 2.1. Condiciones de extraccin con CO2 supercrtico utilizadas en algunas especies de algas y microalgas.
Tipo de microalga Temperatura (C) Haematococcus pluvialis Botryococcus braunii Chlorella vulgaris Nannochloropsis sp Spirulina platensis 40-80 40 40 40-55 83,3 Presin (bar) 200550 125-300 300 550-700 361 Densidad (KgCO2/m3) 841,1- 897,4 731,5- 911,1 911,1 1007,5- 1009,3 785,6 Componentes de inters extrados Astaxantina Hidrocarburos Carotenoides Lpidos Vitamina E Fuente
Machmudah et al., 2006 Mendes et al., 2003 Palavra et al., 2011 Andrich et al., 2005 Mendiola et al., 2008
Nannoclhoropsis gaditana
40-60
100-500
625,9-934,4
Carotenoides y clorofila
Macas-Snchez et al., 2005
Sargassum hemiphyllum Arthrospira maxima Nannochloropsis oculata Dunaliella salina
40-50 50-60 40 40-60
241-379 250-350 250-300 100-500
874,4-914,7 835,2-863,8 880,7-911,1 625,9-934,4
cidos grasos poliinsaturados cido -linolnico Zeaxantina Carotenoides y clorofilas
Cheung et al., 1998

Mendes et al., 2006 Liau et al., 2011 Macas-Snchez et al., 2009
esenciales y 30% gingeroles), extracto de romero rico en cido carnoslico, extracto de vainilla (10 veces ms concentrado que mediante tcnicas convencionales) y otros extractos como: crcuma, organo y pimienta con una produccin de una tonelada al ao aproximadamente (Tornero, 2011). 2.8.2 Fraccionamiento de la grasa lctea La grasa lctea es una mezcla de triglicridos saturados (70%) e insaturados (30%) y contiene tambin un pequeo porcentaje de colesterol. Los puntos de fusin estn entre -40 y 40 C y esto hace que su utilizacin sea muy reducida. En el fraccionamiento de la grasa de leche con SC-CO2 generalmente se obtienen 3 fracciones de triglicridos de peso molecular elevado (C54-42), medio (C40-36) y bajo (C34-24). Las condiciones de fraccionamiento se realizan despus de mezclarlos en el extractor (en 3 o 4 separadores), reduciendo progresivamente la presin de 240 a 34 bar y aumentando gradualmente la temperatura de 40 a 70 C. De este modo se obtiene un producto lcteo refinado que contiene menos colesterol, es rico en triglicridos insaturados y antioxidantes como -caroteno. Resulta ser muy apreciado en leches funcionales enriquecidas, mantequillas, helados y quesos (Ravents, 2005).
2.8.3 Desalcoholizacin de bebidas alcohlicas El contenido final de alcohol con EFS en estos productos oscila entre un 0,5 y un 1% en volumen y ha tenido xito en bebidas de bajo contenido alcohlico como cerveza, sidra, vino y licores de aromas. El proceso de extraccin del etanol de una bebida con este mtodo se realiza normalmente en continuo, sin tiempos muertos y con menos costes que el sistema discontinuo. Se realiza en columnas extractoras de etapas de contacto mltiple donde se introducen, bombeados continuamente, el SC-CO2 y la bebida alcohlica. La bebida fluye descendiendo y se pone en contacto con la corriente ascendente del CO2. Las condiciones ptimas para la extraccin del etanol dependen del tipo de bebida, pero generalmente los valores oscilan entre los 80 y 120 bar a temperaturas de 15 y 40 C (Carretero, 2012).
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extraccin supercrtica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 13
2.8.4 Obtencin de sustancias antioxidantes a partir de microalgas. En Chile ms especficamente en la Regin de Tarapac se encuentra la empresa biotecnolgica Atacama Bio Natural products S.A., la cual utiliza SC-CO2 para extraer complejo de Astaxantina natural a partir de oleorresinas de biomasa de microalga Haematococcus pluvialis. Esta empresa elabora dos productos: Supreme Asta Oil y Products, 2012). Supreme Asta Powder (Atacama Bio Natural
Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extraccin supercrtica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 14
CAPTULO 3 MATERIALES Y MTODOS
Captulo 3. Materiales y Mtodos
CAPTULO 3. MATERIALES Y MTODOS 3.1. Materiales 3.1.1 Materia prima
Se utiliz como sustrato microalga Botryococcus braunii, la cual fue proporcionada por la Universidad de Antofagasta. sta viene en suspensin acuosa con 20% de slidos totales. Fue secada por conveccin con aire caliente y molida hasta obtener un dimetro de partcula menor a 1 mm. La muestra fue tamizada para trabajar con el mismo dimetro de partcula en todas las extracciones. Finalmente, se almacen bajo refrigeracin (5 C) hasta su posterior uso en ensayos de extraccin y anlisis.
3.1.2. Equipos e instrumentos
Extractor supercrtico (Applied Separation Spe-ed SFE-2, modelo 7071, INC Allentown, Estados Unidos) Espectrofotmetro (Bausch & Lomb Spectronic, modelo SP-2000 UV, Estados Unidos) Estufa rango 30-220 C (Electron Thermostatic Oven, modelo DHG-9037A, Japn) Balanza analtica, sensibilidad 0,0001 g (Shimadzu, modelo AUX 220, Japn) Balanza granataria (Shimadzu, modelo ELB600S, Japn) Refrigerador (Frigidaire, modelo FRD22, China) Cronmetro digital (Q&Q HS45, China) Agitador tubos vortex (VELP Scientifica, Italia).
3.1.3. Material de vidrio y otros
Desecador con slica gel Frascos de vidrio (viales) 15 mL

Matraz aforado de 10 mL y 25 mL Cubetas de cuarzo y vidrio Matraz Erlenmeyer 250 mL Pipeta total de 1, 3, 5 y10 mL Micropipeta 10:100 L y 100:1000 L Probeta de 50 mL y 100 mL Vasos precipitados de 50, 100, 250 mL Mortero y pistilo 3.1.4. Reactivos
CO2 99 % de pureza, AGA, Chile Cloroformo p.a. A.C.S., Merck Chemicals, Alemania Anhdrido actico p.a. A.C.S., Cicarelli, San Lorenzo, Argentina Tolueno p.a. A.C.S., Merck Chemicals, Alemania Etanol p.a. A.C.S., Merck Chemicals, Alemania cido sulfrico p.a. JT, Baker, Mxico Estigmasterol, 95%, Sigma, Estados Unidos. 2,2-bipiridina, AcrosOrganics, New Jersey, Estados Unidos.
3.2 Mtodos de anlisis
3.2.1. Determinacin de humedad La humedad del sustrato se determin a travs del mtodo gravimtrico (AOAC, 1990), el cual se basa en la deshidratacin de la muestra hasta peso constante mediante el secado en estufa a 105 C. Este anlisis se realiz en duplicado tanto al sustrato inicial como al agotado obtenido luego de la extraccin.
Se expres el peso perdido por la muestra como el porcentaje de humedad en base hmeda (bh) mediante la Ecuacin (3.1).
( )
Donde: mH: masa muestra hmeda (g) mS: masa muestra seca (g)
(m -mS ) m
100
(3.1)
3.2.2. Extraccin de aceites utilizando SC-CO2 Los ensayos de extraccin de aceite se realizaron cargando 7 g de sustrato seco de B. braunii en un extractor supercrtico de capacidad de 50 mL y un dimetro interno de 14 mm. Las extracciones se realizaron bajo condiciones de extraccin que combinan distintos niveles de temperatura (41-69 C) y densidad de CO2 (843-957 kg CO2/m3), presentadas en la Tabla 3.1. Los extractos obtenidos se recuperaron en viales de vidrio de 60 mL de capacidad previamente pesados para obtener la cantidad de aceite extrado por diferencia de masa entre el vial con aceite y el vial vaco. El rendimiento de extraccin de aceite se expres como g aceite/kg sustrato seco (Anexo B, Tabla B-1 a B-12) y el anlisis del extracto consta de: concentracin de carotenoides (g car/kg aceite), concentracin de esteroles (g est/kg aceite), concentracin de tocoferoles (g toc/kg aceite), rendimiento de carotenoides (mg car/kg slido seco), rendimiento de esteroles (mg est/kg slido seco) y rendimiento de tocoferoles (mg toc/kg slido seco). 3.3. Anlisis del aceite 3.3.1 Contenido de carotenoides totales El contenido de carotenoides totales se determin por espectrofotometra UV, basado en la metodologa informada por Malaysian Palm oil Board. (2005). Las muestras de aceite obtenidas fueron disueltas en cloroformo y a continuacin fueron llevadas al espectrofotmetro UV donde se estableci la absorbancia a una longitud de onda de 452 nm. En el Anexo D, Figura D-1 se observa la curva de calibracin del mtodo de carotenoides totales.
Cd
Donde:
(mA) FD V g
100
(3.2)
Cd: Concentracin de carotenoides totales (mg carotenoides/kg aceite) m: pendiente de la curva patrn -caroteno A: absorbancia de la muestra analizada en longitud 452 nm FD: factor de dilucin de la muestra V: volumen del solvente utilizado en la preparacin del extracto (mL) g: masa de aceite analizado (g)
3.3.2 Contenido de esteroles La concentracin de esteroles se determin a travs del mtodo espectrofotomtrico informado por Sabir et al. (2003). Para este anlisis se prepararon los siguientes reactivos: Solucin patrn de estigmasterol: Se disolvieron 10 mg de patrn estigmasterol en 10 mL de cloroformo y luego se agit. Reactivo Liberman-Burchard: Se disolvieron 0,5 mL de cido sulfrico en 10 mL de anhdrido actico. La solucin se cubri con papel aluminio para protegerla de la luz.
En primer lugar, se prepar una curva de calibracin, adicionando a seis matraces de aforo de 10 mL la solucin patrn (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 mL a cada matraz, el primero se considera como blanco). A continuacin, 2 mL del reactivo Liberman-Burchard fueron aadidos a cada matraz y se aforaron con cloroformo a un volumen final de 10 mL. Los matraces fueron cubiertos por papel aluminio y mantenidos en la oscuridad durante 15 min. Luego se estableci el cero de la absorbancia del blanco a 640 nm y se midi la absorbancia de las dems soluciones, obtenindose de esta forma el grfico de la curva patrn. En el Anexo D, Figura D-2 se observa la curva de calibracin de los esteroles totales.
Para el anlisis de aceites se pesaron 100 mg de ste utilizando cloroformo como solvente. Se tomaron 3 mL de la solucin diluida y se determin su absorbancia luego de aadir el reactivo Liberman-Burchard mas cloroformo. La Ecuacin (3.3) se utiliz para determinar el contenido de esteroles totales presentes en el aceite.
C
Donde:
(mA) FD V g
1000
(3.3)
C: concentracin de esteroles totales (mg esterol/kg de aceite) m: pendiente de la curva patrn estigmasterol A: absorbancia del aceite analizado en longitud 640 nm FD: factor de dilucin V: volumen del solvente utilizado en la preparacin de aceite (mL) g: masa de aceite analizado (g)
3.3.3 Contenido de tocoferoles La concentracin de tocoferoles totales se determin a travs de espectrofotometra UV-VIS, usando el mtodo colorimtrico Emmerie-Engel informado por Wong et al. (1988). Para este anlisis fue necesario preparar los siguientes reactivos: Reactivo - tocoferol: disolver 0,0150 g de - tocoferol en 30 mL de tolueno y agitar. Solucin 2,2-bipiridina: disolver 0,0700g de 2,2-bipiridina en 100 mL de etanolagua (95%). Solucin FeCl3x 6H2O: disolver 0,0400 g de FeCl3*6H2O en 20 mL de etanol-agua (95%).
En primer lugar se prepar una curva de calibracin. A continuacin, 3,5 mL de 2,2 fueron aadidos a cada matraz ms 0,5 mL la solucin de Fe y se afor con tolueno a volumen final de
10 mL. Se estableci el cero de la absorbancia del blanco a 520 nm y luego se procedi a medir la absorbancia de las siguientes soluciones, para obtener de esta forma el grfico de la curva patrn observado en el Anexo D, Figura D-3. Para el anlisis de las muestras se disolvieron 0,2 g de aceite en 5 mL tolueno y se adicionaron 3,5 mL de 2,2-bipiridina y 0,5 mL de Fe. La solucin se afor con tolueno a 10 mL y luego se ley a una absorbancia de 520 nm. La Ecuacin (3.4) se utiliz para determinar la concentracin de trolox equivalente presente en la muestra extrada.
C
Donde:
(mA) V FD 1000 g
(3.4)
C: concentracin de Tocoferoles totales (mg tocoferoles/kg de aceite) m: pendiente de la curva de patrn de -tocoferol A: absorbancia de la muestra analizada en longitud 520 nm V: volumen del solvente utilizado en la preparacin de aceite (mL) g: masa de aceite analizado (g)
3.4 Diseo de experimentos 3.4.1 Anlisis estadstico Se utiliz la metodologa Superficie de Respuesta (MSR) que permiti evaluar el efecto de las variables independientes temperatura codificada (X1) y densidad de CO2 codificada (X2) (Ecuacin 3.5 y 3.6 respectivamente) sobre las variables dependientes; rendimiento de extraccin de aceite (Y1), concentracin de carotenoides (Y2), concentracin de esteroles (Y3), concentracin de tocoferoles (Y4), rendimiento de extraccin de carotenoides (Y5), rendimiento de extraccin de esteroles (Y6) y rendimiento de extraccin de tocoferoles (Y7).
X1
T 55 10
(3.5)
Donde: T: temperatura C
X2 D 900 40
(3.6)
Donde: D: densidad (kg/m3)
Se utiliz un polinomio de segundo orden para expresar la variables respuestas como una funcin de las variables independientes como sigue:
2 Y A0 A1 X 1 A2 X 2 A12 X 1 X 2 A11 X 12 A22 X 2
(3.7)
Donde: A0: es una constante A1 y A2: coeficientes lineales A12: coeficiente de interaccin A11 y A22: los coeficientes cuadrticos.
El diseo experimetal (Tabla 3.1) est basado en un diseo central compuesto rotatorio; el cual consiste de un diseo factorial de 2 factores independientes con niveles de trabajo (-1,+1). El diseo tiene 4 (2n) puntos experimentales y 4 (2n) puntos axiales con una distancia axial de 1,41 ( = 2n/4), y 4 replicas en el punto central (total 12 puntos de diseo). El ajuste del modelo fue evaluado por el coeficiente de determinacin R2 y mediante un anlisis de varianza (ANOVA), para estimar el efecto y significancia de las variables independientes (temperatura y densidad de CO2) sobre las variables respuestas; rendimiento de extraccin de aceite, concentracin de carotenoides, concentracin de esteroles, concentracin de tocoferoles, rendimiento de extraccin de carotenoides, rendimiento de extraccin de esteroles y rendimiento de extraccin de
tocoferoles en el aceite. Los coeficientes de la ecuacin de segundo orden fueron estimados usando el programa Design-Expert Versin 6.0.1 (Stat-Easy, Inc. Minneapolis, MN). La significacin estadstica se bas en los criterios de error total con un nivel de confianza del 95%.
Tabla 3.1. Diseo experimental Central Compuesto Rotatorio. Puntos de diseo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Temperatura (T) C 45 65 45 65 41 69 55 55 55 55 55 55 Densidad (D) kg CO2/m3 860 860 940 940 900 900 843 957 900 900 900 900 X1 (-) -1 1 -1 1 -1,41 1,41 0 0 0 0 0 0 X2 (-) -1 -1 1 1 0 0 -1,41 1,41 0 0 0 0
CAPTULO 4 RESULTADOS Y DISCUSION
Captulo 4. Resultados y discusin
CAPTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIN
4.1 Contenido de humedad de la muestra inicial El contenido de humedad de la muestra inicial de microalga (Botryococcus braunii) fue 3,41 0,21% (b.h) obtenido segn el mtodo gravimtrico (AOAC, 1990) (Anexo A, Tabla A-1). Segn Li et al. (2010), el agua interfiere en la eficiencia de la extraccin, inhibiendo el contacto entre el SC-CO2 y el sustrato, adems, de actuar como anti-solvente y reducir la solubilidad de carotenoides (Sun y Temelli, 2006) En este ensayo la humedad inicial del sustrato es baja y favorable para la extraccin de aceite como de carotenoides con SC-CO2. 4.2 Efecto de las variables independientes temperatura y densidad del CO 2 sobre el comportamiento de las respuestas. Utilizando un diseo central compuesto rotatorio con dos variables independientes: temperatura (X1) y densidad de CO2 (X2), se estudi el efecto de stas sobre las respuestas: rendimiento de extraccin de aceite (Y1), concentracin de carotenoides (Y2), concentracin de esteroles (Y3), concentracin de tocoferoles (Y4), rendimiento de carotenoides (Y5), rendimiento de esteroles (Y6) y rendimiento de tocoferoles (Y7) para, de esta forma, observar cuales son las mejores condiciones de extraccin en los rangos establecidos en el diseo estadstico utilizando el programa Design Expert. En la Tabla 4.1 se puede observar los valores de las respuestas antes citadas, donde Y1 presenta valores de rendimiento que varan entre 60,9 y 84,2 (g aceite/kg SS), la respuesta Y2 presenta una concentracin de carotenoides que vara en un rango de 8,1 a 16,1 (g car/kg aceite), en cuanto a la concentracin de esteroles (Y3) presenta concentraciones comprendidas entre 15,9- 22,0 (g est/kg aceite), la concentracin de tocoferoles (Y4) se encuentra entre 16 y 17,6 (g toc/kg aceite), mientras que el rendimiento de carotenoides (Y5) presenta valores comprendidos entre 497,4 y 1276,8 (mg car/ kg SS), en la respuesta Y6 se observan rendimientos entre 972,4 y 1676,9 (mg est/kg SS) y finalmente, el rendimiento de tocoferoles (Y7) presenta valores que varan desde 974,5 a 1386,8 (mg toc/kg SS). El efecto de las variables se evaluar a continuacin mediante la metodologa de superficie de respuesta usando la ecuacin cuadrtica (Ecuacin 3.7) que describe la respuesta Y en funcin de las variables independientes temperatura y densidad.
Tabla 4.1 Rendimiento de extraccin y concentracin de carotenoides, esteroles y tocoferoles con SC-CO2.
Temperatura (T, C) Densidad (D, kg / m3) X1 () X2 ( ) Y1 (g aceite/ kg SS) Y2 (g car/ kg aceite) Y3 (g est/ kg aceite) Y4 (g toc/ kg aceite) Y5 (mg car/ kg SS) Y6 (mg est/ kg SS) Y7 (mg toc/ kg SS)
45 65 45 65 41 69 55 55 55 55 55 55
860 860 940 940 900 900 843 957 900 900 900 900
-1 1 -1 1 -1,41 1,41 0 0 0 0 0 0
-1 -1 1 1 0 0 -1,41 1,41 0 0 0 0
61,5 62,3 6 60,9 60 80,0 61,1 84,2 60,9 76,1 73,2 67,8 73,4 72,9
8,1 12,4 13,6 16,0 9,6 14,6 8,8 16,1 12,2 12,2 12,2 12,7
17,0 17,5 21,1 18,5 19,6 15,9 16,0 22,0 18,5 18,8 18,3 19,5
16,2 16,2 17,6 16,6 16,0 16,5 16,0 17,5 16,5 17,1 17,0 16,7
497,4 769,5 828,7 828, 1276,8 589,4 1228,2 533,1 1228,2 890,1 825,0 896,7 923,6
1044,3 1087,4 1282,0 1481,2 1193,4 1337,1 972,4 1676,9 1353,1 1270,8 1340,5 1421,5
993,8 1009,6 1070,7 1330,2 977,9 1386,8 974,5 1331,7 1207,6 1160,0 1250,3 1216,0
Y1: rendimiento de extraccin de aceite; Y2: concentracin de carotenoides; Y3: concentracin de esteroles; Y4: concentracin tocoferoles; Y5: rendimiento de extraccin de carotenoides; Y6: rendimiento de extraccin de esteroles; Y7: rendimiento de extraccin de tocoferoles.
Captulo 3.Resultados y discusin
4.3 Anlisis estadstico La evaluacin estadstica del modelo se efectu mediante el anlisis de varianza (ANOVA) el cual permite determinar de forma analtica el comportamiento de los datos obtenidos a partir de los ensayos de extraccin. Mediante este anlisis se podr evaluar la significacin y la adecuacin del modelo cuadrtico propuesto (Ecuacin 3.7). En la Tabla 4.2 se presentan los resultados del anlisis de varianza entregado por el programa Design Expert, versin 6.0.1.
Tabla 4.2. Tabla de anlisis de varianza para el modelo cuadrtico Modelo Y1 Regresin Residuo Total Y2 Regresin Residuo Total Y3 Regresin Residuo Total Y4 Regresin Residuo Total Y5 Regresin Residuo Total Y6 Regresin Residuo Total Y7 Regresin 2,2E5 Residuo 25982,21 Total 2,4E+5 5 6 11 44650,70 4330,37 10,31 < 0,0066 3,86E+5 38459,13 4.2E+5 5 6 11 77253,23 6409,86 12,05 < 0,0044 7,53E+5 12156,94 7,7E+5 5 6 11 1,5E+5 2900,14 51,97 < 0,0001 2,64 0,60 3,24 5 6 11 0,53 0,10 5,30 < 0,0330 34,24 3,62 37,85 5 6 11 6,85 0,6 11,36 < 0,0051 72,12 0,51 72,62 5 6 11 14,42 0,084 170,72 < 0,0001 663,48 83,81 747,29 5 6 11 132,7 13,97 9,5 < 0,0081 Suma de cuadrados gl Cuadrado medio F Valor p
Y1: rendimiento de extraccin de aceite; Y2: concentracin de carotenoides; Y3: concentracin de esteroles; Y4: concentracin de tocoferoles; Y5: rendimiento de extraccin de carotenoides; Y6: rendimiento de extraccin de esteroles; Y7: rendimiento de extraccin de tocoferoles. Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extraccin supercrtica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 24
En la Tabla 4.2 se puede observar los valores F para cada modelo de regresin. Para la respuesta Y1 el valor de F es 9,5 lo que indica que el modelo utilizado es significativo ya que presenta un valor p0,01. El valor p es el nivel de significancia observado en el modelo, cuanto ms pequeo sea su valor mayor ser la evidencia para rechazar la hiptesis nula (H0), en este caso H0 indica que el modelo utilizado no es apropiado para predecir el comportamiento de la respuesta en funcin de las variables en estudio. Para la respuesta Y1 existe menos del 1 % de cometer un error tipo I, es decir, rechazar una hiptesis nula cuando es cierta, en esta ocasin es improbable, por lo tanto, se rechaza H0, y se establece que el modelo es adecuado. Esta situacin se repite para las respuestas Y2, Y3, Y5, Y6, Y7, lo cual indica que el modelo es significativo para predecir el comportamiento de estas respuestas en funcin de las variables no codificadas temperatura de extraccin y densidad de CO2. La respuesta Y4 (concentracin de tocoferoles), presenta un valor p<0,033 lo que indica que existe una probabilidad menor 0,05 que el modelo pueda fallar debido a perturbaciones experimentales. En la Tabla 4.3 se observan los indicadores estadsticos para cada una de las respuestas, donde se encuentran los valores del modelo (F), razn seal/ruido, coeficiente de variacin, coeficiente de determinacin (R2) y falta de ajuste. El coeficiente de determinacin R2, indica la contribucin de todos los componentes de la ecuacin a la respuesta, para Y1 es de 0,89, lo que quiere decir que el 89% del rendimiento de extraccin de aceite est explicado por el modelo representado en la ecuacin. Este valor, al ser alto, le confiere validez al modelo obtenido, el 11% restante es la contribucin del error a la respuesta. Para las dems respuestas, el indicador R2 se encuentra alrededor de 0,90 lo cual seala que el comportamiento de stas est explicado adecuadamente por las variables independientes involucradas en la ecuacin cuadrtica. En cuanto a la razn seal/ruido estas presentan un valor mayor a 4 lo que indica que las respuestas obtenidas tienen robustez y son de calidad, siendo consistentes en el tiempo sin importar las fuentes de ruido que pueden comprometer su calidad. Otro de los indicadores estadsticos que pueden observarse en la Tabla 4.3 es la falta de ajuste, la cual no result significativa (p0,05) para ninguna de las respuestas, esto debido a que no existen grandes diferencias entre el valor experimental y el valor predicho como se puede observar en el Anexo E, (Figura E-1 a E-7), no se observa una alta dispersin de los datos.
Tabla 4.3. Indicadores estadsticos para el modelo de superficie de respuesta Indicadores estadsticos F R2 Falta de ajuste Seal/ruido CV Variable respuesta Y3(g est / Y4 (g toc/ Y5(mg car/ Y6 (mg est/ Y7 (mg toc/ kg aceite) kg aceite) kg SS) kg SS) kg SS)
11,36* 0,90 2,78ns 5,30* 0,82 0,35ns 51,97* 0,97 12156,9ns 12,05* 0,91 26980,0ns 10,31* 0,91 21821,6ns
Y1 (g / kg SS)
9,50* 0,89 61,93ns
Y2 (g car / kg aceite)
170,72* 0,99 0,34ns
9,4 40,4 9,6 7,5 22,6 10,2 9,8 5,38 2,35 4,19 1,89 6,16 6,21 5,68 Y1: rendimiento de extraccin de aceite; Y2: concentracin de carotenoides; Y3: concentracin de esteroles; Y4: concentracin de tocoferoles; Y5: rendimiento de extraccin de carotenoides; Y6: rendimiento de extraccin de esteroles; Y7: rendimiento de extraccin de tocoferoles; CV: coeficiente de variacin;* significativo p0,05* Significante (p0,01); ** Significante (p0,05); y ns No-significante (p0,05).
En base a los resultados estadsticos obtenidos, el modelo cuadrtico resulta adecuado y permite utilizar las superficies de respuesta para analizar el efecto de las variables independientes temperatura de extraccin y densidad del CO2 sobre cada una de las respuestas en estudio. 4.3.1. Anlisis del rendimiento de extraccin de aceite Para la respuesta rendimiento de extraccin de aceite de microalga B. braunii (Y1), se obtuvo la Ecuacin 4.1 que indica la relacin causa/efecto que existe con las variables independientes (temperatura de extraccin y densidad de CO2) donde los coeficientes significativos (p0,05) se indican con (*).
1
T-55 D-900 T-55 2 71,82+ *6,56 ( ) + *4,83 ( ) -0,71 ( ) 10 40 10 -2,76 (

D-900 40
) + *4,57 (
T-55 10
) (
D-900 40
(4.1)
A partir de la Ecuacin 4.1 y el anlisis de varianza para la contribucin de cada trmino presente en la ecuacin polinmica (Anexo E, Tabla E-1), se puede observar que el rendimiento de extraccin de aceite fue afectado significativamente (p0,05) por los componentes lineales de temperatura y densidad y la interaccin de ambos componentes con un 45,9%, 24,8% y 11,2% de contribucin en la respuesta, respectivamente. Esto se observa en la Figura 4.1, donde el efecto positivo de la temperatura se ve a alta densidad y el efecto positivo de la densidad se observa a
alta temperatura. Los coeficientes de las variables lineales y la interaccin de stas fueron significativos y positivos existiendo una relacin directamente proporcional a condiciones de densidad y temperatura sobre el punto central (900 kg CO2/m3 y 55 C) aproximadamente.
90 81 72 63 53
957 69 929 62 900 55 872 843 41 48
Densidad (kg CO2/m3)
Temperatura (C)
Figura 4.1 Superficie de respuesta del rendimiento de extraccin de aceite (Y1) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3).
En la Figura 4.1 se observa que el mayor rendimiento de extraccin se encuentra en la zona de alta temperatura de extraccin y alta densidad de CO2, ya que, de acuerdo al modelo cuadrtico, el mejor rendimiento de extraccin de aceite fue 90,0 g aceite/kg SS, obtenido a 69 C y 957 kg CO2/m3. Adems, se observa una mayor pendiente para la variable temperatura, representando grficamente el mayor % de contribucin a la respuesta. Finalmente, la Figura 4.1, muestra que el menor rendimiento de extraccin se encuentra a temperaturas entre 41 y 48C en el rango de densidades de 843 a 872 kg CO2/m3, de acuerdo al modelo cuadrtico el valor fue 53,0 kg aceite/kg SS.
4.3.2 Anlisis de concentracin de carotenoides Para la respuesta concentracin de carotenoides (Y2) se obtuvo la ecuacin polinmica (4.2), la cual indica la relacin causa/efecto que existe entre la respuesta y las variables independientes temperatura de extraccin y densidad de CO2 donde los coeficientes significativos (p0,05) se indican con (*).
2
T-55 D-900 T-55 2 12,30+ 1,7 ( ) + 2,45 ( ) -0,036 ( ) 10 40 10
+0,13 (
D-900 40
) - 0,47 (
T-55 10
)(
D-900 40
(4.2)
Del anlisis de varianza (Anexo E, Tabla E-2) se establece que la concentracin de carotenoides (Y2) fue afectada principalmente por el componente lineal densidad de CO2 con un 65,9% de contribucin en la respuesta, tambin influy significativamente (p0,05) el componente lineal temperatura con un 32,0% y finalmente la interaccin de los componentes temperatura y densidad de CO2 influy un 1,2% en la concentracin de carotenoides en el aceite extrado. Se puede decir entonces, que estos tres componentes explican en un 99,2% la respuesta Y2. En la Ecuacin 4.2 se observa que el signo de los coeficientes de ambas variables es positivo, lo que indica una relacin directamente proporcional de la temperatura de extraccin y densidad de CO 2 sobre la concentracin de carotenoides (Y2), es decir, a medida que aumenta la densidad a temperatura constante, se produce un aumento en la concentracin de carotenoides (Y2), como se observa en la Figura 4.2, la superficie sigue esta tendencia presentando una mayor concentracin en condiciones sobre el punto central (55C y 900 kg CO2/m3). A partir de la Ecuacin 4.2 se obtuvo la superficie de respuesta observada en la Figura 4.2, donde se ve un comportamiento lineal de la respuesta, presentando una mayor pendiente la variable densidad de CO2, lo que grficamente representa la contribucin que realiza esta variable a la respuesta. De acuerdo a los valores entregados por el modelo cuadrtico la mayor concentracin de carotenoides es 17,0 g car/kg aceite encontrada a una temperatura de 69 C y una densidad de 957 kg CO2/m3, a su vez la menor concentracin de carotenoides presenta un valor de 6,0 g car/kg aceite a una temperatura de 42 C y densidad de 843 kg CO2/m3.
17 14 12 9 6
957 69 929 62 900 55 872 843 41 48

3
Densidad (kg CO2/m )
Temperatura (C)
Figura 4.2 Superficie de respuesta de la concentracin de carotenoides (Y2) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3).
4.3.3 Anlisis de concentracin de esteroles Los valores experimentales de la concentracin de esteroles se ajustaron a un modelo cuadrtico con la finalidad de generar la Ecuacin 4.3 que indica la relacin causa/efecto que existe con las variables independientes (temperatura y densidad de CO2) donde los coeficientes significativos (p0,05) se indican con (*).
3
18,76 - 0,90 (
T-55 D-900 T-55 2 ) + 1,71 ( ) - 0,48 ( ) 10 40 10

D-900 40
+0,16 (
) - 0,76 (
T-55 10
)(
D-900 40
(4.3)
A partir del anlisis de varianza para la concentracin de esteroles en el aceite (Anexo E, Tabla E-3) y al analizar la Ecuacin 4.3, se observa que la variable lineal densidad de CO2 influye significativamente (p0,05) en la respuesta contribuyendo un 62,6%, presentando un coeficiente de signo positivo lo que indica una relacin directamente proporcional a la respuesta (Y3) a bajas temperaturas. Otro de los factores que influy significativamente en la respuesta (Y3) es la
variable lineal temperatura aportando un 17,4% a la respuesta, su coeficiente es negativo lo que indica una relacin indirecta entre temperatura y concentracin de esteroles, este comportamiento se observa en la Figura 4.3 donde, a medida que aumenta la temperatura a densidad de CO2 constante, la concentracin de esteroles disminuye.
23 21 19 17 15
957 69 929 62 900 55 872 843 41 48
Temperatura (C)
Figura 4.3 Superficie de respuesta de la concentracin de esteroles (Y3) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3).
En la Figura 4.3 se observa una mayor concentracin de esteroles a temperaturas entre 41 a 48 C y densidad de CO2 entre 929 y 957 kg CO2/m3 y de acuerdo al valor entregado por el modelo cuadrtico la mayor concentracin es 23,0 g esteroles/ kg aceite, a su vez la menor concentracin de esteroles presenta un valor de 15,0 g esteroles /kg aceite a una temperatura de 69 C y densidad de 860 kg CO2/m3.
4.3.4 Anlisis de concentracin de tocoferoles Para la respuesta concentracin de tocoferoles (Y4) se obtuvo la ecuacin polinmica (4.4), la cual indica la relacin causa/efecto que existe entre la respuesta y las variables independientes temperatura de extraccin y densidad de CO2 donde los coeficientes significativos (p0,05) se indican con (*).
16,83-0,03 (
T-55 D-900 T-55 2 ) + 0,49 ( ) - *0,25 ( ) 10 40 10

D-900 40
-3,12 10-3 (
) -0,25 (
T-55 10
)(
D-900 40
(4.4)
El anlisis de varianza para la concentracin de tocoferoles (Anexo E, Tabla E-4) y la Ecuacin 4.4 indican que la respuesta fue afectada significativamente (p0,05) por la variable lineal densidad de CO2 y la variable cuadrtica temperatura de extraccin, presentando una contribucin de 60,4% y 12,7% respectivamente. Al observar los signos que acompaan los coeficientes, en el caso de la variable lineal densidad es positivo y su comportamiento se puede observar en la Figura 4.4 donde a valores de temperatura bajo el punto central (55 C) se observa un comportamiento directamente proporcional a la respuesta (Y4). Mientras que el signo negativo que acompaa el coeficiente de la variable cuadrtica temperatura indica que dentro de un rango de trabajo, desde una determinada temperatura la concentracin de tocoferoles disminuye al aumentar esta variable, presentndose un mximo en la respuesta lo que se observa en la Figura 4.4. En la Figura 4.4 se observa que a valores bajos de densidad de CO2 la concentracin de tocoferoles aumenta a medida que aumenta la temperatura, mientras que a valores altos de densidad de CO2, la concentracin de tocoferoles disminuye con el aumento de la temperatura. Este comportamiento explica porque el componente cuadrtico de la variable temperatura es negativo y significativo (p0,05). De acuerdo al valor entregado por el modelo cuadrtico, la mayor concentracin de tocoferoles es 18,0 g tocoferoles/ kg aceite observada a condiciones de 41 C y 957 kg CO2/m3, a su vez la menor concentracin de tocoferoles presenta un valor de 15,0 g tocoferoles/ kg aceite a una temperatura de 41 C y densidad de 843 kg CO2/m3
18 17 16 16 15
957 69 929 62 900 872 48 843 41 55
Temperatura (C)
Figura 4.4 Superficie de respuesta de la concentracin de tocoferoles (Y4) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3).
4.3.5 Anlisis de rendimiento de extraccin de carotenoides Del anlisis estadstico se obtuvieron las variables significativas para el rendimiento de extraccin de carotenoides en el aceite. La Ecuacin 4.5 indica la relacin causa/efecto que existe entre la respuesta rendimiento de extraccin de carotenoides (Y5) y las variables independientes temperatura y densidad de CO2, donde los coeficientes significativos (p0,05) se indican con (*).
T-55 D-900 T-55 2 883,85+ *202,99 ( ) + *227,71 ( ) -0,40 ( ) 10 40 10
-14,53 (
D-900 40
) +43,99 (
T-55 10
)(
D-900 40
(4.5)
El anlisis de varianza realizado para el rendimiento de extraccin de carotenoides en el aceite (Anexo E, Tabla E-5) y la ecuacin polinmica (4.5) indican que la respuesta (Y5) fue afectada significativamente (p0,05) por los componentes lineales densidad de CO2 y temperatura de extraccin presentando una contribucin a la respuesta de 53,8% y 42,8% respectivamente. En la Ecuacin 4.5 se observa que el signo de los coeficientes de ambas variables es positivo, lo que indica una relacin directamente proporcional de la temperatura de extraccin y densidad de CO 2 sobre el rendimiento de extraccin de carotenoides (Y5), es decir, a medida que aumenta la densidad a temperatura constante, se produce un aumento en el rendimiento de extraccin de carotenoides (Y5), como se observa en la Figura 4.5, la superficie sigue esta tendencia presentando un mayor rendimiento en condiciones sobre el punto central (55 C y 900 kg CO2/m3). En la Figura 4.5 se observa un comportamiento lineal de la superficie de respuesta y segn los valores entregados por el modelo cuadrtico el mejor rendimiento es 1550,0 mg car/kg SS obtenido a 69 C y 957 kg CO2/m3, a su vez, el menor rendimiento de extraccin de carotenoides es 333,0 mg car/kg SS, encontrado a 41 C y 843 kg CO2/m3.
1550 1246 941 637 333
957 69 929 62 900 55 872 843 41 48
Temperatura (C)
Figura 4.5. Superficie de respuesta del rendimiento de extraccin de carotenoides (Y5) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3)
4.3.6 Rendimiento de extraccin de esteroles Del anlisis estadstico se obtuvieron las variables significativas para el rendimiento de extraccin de esteroles en el aceite. Los coeficientes significativos (p0,05) indicados con (*) se observan en la Ecuacin 4.6, ecuacin polinmica que indica la relacin causa/efecto que existe entre la respuesta rendimiento de extraccin de esteroles (Y6) y las variables independientes temperatura y densidad de CO2.
6
T-55 D-900 T-55 2 1347,22+55,68 ( ) + 203,48 ( ) -58,81 ( ) 10 40 10
-29,09 (
D-900 40
) +39,03 (
T-55 10
)(
D-900 40
(4.6)
Del anlisis de varianza (Anexo E, Tabla E-6) y al observar la Ecuacin 4.6 se establece que el rendimiento de extraccin de esteroles (Y6) fue afectado mayoritariamente por el componente lineal densidad de CO2 con un 77,4% de contribucin, presentando un coeficiente positivo el cual indica un comportamiento directamente proporcional a la respuesta, lo que quiere decir que a medida que la densidad de CO2 aumenta a temperatura constante el rendimiento de extraccin de esteroles aumenta, esta situacin se puede observar en la Figura 4.6 tanto a bajas como a altas temperaturas de extraccin. En la Figura 4.6 se observa que el mayor rendimiento de extraccin se encuentra en condiciones sobre el punto central (55 C y 900 kg CO2/m3) presentando un valor de 1631,0 mg est/ kg SS, adems, el modelo cuadrtico seala que el menor rendimiento de esteroles es 883,0 mg est/ kg SS observado a 41C y 843 kg CO2/m3.
1631 1444 1257 1070 883
957 69 929 62 900 55 872 843 41 48
Temperatura (C)
Figura 4.6. Superficie de respuesta de la rendimiento de extraccin esteroles (Y6) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3).
4.3.7 Rendimiento de extraccin de tocoferoles A partir del anlisis de varianza (ANOVA) desarrollado para el rendimiento de extraccin de tocoferoles (Anexo E, Tabla E-7) se observa que las variables de los componentes lineales temperatura de extraccin y densidad de CO2 influyen significativamente (p<0,05) en la respuesta Y7 aportando un 36,2% y un 40,4% respectivamente. Los valores experimentales del rendimiento de extraccin de tocoferoles, se ajustaron a un modelo cuadrtico con la finalidad de generar la Ecuacin 4.7 que indica la relacin causa/efecto que existe con las variables independientes (temperatura de extraccin y densidad de CO2). T-55 D-900 T-55 2 1208,47+ *106,70 ( ) + *112,83 ( ) -29,74 ( ) 10 40 10
-44,34 (
D-900 40
) +60,94 (
T-55 10
)(
D-900 40
(4.7)
En la Ecuacin 4.7 se observa el signo positivo que acompaa los coeficientes lineales temperatura de extraccin y densidad de CO2 lo que se ve en la Figura 4.7, donde el efecto positivo de la temperatura se observa a alta densidad y el efecto positivo de la densidad se observa a alta temperatura existiendo una relacin directamente proporcional que se observa solo a condiciones de densidad y temperatura sobre el punto central (900 kg CO2/m3 y 55 C) aproximadamente.
1492 1337 1182 1027 872
957 69 929 62 900 55 872 843 41 48
Densidad (kgCO2/m3)
Temperatura (C)
Figura 4.7 Superficie de respuesta del rendimiento de extraccin de tocoferoles (Y7) como funcin de la temperatura (C) y densidad (kg CO2/m3).
En la Figura 4.7 se observa que el mayor rendimiento de extraccin de tocoferoles se encuentra en la zona de alta temperatura de extraccin y alta densidad de CO2, ya que, de acuerdo a los valores entregados por el modelo cuadrtico el mejor rendimiento de extraccin fue 1492,0 mg toc/kg SS, obtenido a 69 C y 957 kg CO2/m3. Finalmente, a partir de la Figura 4.7, tambin se puede ver que el menor rendimiento de extraccin se encuentra a temperaturas de 41 a 48 C en
un rango de densidades de 843 a 872 kg CO2/m3 y de acuerdo al modelo cuadrtico fue 872,0 mg toc/kg SS.
4.4 Discusin general Existen muchos factores que pueden influenciar el rendimiento de extraccin supercrtica, estos pueden ser: humedad del sustrato, presin de CO2, temperatura de extraccin, tamao de partcula, densidad del CO2 entre otras. En este caso, se estudia el efecto de la temperatura de extraccin y densidad del CO2 sobre el rendimiento de extraccin de aceite de la microalga (Botryococcus braunii), donde, de acuerdo a los resultados presentados en la Tabla 4.1 existe relacin entre estas variables y cada una de las respuestas en estudio, observando un efecto significativo de la temperatura sobre el rendimiento de extraccin encontrando el mayor a una temperatura de 69 C y una densidad de 957 kg CO2/m3 lo cual concuerda con Marstica et al. (2010) que sealan que el aumento de la temperatura acelera la transferencia de masa, aumentando la presin de vapor de los compuestos extractables y mejorando el rendimiento de extraccin. Marstica et al. (2010), indican que la solubilidad de los solutos est influenciada claramente por dos factores: la densidad del SC-CO2, que aumenta con la presin trabajando a temperaturas constantes, y la presin de vapor de los solutos, la cual aumenta por el incremento de la temperatura, es decir, la solubilidad de los solutos cambiar de acuerdo al factor ms predominante. En cuanto al contenido de aceite de microalga Botryococcus braunii, Antilaf (2011), extrajo aceite a condiciones de 40 C y 911,1 kg CO2/m3 logrando un rendimiento de 86,3 g aceite/ kg SS, rendimiento similar al obtenido en esta investigacin. Por otro lado, estudios realizados por Chen y Walker (2012), lograron el mayor rendimiento de extraccin de aceite de microalga Chlorella protothecoides a condiciones de 50 C y 900 kg CO2/m3, condiciones de extraccin dentro de nuestro rango de estudio, mientras que, Andrich et al. (2005), extrajo aceite a partir de la microalga Nannochloropsis sp., obteniendo el mayor rendimiento (118,04 g aceite/kg SS) a 55 C de temperatura y una densidad de 1000 kg CO2/m3. Como se puede observar la densidad es mayor a la utilizada en esta investigacin y por ende el rendimiento de extraccin tambin es mayor. Este hecho se debe a la alta presin del solvente lo que genera una menor distancia entre
las molculas provocando un aumento en la solubilidad del aceite como tambin un incremento del poder solvente del SC-CO2 (Li et al., 2010). Cabe mencionar que el aceite obtenido de microalgas y de otros sustratos en general se extrae como mezcla de varias fracciones de lpidos, en el caso de B. braunii, Fang et al. (2004) determin que un 55,4% del extracto corresponde a cidos grasos como cido oleico, palmtico, linoleico entre otros. Los mejores resultados, en trminos de rendimiento de extraccin de carotenoides, se obtuvieron trabajando con las densidades de CO2 ms altas (sobre 900 kg CO2/m3), con valores superiores a 1500 mg car/ kgSS. Esto puede ser debido a que la extraccin de carotenoides est favorecida por el empleo de elevadas densidades de CO2 cuando se trabaja en intervalos supercrticos (Ibaez et al., 1998). Los carotenoides son pigmentos termolbiles y fotodegradables cuyas propiedades antioxidantes estn ampliamente estudiadas y para los que la extraccin con CO2 supercrtico ha sido ampliamente utilizada. Debido a la baja polaridad de estos compuestos y a la alta selectividad de este mtodo se ha llegado a calificar la extraccin con fluidos supercrticos como el mtodo ms apropiado para la obtencin de cidos grasos, pigmentos, etc., a partir de biomasa de microalgas (Careri et al., 2001). En el proceso de extraccin de carotenoides tanto la densidad de SC-CO2 como la temperatura de extraccin influyeron significativamente en el rendimiento de carotenoides, logrando el mayor rendimiento por sobre los 55 C y densidades sobre los 900 kg CO2/m3, resultados similares a la investigacin realizada por Macas-Snchez et al. (2010), quienes utilizaron extraccin con SCCO2, en la microalga S. almeriensis trabajando a temperaturas entre 32 y 60 C, densidades de 882 a 957 kg CO2/m3, obteniendo los mejores rendimientos de carotenoides a condiciones de trabajo de 60 C, 890 kg CO2/m3. Por otro lado, los resultados obtenidos por Macias-Snchez et al. (2005), en Nannoclhoropsis gaditana utilizando SC-CO2 indican que a temperaturas de 60 C y densidad de 890 kg CO2/m3 se obtiene el mayor rendimiento en la extraccin de carotenoides, esto puede ser debido a que la extraccin de carotenoides est favorecida por el empleo de elevadas densidades del CO2 cuando se trabaja en intervalos supercrticos (Favati et al., 1998). Mendiola (2008) seala que a pesar de que en el rendimiento de extraccin de carotenoides se debe tener en cuenta la presencia de otros compuestos en el extracto, el rendimiento de
carotenoides tiene una relacin directa con el total del aceite extrado. Esta relacin se refleja en los resultados obtenidos en esta investigacin, ya que, el mayor rendimiento de carotenoides y el mayor rendimiento de aceite se obtuvieron a las mismas condiciones (69 C y 957 kg CO2/m3). En cuanto al rendimiento de extraccin de tocoferoles tanto la densidad de CO2 como la temperatura de extraccin influyeron significativamente p 0,05 sobre el rendimiento. Estos resultados coinciden con la aseveracin de que los tocoferoles son compuestos fcilmente extrables, dado que la temperatura afecta positivamente su extraccin (King et al., 1996), por tanto, es lgico pensar que el rendimiento estar favorecido a elevadas temperaturas. Otro estudio realizado por Mendiola (2008) en extractos de Spirulina tambin concuerda con lo anteriormente descrito, obteniendo el mayor rendimiento a condiciones mximas de temperatura (83 C). Finalmente, en este estudio el mayor rendimiento de extraccin de tocoferoles se obtuvo a la mxima temperatura del rango de trabajo (69 C). La velocidad de extraccin de aceite de microalga Botryococcus braunii se puede observar en el Anexo C, (Figua C-1 a C-12) donde se ven claramente dos fases predominantes en las curvas del modelo de extraccin. En la primera fase se observa una velocidad de extraccin rpida durante los primeros 10 minutos, esto ocurre debido a que en esta fase se encuentra todo el aceite disponible para la extraccin, luego se observa que la tasa de extraccin va disminuyendo (fase de transicin), durante esta fase, una gran proporcin del aceite ha sido extrado lo que grficamente se representa por una asntota. Este comportamiento indica que el proceso sera controlado por la transferencia de masa (difusin del CO2 al interior de la matriz vegetal y difusin del CO2 mas el aceite desde el interior de las partculas hacia la superficie) (MacasSnchez et al., 2009) Finalmente, a condiciones de 69 C y 900 kg CO2/m3 (finalizada la extraccin) se obtuvo el mayor rendimiento. .
CAPTULO 5 CONCLUSIONES
Captulo 5. Conclusiones
CAPTULO 5. CONCLUSIONES
La temperatura y la densidad de CO2 afectaron significativamente (p0,05) el rendimiento de extraccin de aceite de microalga (B. braunii), explicando su comportamiento en un 89,0%, siendo la temperatura de extraccin la variable que ms afect con un 46,4%, El mayor rendimiento de extraccin de aceite se obtuvo a 69 C, con una densidad de 957 kg CO2/m3.
El comportamiento del rendimiento de extraccin de carotenoides fue explicado en un 82,0% por las variables en estudio, siendo la densidad de CO2 la variable que ms afect con un 53,9%, seguido por la temperatura con un 42,8%.
La densidad del CO2 afect significativamente (p0,05) la concentracin de carotenoides en el extracto con un 66,1% de contribucin seguido por el 32,0% de influencia de temperatura. La mayor concentracin de carotenoides fue 17,0 g car/kg aceite registrada a una temperatura de 69 C y una densidad de 957 kg CO2/m3.
La concentracin de esteroles y tocoferoles en el extracto fueron afectadas significativamente (p0,05) por las 2 variables en estudio, siendo la densidad del CO2 la variable que ms contribuy a la respuesta con un 62,6% y un 60,4% respectivamente.
El aceite obtenido bajo condiciones seleccionadas (55 C, 900 kg CO2/m3) present un contenido de esteroles totales de 18,8 g esterol/kg aceite, un contenido de carotenoides de 12,2 g car/kg aceite y un contenido de tocoferoles totales de 16,8 g toc/kg aceite.
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ANEXOS
Anexos
ANEXOS ANEXO A. Determinacin de la humedad del sustrato Tabla A-1: Determinacin de la humedad inicial de la microalga (Botryococcus braunii). N de rplica 1 2 Peso placa (g) 27,5029 27,8300 Peso muestra hmeda (g) 28,5072 28,8315 Peso placa + Muestra seca (g) 28,4737 28,7952 Promedio % humedad (b.h) 3,3357 3,6246 4,4800,205 % humedad (b.s) 3,4508 3,7609 3.6060,220
Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extraccin supercrtica de aceite de microalga (Botryococcus braunii). 51
Efecto de la densidad y temperatura sobre la extraccin supercrtica de aceite de microalga (Botryococcus braunii) 52
ANEXO B. Determinacin del rendimiento de extraccin de aceite de microalga B. braunii. Tabla B-1. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 45C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseo 1)
Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 39 Consumo L NPT 10,5 17,5 35 70 136,5 CO2 g 18,9 31,5 63,0 126,0 245,6 Peso Inicial 30,5457 30,9924 30,4248 30,3473 30,5223 vial (g) Final 30,6284 31,0069 30,4585 30,3828 30,566 Peso extracto (g) 0,0827 0,0145 0,0337 0,0355 0,0437 Peso acumulado recuperado 0,0827 0,0972 0,1309 0,1664 0,2101 corregido 0,1639 0,1927 0,2595 0,3299 0,4165 kg CO2 / kg SS 2,8 4,6 9,3 18,6 36,3 g aceite / kg MP 24,20 28,45 38,31 48,70 61,49
Tabla B-2. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 65C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseo 2).
Vial Tiempo (min) 3 5 10 20 39 Consumo L NPT 10,5 17,5 35 70 136,5 CO2 g 18,9 31,5 63,0 126,0 245,6 Peso Inicial 30,5872 30,5784 30,547 30,7289 30,5709 vial (g) Final 30,6728 30,6369 30,6289 30,78 30,6312 Peso extracto (g) 0,0856 0,0585 0,0819 0,0511 0,0603 Peso acumulado recuperado 0,0856 0,1441 0,226 0,2771 0,3374 corregido 0,1068 0,1799 0,2821 0,3459 0,4212 kg CO2 / kg SS 2,8 4,7 9,3 18,6 36,3 g aceite / kg MP 15,79 26,59 41,70 51,13 62,25
1 2 3 4 5
Anexos
Vial 1 2 3 4 5 Tiempo (min) 3 5 10 20 40 Consumo L NPT 11,7 19,5 39 78 156 CO2 g 21,1 35,1 70,2 140,3 280,7 Peso Inicial 33,5708 33,3936 33,643 34,0229 34,0169 vial (g) Final 33,6366 33,4343 33,684 34,0623 34,0592 Peso extracto (g) 0,0658 0,0407 0,041 0,0394 0,0423 Peso acumulado recuperado 0,0658 0,1065 0,1475 0,1869 0,2292 corregido 0,1182 0,1914 0,2651 0,3359 0,4119 kg CO2 / kg SS 3,1 5,2 10,4 20,8 41,5 g aceite / kg MP 17,49 28,30 39,20 49,67 60,91
Anexos Anexos
Tabla B-6. Extraccin de aceite de microalga B. braunii a 69C y 900kg CO2/m3 (punto de diseo 6) .
Anexos
Anexos
Anexos
Anexos
Anexos
ANEXO C. Determinacin de la cintica de extraccin de aceite de microalga (Botryococcus braunii).
70
Rendimiento (g aceite/kg SS)
60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50
tiempo (min)
Figura C-1. Curva cintica de extraccin de aceite a 45C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseo 1).
70
60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50
tiempo (min)
Figura C-2 Curva cintica de extraccin de aceite a 65C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseo 2).
Anexos 70 Rendimiento (g aceite/kg SS 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 Tiempo (min) 40 50
90 Rendimiento (g aceite/kg SS 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min)
. Figura C-4 Curva cintica de extraccin de aceite a 65C y 940kg CO2/m3 (Punto de diseo 4).
Anexos 70
60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40
tiempo (min)
Figura C-5 Curva cintica de extraccin de aceite a 41C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseo 5).
90 Rendimiento (g aceite/kg SS 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (min)
Anexos
70 Rendimiento (g aceite/kg SS) 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min)
Figura C-7.Curva cintica de extraccin de aceite a 55C y 843kg CO2/m3 (Punto de diseo 7).
80 Rendimiento (g aceite/kg SS 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min)
. Figura C-8. Curva cintica de extraccin de aceite a 55C y 957kg CO2/m3 (Punto de diseo 8).
Anexos 80 Rendimiento (g aceite/kg SS 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min)
. Figura C. 9 Curva cintica de extraccin de aceite a 55C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseo 9).
. Figura C-10. Curva cintica de extraccin de aceite a 55C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseo 10).
Anexos 80 Rendimiento (g aceite/kg SS 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (min)
. Figura C-11. Curva cintica de extraccin de aceite a 55C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseo 11)
. Figura C-12. Curva cintica de extraccin de aceite a 55C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseo 12)
Anexos
ANEXO. D Anlisis del extracto de aceite de microalga (Botryococcus braunii).
Tabla D-1. Datos curva de calibracin para la concentracin de carotenoides en el aceite de microalga B. braunii Diluciones 1 2 3 4 5 6 -caroteno (mg/mL) 0 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 Absorbancia 0 0,895 0,716 0,545 0,366 0,184
0,06 0,05 -caroteno (mg/mL) 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 y = 0,0556x R = 0,9998
Absorbancia
Figura D-1. Curva calibracin carotenoides totales.
Anexos
Tabla D-2. Datos curva de calibracin para la concentracin de esteroles en el aceite de microalga B. braunii. Diluciones Absorbancia a 15mn 0,951 0,678 0,574 0,442 0,357 0,234 0,102 0,000 Estigmasterol (mg /mL) 0,40 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
1 2 3 4 5 6 7 8
0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000
mg estigmasterol/ml
y = 0,425x + 0,0039 R = 0,9979
absorbancia a 15mn
Figura D-2.Curva de calibracin esteroles totales.
Anexos
Tabla D-3. Datos curva de calibracin para la concentracin de tocoferoles en aceite de microalga (Botryococcus braunii).
Diluciones 1 2 3 4 5
-Tocoferol (mg/mL)
Absorbancia 0,979 0,813 0,616 0,428 0,212
0,05 0,04 0,03 0,02 0,01
0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 y = 0,0497x R = 0,9976
-tocoferol (mg/mL)
Absorbancia
Figura D-3. Curva de calibracin para tocoferoles totales.
Anexos
ANEXO E Anlisis Estadstico
90 85
Y Predicho
80 75 70 65 60 60 70 80 90
Yac Experimental
Figura E-1 Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de extraccin de aceite (Y1).
17 16 15
Y Predicho
14 13 12 11 10 9 8 8 10 12 14 16 18
Y Ac Experimental
Figura E-2. Valores actuales y predichos para la respuesta concentracin de carotenoides (Y2).
Anexos 23 22 21
Y Predicho
20 19 18 17 16 15 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Y Ac Experimental
Figura E-3. Valores actuales y predichos para la respuesta concentracin de esteroles (Y3).
18,0 17,5
Y Predicho
17,0 16,5 16,0 15,5 15,5 16,5 17,5 18,5
Y Ac Experimental
Figura E-4. Valores actuales y predichos para la respuesta concentracin de tocoferoles (Y4).
Anexos 1480 1380 1280 1180
Y Predicho
1080 980 880 780 680 580 480 490 690 890 1090 1290 1490
Y Ac Experimental
Figura E-5. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de carotenoides (Y5).
1700 1600 1500
Y Predicho
1400 1300 1200 1100 1000 960 1060 1160 1260 1360 1460 1560 1660 1760
Y Ac Experimental
Figura E-6. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de esteroles (Y6)
Anexos 1470 1420 1370 1320
Y Predicho
1270 1220 1170 1120 1070 1020 970 990 1090 1190 1290 1390 1490
Y Ac Experimental
Figura E-7. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de tocoferoles (Y7).
Tabla E-1. Anlisis de varianza para el rendimiento de extraccin de aceite. Fuente X1 X2 X12 X22 X1X2 Suma de cuadrados 344,62 186,36 3,19 48,71 83,63 Gl 1 1 1 1 1 Varianza 344,2 186,36 3,19 48,71 83,63 Valor F exp 24,67 13,34 0,23 3,49 5,99 Probabilidad 0,0025* 0,0107* 0,6495 0,1111 0,0500* R2 % 45,93 24,84 0,43 6,49 11,15
X1: Temperatura [C]; X2: Densidad [kg CO2/m3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo (p<0,05).
Anexos
Tabla E-2. Anlisis de varianza para la concentracin de carotenoides en el aceite. Fuente X1 X2 X12 X2
2
Suma de cuadrados 23,21 47,88 0,0081 0,1 0,9
Gl 1 1 1 1 1
Varianza 23,21 47,88 -0,0081 0,1 0,9
Valor F exp 274,7 566,69 0,096 1,22 10,68
Probabilidad 0,0001* 0,0001* 0,767 0,3118 0,0171*
R2 % 31,97 65,94 0,01 0,14 1,24
X1X2
X1: Temperatura [C]; X2: Densidad [kg CO2/m3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo (p<0,05).
Tabla E-3. Anlisis de varianza para la concentracin de esteroles en el aceite. Fuente X1 X2 X1

2
Suma de cuadrados 6,51 23,52 1,5 0,16 2,28
Gl 1 1 1 1 1
Varianza 6,51 23,52 1,5 0,16 2,28

3
Valor F exp 10,8 39,04 2,49 0,26 3,78
Probabilidad 0,0167* 0,0008* 0,166 0,6288 0,0997
R2 % 17,32 62,57 3,99 0,43 6,07
X22 X1X2
X1: Temperatura [C]; X2: Densidad [kg CO2/m ]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo (p<0,05).
Anexos
Tabla E-4. Anlisis de varianza para la concentracin de tocoferoles en el aceite. Fuente X1 X2 X12 X22 X1X2 Suma de cuadrados 0,0071 1,95 0,41 0,000062 0,26 Gl 1 1 1 1 1 Varianza 0,0071 1,95 0,41 0,000062 0,26
3
Valor F exp 0,072 19,61 4,12 0,00062 2,56
Probabilidad 0,797 0,004* 0,089* 0,981 0,161
R2 % 0,22 60,42 12,70 0,00 8,06
Tabla E-5. Anlisis del rendimiento de carotenoides. Fuente X1 X2 X12 X22 X1X2 Suma de cuadrados 329600 414800 1,05 1350,71 7739,6 Gl 1 1 1 1 1 Varianza 329600 414800 1,05 1350,71 7739,6
3
Valor F exp 113,66 143,03 0,00036 0,47 2,67
Probabilidad 0,0001* 0,0001* 0,9854 0,5204 0,1535
R2 % 42,76 53,81 0,00 0,18 1,00
Anexos
Tabla E-6. Anlisis del rendimiento de esteroles Fuente X1 X2 X1 X2

2 2
Suma de cuadrados 24800,15 331200 22136,55 5415,63 6093,36
Gl 1 1 1 1 1
Varianza 24800,15 331200 22136,55 5415,63 6093,36

3
Valor F exp 3,87 51,68 3,45 0,84 0,95
Probabilidad 0,0968 0,0004* 0,1125 0,3935 0,3672
R2 % 5,79 77,36 5,17 1,27 1,42
X1X2
Tabla E-7. Anlisis del rendimiento de tocoferoles Fuente X1 X2 X1 X2

2 2
Suma de cuadrados 91071,51 101800 5660,12 12580,5 14853,52
Gl 1 1 1 1 1
Varianza 91071,51 101800 5660,12 12580,5 14853,52

3
Valor F exp 21,03 23,52 1,31 2,91 3,43
Probabilidad 0,0037* 0,0029* 0,2965 0,1392 0,1135
R2 % 36,15 40,41 2,25 4,99 5,90
X1X2

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UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA FACULTAD DE INGENIERA, CIENCIAS Y ADMINISTRACIN DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA

LETICIA ALEJANDRA DURN MANOSALVA 2012

UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA FACULTAD DE INGENIERA, CIENCIAS Y ADMINISTRACIN DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA

TRABAJO PARA OPTAR AL TTULO DE INGENIERO EN ALIMENTOS

Profesor Gua: Dr.Edgar Uquiche Carrasco

LETICIA ALEJANDRA DURN MANOSALVA 2012

LETICIA ALEJANDRA DURN MANOSALVA 2012

EDGAR UQUICHE CARRASCO Profesor gua

CAROLINA SHENE DE VIDTS Profesor examinador

XIMENA INOSTROZA HOFFMANN Profesor examinador

Nota trabajo escrito : Nota examen Nota final : :

INDICE DE CONTENIDOS Pgina

CAPTULO 1. INTRODUCCIN ............................................................................................... 1

3.1.1 Materia prima ................................................................................................................ 15 3.1.2. Equipos e instrumentos ................................................................................................ 15

3.1.3. Material de vidrio y otros ............................................................................................. 15 3.1.4. Reactivos ...................................................................................................................... 16

3.4.1 Anlisis estadstico ........................................................................................................ 20 CAPTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIN ....................................................................... 22

CAPTULO 5. CONCLUSIONES ............................................................................................. 39 BIBLIOGRAFA ......................................................................................................................... 42

CAPTULO 2 ANTECEDENTES GENERALES

Captulo 2. Antecedentes generales

CAPTULO 2. ANTECEDENTES GENERALES

Figura 2.1. Forma estructural B.braunii (Barker et al., 2012).

Captulo 2. Antecedentes generales

Captulo 2. Antecedentes generales

2.4 Importancia de los carotenoides, esteroles y tocoferoles en la nutricin. 2.4.1 Carotenoides

Captulo 2. Antecedentes generales

Captulo 2. Antecedentes generales

Captulo 2. Antecedentes generales

Figura 2.2. Diagrama de fases que muestra la regin de un FSC.

Captulo 2. Antecedentes generales

Captulo 2. Antecedentes generales

Captulo 2. Antecedentes generales

Macas-Snchez et al., 2005

Sargassum hemiphyllum Arthrospira maxima Nannochloropsis oculata Dunaliella salina

40-50 50-60 40 40-60

241-379 250-350 250-300 100-500

874,4-914,7 835,2-863,8 880,7-911,1 625,9-934,4

cidos grasos poliinsaturados cido -linolnico Zeaxantina Carotenoides y clorofilas

Cheung et al., 1998

Mendes et al., 2006 Liau et al., 2011 Macas-Snchez et al., 2009

Captulo 2. Antecedentes generales

Captulo 2. Antecedentes generales

CAPTULO 3 MATERIALES Y MTODOS

Captulo 3. Materiales y Mtodos

CAPTULO 3. MATERIALES Y MTODOS 3.1. Materiales 3.1.1 Materia prima

3.1.2. Equipos e instrumentos

3.1.3. Material de vidrio y otros

Desecador con slica gel Frascos de vidrio (viales) 15 mL

Captulo 3. Materiales y Mtodos

3.2 Mtodos de anlisis

Captulo 3. Materiales y Mtodos

Captulo 3. Materiales y Mtodos

Captulo 3. Materiales y Mtodos

Captulo 3. Materiales y Mtodos

Captulo 3. Materiales y Mtodos

Donde: D: densidad (kg/m3)

2 Y A0 A1 X 1 A2 X 2 A12 X 1 X 2 A11 X 12 A22 X 2

Captulo 3. Materiales y Mtodos

CAPTULO 4 RESULTADOS Y DISCUSION

Captulo 4. Resultados y discusin

CAPTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIN

Captulo 4. Resultados y discusin

Captulo 4. Resultados y discusin

Captulo 4. Resultados y discusin

T-55 D-900 T-55 2 71,82+ 6,56 ( ) + 4,83 ( ) -0,71 ( ) 10 40 10 -2,76 (

T-55 D-900 T-55 2 883,85+ 202,99 ( ) + 227,71 ( ) -0,40 ( ) 10 40 10